Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация фактора элонгации EF-G и THERMUS THERMOPHILUS

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация фактора элонгации EF-G и THERMUS THERMOPHILUS"

ГОСКОМИТЕТ РСФСР ПО ДЕЛАМ НАУКИ И ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ

РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Специализированный совет К 063.52.09

На правах рукописи

КЛИМОВА Ирина Алексеевна

УДК 577.322.2.

СТРУКТУгаО-ФУНКЦИОНАЛЫШ! ОРГАНИЗАЦИЯ «АКТОРА ЭЛОНГАЦИИ ЕР-С ИЗ ТНЕШБ ТНЕШОРНШв.

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учбной степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону - 1992

Работа выполнена в Институте бежа АН СССР

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ю.Б.Алахов (г.Пущино, Московской обл.) Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.И.Матвиенко (г.Пущино, Институт белка АН СССР).

Ведущая организация: "Филиал Института биоорганической хими

Защита диссертации состоится "26" марта 1992 г. в 10°° час. на заседании Специализированного УчЭного совета К 063.52.09 при Ростовском Государственном Университете ( г.Ростов-на-Дону, ул.Энгельса, 105, ауд.304).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке РГУ

Учбный секретарь специализированного совета.

кандидат биологических наук, науч.cotí Г.Г.Диханов (г.Ростов-на-Дону, Ростове* Противочумный Институт).

АН СССР (г.Пущино). Автореферат разослан " л Ч 1992 г.

доктор биологических наук

В.Н.Кирой

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

_Актуальность_теии. Изучение механизма белкового синтеза едставляет собой одну из центральных проблем молекулярной био-гии. Напомним, что трансляция инфор?лационной РНК в белок проис-дит в три стадии - инициацию, элонгацию, терминацию и каждый из их шагов связан с отдельным набором растворимых белковых фактов, которые выполняют различные задачи в соответствующем функ-ональном состоянии.

Одним из ключевых этапов трансляции является элонгация, т.е. ращиванш полипептидной цепи с одновременным передвижением мат-цы на один кодон. Сегодня факторы элонгации из E.oolt наиболее лно изучены по сравнению с другими белками аппарата трансляции, ределена первичная структура всех трёх факторов (EP-Ts, ef-Tu. и -G) из E.coll и T.thermophtlua НВ8 и пространственная структура -Tu из E.oolt. Получена информация об общей топографии молекулы -G и расположении его активных центров. Интенсивно ведутся тагеноструктурные исследования кристаллов EF-G из экстремально-рмофильных бактерий Therrma themophílus. Однако сведений о зкретных механизмах действия факторов элонгации и о выполняемых г функциях в клетке имеется мало.

Цвль_Е§0отыл Для детального изучения физико-химических основ акционирования фактора элонгации G в Институте белка АН СССР вводятся исследования его первичной структуры и структурвоч$ун-лональных взаимоотношений. Данная работа является частью этих зледований.

-Объектом изучения являлись факторы элонгации ef-g из E.coll экстремально-термофильных бактерий T.thermophllua НВ8 и ТЛЪег-эМ1иэ VK. Основная цель работы заключалась в получении в срав-гельных аспектах общей картины структурно-функциональной орг'а-зации этих белков, а так же в выяснении структурных особеннос-1 термофильных ef-g, обуславливающих их высокую термостабиль-зть, устойчивость к протеазам и денатурирующим агентам.

При этом необходимо было решить следующие задачи: разрабо-гь простые препаративные методы выделения исследуемых термосных белков, которые обеспечивали бы химическую чистоту препа-гов при достаточно высоком выходе и сохранении биологической ■ивности. Подобрать условия ограниченного протеолиза термо-[ьных EP-G и выделить фрагменты ограниченного протеолиза. С

целью изучения роли отдельных аминокислотных остатков в общей т> пографии молекулы белка исследовать реакционную способность s: груш мезо- и термофильных ef-g ' различными сульфгидрильными ре. гентами.

_Но£чная_новизна_н_щактэтэская_зна5^ост Разработ

упрощённый метод выделения фактора элонгации ef-g из T.thermoph 1из, предусматривающий использования шшуноаффинной хроматограф Подобраны условия ограниченного трипсинолиза термофильных tef-g YKTEF-g. Для разделения фрагментов с Ыг 75 , 43 и 26 кДа удачн оказалось использование гель-фильтрации на колонке с ультрогел АоА-44.

