Анализ структурно-функциональных особенностей РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus Aquaticus

Миропольская, Наталия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ структурно-функциональных особенностей РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus Aquaticus
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ структурно-функциональных особенностей РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus Aquaticus"

На правах рукописи

МИРОПОЛЬСКАЯ НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ THERMUS AQUA TICUS

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

□ОЗ493272

003493272

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (Москва).

Научный руководитель:

доктор биологических наук ИМГРАН

А.В. Кульбачияский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика»

В.В. Носиков

кандидат химических наук ИМБРАН

М.В. Козлов

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится 16 марта 2010 г. в 14:00 на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545 Россия, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан « » февраля 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Воюшина Т.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Транскрипция - один из ключевых процессов, лежащих в основе экспрессии генетического материала. Транскрипция в клетках всех организмов осуществляется многосубъединичными РНК-полимеразами (РНКП). Основные механизмы транскрипции и общая структура РНКП высоко консервативны в эволюции. Бактериальная РНКП, имеющая наиболее простое строение, является удобной моделью для изучения фундаментальных механизмов транскрипции и ее регуляции. РНКП способна синтезировать РНК длиной до нескольких десятков тысяч нуклеотидов с очень высокой точностью и процессивностью, что обеспечивается сложными структурными перестройками фермента в процессе транскрипции. Активность РНКП на разных стадиях транскрипции регулируется самыми разнообразными факторами: белками, некодирующими РНК, низкомолекулярными соединениями и метаболитами, антибиотиками. Большинство регуляторов транскрипции действуют либо на стадии инициации транскрипции, влияя на взаимодействие РНКП с промоторами, либо непосредственно на каталитическую активность РНКП. Расшифровка детальных механизмов различных стадий транскрипции, в том числе, анализ взаимодействий РНКП с промоторами, регуляторными сигналами в ДНК и РНК, транскрипционными факторами, а также изучение механизмов катализа в активном центре РНКП, является одной из важных проблем современной молекулярной биологии и необходима для понимания основных механизмов регуляции генной экспрессии.

Транскрипция включает три основные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Инициация происходит в специфических участках ДНК -промоторах, и является одной из основных мишеней генетической регуляции. В процессе инициации РНКП узнает промотор и плавит промоторную ДНК в точке инициации, после чего инициирует синтез РНК de novo, без использования затравки. У бактерий все стадии инициации осуществляются холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента (субъединичный состав алрр'со) и фактора инициации - а-субъединицы, которая диссоциирует при переходе к элонгации. Элонгация и терминация транскрипции осуществляются кор-ферментом РНКП. Сигма-субъединица играет основную роль в узнавании промоторов и плавлении ДНК в районе стартовой точки транскрипции, а также непосредственно участвует в инициации синтеза РНК и уходе РНКП с промотора. Имеются данные, указывающие на то, что кор-фермент РНКП также может участвовать в специфическом узнавании промоторов, но детально его роль в этом процессе не исследовалась.

Понимание молекулярных механизмов катализа РНКП стало возможным в последние годы в связи с успехами в расшифровке трехмерной структуры РНКП термофильных бактерий (Thermus aquaticus и Thermus thermophilus) и РНКП II Saccharomyces cerevisiae, а также структуры элонгационных комплексов этих РНКП в различных состояниях. Активный центр РНКП имеет очень консервативную структуру и содержит два иона магния, координирующие реакционные группы, а также дополнительные структурные элементы, обеспечивающие связывание и правильную ориентацию субстратов реакции. На основе полученных данных была предложена модель присоединения нуклеотидов в

активном центре РНКП, которая позволяет предположить возможную роль различных структурных элементов в катализе и может служить основой для детального структурно-функционального анализа активного центра РНКП.

Следует подчеркнуть, что до настоящего времени подавляющее большинство исследований механизмов инициации транскрипции и каталитических механизмов РНКП были проведены на примере РНКП мезофильной бактерии Escherichia coli. В то же время, было обнаружено, что РНКП других бактерий, в частности термофильных бактерий Т. aquaticus и Т. thermophilus, могут проявлять значительные отличия в механизмах узнавания промоторов, инициации транскрипции и в каталитических свойствах (Xue et al., 2000; Minakhin et al., 2001; Kulbachinskiy et al., 2004). РНКП термофильных бактерий являются исключительно интересной моделью для изучения различных стадий транскрипции, поскольку, при сохранении консервативного механизма транскрипции, они обладают особенностями, связанными с адаптацией к высоким температурам. РНКП термофильных бактерий имеют более «жесткую» структуру и сниженную конформационную подвижность, что обеспечивает их термостабильность. Сравнение транскрипционных свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий дает уникальную возможность для поиска функционально-важных участков РНКП, задействованных в узнавании промоторов и в катализе и обеспечивающих адаптивные различия между различными группами бактерий. РНКП Т. aquaticus является наиболее интересной модельной РНКП, так как для этой РНКП известна трехмерная структура высокого разрешения.

Кроме несомненной фундаментальной ценности, исследование детального механизма инициации транскрипции и механизмов катализа в активном центре РНКП имеет также большое практическое значение. В частности, анализ механизма транскрипции прокариот необходим для разработки новых методов регуляции активности бактериальной РНКП, которые могут найти широкое применение в биотехнологии, и для получения новых ингибиторов РНКП, которые могут иметь большое значение для медицины.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлся анализ особенностей узнавания промоторов и катализа РНКП термофильной бактерии Т. aquaticus по сравнению с РНКП мезофильных бактерий Е. coli и Deinococcus radiodurans. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить механизм узнавания нового промоторного элемента GGGA РНКП Т. aquaticus. Сравнить роль этого элемента в инициации транскрипции РНКП Т. aquaticus и Е. coli.

2. Сравнить каталитические свойства РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans и охарактеризовать структурные элементы активного центра РНКП, участвующие в катализе и обеспечивающие функциональные различия между этими РНКП.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе получены новые данные об особенностях транскрипции РНКП термофильных бактерий. Показано, что РНКП Т. aquaticus обладает уникальными отличиями от РНКП мезофильных бактерий Е. coli и D. radiodurans, которые проявляются на стадиях инициации и элонгации транскрипции и связаны с температурной адаптацией.

Детально охарактеризован новый промоторный элемент СвОА, играющий важную роль в узнавании промоторов РНКП Т. адиайст\ установлено, что ОввЛ присутствует в природных промоторах Т. ациаНсш. Показано, что вССА стабилизирует открытые промоторные комплексы РНКП, но не влияет на формирование закрытых промоторных комплексов. Показано, что промоторы, содержащие СССА, по-разному узнаются РНКП Т. адиайсиз и Е. соИ, причем эти различия в значителньной мере определяются свойствами кор-фермента РНКП.

Впервые проведено детальное сравнение каталитических свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий на примере сравнения РНКП родственных бактерий Т. ациайсиз и И. гаШос!игат. Показано, что РНКП Т. адиаИст характеризуется резко сниженной скоростью катализа при умеренных и низких температурах. Выявлены структурные элементы РНКП, отвечающие за эти различия и задействованные в катализе. В частности, охарактеризован новый элемент активного центра РНКП - Б-петля, - который аллостерически участвует в реакции присоединения нуклеотида к З'-концу РНК в активном центре РНКП.

Полученные в работе данные существенно расширяют имеющиеся представления о молекулярных механизмах транскрипции. Результаты работы могут также иметь важное практическое значение и найти применение в прикладных исследованиях. В частности, результаты работы могут быть использованы для разработки новых высокоэффективных промоторов и систем белковой экспрессии, получения различных вариантов РНКП с заданными каталитическими свойствами, а также для поиска новых ингибиторов РНКП.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009), 1-м Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008), XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Летней исследовательской конференции Федерации Американских обществ экспериментальной биологии (РАЗЕВ, Вермонт, 2007), Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), 9-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 -статьи в рецензируемых научных изданиях, 8 - материалы международных и всероссийских конференций и симпозиумов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит 44 рисунка и 8 таблиц. Библиография включает 242 названия.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Особенности инициации транскрипции РНКП T. aquaticus

Инициация транскрипции в клетках бактерий осуществляется холоферментом РНКП, который является комплексом кор-фермента и О-субъединицы. 0-субъединица играет главную роль в узнавании последовательностей промоторов. В клетках бактерий обычно присутствует несколько о-субъединиц, ответственных за транскрипцию разных групп генов. Большинство промоторов узнается при участии главной о-субъединицы (которая называется с у Е. coli и о* у большинства других бактерий). В составе о-субъединицы выделяют четыре консервативных района, каждый из которых разделяется на несколько подрайонов. Основные исследования механизмов инициации транскрипции были проведены на примере РНКП Е. coli.

Промоторы Е. coli содержат несколько консервативных элементов, необходимых для их узнавания. Наиболее изученными являются -10 и -35 элементы (консенсусная последовательность ТАТААТ и TTGACA, соответственно), которые расположены на расстоянии 10 и 35 нуклеотидов левее старта транскрипции. Эти элементы узнаются районами 2.4 и 4.2 о-субъединицы, соответственно (Рис. 1). Некоторые промоторы могут содержать дополнительные элементы: динуклеотид TG, который располагается на один нуклеотид левее -10 элемента, и А/Т-богатый UP-элемент, расположенный на расстоянии 50-70 нт левее стартовой точки транскрипции. TG элемент узнается районами 2.4 и 2.5 о-субъединицы, а UP-элемент - С-концевыми доменами а-субъединиц РНКП (aCTD). Роль остальных участков ДНК в промоторной области в узнавании промоторов остается мало изученной. При инициации транскрипции РНКП сначала связывается с промотором в двунитевом состоянии, в результате образуется закрытый промоторный комплекс. После этого происходит плавление ДНК, что приводит к формированию открытого промоторного комплекса. Как было установлено, в плавлении промоторов главную роль играют контакты района 2 о-субъединицы с -10 элементом промотора (Gross et al., 1998).

Охарактеризованные на сегодняшний день промоторы других бактерий имеют сходную структуру и содержат похожие консервативные элементы. В то же время, РНКП некоторых бактерий отличаются по специфичности узнавания промоторов и свойствам промоторных комплексов от РНКП Е. coli. В частности, РНКП термофильной бактерии T. aquaticus осуществляет инициацию транскрипции при значительно более высокой температуре и образует гораздо менее стабильные комплексы на всех изученных промоторах (Minakhin et al., 2001; Kulbachinskiy et al., 2004; KuznedeJov et al., 2006). Причины этих различий и лежащие в их основе молекулярные механизмы до последнего времени оставались неизвестны.