Титрование сульфгидрильными реагентами устойчивых к дальне шему действию тршсина пептидов позволило локализовать sh-rpyn в Н-концевом участке ef-g (как tef-g, так и vktef-G). Единстве ный Oys-остаток располагается в iï-концевых фрагментах с Иг 75 и кДа. Исследование доступности сульфгидрильшх групп к модифвд рующим реагентам, а так шэ изучение реакционной способное тиольных остатков рассматриваемых мезо- и термофильных бежов их пептидов позволили сделать вывод, что молекула ЁР-о из терм фильных микроорганизмов обладает большей компактностью и бол тесным взаимодействием доменов в составе целой молекулы интервале 20-30°С по сравнению с ef-g из Е.соII.

_С^уктща_диссертадиил Диссертационная работа состоит из 2 частей: I) обзор литературы, 2) экспериментальная часть (матери лы и методы), 3) результаты и их обсуждение; работа завершает выводами и списком цитированной литературы (162 ссылки). Рабе иллюстрируют 26 рисунков и 2 таблицы. Общий объбм диссертация 104 страницы.

_Апро0ад1м_ра0оты_и_пз[бликадии£ Результаты диссертации дом давались на vu Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептид (Таллин, 1987) и V Всесоюзной конференции по методам получения анализа биохимических препаратов (Рига, 1987). По теме диссерт ции опубликовано 3 печатных работы и I находится в печати.

' II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. Некоторые j|^aKTepme_4^

Первоначально был выделен, очищен и исследован фактор эло: гации G из экстремально-термофильного микроорганизма Ther, 2

эгторЫ1иа HB8. Однако в процессе работ мы обнаружили, что по-заемая наш биомасса принадлежит - другому родственному штамму '"•emus thermophilic. Предварительно, штамм озаглавлен как Ther-з thermophilic VK. Сотрудниками группы препаративной биохимии лков и группы структур рибосом Института белка АН СССР, а, так японскими коллегами из Института технологии (Токио) установле-, что рассматриваемые штаммы T.thermoptillus близки по своим льтуральным, генетическим и физиолого-биохимическим свойствам, имеют ряд существенных отличительных особенностей. Например, ализ T.thermophllua НВ8 и T.thermopTillus VK микробиологическим стом (рост на богатой и бедной среде с различными концентрация: NaCl и при различных температурах 75° и 80°С) показал, что все льтуральные и физиологические характеристики термофильных штам-'В практически совпадают. По содержанию и составу полиаминов ■аммы T.thermophllua НВ8 и T.thermopxllua VK являются полными [алогами. На близкое родство штаммов 7herm.ua thermophtlua указы-мт и абсолютно идентичные условия выделения и очистки термо-¡льных Факторов элонгации G.

Однако установлено, что ДНК T.thermophllua VK отличается от Ж штамма Т.thermophilic НВ8 по содержанию G+C пар £1 Более )го, рассматривание штаммы имеют рэстрикционный набор эндонук-)аз с различной специфичностью.

Методом генетического анализа показано, что термофилу T.tTwr-jphllua НБ8 свойственна плазмид-ассощшрованная агрегация кле-ж. Штамм T.thermophllua НВ8 содержит.две критические плазмиды: ГТ8 6 ВДА) и pW8 47 ВДА). Видимая агрегация клеток штам-з Т.thermophilic НВ8 связана с наличием большой плазмиды pYY8. отеря этой плазмиды приводит к потере агрегации.

Штамму Т.thermophilic VK не характерна плазмид-ассоциирован-ая агрегация. Установлено, что термофил T.thermophllua VK вооб-е не содержит плазмид, ни рТТ8, ни prvs. По микробиологическим, энетичэским и физиологическим параметрам изучаемый микроорганизм лизок к штамму T.thermophllua ОТ (рГТ8~, pW8~) (производное от .thermophilic НЕ8), либо к лейцинауксотрофному штамму T.thermo-hllua BPL7 (рТТ8-, pW8~, Leu-) (lCR-1 91 мутагенетическое произ-одное BP3).

Поскольку данная работа является частью комплексных струк-урно-функциональных исследований фактора элонгации EP-G предс-

3

тавляет интерес в сравнительном аспекте изучить основные физике химические характеристики EF-G из Е.col i и двух штаммов Т.thermi рНИиз.

Глава 2. _Ещелеше_и_физико-х^гаесгае_свойства

Предложенная схема выделения факторов элонгации tef-g i vktef-g включает двухступенчатое скоростное центрифугирование две стадии хроматографии. Исходный клеточный экстракт был получе после разрушения клеток и центрифугирования гомогената при 3000С и 100000g (для отделения клеточных осколков, получения рибосомнъ _белков, факторов- инициации и терминации, рибосом и рибосомнъ РНК). Для первоначального грубого разделения использована ионнс обменная хроматография на ДЕАЕ-сефарозе CL-6B.

Белковые фракции использовались для дальнейшего фракционирс вая сульфатом аммония. Область насыщения белкового раствор (HH4)gS04 от 0-58% является источником для выделения ДКК-полиме разы III, ß-галоктозидазн, D-Ala-карбоксипептидазы, нуклеотидфос форилазы; область насыщения 58-70% - для выделения РНК-полимера зы, аа-тРНК-сштетаз, щелочной фосфотазы, неорганической пирофос фотазы, ДНК-метилазы, факторов элонгации ts, tu и g. Используемы приём дал возможность значительно обогатить смесь белков факторе элонгации ef-g и подавить неспецифическую сорбцию при последующе юймуноаЗфинной хроматографии с антителами против TEF-G (см.рис.1 Результаты электрофоретического анализа продуктов 2 этапа выде ления tep-g представлены на рис.2.

Благодаря высокоспецифической иммуноаффпшой хроматографи процесс выделения удалось упростить во времени по сравнению с описанными в литературе методами. Необходимо отметить, что несмотря на небольшую ёмкость сорбента (10-12 мг белка сорбируете: на 56 мг иммобилизованных igG) в одной операции удаётся достич] колоссальной очистки искомого биологически активного вещества причём, производительность процесса достаточно велика, вследстви< высокой скорости сорбции и десорбции белка и быстрой регенерацш колонки без значительной потери её бмности. Использование для де-

4

0.5ШаС1

1 .51гкснЗ

-Г"

40

60

80

иг

100 МЛ '

[0.1.

Иммуноаф5®нное выделение фактора элонгации ЕР-в из белковой фракции, полученной после хроматографии грубого экстракта клеток ТЬегтиэ ТЪетюрйПиз на ДЕАЕ-сефарозе СЬ-бВ. Колонка с апти-Е?-С-1еС, иммобилизованными на агарозе (2.5x8 см), уравновешена 25мМ трис-Н01,150Ш ПаС1,0.02^ Г,таЫ3,2мМ ЭДТА, рН 7.5. Стрелками обозначены моменты добавления в уравновешивающий буфер 0.5М N801 и 1.5М КСН5.

* 3 » Рис.2.

Результаты электрофоретшеского анализа в 1ШГ в присутствии бээ иммуноаффинного выделения ЕР-с. I,- смесь стандартных белков по - - убыванию молекулярных масс: фосфорилаза ь о Мг 97500¡сывороточный альбумин, 67000; оваль-* бумин, 43000; карбоангидраза, 30000; соевый .,.„.1 игибитор трипсина, 20100; а-лактальбумин,

I. .| 14140. 2.- белковая фракция, содержащая ЕР-й

нанесбнная на иммуноаффилную колонку (фракция 2); 3.- фактор элонгации ЕР-С, элкирован-ный с иммуноаффинной колонки (фракция 3); 4.' - Л * белковая фракция не связавшаяся с иммуноаффин ~~ - " ним сорбентом (фракция 4).

>рбции растворов со слабощелочными значениями рН позволяет >лучить ЕР-(3 с васокой ГТФ-связыващей и ГТФ-азной активностями, ютота выделенных термофильных ЕР-С, оцененная по данным юктрофореза в голиакриламидном геле в присутствии БДв и опреде-1ния и-концевых агяшокислот, составляет 98-100%.

Молекулярная масса ЕР-о из Т ЛЬегторПИиз НВ8, определённая помощью электрофореза в ПААГ в присутствии БОБ, а так же равно-

5

весным центрифугированием, равна 79 и 85 кДа, соответственно, 41 согласуется с литературными данными, где Mr 76756 Да. Установле но, что молекулярные массы EF-G из l.tbermophilua НВ8 и T.thermc hl lúa VK идентичны.

Таким образом, вышеизлоиенний метод комплексной переработа клеток 17тегтиз thermophilic даёт возможность кроме интересующе! нас белка выделить в индивидуальном состоянии около 30 друп белков.