Ранее в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов (ЛМГМ) ИМГ РАН для анализа механизмов узнавания промоторной ДНК РНКП T. aquaticus был проведен поиск последовательностей оцДНК (аптамеров), способных взаимодействовать с оА-субъединицей РНКП T. aquaticus. Полученные в результате аптамеры к Од-субъединице T. aquaticus были названы sTap (sigma T. aquaticus agtamer). Анализ аптамеров показал, что в них содержится консервативная последовательность TG(C/T)ATAATGGGA. которая специфически узнается оА-субъединицей. Эта последовательность включает в себя -10 элемент промотора (подчеркнут), TG-элемент, а также дополнительный элемент GGGA. При помощи

-35

Рис. 1. Модель промоторного комплекса

(Murakami et al., 2002). Предполагаемое расположение ДНК показано на структуре РНКП Т. aquaiicus. ДНК показана оранжевым; обозначены -10, TG, -35, GGGA и UP-элементы. Ион Mg* в активном центре обозначен сферой сиреневого цвета. ДНК-узнающие районы а-субъединицы показаны в цвете: район 4.2 - зеленый, районы 2.3 и 2.4 - красные, район 1.2 - синий, а-, р- и р'-субъединицы кор-фермента показаны светло-голубым, светло-зеленым и светло-розовым, соответственно. С-концевые домены а-субъединиц (aCTD), контактирующие с UP-элементом, схематично изображены овалами розового цвета

методов ДНК-белковых сшивок было установлено, что GGGA в составе аптамеров узнается районом 1.2 сг^-субъединицы. Это согласуется с моделью открытого промоторного комплекса, на которой участок ДНК, соответствующий GGGA-элементу, сближен с районом 1.2 G-субъединицы (Рис. 1).

Задачей первой части данной работы было исследование функциональной роли GGGA-элемента в узнавании природных и синтетических промоторов РНКП T. aquaticus (в сравнении с РНКП Е. coli) и анализ особенностей инициации транскрипции РНКП Т. aquaticus на промоторах, содержащих и не содержащих GGGA-элемент.

1.1. Функции промоторного элемента GGGA в узнавании природных промоторов Т. aquaticus и T. thermophilus

Для изучения возможной роли GGGA-элемента в узнавании промоторов РНКП Т. aquaticus мы провели анализ опубликованных последовательностей промоторов Т. aquaticus и промоторов близкородственной бактерии Т. thermophilus. Было обнаружено, что некоторые из промоторов содержат GGGA-подобные мотивы справа от -10 элемента (Рис. 2).

Для проверки роли элемента GGGA в узнавании природных промоторов, мы исследовали один из таких промоторов - промотор гена dnaK, - который содержит GGGA-элемент наряду с -10 и -35 элементами (Рис. 2, А). На основе этого промотора были получены его мутантные варианты с заменами -35 элемента (на последовательность GGTCAC), GGGA-элемента (на последовательность TACT) и с заменой обоих элементов. Было показано, что удаление -35 элемента (Рис. 2, Б, дор.З) приводит к заметному снижению, а удаление GGGA-элемента (Рис.2, Б, дор.2) - почти к полному исчезновению активности РНКГ1 T. aquaticus на этом промоторе. Одновременная замена обоих элементов полностью инактивирует промотор (Рис. 2, Б, дор. 4). Таким образом, GGGA-мотив в промоторе dnaK специфически узнается РНКП T. aquaticus и способен обеспечивать инициацию транскрипции данной РНКП в отсутствие -35 элемента. РНКП Е. coli обладает

AdnaK trpñB

S20

P35, rpsO

P31

dnaA

trpE

P211

pyr

P39

P21S

T7A1

sTap2

РНКП Taq Eco

dnaK < < H О >r, Ü £ g 4 7 g < > < •S-, «3 о T'O G

РНКП Taq Fco

T7 A1 Ï- -o Z * с t. j - * >

12 3 4 5 6 7 8

Рис. 2. Роль GGGA в узнавании промоторов РНКП T. aquaticus. (А) Последовательности промоторов Т. themophilus и Т. aquaticus, содержащих GGGA-подобные мотивы (Koyama and Furukawa, 1990; Leontiadou et al., 2001; Maseda and Hoshino, 1995; Nardmann and Messer, 2000; Osipiuk and Joachimiak, 1997; Sato et al., 1988; Serganov et al., 1997; Van de Casteele et al., 1997), a также последовательности промоторов Т7А1 и sTap2. -35, -10 и GGGA-элементы показаны зеленым, красным и голубым, соответственно. (Б) Активность РНКП T. aquaticus и Е. coli на c/na^-промоторе и его мутантных вариантах. Стрелкой показана полноразмерая РНК, синтезируемая на данных матрицах, (В) Транскрипция РНКП Т. aquaticus и Е. coli на мутантных вариантах Т7А1-промотора с заменами в участке, соответствующем GGGA-элементу. Стрелкой указано положение РНК-продукта CAU, который образуется в результате транскрипции с использованием в качестве субстратов динуклеотидной затравки СрА и UTP. Активность РНКП Т. aquaticus измеряли при 60 °С, активность РНКП Е. coli - при 37 °С.

заметно меньшей активностью на о^оА^-промоторе, чем РНКП Т. aquaticus. Замена GGGA не оказывает сильного влияния на эффективность транскрипции РНКП Е. coli, тогда как при замене -35 элемента, либо обоих элементов, активность пропадает (Рис. 2, Б, дор. 5-8).

Для того, чтобы выяснить, способен ли GGGA-элемент влиять на эффективность транскрипции РНКП Т. aquaticus на других природных промоторах, мы измерили активность данной РНКП на различных вариантах промотора Т7А1 Е. coli (сильный ранний промотор фага Т7, содержащий -10 и -35 элементы). Были исследованы Т7А1-промотор дикого типа, содержащий правее -10 элемента последовательность TACT, а также промоторы с заменой данного участка на GGGA или СССТ. GGGA-содержащий промотор узнавался РНКП T. aquaticus с заметно большей эффективностью, чем промотор дикого типа, а активность варианта, содержащего СССТ, была значительно снижена (Рис. 2, В). В то же время, РНКП Е. coli проявляла гораздо меньшие различия в узнавании всех трех вариантов Т7А1-промотора (Рис. 2, В). Таким образом, полученные результаты показывают, что GGGA-элемент играет важную роль в узнавании различных природных промоторов РНКП Т. aquaticus.

Tccd

cgagi aagîj

ctggI aaggj тсс a cccci

■aaaatgcgggatctgcgt-icgggaggcccctccgggg— ■ccttaggcgcagggtgtgc' igGGACGGGGAGGAGGGCC-

Íaaaatccccgcccccgtcc-■ctctagcgggtcccgggg: Bgggcccccgtgtcccgc— ftttcggacacccçtgtgc—■ ■gggacggggcagggggtg— Íggggac-gaggcaacgggg--■tcataaagîgcttgagg- ■

agtahib'raa-ü'gtctaacctatag—g

agctcagaataaacgctcaaggccacgtgBa|c|

ígcgaggtgaa (gttgtcttggc 'cctggtttgcc 'aaggcttggcg ¡gcaaggaggtt |ggaccgggacga ¡ccatggccctt gccgtgaacctg [ggtggccttîaa ¡gcgagagcggc ¡cctgggcgcaa :§tacagccatcgagag igcacctacgga

1.2. Узнавание промоторного элемента GGGA РНКП Е. coli

Анализ различных вариантов промоторов, содержащих и не содержащих GGGA-элемент, показал, что GGGA-элемент играет меньшую роль в узнавании промоторов РНКП Е. coli, чем в случае РНКП Т. aquaticus. В частности, GGGA-элемент не способен обеспечивать инициацию транскрипции РНКП Е. coli в отсутствие -35 элемента. Можно предположить, что эти различия объясняются различиями в специфичности узнавания GGGA-элемента а-субъединицами Е. coli и Т. aquaticus. Как было установлено ранее в ЛМГМ, GGGA узнается районом 1.2 аА-субъединицы Т. aquaticus. Для анализа специфичности узнавания GGGA-элемента районом 1.2 ст70-субъединицы Е. coli мы получили химерную ст-субъединицу (ое7), содержащую N-конец, включая район 1.2 (аминокислотные остатки 1-94), от G70-субъединицы Е. coli, а С-концевую часть - от стА-субъединицы Г. aquaticus. Мы проанализировали транскрипционные свойства стеГ-субъединицы на промоторе sTap2, созданном на основе последовательности аптамера к стА-субъединице Г. aquaticus. Этот промотор содержит -10 элемент и элемент GGGA, но не содержит -35 элемента (Рис 2, А). Было показано, что холофермент РНКП Г. aquaticus дикого типа обладает высоким уровнем активности на sTap2-np0M0T0pe. Холофермент, содержащий химерную оеГ-субъединицу, узнает зТар2-промотор с той же эффективностью, что и РНКП дикого типа (Рис. 3, А, дор. 1-2). Таким образом, район 1.2 ст70-субъединицы способен узнавать GGGA-элемент в составе промоторов.

В то же время, было обнаружено, что холофермент РНКП Е. coli, а также гибридные холоферменты, состоящие из кор-фермента Е. coli и оА-субъединицы Т. aquaticus, либо химерной сеГ-субъединицы, не способны узнавать вТар2-промотор, хотя и обладают активностью на контрольном промоторе Т7А1 (Рис. 3, А, дор. 5-8). Следовательно, неспособность РНКП Е. coli к инициации транскрипции на GGGA-содержащих промоторах (в частности, на промоторе sTap2) в отсутствие -35 элемента определяется свойствами кор-фермента РНКП, а не о70-субъединицы.

кор Taq Eco

ДНК sTap2 T7A1 sTap2 T7A1

CT Taq еТ Taq еТ Taq eT Taq eT

РНКП WT aTE

ДНК IM < 1 Я £ О CO « 9 + Ъ $ » iOn tÄ ü +

«tR2

RO»

1 2 3 4 5 6 7 8

12 3 4 5 6

Рис. 3. Узнавание GGGA-элемента РНКП Е. coli. (А) Активность РНКП Т. aquaticus и Е. coli, содержащих о*-субъединиду Т. aquaticus, либо 0 еТ, на промоторах sTap2 и Т7А1. На рисунке показано положение полноразмерной РНК, синтезируемой на sTap2 (RO, от англ. "run off'), и положение РНК, образующейся в результате терминации транскрипции на Й{2-терминаторе на матрице Т7А1 (tR2). (Б) Активность РНКП Т. aquaticus дикого типа (WT) и мозаичной РНКП с заменой aCTD (aTE) на различных вариантах промотора sTap2. Эксперименты проводились при температуре 60 "С.