Глава 3. _Ощаниче^ж^_^штический__rHfi20^H3_TEP-G_(VKTEF-Gi_H

вщелеше_его_фрагиэнтов^

Из литературных данных известно, что фактор элонгации G i T.thermophllus НВв обладает большим структурным и функциональнь сходством с EF-G из E.aolt, однако отличается от последнего бол] шей компактностью молекулы и повышенной устойчивостью денатурирующим агентам и действию трипсина. Ранее установленс что жр-с из T.thermophllus НВ8 практически не меняется в течеш начальных 10 мин инкубации с трипсином, а затем постепенз образуется полипептид с Мг 75 кДа, который сохраняет способное: натиьной молекулы образовывать тройственный комплекс с ГДФ и pi босомой. При выделении TEF-G обнаружено, что уже на первых этап; выделения и очистки в результате действия эндогенных протеаз клеточном экстракте образуется активный полипептид с Мг 75 kJ (аналогичную картину наблюдали и в случае VKTEF-G). Полученный ходе естественного протеолиза белок был выделен и охарактеризс ван; он оказался идентичен триптическому фрагменту с Мг 75 кДг который устойчив к дальнейшему трипсинолизу и постепенно деграда рует до мелких полипептидов при более жёстких условиях протеоли;

Высокая специфичность действия протеаз на молекулу TEF-(или yktef-g) и высокая устойчивость образующихся фрагментов дальнейшему действию ферментов, очевидно обусловлена их компак: ной структурой и вероятно, фрагмента в составе целой MOJieKyj бежа существуют как независимые структурные единицы -• домень Известно, что ep-g из E.coll имеет доменную организацию, прич? степень взаимодействия доменов в составе целой молекулы белка ве роятно невелика и С-концевой домен под воздействием протеаз леп отщепляется от основной цепи. С другой стороны, факт, что ef-g i

6

thermophilus HB8 и Ж.coli взаимозаменяемы в функциональных |акциях на гетерологичных рибосомах, позволяет предположить, что ia фактора элонгации имеют сходную как функциональную, так и груктурную организацию. При исследовании термофильного ef-g медом сканирующей микрокалориметрии обнаружено, что его полипеп-цдаая цепь имеет доменное строение аналогичное ef-g из E.coll йилимонов В.В., Кашаров H.A., неопубликованные данные). Поэтому 1ли подобраны такие условия протеолиза, при которых изучаемый )лок мог бы расщепиться на фрагменты, аналогичные получаемым при ротеолизе ef-g из E.coli. Оказалось, что при частичной дестаби-1зации пространственной структуры белка мочевиной (ЗМ) трипти-эский гидролиз приводит к ожидаемому результату.

'"> Оо«?

— 75 —43

—26

i 2 3 Ч Ь 6 7 s Э Ю H 12 13 Ис.З. Электрофоретический анализ в ЛААГ в присутствии SDS продуктов триптического гидролиза vktef-g и tef-g. 1,7,13 -смесь стандартных белков по убыванию молекулярных масс. Ход триптического гидролиза vktef-g и tef-g через 0(2,8), 10(3,9), 30(4,10), 60(5,11), 180(6,12) мин, соответственно. Цифры справа характеризуют молекулярные массы получаемых фрагментов (в килодальтонах), определяемых по Леммли.

На рис.3 показан ход триптического трипсинолиза tef-g и vktef-g в зависимости от времени. Приведённые здесь эксперименты ясно указывают на сходство конформаций исследуемых термофильных ef-g. Из кинетических данных трипсинолиза видно, что первоначальным актом является быстрое образование фрагмента с Мг 75 кДа, который далее распадается на два фрагмента с Мг 43 и 26 кДа, и эти фрагменты по своим молекулярным массам близки к Мг фрагментов Т3 и те ef-g из E.coll.

ÎD

7

Рис.4.

Хроматография смеси фрагмен полученной после триптическ гидролиза tep-g (vktep-g), : колонке с улирогелеи АсА-уравновешенной 20мМ K-Na-ф фатным буфером, содержащим KOI, 2-меркаптоэта:юла 0.02% BafJ , со скоростью 35 I пик - фрагмент с ыг 75 кД 2.пик - фрагмент с Ыг 43 кД 3 пик - фрагмент с глт 26 кД

90 110

Номер фракции

Рис.5. ЭлектрофоретическиЯ анализ в ПААГ продуктов хроматографи-ческого разделения фрагментов ограниченного трипсинолиза ТЕР-О (уктер-с). 1-3 - см.рис.4; 4 - смесь фрагментов ограниченного трипсинолиза тер-с (уктер-в).

Для разделения смеси фрагментов ограниченного тркпсинолиз наиболее удачным оказалось использование хроматографии на колонк с ультрогелеы АсА-44 (см.рис.4). При этом удалось разделить вс фрагмента с Мг 75, 43 и 26 кДа и выделить их в электрофоретическ: гомогенном виде (см.рис.5). Условия выделения всех трёх фрагмен тов идентичны для обоих термофильных EF-G.

Молекулярные массы полученных фрагментов определены методо( гель-электрофореза. Результаты аминокислотного анализа показывают, что сумма аминокислотных остатков фрагментов о Мг 43 и 2( кДа близка к суше аминокислотных остатков фрагмента с Мг 75 кДа, одныко сумма их молекулярных масс меньше молекулярной массы фрагмента с Мг 75 кДа. Возможно происходит отщепление неболыаогс участка полипептидной цепи между фрагментами, в отличие от факто-

элонгации G- из E.coli, где не происходит выщепления шько-нибудь значительных участков цепи, находящихся между ¡гментами.

Сходство n-концевых аминокислот термофильных ef-g и их трип-[вских фрагментов, а так же исследование н-концевых последова-ъностей tef-g и фрагментов с Ыг 75, 43 и 26 кДа позволило не ъко установить пути образования фрагментов, определённые с ющью кинетических данных, и располояять все фрагменты по поли-

TZ?-G (VKIEP-G)

нн -| I-соон

sh

У__

Ш -I | 1 _ | -соон

6-7кДа sh 75 кДа

нн,-1 | I I 1 ! -соон

6-7кДа 43 кДа 26 кДа

teua I. Расположение фрагментов ограниченного трипсинолиза к локализация SH-групп по полипептидной цепи фактора элонгации g из Thermua tnermophilus.

тгидаой цепи tef-g (или vktef-g) (см.схему i), но и предполо-гь абсолютную идентичность структур молекул tef-g и vkief-g. эгмент о Мг 43 кДа находится в н-концевой части молекулы tef-g, зкольку имеет ту se самую последовательность, что и фрагмент с 75 КДа -Gly-Ile-Tyr-Ser-Ala-Ala-Val-..., а фрагмент с Мг 26 а, шея N-концевую последовательность Gln-Phe-Lys-Val-Asp-Ala-lu-Pro-..., является С-концевым участком молекулы tef-g и пред-эвляет собой С-концевой домен, аналогичный домену в молекуле -g из E.coli. При исследовании н-концевой аминокислотной после-зательности этого фрагмента обнаружено, что она гетерогенна. же основной последовательности, приведенной выше, определяется с же последовательность -Val-Asp-Ala-..., т.е. при гидролизе »исходит расщепление как связи -X-Gln-..., так и связи -Lys-

I-____ Это говорит в пользу того, что между фрагментами проис-

DiT выщепление участка, цепи в отличие от ef-G из E.colt, у косого расщепление цепи при трипсинолизе происходит строго специ-шо по единственной связи в этом участке далипептидной' цепи.

9

Глава 4. _PeaM®2!ffi§5Jí52co6HOCTb_CE^__факто

Общими свойствами термофильных белков являются высокая терм стабильность, устойчивость к протеиназам и денатурирующим are там, низкое содержание Oys-остатков. Предполагают, что уменьшен количества сульфгидрильных групп в термофильных белках обусловл но высокой реакционной способностью SH-груш при повышенных те пературах.

Свойства и функции цистеиновых остатков в полипептидной ц пи фактора элонгации G из E.colt были ранее исследованы при ти ровании [14с]р-хлормеркурибензоатом (р-СМВ), и-этилмалеимид (НЕМ), 5,5 -дитиобис(2-нитробензойной) кислотой (гаив) на акти ность фактора. EP-G содержит три тиольные группы на моль белк одна из которых экспонирована в N-концевом участке молекулы реактивна в нативных условиях. Две другие группы не реактивны титруются только при полной дэнатуоации белка.

Известно, что фактор элонгации G из экстремальных термофил ТЛЬегторЫХхш UB8, (ТЕР-су, так же содержит экспонированн сульфгидрильную группу. Аналогично с EF-G модифицированная s груша приводит к ингибированию взаимодействия белка с рибосомо Однако скорость модификации этой тиольной группы по отношению различным сульфгидрильным реагентам в обоих белках сильно разл чаются. Было показано, что N-этилмалеимид не модифицирует (в от чие от EP-G из E.coli) термофильный фактор при 30°С, но модифиц рует при 60°С с ингибированием образования тройственного компле са TEF-GxRsxGTP и ГГФ-азной реакции.