Мы предположили, что межвидовые различия в узнавании GGGA-содержащих промоторов РНКП Е. coli и Т. aquaticus могут быть связаны с различиями в структуре CTD-районов а-субъединицы кор-фермента, которые способны принимать участие как в специфических, так и в неспецифических контактах с ДНК левее -35 области промоторов (см. Рис. 1). Для проверки роли aCTD в узнавании GGGA-содержащих промоторов РНКП Т. aquaticus мы исследовали химерный вариант РНКП Т. aquaticus, в которой aCTD были заменены на соответствующие районы Е. coli (РНКП аТЕ). Активность этой РНКП была исследована на промоторе sTap2, а также на его вариантах, в одном из которых GGGA-элемент был заменен на последовательность СССТ (sTap2-GGGA), а в другом присутствовал и GGGA, и -35 элемент (sTap2+35). Было обнаружено, что, в отличие от РНКП Т. aquaticus, РНКП аТЕ не способна к эффективной инициации транскрипции на вТар2-промоторе (Рис. 3, Б). В то же время, эта РНКП обладает активностью на sTap2+35-np0M0T0pe. Таким образом, замена aCTD нарушает узнавание GGGA-содержащих промоторов РНКП Т. aquaticus в отсутствие -35 элемента. Из этого можно сделать вывод, что неспецифические контакты aCTD с GGGA-сдеражщими промоторами вносят важный вклад в их узнавание РНКП Т. aquaticus и могут определять межвидовые различия в узнавании этих промоторов РНКП разных бактерий.

1.3. Роль GGGA-элемента в плавлении промоторов и стабилизации промоторных комплексов

Как было описано выше, GGGA-элемент играет важную роль в узнавании промоторов РНКП Т. aquaticus. Однако оставалось неизвестным, на какую стадию инициации транскрипции в наибольшей степени влияет GGGA-элемент: первоначальное узнавание промоторов, плавление ДНК или стабилизацию открытого промоторного комплекса.

Чтобы изучить роль GGGA-элемента в формировании открытых промоторных комлексов, мы провели анализ плавления различных вариантов промотора sTap2 РНКП Т. aquaticus методом футпринтинга перманганатом калия. Этот метод позволяет специфически модифицировать тиминовые нуклеотиды в составе однонитевой ДНК (с последующим расщеплением цепи ДНК), что позволяет детектировать плавление промотора. Было установлено, что наибольшая эффективность плавления наблюдается в случае промотора с дополнительно внесенным -35 элементом (sTap2+35). Это означает, что одновременное наличие -35 и GGGA-элемента способствует формированию открытого промоторного комплекса (Рис. 4, А, дор. 4). Плавление промоторов sTap2 дикого типа и варианта sTap2+35-GGGA (промотор без GGGA-элемента, но с -35 элементом) происходит с несколько меньшей эффективностью (Рис. 4, А, дор. 2 и 5). В отсутствие -35 и GGGA-элементов (sTap2-GGGA) открытые промоторные комплексы не образуются (Рис. 4, А, дор. 3). Следовательно, GGGA-элемент важен для плавления промоторной ДНК в ходе инициации транскрипции РНКП Т. aquaticus.

Чтобы проверить, насколько важен GGGA-элемент для формирования закрытого промоторного комплекса, т.е. первоначального связывания РНКП с промотором, мы провели эксперименты по замедлению в геле промоторных фрагментов sTap2 и sTap2-GGGA РНКП Т. aquaticus. Было показано, что оба промотора связываются с РНКП Т. aquaticus с одинаковой эффективностью (Рис.4,

Б ДНК sTap2 -GGGA

РНКП - + - +

ДНК М

Jm»

ШМтШ

12 3 4 5

12 3 4

Рис. 4. Эффект мутаций в sTap2 промоторе на формирование открытого и закрытого промоторных комплексов. (А) Футпринтинг перманганатом калия комплексов РНКП T.aguaticus с различными вариантами sTap2 промотора. Эксперимент проводился при 65°С. Дорожка 1 содежит маркерную ДНК, полученную в результате расщепления промотрного фрагмента по остаткам А и G. Позиции модифицированных тиминов показаны справа от рисунка. (Б) Формирование комплексов РНКП Т. aquaticus с промоторами sTap2 дикого типа и без GGGA-элемента ("-GGGA").

Б, дор. 2 и 4). Таким образом, удаление GGGA-элемента нарушает плавление ДНК и формирование открытого промоторного комплекса, но не влияет на связывание РНКП Т. aquaticus с промотором.

Помимо прочих факторов эффективность инициации транскрипции определяется тем, насколько стабильные промоторные комплексы формируются при узнавании промоторов. Ранее было показано, что стабильность промоторных комплексов РНКП зависит от последовательности промотора и определяется контактами РНКП с консервативными промоторными элементами (Gross et al., 1998; Haugen et al., 2008a; McClure, 1985). Вероятно, изменение стабильности промоторных комплексов в результате изменения последовательности промотора является одним из механизмов регуляции транскрипции на стадии инициации (Gourse et al., 1998; Gross et al., 1998).

Так как GGGA является еще одним элементом, специфически узнаваемым РНКП, можно предположить, что он также способен вносить вклад в стабилизацию связывания РНКП с промотором. Для выяснения возможной роли GGGA-элемента в стабилизации промоторных комплексов мы сравнили стабильность промоторных комплексов РНКП Т. aquaticus и Е. coli на двух вариантах промотора sTap2, содержащих -35 элемент, один из которых (sTap2+35) содержал GGGA, а в другом (sTap2+35-GGGA) GGGA был заменен на последовательность СССТ.

Ранее было показано, что РНКП Т. aquaticus образует на большинстве промоторов очень нестабильные комплексы (Kulbachinskiy et al., 2004), что делает невозможным прямое сравнение времени полужизни этих комплексов. В связи с этим, для оценки уровня стабильности промоторных комплексов РНКП Т. aquaticus мы исследовали ее активность в условиях разной ионной силы (40 мМ и 130 мМ КС1 в реакционном буфере). Было установлено, что в условиях низкой ионной силы РНКП Т. aquaticus обладает сравнимой активностью на промоторах sTap2+35 и sTap2+35-GGGA, а при повышенной концентрации солей оказывается способна к инициации транскрипции только на промоторе, содержащем GGGA (Рис. 5, А).

GGGA + —

КС1,мМ 40 130 40 130

GGGA + —

время

12 3 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 5. Роль GGGA-элемента в стабилизации промоторных комплексов РНКП. (А)

Активность РНКП Т. aquaticus на промоторах sTap2+35 и sTap2+35-GGGA в условиях различной ионной силы (40 мМ и 130 мМ KCl). (Б) Кинетика диссоциации промоторных комплексов РНКГТ Е. coli на промоторах sTap2+35 и sTap2+35-GGGA в присутствии гепарина (время инкубации от 20 секунд до 60 минут). Активность РНКП Е. coli и Т. aquaticus измеряли при 37 "С и 60 °С, соответственно.

Таким образом, удаление GGGA из промотора приводит к значительному уменьшению стабильности промоторных комплексов РНКП Т. aquaticus.

Для анализа влияния GGGA-элемента на стабильность промоторных комплексов РНКП Е. coli мы определяли уровень активности РНКП после инкубации промоторных комплексов в течение разного времени в присутствии гепарина - конкурентного ингибитора связывания ДНК (Cech and McClure, 1980). Было показано, что промоторные комплексы, содержащие промотор sTap2+35-GGGA, диссоциировали значительно быстрее (Рис. 5, Б, дор. В-14), чем комплексы, содержащие sTap2+35 (Рис. 5, Б, дор. 1-7) - замена GGGA на СССТ приводит к уменьшению времени полужизни комплексов примерно в 100 раз, с 60 минут до 40 секунд. Таким образом, GGGA-элемент способен значительно стабилизировать открытые промоторные комплексы как РНКП Т. aquaticus, так и РНКП Е. coli.

Функциональная роль GGGA-элемента в узнавании промоторов РНКП Е. coli подтверждается тем, что замены в участке, соответствующем GGGA, влияют на стабильность комплексов РНКП Е. coli с природными промоторами (Haugen et al., 2006). Кроме того, исследование функциональной роли участка дискриминатора, положение которого соответствует положению GGGA-элемента, показало, что он определяет низкую стабильность комплексов РНКП Е. coli с некоторыми промоторами (в частности, с промоторами рРНК) (Travers, 1980; Gourse et al., 1998). Вероятно, нестабильность промоторных комплексов в этом случае определяется неоптимальной последовательностью ДНК в области дискриминатора и отсутствием стабилизирующих контактов с районом 1.2 а-субъединицы РНКП (Haugen et al., 2006; Haugen et al., 2008b).

В целом, проведенные нами эксперименты позволили установить, что GGGA-элемент играет важную роль в инициации транскрипции РНКП разных бактерий, вероятно, за счет усиления контактов РНКП с промотором. В процессе инициации транскрипции GGGA-элемент стимулирует плавление промоторной ДНК холоферментом РНКП, а также стабилизирует уже сформировавшиеся открытые промоторные комплексы. В случае РНКП Т. aquaticus стабилизирующие контакты с GGGA могут иметь особенно важное значение в инициации транскрипции, так как для этой РНКП в целом характерна низкая стабильность промоторных комплексов. Вероятно, именно этим объясняется то, что GGGA-элемент представлен в промоторах Т. aquaticus в большей степени, чем в промоторах Е. coli.

2. Анализ особенностей катализа в активном центре РНКП T. aquaticus

2.1 Различия в скорости синтеза РНК у РНКП мезофильных и

термофильных бактерий

Исследования РНКП из разных бактерий показали, что РНКП термофильных бактерий являются более термостабильными по сравнению с гомологичными ферментами мезофильных бактерий и обладают сниженной активностью при умеренных и низких температурах (Meier et al., 1995; Nikiforov, 1971; Xue et al., 2000). Это, вероятно, является следствием снижением структурной подвижности активного центра ферментов термофилов, что необходимо для повышения их термостабильности (Fields, 2001; Golding and Dean, 1998; Vieille and Zeikus, 2001). Различия в каталитических свойствах РНКП термофильных и мезофильных бактерий делают возможным поиск функционально-важных элементов РНКП, задействованных в катализе и определяющих функциональные различия между разными РНКП.

До настоящего времени не проводилось детальных исследований, направленных на сравнение каталитических свойств РНКП родственных термофильных и мезофильных бактерий. При проведении подобных исследований желательно сравнивать ферменты из бактерий, которые близки филогенетически, так как в данном случае различия свойств РНКП будут связаны именно с температурной адаптацией. В данной работе в качестве модели для анализа адаптивных различий между бактериальными РНКП были использованы РНКП термофильной бактерии T. aquaticus и мезофильной бактерии Deinococcus radiodurans, которая является наиболее близкой к Т. aquaticus из известных мезофильных бактерий.