Из литературных данных известны результаты аминокислотно анализа EF-G из Т.thermophilics НВ8, согласно которым молеку TEF-G содержит один остаток Oys. Кроме того, авторами показан< что в 8М гуанидингидрохлориде (GuHCi) в термофильном EF-G с п< мощью [1-4о]р-СМВ титруется только одна тиольная. группа, а пос. окисления ещё около двух. На этом основании сделан вывод о нал] чии в белке одной дисульфидной связи. Мы модифицировали р-СМВ различных денатурирующих условиях <etó гуанидингидрохлориде, ¡ мочевине, 0,2% 5DS) EF-G и TEP-G, а так же после обработки i

10

Рис.6.

Кривые спектрофотометрического титрования ЕР-сз и его трипти-ческого фрагмента с ыг 75 кДа в нативных "условиях с помощью р-СМВ: 1 - ЕРНЗ (-); 2 - ТЕР-0 (Д); 3 - УКТЕР-О (А); 4 - 75кДа ТЕР-Й (о); 5-75 кДа УКТЕР-Я (в).

Условия: 50мМ к-фосфат, рН 7,2.

Рис.7.

Результаты спектрофотометрического титрования факторов элонгации EP-G из E.coll, термофильных TEF-G, VKTEF-G и их триптических фрагментов с Мг 75 кДа с помощью р-СМВ в денатурирующих условиях (6М GuHCl):1 -EP-G (-); 2 -TEP-G (Д); 3 - VKTEF-G (Ä); 4-75 кДа TEF-G (о); 5 -75 кДа VKTEF-G (в).

Условия: 50 мМ K-фосфат, pH 7.2.

¡личными восстанавливающими или окисляющими реагентами: 2-мер-ггоэтанол, сульфитом натрия-и дитионитом натрия. Hai,га было уста злено, что после восстановления или окисления белков различными агентами количество модифицируемых игольных групп не увеличи-зтся. Это свидетельствует с одной стороны об отсутствии в моле-яе фактора элонгации дисульфидной связи, но с другой стороны, о 5х БН-группах на моль белка.

Однако многочисленные подтверждения минимального количества эльных групп в белках термофильных бактерий, и прежде всего \bermopillva НВ8, достоверные факты о избыточном титровании SH-гпп при работе с р-меркурибензоатами, а так же наличии одного з-остатка в недавно опубликованной первичной структуре фактора энгации G из Г.thermophllua BBS привели нас к необходимости зтановни повторных экспериментов но химической модификации яьфгидрильными реагентами термофильных и мезофильных EF-G (штам з Т. thermophilic НВ8, T.thermophllu3 УК и E.coll).

II

HgBsOH (nMol) nSH

То 30 50 (мин)

BgBzOH „„-

10 30 50(мин)

Рис.8 Кинетика модификации факторов элонгации а в нативных уы виях с помощью неив. 1 - ерчз (-); 2 - тер-я (д); 3 - уктбш (о). Условия: 20мМ трис-НО!, рН 8.0-8.1, 1мМ Иа ЭДТА.

Рис.9 Результаты спектрофотометрического титрования факторе элонгации с в денатурирующих условиях (бм СиНС1) с помощь итив: 1 - ЕР-С (-); 2 - ТЕР-в (Д); 3 - ТСГЕР-С (•). Условия: 20мМ трис-нс1, рН 8.0-8.1, 1мМ №а2ЭДТА.

Факторы элонгации EP-G из E.coli, TKF-G из T.thermopfill НВ8 и VKTEF-G из T.ttiermophllua VK содержат по одной модифициру мой с помощью р-СМВ тиольной группе. Данная SH-rpyima являет высокореакционноспособной (для всех факторов модификация заве шается за 1-1,5 мин) (см.рис.6, кривые 1-3). Следует подчеркнут что термофильные факторы элонгации в тех же самых условиях вооб не модифицируются иодацетамидом, иодацетатом, Ы-этилмалеимидо дитиодипирддином и DTNB (см.рис.8, кривые 2-3).

При дестабилизации tef-g и vktef-g 6М guhci (или 8М мочев ной) с помощью р-СМВ как в одном, так и в другом факторе g ти руется.по одной тиольной группе на моль белка, что позволяет сд дать вывод о наличии в обоих термофильных факторах ef-g одн вн-группы.

В присутствии 6М GuHCl (или 8М мочевины) в EF-G из Я.со р-СМВ модифицирует три сульфгидрильные группы (см.рис.7, крив I). Аналогичные данные получены при модификации фактора G E.coli DTNB а присутствии различных денатурирующих агентов (с

12

.9, кривая I). Результаты спектрофотометрического титрования -g и VKTEF-g в 6М guhci (или 8М мочевине) бтыв показали, что В не модифицирует термофильные факторы ни в нативных (см.рис. кривые 2-3), ни в денатурирующих условиях (см.рис.3, кривые 2-Предполагается, что единственный остаток Cys EF-g из T.ther-ЧИиэ НВ8 и Г.thermophilua VК частично экронирован, ввиду ком-гности термофильных молекул, и поэтому остаётся недоступен к ищи с DTNB.

Иначе протекает процесс модификации тиольных групп во фраг-гах tef-g и yktep-G с Мг 75 кДа. Из литературных данных извес-, что фрагмент tef-g с Мг 75 кДа образуется в результате отщеп т 10-15 аминокислотных остатков от N-конца полипептидной це-ГЕР-G. Этот полипептид обладает способностью G-фактора к несо-к5нной ГТФ-азной реакции и к стимуляции синтеза полифенилала-а на рибосомах с poli(и) в качестве матрицы, по-видимому, эдствие сохранения необходимой конформации .для функционирова-. Об этом свидетельствует сходство кривых титрования tef-g, 5f-G и их тржптических фрагментов с Мг 75 кДа с помощью р-СМВ .рис.6,7).

Аналогично целым молекулам термофильных факторов ef-g в на-шх условиях dtnb не модифицирует триптический фрагмент с Мг {Да tef-g (см.рис.10,кривая I).

Существуют определённые различия в титровании dtnb как в на-шх, так и в денатурирующих условиях фрагмента с мг 75 кДа из wrmophilua УК и его аналога из Т.thermophilua НВ8 (см.рис.10, зые 2,4). Если при модификации dthb фрагмента tef-g с Мг 75 в нативном состоянии титруется только 0.3 БН-группы на моль гида (см.рис.10, кривая I), то у фрагмента аналога yktef-g при же условиях 0.6 SH-группы на моль фрагмента (см.рис.10, кри-2). При дестабилизации структуры Ж гуанидингидрохлоридом i 8М мочевиной) фрагмента с Мг 75 кДа из T.tTiermophilua IIB8 за ган модифицируется 0.2-0.3 SH-группы на моль белка (см.рис.Ю, зая 3), тогда как в случае фрагмента с Мг 75 кДа из T.thermop-13 VK модификация заканчивается через 2 часа, при этом титрует 3.8-1.0 SH-группы на моль фрагмента (см.рис.Ю, кривая 4). По-энныэ данные позволяют предположить, что ef-g из T.thermophl-НВ8 обладает более компактной структурой балка, чем его ана-из Т.thermophilua УК.

13

6.25

Рис. 10.

Кривые спектрофотометрическог титрования триптического фраг менга с посощью DTNB в натив ных и денатурирующих условиях (6М GuHCl): 1 - 75 кДа TEF-G (Д); 2 - 75 КДа VKTEF-G (о); 3-75 КДа TEF-G в 6М GuHCl (А); 4 - 75 кДа VKTEF-G в 6М GuHOl (•).

Условия: 20 мМ трис-HCi, pH 876-8.1, 1 мМ Na-ЭДТА.

30 во

Рис.11. Рис.12.

CIHqBzOmnMol)_ nSH" DTNB inMol)_

' 1,5

Рис.11. Кинетика модификации триптического фрагмента с Мг 43 к) ТЕР-в и уктер-о с помощью р-смв в нативных и денатурируют (6МСиН01) условиях: 1 - 43кДа ТЕР-й (А); 2 - 43 кДа УКТЕР-(о); 3 - 43кДа ТЕР-в (6М СиНС1) (А); 4 - 43 кДа УКТЕР-в (6 вШС!) (•). Условия^ 50 мМ к-фосфат, рН 7,2.