Сравнительный анализ транскрипционных свойств РНКП Е. coli, D. radiodurans и Т. aquaticus, проведенный ранее, показал, что РНКП мезофильных бактерий действительно проявляют большую скорость элонгации транскрипции, чем РНКП Т. aquaticus, причем эти различия становятся особенно заметны при низких температурах (Kulbachinskiy et al., 2004). Было предположено, что сниженная скорость катализа РНКП T. aquaticus напрямую связана температурной адаптацией и определяется особенностями структуры активного центра этой РНКП.

Задачей второй части данной работы было изучение особенностей катализа РНКП T. aquaticus по сравнению с РНКП D. radiodurans и анализ функционально-важных элементов активного центра РНКП, участвующих в синтезе РНК и определяющих межвидовые различия в скорости катализа. Наличие данных о трехмерной структуре РНКП T. aquaticus позволило провести направленный поиск таких элементов и предположить их роль в катализе.

2.2 Структурные элементы РНКП, определяющие скорость синтеза РНК

Для поиска структурных элементов РНКП, определяющих скорость катализа, мы обратились к трехмерной структуре элонгационного комплекса РНКП Т. ЛегторИИш (Рис. 6, А). Реакция присоединения нуклеотида осуществляется в активном центре фермента двумя каталитическими ионами магния, связанными с консервативным для всех РНКП мотивом NADFDGD |3'-субъединицы. Недавние структурные и биохимические исследования показали, что в присоединении нуклеотидов в ходе катализа главную роль играют два элемента р'-субъединицы РНКП: О-петля и Б-спираль. Связывание нуклеотида индуцирует «сворачивание» й-петли и образование «закрытой» конформации активного центра, обеспечивающей правильную ориентацию нуклеотида, который напрямую контактирует с в-петлей и Р-спиралью. Транслокация РНКП по матрице ДНК,

Mg2t

G-петля

F-петля

-ВВЯЗ-

1226 stgepgtqltjr tfflhbvgtdi tqglprviei.fe 1245 ..................i.g.g..-m..........

Taq 1033 ^irllcgmbsmqkpsgetfeve^vrss^regltvlevfisshgftrkggrptalrtrdsgybtrklvdvft Ora 105: ......a......ar.d.s.i. . .i.a..............t............................

Рис. 6. Структура активного центра РНКП. (А) Общий вид элонгационного комплекса РНКП Т. themophilus в процессе присоединения нуклеотида (справа) и область активного центра РНКП Т. thermophilus (слева) (Vassylyev et al., 2007b). a-, (5-, P'- и ю-субъединицы показаны голубым, бирюзовым, розовым и серым. Два иона магния в активном центре РНКП показаны сферами малинового цвета, матричная ДНК окрашена оранжевым, РНК-желтым, присоединяемый нуклеотид (АТР) - черным. F-спираль показана фиолетовым цветом, G-петля - зеленым, F-петля - красным. Остатки аминокислот в кончике G-петли (1243-1247) показаны бирюзовым, а близко к ним расположенные остатки F-петли - красным. Остатки аминокислот в F-петле, различающиеся в РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans, показаны объемно, бледно-желтым цветом. Остаток Gin 1046 (который у D. radiodurans заменен на Ala) выделен ярко-желтым. Границы делеции F-петли показаны черной линией. (Б) Выравнивание аминокислотных последовательностей F-петли, F-спирали и G-петли РНКП Т. aquaticus (Taq) и D. radiodurans (Dra). Красным шрифтом показаны замены в РНКП Т. aquaticus/D. radiodurans, участок делеции в F-петле выделен черной рамкой. Аминокислотные остатки, взаимодействующие со стрептолидигином в РНКП Т. thermophilus (Vassylyev et al., 2007b) показаны на сером фоне.

происходящая после включения нуклеотида, также сопровождается структурными изменениями G-петли и F-спирали. Рядом с G-петлей расположен еще один район (З'-субъединицы - jaw-домен, который может влиять на конформационные перестройки G-петли. Ранее было показано, что мутации во всех этих районах (G-петле, F-спирали и jaw-домене) приводят к сильному падению скорости синтеза РНК (Temiakov et al., 2005; Toulokhonov et al., 2007; Vassylyev et al., 2007b; Ederth et al., 2002). Помимо перечисленных элементов с G-петлей в закрытой конформации контактирует еще одна петля, образованная консервативным районом F (}'-субъединицы, мы назвали ее F-петля (Рис. 6, А). Функции этой петли в транскрипции ранее исследованы не были.

Мы предположили, что перечисленные выше элементы активного центра РНКП могут определять видоспецифические огличия в скорости катализа у РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans. При сравнении последовательностей |3' субъединиц Т. aquaticus и D. radiodurans (Рис. 6, Б) были обнаружены аминокислотные замены, которые, возможно, влияют на скорость синтеза РНК. В частности, в G-петле содержится 4 аминокислотные замены (V1246I, V1248G, T1250G и Q1254M), в F-спирали - одна замена (S1074T), в F-петле - 8 замен и 36 аминокислотных замен в jaw-домене. Все эти аминокислотные замены потенциально могут вносить вклад в изменение скорости РНКП, влияя на конформационные переходы G-петли и F-спирали, необходимые для катализа. Так, замены в G-петле и F-спирали могут напрямую влиять на их подвижность, а замены в F-петле и в jaw-домене могут действовать опосредованно, изменяя структуру и конформационную подвижность G-петли и F-спирали.

Для анализа функциональной роли данных участков были получены химерные варианты РНКП Т. aquaticus, в каждом из которых один из перечисленных участков был заменен на соответствующий участок D. radiodurans. В первом ферменте (G-Dra) мы заменили G-петлю (аминокислотные остатки 1246-1254 в РНКП Т. aquaticus, всего 4 замены), во втором (F-Dra) фрагмент включающий F-петлю и N-концевую часть F-спирали (остатки 1039-1074, всего 9 замен), в третьем (Javf-Dra) jaw-домен (остатки 1267-1325, 36 замен). Мозаичные гены р'-еубъедишшы были получены методами сайт-направленного мутагенеза; мутантные РНКП были выделены из клеток-суперпродуцентов Е. coli. Контрольные эксперименты показали, что все полученные химерные варианты РНКП являются каталитически активными и способны к эффективной инициации и элонгации транскрипции.

2.2.1 Элонгационые свойства различных вариантов РНКП 71 aquaticus

Элонгационные свойства РНКП D. radiodurans, РНКП Т. aquaticus дикого типа, а также ее мозаичных вариантов, были проанализированы при помощи транскрипции in vitro на матрице, содержащей XPr промотор и his терминатор. При измерении скорости элонгации на этой матрице сначала были получены элонгационные комплексы, остановленные в определенном положении матрицы. Для этого промоторные комплексы инкубировали в присутствии ограниченного набора субстратов (ATP, GTP, UTP, с добавлением а32Р -UTP) при оптимальной температуре (40°С для РНКП D. radiodurans, 60 °С для РНКП Т. aquaticus). Это приводило к формированию элонгационных комплексов, содержащих РНК длиной 26 нт (так как в 27 положении матрицы закодирован цитозин). После этого к

элонгационным комплексам добавляли все ЭТР до концентрации 100 ]ЛМ и анализировали кинетику синтеза РНК.

Сравнение скорости синтеза РНК было сначала проведено при 40°С, что является температурным оптимумум для РНКП £>. гскИодигапя (Рис. 7, А). Было показано, что скорости элонгации РНКП Т. ациаИст и П. гасИосЪлгапз сильно различаются, что согласуется с опубликованными данными (КиШасЫшЫу е1 а1., 2004). Время, за которое количество синтезированной РНК достигало половины от максимума, для этих РНК составляло 80 с и 10 с, соответственно. Было установлено, что замена в-петли практически не оказывает влияния на скорость элонгации. Мозаичная РНКП й-Пга обладает даже несколько меньшей скоростью, чем РНКП Т. адиаИсия дикого типа. Замена домена jaw приводит к незначительному увеличению скорости элонгации (примерно в 2-3 раза). В то же время, РНКП Т-Эга проявляет значительно большую скорость элонгации, чем РНКП Т. адиайсиь (более чем в 5 раз - время полусинтеза 15 с, см. Рис. 7, А).

После этого мы проверили элонгационные свойства РНКП ¥-Пга при 20°С, поскольку разница в скоростях Т. адиаИсиз и А гадМигапь увеличивается при низких температурах (КиШасЫпвИу е1 а1., 2004). Действительно, при 20°С РНКП В. гас/ю<1игап5 транскрибирует значительно быстрее, чем РНКП Т. адиаНсиз (время полусинтеза полноразмерной РНК составляет 45 с и более 1800 с, соответственно, см. Рис. 7, Б). Мозаичные РНКП Jaw-Z)ra и ¥-йга также показывают заметно большую скорость, чем РНКП Т. ациайсив дикого типа, причем этот эффект особенно заметен в случае РНКП ¥-Ига (время полусинтеза - 400 с).

А РНКП Тар Ога С-Ога Р-Оге

время, с 0 10 20 40 60 90 120 0 10 20 40 60 90 120 0 10 20 40 60 90 120 0 10 20 40 60 90 120 0 10 20 40 60 90 120

РНКП Тар Ога ? -Ога Ла\л/ -Ога

время. С 0 10 20 40 60 120 240 600 1200 0 10 20 40 60 120 240 600 <200 0 10 20 40 60 120 240 600 1200 0 10 20 40 60 120 240 600 1200

;ц ч

Рис. 7. Скорости элонгации РНКП Т. ациайси^, И. гшИойигапя, О-Ога, 1-/)га и .¡ип-Ога.

Позиции 26нт РНК и 157нт терминированного РНК-продукта отмечены слева на рисунке. Эксперименты проводили при 40 "С (А) и при 20 °С (Б).

2.2.2. Аминокислотные замены в Р-петле и Р-спирали влияют на скорость присоединения нуклеотидов

Наблюдаемая разница в скорости элонгации разными вариантами РНКП может быть связана с различиями в связывании входящего нуклеотида, разными скоростями включения нуклеотида и/или транслокации РНКП, а также может быть вызвана различиями в образовании пауз транскрипции у разных вариантов РНКП. Для сравнения непосредственно скоростей катализа мы измерили скорость присоединения одного нуклеотида, используя искусственно собранные из олигонуклеотидов и кор-фермента РНКП элонгационные комплексы. Эти эксперименты были проведены с использованием синтетической минимальной матрицы, содержащей 8-нуклеотидный РНК/ДНК гибрид и 18-нуклеотиднй ДНК дуплекс спереди по ходу транскрипции (Рис. 8, А) (КоггЬеуа е1 а1., 1998). Эта минимальная матрица позволяет исследовать удлинение РНК-транскрипта на один нуклеотид, происходящее в ходе единичного каталитического цикла РНКП. Скорости катализа были измерены при насыщенной концентрации 1ЛР (1 мМ), которая в несколько раз выше значения Км для ЦТР для РНКП дикого типа Т. адиаИсия на этой минимальной матрице (Км = 200 мкМ). Контрольные эксперименты показали, что комплекс РНКП с данной минимальной матрицей находится в посттранслокационном состоянии, в котором новый субстрат реакции может сразу же связываться в свободном активном центре.

к РНК

5' -<ЗиАССС<5А-3'

3' -САТСвССТАТТОТТАААвТСТеТССТаз 5' -АСААТТТСА<ЗАСАе<ЗАСС

РНКП - Тац Ога

время, с - 3 - « г 8 8 0.004 0 01 0 02 О 04 0.1 1

9 — 8 — » •••• «■>т•

Р-Ога +5И ЛР+ЭН

Рис. 8. Измерение скорости присоединения одного

нуклеотида различными РНКП.

(А) Структура минимальной матрицы, использованной в экспериментах. РНК в составе минимальной матрицы содержала радиоактивную метку на 5'-конце. (Б) Элевтрофоретаческое разделение продуктов реакции 8 нт РНК + ЦТР ->9 нт РНК на 23 % ПААГ. Реакцию проводили при 20 °С с использованием аппарата по измерению быстрой кинетики. Положение исходной 8нт РНК и 9 нт РНК-продукта показано слева от рисунка. (В) Кинетика присоединения ЦТР различными РНКП при 20 "С. Процент синтеза 9 нт РНК-продукта отложен по оси ординат, время по оси абсцисс. Некоторые реакции проводили в присутствии стрептолидигина (вй, 100 мкг/мл).

0,01 0,1

10 100 1000

время, с

Измерения были проведены при 40 и 20°С, что позволило сопоставить результаты экспериментов с данными измерения общей скорости элонгации, полученных в тех же условиях. Наблюдаемая скорость включения UMP РНКП Т. aquaticus была в 10 раз медленнее скорости РНКП D. radiodurans при 40°С, и в 320 раз медленнее при 20°С (Рис. 8, Б и В). Эти значения хорошо коррелируют с данными по измерению общей скорости элонгации. Таким образом, различия в общей скорости элонгации для РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans могут быть в значительной мере объяснены разницей в скорости катализа.

Было показано, что скорость катализа РНКП G-Dra была приблизительно такой же (даже чуть меньше), что и у РНКП Т. aquaticus, что согласуется с данными для общей скорости элонгации. Замена домена jaw приводит к незначительному ускорению синтеза РНК (примерно в 2-3 раза при 20°С). При этом, мозаичная РНКП F-Dra была в 6 раз быстрее при 40°С и в 40 раз быстрее при 20°С (Рис. 8, В). Таким образом, по скорости катализа РНКП F-Dra оказывается ближе к РНКП D. radiodurans, чем к РНКП Т. aquaticus. Контрольные эксперименты показали, что мозаичная РНКП F-Dra имеет примерно то же значение Км для UTP, что и РНКП дикого типа Т. aquaticus, поэтому наблюдаемая разница является следствием различий в скорости катализа, а не в эффективности связывания субстрата. Таким образом, 9 аминокислотных замен в F-петле и F-спирали в значительной степени обусловливают разницу скоростей катализа РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans.

Для того, чтобы определить, какие из этих аминокислотных остатков в большей степени влияют на скорость катализа, мы сконструировали дополнительные мутантные варианты РНКП Т. aquaticus с заменами в этой области: (i) замена S1074T, затрагивающая единственный остаток, различающийся в F-спирали между РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans; (ii) замена Q1046A, затрагивающая остаток, контактирующий с G-петлей в свернутом состоянии (Рис. 6, A); (iii) замена центральной части F-петли ("F-loop-Dra", всего 5 замен, Q1046А, K1047R, S1049D, E1051S and F10531); и (iv) делеция центральной части F-петли ("AF", остатки 1044-1056 заменены на остаток глицина) (Рис. 6). Все эти РНКП были выделены из клеток-суперпродуцентов и исследованы в экспериментах по присоединению UTP на минимальной матрице.

Скорости присоединения нуклеотида РНКП с одиночными заменами Q1046А и S1074T оказались промежуточными по сравнению с РНКП Т. aquaticus дикого типа и мозаичной F-Dra РНКП (Табл. 1). Обе РНКП обладают несколько большей скоростью чем РНКП дикого типа (в 1.5-2 раза при 40 "С и в 3-3.5 раза при 20 °С). РНКП F-loop-fra, содержащая 5 замен в F-петле, включая Q1046A, имеет такую же скорость катализа, как и РНКП с единственной заменой Q1046A (Табл. 1). Это говорит о том, что другие 4 аминокислотные замены не влияют на скорость катализа. Таким образом, две аминокислотные замены в р'-субъединице, Q1046A в F-петле и S1074T в F-спирали, влияют на скорость присоединения нуклеотидов и, вероятно, в значительной степени определяют разницу в скоростях катализа Т. aquaticus и D. radiodurans РНКП.

Делеция центральной части F-петли в РНКП Т. aquaticus приводит к серьезным дефектам в катализе; скорость присоединения нуклеотидов мутантной РНКП снижается более чем в 70 раз по сравнению с РНКП дикого типа (Рис. 8, В; Табл. 1). В то же время, делеция не влияет на значение Км для UTP. Ранее было показано, что похожие дефекты в каталитических свойствах РНКП наблюдаются и при мутациях в G-петле. В частности, делеции G-петли у РНКП Т. aquaticus и Е. coli, а также аминокислотные замены в G-петле РНКП Е. coli и РНКП II S. cerevisiae приводят к заметному снижению скорости присоединения нуклеотидов (Temiakov et al., 2005; Toulokhonov et al., 2007; Vassylyev et al., 2007b; Kaplan et al., 2008). Как и делеция F-петли, замены в G-петле и ее делеция не меняют значений Км для НТФ (Kaplan et al., 2008; Toulokhonov et al., 2007; Vassylyev et al., 2007b). Таким образом, можно сделать вывод, что F-петля не участвует в связывания нуклеотидных субстратов, но играет большую роль в катализе образования фосфодиэфирной связи, возможно, за счет взаимодействия с G-петлей.

2.2.3 Влияние стрептолидигина на присоединение нуклеотидов различными вариантами РНКП Т. aquaticus

Стрептолидигин (Stl) - антибиотик, который связывается в районе центральной части F-спирали в бактериальной РНКП и препятствует правильному сворачиванию G-петли, стабилизируя элонгационный комплекс со связанным НТФ (Vassylyev et al., 2007b). Stl ингибирует реакции присоединения нуклеотида, пирофосфоролиза и расщепления РНК (Temiakov et al., 2005). Предполагается, что действие Stl на активность РНКП объясняется стабилизацией непродуктивной конформации РНКП с открытой G-петлей.

Мы проверили, как влияет Stl на включение нуклеотидов РНКП Т. aquaticus и ее мозаичными вариантами при 20°С (так как при этой температуре анализируемые РНКП проявляют наибольшие различия в скоростях катализа). При добавлении в транскрипционную смесь Sti скорость присоединения нуклеотидов для РНКП Т. aquaticus дикого типа снижается приблизительно в 80 раз (Рис. 8, В). В случае РНКП F-Dra Stl оказывает еще более выраженный эффект и приводит к уменьшению скорости фермента в 3300 раз. В то же время, РНКП AF оказывается практически устойчива к действию Stl (ингибирование менее, чем в 2 раза). В то же время, как было показано, делеция F-петли не нарушает связывание антибиотика (данные не приведены). Примечательно, что все три фермента (РНКП дикого типа, F-Dra и AF) имеют одинаковую скорость катализа в присутствии Stl, сравнимую со скоростью РНКП AF в отсутствие антибиотика (Рис. 8, В). Наиболее вероятным объяснением отсутствия эффекта Stl на активность РНКП AF является то, что

Табл. 1. Относительные скорости катализа РНКП Т. aquaticus и ее мутантных вариантов при 20 "С

РНКП Относительная скорость катализа РНКП

Присоединение Расщепление

нуклеотида РНК

Taq 1 1

Dra 320 6.4

F-Dra 40 2

Q1046А 3 -

S1074T 3.4 -

AF 0.014 0.35

стадия катализа, которая блокируется Stl в РНКП дикого типа (то есть, сворачивание G-петли), оказывается нарушена в РНКП с делецией F-петли и в отсутствие антибиотика. Эти данные позволяют предположить, что Stl и делеция F-петли могут влиять на реакцию присоединения нуклеотида одинаковым образом, то есть нарушая правильное сворачивание G-петли в процессе катализа.

2.2.4 Влияние мутаций в F-петле на дискриминацию субстратов РНКП

Данные рентгено-структурного анализа позволяют предположить, что F-петля может участвовать в катализе за счет прямых взаимодействий с G-петлей (Рис. 6 и Рис. 10). Ранее было показано, что мутации в G-петле в РНКП S. cerevisiae уменьшают эффективность дискриминации правильных нуклеотидов по сравнению с дезоксирибонуклеотидами и некомплементарными нуклеотидами (Kaplan et al., 2008). Это позволяет предположить, что мутации в F-петле также могут оказывать влияние на эффективность дискриминацию нуклеотидов. Для проверки этой гипотезы мы проанализировали эффективность включения комплементарного нуклеотида dTTP и некомплементарного нуклеотида СТР на минимальной матрице. Оба субстрата включались РНКП Т. aquaticus дикого типа с очень низкой эффективностью. Скорости включения dTTP и СТР (измеренные при 40°С и 1 мМ концентрации субстратов) были ниже, чем скорость включения UTP в -17000 и 3500 раз, соответственно. РНКП F-Dra также проявляет очень низкую эффективность включения dTTP и СТР по сравнению с UTP и, таким образом, способна эффективно дискриминировать субстраты. В отличие от этого, РНКП AF дискриминирует правильные и неправильные нуклеотиды с гораздо меньшей эффективностью, чем РНКП дикого типа (скорости включения dTTP и СТР оказываются ниже, чем скорость включения UTP, в -120 и 700 раз, соответственно).

Как было показано ранее, мутации в G-петле в РНКП Е. coli и РНКП II S. cerevisiae приводят к аналогичным дефектам в эффективности дискриминации субстратов (Bar-Nahum et al., 2005; Kaplan et al., 2008; Kireeva et al., 2008). Предполагается, что G-петля обеспечивает кинетическую селекцию правильных субстратов, за счет ускорения их включения в РНК по сравнению с неправильными (Kaplan et al., 2008; Kireeva et al., 2008). Наши результаты показывают, что F-петля также необходима для правильной дискриминации субстратов, по-видимому, за счет воздействия на конформационную динамику G-петли в процессе катализа

2.2.5 Роль F-петли в расщеплении РНК

Расщепление вновь синтезированной РНК в элонгационном комплексе происходит в том же активном центре РНКП, что и синтез РНК и играет важную роль в исправлении ошибок транскрипции и реактивации неактивных элонгационных комплексов (Sosunov et al., 2003; Sosunov et al., 2005). Литературные данные указывают на то, что в реакции расщепления РНК могут участвовать другие элементы активного центра РНКП, чем в реакции синтеза (Sosunov et al., 2005). Однако, роль различных структурных элементов активного центра РНКП в реакции расщепления, в том числе, G-петли, F-спирали и F-петли, детально не исследована. Кроме того, остается неизвестным, как различаются скорости расщепления у РНКП, имеющих различную скорость синтеза РНК, в частности, у РНКП термофильных и мезофильных бактерий .

А ТАССАСАССбАСА

5' -АйбАТАСТТАЗАвСС СаССБААТАЗССАТ

3' -ТССТАТ&ААТСТСОСАТССТСТСССТСТСССССТТАТС(ЗСТА

I I I I I I I I I I I

5' -АиСвАСАССвАСА г- РНК к

[РНКП, Та д Р-Ога Д ?

время, с => 8 ? 8 § | § I |

Рис. 9. Кинетика расщепления РНК РНКП Т. aquaticus и ее мутантнымн вариантами. (А)

Минимальная матрица, использованная в экспериментах. Место расщепления РНК показано стрелкой. (Б) Кинетика расщепления РНК при 20 °С. Положения исходной 13 нт РНК и 11 нт продукта расщепления показаны стрелками.

Мы измерили скорости расщепления РНК для РНКП Т. ациайсих и О. гас1юс1игат дикого типа и для мозаичных вариантов РНКП Т. адиаНсия с использованием специальной минимальной матрицы (Рис. 9, А), на которой расщепление РНК происходит с достаточно большой эффективностью (Бозипоу а1., 2005). Инкубация искусственных элонгационных комплексов, собранных на этой матрице, в присутствии ионов магния приводит к отщеплению двух нуклеотидов с З'-конца 13-нуклеотидной РНК и образованию 11-нуклеотидного РНК-продукта (Рис. 9, Б). Было обнаружено, что при 20°С разница в скоростях расщепления РНКП Т. ациаНсш и £>. гас1юс1игат составляет всего 6 раз, что резко отличается от разницы в 320 раз при синтезе РНК (см. выше, Табл. 1). Таким образом, скорость реакции расщепления РНК меньше зависит от температурной адаптации, чем скорость синтеза РНК.

Скорость расщепления РНК РНКП ДР оказывается всего лишь в 3 раза меньше, чем скорость РНКП Т. адиШжия дикого типа (Рис. 9, Б и Табл. 1). Это означает, что реакция расщепления РНК не зависит от Р-петли, и, вероятно, от сворачивания й-петли в закрытую конформацию. Таким образом, реакции расщепления и синтеза РНК осуществляются разными элементами активного центра РНКП.

В целом, полученные данные указывают на то, что Р-петля является дополнительным элементом активного центра, который, наряду с в-петлей и Р-спиралью, играет важную роль в работе бактериальной РНКП. Вместе с Р-спиралью Р-петля формирует своеобразные «ворота», в которых во время присоединения нуклеотида располагается свернутая й-петпя. Вероятно, Р-петля способствует сворачиванию в-петли в процессе катализа присоединения нуклеотидов. Сравнение структур элонгационных комплексов Т. IИегторИНш со связанным №ГР и без него показывает локальные конформационные изменения Р-петли, которые могут быть связаны со сворачиванием в-петли (Рис. 10). Тогда как

Рис. 10. Возможные конформационные перестройки Г-петли в процессе катализа.

Па рисунке показан участок активного центра РНКП Т. ЖегторЫЬя со связанным нуклеотидом (Уаззу1уеу е! а1., 2007Ь). Ориентация РНКП и обозначения цветом те же, что на рисунке 6, А. Показаны аминокислотные остатки 01033, 01037, К.1042, 1Л044, 01046 и Е1051. Структура Р-петли в элонгационном комплексе РНКП без связанного нуклеотида наложена на рисунок, остов полипептидной цепи показан светло-красным, аминокислотные остатки, изменившие свое положение по сравнению с элонгационным со связанным нуклеотидом, показаны белым.

конформация самой полипептидной цепи значительно не изменяется, положения боковых радикалов отдельных аминокислотных остатков в этой области изменяется на 1.6-4.5 А. В частности, меняется положение аминокислотных остатков р'-субъединицы (21033, С?1037, Ш042, Ы044 и С?1046, которые непосредственно контактируют с кончиком в-петли в свернутой конформации, и остатка Е1051, который расположен в кончике Р-петли. Можно предположить, что эти изменения играют важную роль в катализе и сопряжены со сворачиванием в-петли.

выводы

1. Промоторный элемент GGGA стимулирует узнавание природных и синтетических промоторов РНКП Т. aquaticus. GGGA-элемент способствует плавлению промоторов и увеличивает стабильность промоторных комплексов РНКП.

2. РНКП Т. aquaticus узнает промоторы, содержащие GGGA-элемент, с большей эффективностью, чем РНКП Е. coli. Эти различия не связаны с разницей в специфичности узнавания GGGA-элемента с-субъединицами Т. aquaticus и Е. coli, а определяются особенностями структуры кор-фермента РНКП Т. aquaticus.

3. РНКП Т. aquaticus характеризуется резко сниженной скоростью синтеза РНК при умеренных и низких температурах по сравнению с РНКП D. radiodurans. Эти различия определяются особенностями структуры нескольких участков активного центра РНКП Т. aquaticus, в том числе, F-спирали, F-петли и "jaw"-домена ß'-субъединицы.

4. F-петля, расположенная в активном центре РНКП, стимулирует присоединение нуклеотидов, способствуя формированию закрытой конформации активного центра в процессе катализа. F-петля участвует в дискриминации субстратов в активном центре РНКП. F-петля не участвует в реакции расщепления РНК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи:

1. Miropolskaya N.. Artsimovitch I., Klimasauskas S., Nikiforov V., Kulbachinskiy A. 2009. Allosteric control of catalysis by the F-loop of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 106: 18942-18947.

2. Barinova N. (Miropolskava N."). Kuznedelov K., Severinov K., Kulbachinskiy A. 2008. Structural modules of RNA polymerase required for transcription from promoters containing downstream basal promoter element GGGA. J. Biol. Chem. 283:22482-22489.

3. Sevostyanova A., Feklistov A., Barinova N. (Miropolskava Ю. Heyduk E., Bass I., Klimasauskas S., Heyduk Т., Kulbachinskiy A. 2007. Specific recognition of the -10 promoter element by the free RNA polymerase sigma subunit. J. Biol. Chem. 282: 22033-22039.

4. Feklistov A., Barinova N. (Miropolskava N.1. Sevostyanova A., Heyduk E., Bass I., Vvedenskaya I., Kuznedelov K., Merkiene E., Stavrovskaya E., Klimasauskas S., Nikiforov V., Heyduk Т., Severinov K., Kulbachinskiy A. 2006. A basal promoter element recognized by free RNA polymerase sigma subunit determines promoter recognition by RNA polymerase holoenzyme. Mol. Cell. 23: 97-107.

Материалы всероссийских и международных конференций:

1. Н.А. Миропольская, А.В. Кульбачинский. «Механизмы катализа в активном центре бактериальной РНК-полимеразы». Международная научная конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 28 сентября - 1 октября 2009 г., Москва-Пущино, Россия. Т.2, с. 149-152

2. Кульбачинский А.В., Миропольская Н.А. «Структурные элементы РНК-полимеразы, определяющие скорость синтеза РНК». IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», 23-27 июня 2009 г., Казань, Россия. С. 80

3. Миропольская Н.А., Кульбачинский А.В. «РНК-полимераза как молекулярная машина: поиск структурных элементов фермента, определяющих скорость транскрипции.» 1-й Международный форум по нанотехнологиям. 3-5 декабря 2008 г., Москва, Россия. С. 502-503

4. Kulbachinskiy A., Pupov D., Barinova N. (Miropolskaya N.) "Analysis of promoter recognition by bacterial RNA polymerase using model DNA substrates." XX International Congress of Genetics. "Genetics - understanding living systems". July 12-17, 2008, Berlin, Germany. P.292.

5. Кульбачинский A.B., Пупов Д.В., Баринова Н.А. (Миропольская Н.А.) Исследование структуры РНК-полимеразы и механизмов узнавания промоторов при помощи аптамеров. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008 г., 11-15 мая. С. 66.

6. Barinova N. (Miropolskaya Ю. Klimasauskas S., Nikiforov V., Kulbachinskiy A., Artsimovitch I. Comparison of mesophilic and thermophilic RNA polymerases reveals a structural element controlling catalysis allosterically. FASEB summer research conference: Mechanisms & Regulation of Prokaryotic Transcription. Vermont, 2007, June 23-28. P.3.

7. Баринова Н.А. (Миропольская H.A.). Кульбачинский А.В. Исследование нового промоторного элемента бактерий, расположенного между -10 областью и стартовой точкой транскрипции. Российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. Москва-Пущино, 2006, 26 ноября - 2 декабря. С. 17-19.

8. Баринова Н.А. (Миропольская Н.А.). Басс И.А., Кульбачинский А.В. Выявление районов РНКП Т. aquaticus, ответственных за сниженную скорость элонгации транскрипции при низких температурах. 9-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2005, 18-22 апреля. С. 7.

Подписано в печать:

11.02.2010

Заказ № 3257 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Миропольская, Наталия Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Основные механизмы инициации и элонгации транскрипции бактериальной РНКП.

1. Механизм инициации транскрипции.

2. Механизм синтеза РНК на стадии элонгации транскрипции.

2.1. Структура эло/рационного комплекса.

2.2. Реакции, катализируемые РНКП.

2.3. Механизм присоединения NTP в активном центре РНКП.

2.4. Механизм транслокации РНКП.

3. Действие антибиотиков на каталитический цикл РНКП.

3.1. Стрептолидигин.

3.2. а-Аманитин.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ структурно-функциональных особенностей РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus Aquaticus"

Актуальность проблемы

Транскрипция - один из ключевых процессов, лежащих в основе экспрессии генетического материала. Транскрипция генов в клетках всех организмов осуществляется многосубъединичными РНК-полимеразами (РНКП). Основные механизмы транскрипции и общая структура РНКП высоко консервативны в эволюции. Бактериальная РНКП, имеющая наиболее простое строение, является удобной моделью для изучения фундаментальных механизмов транскрипции и ее регуляции. РНКП способна синтезировать РНК длиной до нескольких десятков тысяч нуклеотидов с очень высокой точностью и процессивпостыо, что обеспечивается сложными структурными перестройками фермента в процессе транскрипции. Активность РНКП на разных стадиях транскрипции регулируется самыми разнообразными факторами: белками, некодирующими РНК, низкомолекулярными соединениями и метаболитами, антибиотиками. Большинство регуляторов транскрипции действуют либо на стадии инициации транскрипции, влияя на взаимодействие РНКП с промоторами, либо непосредственно на каталитическую активность РНКП. Расшифровка детальных механизмов различных стадий транскрипции, в том числе, анализ взаимодействий РНКП с промоторами, регуляторными сигналами в ДНК и РНК, транскрипционными факторами, а также изучение механизмов катализа в активном центре РНКП, является одной из важнейших проблем современной молекулярной биологии и необходима для понимания основных механизмов регуляции генной экспрессии.

Транскрипция включает три основные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Инициация происходит в специфических участках ДНК - промоторах, и является одной из основных мишеней генетической регуляции. В процессе инициации РНКП узнает промотор и плавит промоторную ДНК в точке инициации, после чего начинает синтез РНК de novo, без использования затравки. У бактерий все стадии инициации осуществляются холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента (субъединичный состав агРР'со) и фактора инициации — ст-субъединицы, которая диссоциирует при переходе к элонгации. Элонгация и терминация транскрипции осуществляются кор-ферментом РНКП. Сигма-субъединица играет основную роль в узнавании промоторов и плавлении ДНК в районе стартовой точки транскрипции, а также непосредственно участвует в инициации синтеза РНК и уходе РНКП с промотора. Имеются данные, указывающие на то, что кор-фермент РНКП также может участвовать в специфическом узнавании промоторов, но детально его роль в этом процессе пс исследовалась.

Следует подчеркнуть, что до настоящего времени подавляющее большинство исследований механизмов инициации транскрипции и каталитических механизмов РНКП были проведены на примере РНКП мезофильной бактерии Escherichia coli. В то же время, было обнаружено, что РНКП других бактерий, в частности термофильных бактерий Т. aquaticus и Т. thermophilus, могут проявлять значительные отличия в механизмах узнавания промоторов, инициации транскрипции и в каталитических свойствах (Xue et al., 2000; Minakhin et al., 2001; Kulbachinskiy et al., 2004). РНКП термофильных бактерий являются исключительно интересной моделью для изучения различных стадий транскрипции, поскольку, при сохранении консервативного механизма транскрипции, они обладают особенностями, связанными с адаптацией к высоким температурам. РНКП термофильных бактерий имеют более «жесткую» структуру и сниженную конформационную подвижность, что обеспечивает их термостабильность. Сравнение транскрипционных свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий дает уникальную возможность для поиска функционально-важных участков РНКП, задействованных в узнавании промоторов и в катализе и ответственных за адаптивные различия в свойствах РНКП разных бактерий. РНКП Т. aquaticus является наиболее интересной модельной РНКП, так как для этой РНКП известна трехмерная структура высокого разрешения.

Кроме несомненной научной ценности, исследование детального механизма инициации транскрипции и механизмов катализа в активном центре РНКП имеет также большое практическое значение. В частности, анализ механизма транскрипции прокариот необходим для разработки новых методов регуляции активности бактериальной РНКП, которые могут найти широкое применение в биотехнологии, а также для получения новых ингибиторов РНКП, которые могут иметь большое значение для медицины.

Цели и задачи исследования

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Основные механизмы инициации и элонгации транскрипции бактериальной РНКП

РНКП является одним из ключевых ферментов, участвующих в экспрессии генов. За примерно 50 лет, прошедших с момента открытия РНКП, были достаточно подробно исследованы механизмы основных стадий транскрипции, идентифицированы многие функционально-важные районы РНКП, изучены генетические и биохимические эффекты мутаций в различных субъединицах фермента. Настоящий прорыв в исследованиях структурно-функциональной организации РНКП произошел в самые последние годы, в связи с расшифровкой трехмерных структур РНКП термофильных бактерий Т. aquaticus и Т. thermophilus и РНКП II дрожжей S. cerevisiae. В частности, были расшифрованы структуры кор-фермента РНКП Т. aquaticus (Zhang et al., 1999), ст-субъединицы РНКП Е. coli и Т. aquaticus (Campbell et al., 2002; Malhotra et al., 1996), холоферментов РНКП Т. aquaticus и Т. thermophilus (Murakami et al., 2002a; Murakami et al., 2002b; Vassylyev et al., 2002), РНКП II дрожжей S. cerevisiae (Cramer et al., 2001), элонгационного комплекса (ЭК) РНКП Т. thermophilus и S. cerevisiae (Gnatt et al., 2001; Vassylyev et al., 2007a; Vassylyev et al., 2007b), а также структуры комплексов РНКП с ингибиторами: миксопиронином (Belogurov et al., 2009; Mukhopadhyay et al., 2008), стрептолидигином (Temiakov et al., 2005; Tuske et al., 2005), а-аманитином (Brueckner and Cramer, 2008; Bushnell et al., 2002), тагетитоксином (Vassylyev et al., 2005), рифампицином (Artsimovitch et al., 2005; Campbell et al., 2001), сорангицином (Campbell et al., 2005). Кроме того, были расшифрованы структуры целого ряда транскрипционных факторов, непосредственно регулирующих работу активного центра РНКП: Gre-факторов (Vassylyeva et al., 2007), белков DksA (Perederina et al., 2004), Gfhl (Lamour et al., 2006; Laptenko et al., 2006; Symersky et al., 2006), Rnk (Lamour et al., 2008). Анализ полученной информации позволил создать модели транскрипционных комплексов на разных стадиях синтеза РНК, предложить основные принципы работы активного центра РНКП и возможные механизмы регуляции транскрипции различными факторами. Первая часть данного обзора посвящена краткому анализу известных на сегодняшний день данных о механизмах инициации, элонгации транскрипции и о структуре активного центра бактериальной РНКП.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Миропольская, Наталия Александровна

выводы

2. РНКП Т. aquaticus узнает промоторы, содержащие GGGA-элемент, с большей эффективностью, чем РНКП Е. coli. Эти различия не связаны с различиями в специфичности узнавания GGGA-элемента ст-субъединицами Т. aquaticus и Е. coli, а определяются особенностями структуры кор-фермента РНКП Т. aquaticus.

Последовательности промоторов, использованных в работе

Показаны последовательности центральной части промоторов, включая участки отжига праймеров, использованных для амплификации промоторных фрагментов. Праймеры показаны под последовательностями соответствующих промоторов; в составе праймеров подчеркнуты последовательности рестриктных сайтов EcoRL и Hindlll. -10, -35, TG и GGGA элементы в составе промоторов показаны красным, голубым, зеленым и желтым цветами, соответственно. Стартовая точка транскрипции показана серым.

Т7А1 и его производные

Т7А1 gaaaat Т ТAT CAAAAAGAGTAl

T7A1GGGA GAAAATTTATCAAAAAGAGTAl t7aiccct gaaaatttatcaaaaagagtaI TAAAGTCTAACCTATAGj з АШ T AAAG TCTAAC С TAT AG; ^J^AAAGTCTAACCTATAG tacagccatcgagagggacacggcgaatag gggagccatcgagagggacacggcgaatag ccctgccatcgagagggacacggcgaatag

T7A11RI T7AlrHindIII

AGTGAATTCTATTTGGATCCAGATCCCGAAAArrrATCAAAAAGAG CGAAGCTTCCCCGGTGTCGATTGGGATGGCrATrCGCCGrGTCCC galPl ^^^ ccactaatttattccatgtcacacttttcgcatcttttttahck^^tatttcataccataagcctaatggagcgaa galPllRI galPl rHindlll

AGTGAATTCATTCTTGTGTAAACGATTCCACTAArrrArrCCATGr CCGAAGCTTCGGTAACCAGAACTCTCATAATrCGCrCCArrAGGCr

XPR

CGTTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGBBBATTTTACCTCTGGCGGTC

TATGGAAGAGGCGGTAGCGTGCGTTTTTCGATCTTCC

EGGTTGCATGTAGTAAGGAGGTTG

XPRleft XPRright

CGTTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTG GGCTTTCTCATGCGTTCATGCACCACTGGAAGATCGAAAAACG dnaK dnaK dnaKGGGA dnaK-35 tcatactcaactcc tcatactcaactcc

TGA<

TGCGGCATGTGCGT1 TGCGGCATGTGCGT^

GGGAGGCGAGGTGAAGACGTATGGCCAAGGCAGT TACTCGCGAGGTGAAGACGTATGGCCAAGGCAGT

TCATACTCAACTCCCGGTCACAAAATGCGGCATGTGCGTTAGCCTGGGAGGCGAGGTGAAGACGTATGGCCAAGGCAGT dnaK-35GGGA TCATACTCAACTCCC GGTCACAAAATGCGGCATGTGCGTTAGCCT|IACTGGCgAGGTGAAGACGTATGGCCAAGGCAGT dnaKleft dnaKright

AGTGAATTCACAAAATCATACTCAACTCCC; CGAAGCTTTCAATGCCCACTGCCTTGGCCATAC

Синтетические промоторы на основе аптамеров sTapl sTapl+35 sTapl+35-GGGA sTap2 sTap2 "-GGGA" sTap2 "+35" sTap2 "+35-GGGA1

AGAATAAACGCTCAACACGGCCGAGGj AGAA|^eCTCAACACGGCCGAGG

AGAA^^HCTCAACACGGCCGAGGI

GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCCACGj GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCCACG GGGAGCTC^^eAACGCTCAAGGCCACG| GGGAGCTC^^eAACGCTCAAGGCCACG! itaatgggagcggtat pta&tgggagcgg'TAT шш ccctgc gg T AT eaaactgggagcacctacggatggttcgacatgaggcccggatc h^^^ccctgcacctacggatggttcgacatgaggcccggatc

Sgggagcacctacggatggttcgacatgaggcccggatc Btaaactccctg сacсtacggatggttсgacatgaggcссggatс

PLEcoRI:

PL+35

PRHindHI:

5'-cagtgaattcgggagctcagaataaacgctcaa

5'-CAGTGAATTCGGGAGCTCTTGACAAACGCTCAAGGCC 5'-CCGAAGCTTGATCCGGGCCTCATGTCGAA

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Миропольская, Наталия Александровна, Москва

1. Acharya, P., Rajakumara, Е., Sankaranarayanan, R., and Rao, N.M. (2004). Structural basis of selection and thermostability of laboratory evolved Bacillus subtilis lipase. J Mol Biol 341, 12711281.

2. Aniskovitch, L.P., and Winkler, H.H. (1995). Instability of Rickettsia prowazekii RNA polymerase-promoter complexes. J Bacteriol 177, 6301-6303.

3. Artsimovitch, I., Chu, C., Lynch, A.S., and Landick, R. (2003). A new class of bacterial RNA polymerase inhibitor affects nucleotide addition. Science 302, 650-654.

4. Artsimovitch, I., Patlan, V., Sekine, S., Vassylyeva, M.N., Hosaka, Т., Ochi, K., Yokoyama, S., and Vassylyev, D.G. (2004). Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell 117, 299-310.

5. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Anthony, L., Burgess, R.R., and Landick, R. (2000). RNA polymerases from Bacillus subtilis and Escherichia coli differ in recognition of regulatory signals in vitro. J Bacteriol 182, 6027-6035.

6. Bae, E., and Phillips, G.N., Jr. (2004). Structures and analysis of highly homologous psychrophilic, mesophilic, and thermophilic adenylate kinases. J Biol Chem 279, 28202-28208.

7. Bar-Nahum, G., Epshtein, V., Ruckenstein, A.E., Rafikov, R., Mustaev, A., and Nudler, E. (2005). A ratchet mechanism of transcription elongation and its control. Cell 120, 183-193.

8. Bar-Nahum, G., and Nudler, E. (2001). Isolation and characterization of sigma(70)-retaining transcription elongation complexes from Escherichia coli. Cell 106, 443-451.

9. Barlow, D.J., and Thornton, J.M. (1983). Ion-pairs in proteins. J Mol Biol 168, 867-885.

10. Barne, K.A., Bown, J. A., Busby, S.J., and Minchin, S.D. (1997). Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters. EMBO J 16, 4034-4040.

11. Batada, N.N., Westover, K.D., Bushnell, D.A., Levitt, M., and Komberg, R.D. (2004). Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proc Natl Acad Sci U S A101, 17361-17364.

12. Bell, G.S., Russell, R.J., Connaris, H., Hough, D.W., Danson, M.J., and Taylor, G.L. (2002). Stepwise adaptations of citrate synthase to survival at life's extremes. From psychrophile to hyperthermophile. Eur J Biochem 269, 6250-6260.

13. Bigelow, C.C. (1967). On the average hydrophobicity of proteins and the relation between it and protein structure. J Theor Biol 16, 187-211.

14. Bismuto, E., Febbraio, F., Limongelli, S., Briante, R., and Nucci, R. (2003). Dynamic fluorescence studies of beta-glycosidase mutants from Sulfolobus solfataricus: effects of single mutations on protein thermostability. Proteins 51, 10-20.

15. Bouthier de la Tour, C., Portemer, C., Nadal, M., Stetter, K.O., Forterre, P., and Duguet, M. (1990). Reverse gyrase, a hallmark of the hyperthermophilic archaebacteria. J Bacteriol 172, 68036808.

16. Brodolin, K.L., Studitsky, V.M., and Mirzabekov, A.D. (1993). Conformational changes in E. coli RNA polymerase during promoter recognition. Nucleic Acids Res 21, 5748-5753.

17. Brueckner, F., and Cramer, P. (2008). Structural basis of transcription inhibition by alpha-amanitin and implications for RNA polymerase II translocation. Nat Struct Mol Biol 15, 811-818.

18. Bushnell, D.A., Cramer, P., and Kornberg, R.D. (2002). Structural basis of transcription: alpha-amanitin-RNA polymerase II cocrystal at 2.8 A resolution. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1218-1222.

19. Cambillau, C., and Claverie, J.M. (2000). Structural and genomic correlates of hyperthermostability. J Biol Chem 275, 32383-32386.

20. Campbell, E.A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair, S., Goldfarb, A., and Darst, S.A. (2001). Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial rna polymerase. Cell 104, 901-912.

21. Campbell, E.A., Muzzin, O., Chlenov, M., Sun, J.L., Olson, C.A., Weinman, O., Trester-Zedlitz, M.L., and Darst, S.A. (2002). Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit. Mol Cell 9, 527-539.

22. Campbell, E.A., Pavlova, O., Zenkin, N., Leon, F., Irschik, H., Jansen, R., Severinov, K., and Darst, S.A. (2005). Structural, functional, and genetic analysis of sorangicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Embo J 24, 674-682.

23. Carey, J., Cameron, V., de Haseth, P.L., and Uhlenbeck, O.C. (1983). Sequence-specific interaction of R17 coat protein with its ribonucleic acid binding site. Biochemistry 22, 2601-2610.

24. Cech, C.L., and McClure, W.R. (1980). Characterization of ribonucleic acid polymerase-T7 promoter binary complexes. Biochemistry 19, 2440-2447.

25. Chafin, D.R., Guo, H., and Price, D.H. (1995). Action of alpha-amanitin during pyrophosphorolysis and elongation by RNA polymerase II. J Biol Chem 270, 19114-19119.

26. Chakrabartty, A., and Baldwin, R.L. (1995). Stability of alpha-helices. Adv Protein Chem 46, 141176.

27. Chakravarty, S., and Varadarajan, R. (2000). Elucidation of determinants of protein stability through genome sequence analysis. FEBS Lett 470, 65-69.

28. Cramer, P., Bushnell, D.A., and Kornberg, R.D. (2001). Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science 292, 1863-1876.

29. Croft, J.E., Love, D.R., and Bergquist, P.L. (1987). Expression of leucine genes from an extremely thermophilic bacterium in Escherichia coli. Mol Gen Genet 210, 490-497.

30. Davis, C.A., Capp, M.W., Record, M.T., Jr., and Saecker, R.M. (2005). The effects of upstream DNA on open complex formation by Escherichia coli RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 102, 285-290.

31. Demirjian, D.C., Moris-Varas, F., and Cassidy, C.S. (2001). Enzymes from extremophiles. Curr OpinChemBiol 5,144-151.

32. Dill, K.A. (1990). Dominant forces in protein folding. Biochemistry 29, 7133-7155.

33. Ederth, J., Artsimovitch, I., Isaksson, L.A., and Landick, R. (2002). The downstream DNA jaw of bacterial RNA polymerase facilitates both transcriptional initiation and pausing. J Biol Chem 277, 37456-37463.

34. Eichler, J., and Adams, M.W. (2005). Posttranslational protein modification in Archaea. Microbiol Mol Biol Rev 69, 393-425.

35. Elcock, A.H. (1998). The stability of salt bridges at high temperatures: implications for hyperthermophilic proteins. J Mol Biol 284, 489-502.

36. Epshtein, V., Mustaev, A., Markovtsov, V., Bereshchenko, O., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. (2002). Swing-gate model of nucleotide entry into the RNA polymerase active center. Mol Cell 10, 623-634.

37. Faraldo, M.M., de Pedro, M.A., and Berenguer, J. (1992). Sequence of the S-layer gene of Thermus thermophilus HB8 and functionality of its promoter in Escherichia coli. J Bacteriol 174, 7458-7462.

38. Farias, S.T., and Bonato, M.C. (2003). Preferred amino acids and thermostability. Genet Mol Res 2,383-393.

39. Fields, P.A. (2001). Review: Protein function at thermal extremes: balancing stability and flexibility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 129, 417-431.

40. Fields, P.A., and Somero, G.N. (1998). Hot spots in cold adaptation: localized increases in conformational flexibility in lactate dehydrogenase A4 orthologs of Antarctic notothenioid fishes. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 11476-11481.

41. Fitter, J., Herrmann, R., Dencher, N.A., Blume, A., and Hauss, T. (2001). Activity and stability of a thermostable alpha-amylase compared to its mesophilic homologue: mechanisms of thermal adaptation. Biochemistry 40, 10723-10731.

42. Fukuchi, S., Yoshimune, K., Wakayama, M., Moriguchi, M., and Nishikawa, K. (2003). Unique amino acid composition of proteins in halophilic bacteria. J Mol Biol 327, 347-357.

43. Gershenson, A., Schauerte, J.A., Giver, L., and Arnold, F.H. (2000). Tryptophan phosphorescence study of enzyme flexibility and unfolding in laboratory-evolved thermostable esterases. Biochemistry 39, 4658-4665.

44. Gianese, G., Bossa, F., and Pascarella, S. (2002). Comparative structural analysis of psychrophilic and meso- and thermophilic enzymes. Proteins 47, 236-249.

45. Gnatt, A.L., Cramer, P., Fu, J., Bushnell, D.A., and Kornberg, R.D. (2001). Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science 292, 1876-1882.

46. Golding, G.B., and Dean, A.M. (1998). The structural basis of molecular adaptation. Mol Biol Evol 15, 355-369.

47. Goldman, A. (1995). How to make my blood boil. Structure 3, 1277-1279.

48. Gourse, R.L., Gaal, Т., Aiyar, S.E., Barker, M.M., Estrem, S.T., Hirvonen, C.A., and Ross, W. (1998). Strength and regulation without transcription factors: lessons from bacterial rRNA promoters. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63, 131-139.

49. Gross, C.A., Chan, C., Dombroski, A., Gruber, Т., Sharp, M., Tupy, J., and Young, B. (1998). The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63, 141-155.

50. Haney, P.J., Stees, M., and Konisky, J. (1999b). Analysis of thermal stabilizing interactions in mesophilic and thermophilic adenylate kinases from the genus Methanococcus. J Biol Chem 274, 28453-28458.

51. Hartmann, R.K., and Erdmann, V.A. (1989). Thermits thermophilus 16S rRNA is transcribed from an isolated transcription unit. J Bacteriol 171, 2933-2941.

52. Hartmann, R.K., Ulbrich, N., and Erdmann, V.A. (1987). An unusual rRNA operon constellation: in Thermus thermophilus HB8 the 23S/5S rRNA operon is a separate entity from the 16S rRNA operon. Biochimie 69, 1097-1104.

53. Haslbeck, M., Franzmann, Т., Weinfurtner, D., and Buchner, J. (2005). Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nat Struct Mol Biol 12, 842-846.

54. Haugen, S.P., Berkmen, M.B., Ross, W., Gaal, Т., Ward, C., and Gourse, R.L. (2006). rRNA promoter regulation by nonoptimal binding of sigma region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase. Cell 125, 1069-1082.

55. Haugen, S.P., Ross, W., and Gourse, R.L. (2008a). Advances in bacterial promoter recognition and its control by factors that do not bind DNA. Nat Rev Microbiol 6, 507-519.

56. Haugen, S.P., Ross, W., Manrique, M., and Gourse, R.L. (2008b). Fine structure of the promoter-sigma region 1.2 interaction. Proc Natl Acad Sci USA 105, 3292-3297.

57. Hendsch, Z.S., and Tidor, B. (1999). Electrostatic interactions in the GCN4 leucine zipper: substantial contributions arise from intramolecular interactions enhanced on binding. Protein Sci 8, 1381-1392.

58. Henne, A., Bruggemann, H., Raasch, C., Wiezer, A., Hartsch, Т., Liesegang, H., Johann, A., Lienard, Т., Gohl, O., Martinez-Arias, R., et al. (2004). The genome sequence of the extreme thermophile