Рис.12. Кривые спектрофотометрического титрования триптическогс фрагмента фактора элонгации g с Мг 43 кДа в нативных и денатурирующих условиях (6М GuHCl) с помощью DTNB: 1 - 43кДе tef-G (А); 2- 43кДа vktef-g (о); 3 - 43кДа tef-g (6М GuHC] (Л); 4 - 43 кДа vktef-g (6м guhgi) (•). Условия: 20мМ трис HCl, pH 8.0-8.1, ImM Na ЭДТА.

При титровании р-СМВ триптических фрагментов ТЕР-С и ТОТЕ] с Мг 43 кДа (см.рис.II) обнаружилось, что единственный суи^с ток термофильных факторов элонгации а находится на этих фрагмг тах. Это позволило определить положение вн-группы в полиготщо 14

и исследуемых белков (см.схему I). Кривые титровашя фрагмен--аналогов с- помощью р-СМВ идентичны (см.рис.II).

Результаты модификации триптических фрагментов с Мг 43 кДа

их термофильных факторов как в нативном, так и в денатуриро-

ном состоянии сходны с титрованием с помощью DTNB целых факто-

элонгации G (TEF-G и VKTEF-G) и их фрагментов с Мг 75 кДа (см

. 6,7,10,12). Недоступность SH-групп во фрагментах с мг 43 кДа

)еакции с нгыв можно объяснить особенностями организации целых

:екул EP-G. Как уже отмечалось выше, для фактора элонгации G из

olí было показано, что аналогичные триптические фрагменты по

ным КД и микрокалориметрии, сохраняют компактную структуру

дную со структурой в составе целой молекулы и существуют в ви-независи?шх структурных единиц или доменов. Сходные данные по-

шны и для EP-G из Г.thermophllua ЯВ8 (Кавшаров И.А., Филимонов

3., Веньяминов С.Ю.).

Исследование кинетики модификации фрагмента с Мр 43 кДа из thermophllua 7К и его аналога из Т.thermophllua НВ8 (см.рис.12) юмощыо DTNB, подтверждают ранее сделанный вывод о меньшей ком-íthocth молекулы yktef-g по сравнению с tef-g.

ВЫВОДЫ

1. Разработан комплексный метод выделения и очистки факторов шгации G из Т.thermophllua HB и T.thermophllus VK, который эспечивает химическую чистоту препарата при достаточно высоком коде и сохранении биологической активности. Предложенная схема целения может быть использована для получения в индивидуальном зтоянии ряда важных в биологическом отношении белков.

2. Подобраны условия ограниченного протеолиза термофильных ?-G и YKTEF-G. Для разделения фрагментов удачным оказалось гользование гель-фильтрации на колонке с ультрогелем АсА-44.

3. Исследование мезо- и термофильных факторов элонгации G с лощыо методов химической модификации позволило установить сум-рное количество SH-групп и локализовать их положение в полипеп-прой ц&пи рассматриваемых белков. Единственный Cys-остаток тер-рильных EF-G располагается в N-концевых триптических фрагментах Sir 75 и 43 кДа.

4. Изучение доступности сульфгидрильных груш к модифицирую-u реагентам, а так же исследование реакционной способности эльных остатков EF-0, TEF-G и VKTEF-G и их пептидов показало.

что молекулы EF-G из термофильных микроорганизмов обладают боль шей компактостыо и более тесным взаимодействием доменов в состг целой молекулы в интервале 20-30°С по сравнению с EF-G из E.coí

1. Кашпаров И.А., Климова И.А., Алахов Ю.Б. Выделение физико-химическая характеристика фактора элонгации G из Therm thermophtlus. - vil Всесоюзный симпозиум по химии белков и пепт дов, 19-23 октября 1987 г., Б1-12, Таллин.

2. Кашпаров И.А., Климова И.А., Шинке Ю.А., Шинке A.B. В деление компонентов аппарата трансляции у экстремально-термофил ных бактерий Th.thermophllua. - V Всесоюзная конференция "Мэт да получения и анализа биохимических реактивов", 26-28 октяб 1987г., A-I6, Юрмала.

3. Кашпаров И.А., Климова И.А., Алахов Ю.Б. Некоторые ф зико-химические свойства фактора элонгации EF-G из зкстремальн термофильных бактерий ТЛЬвгшорЫХиз HBS. - Биоорган, хими 1989, т.15, Jé 3, с.293-303.

4. Климова И.А., Алахов Ю.Б. Реакционная способность сулы гидрильных"групп в факторах элонгации мезо- и термофильных ми роорганизмов. - Биоорган, химия, 1990, в печати.

23.01.92 г. Зак. 3897Р Тир.125 экз. Уч.-изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН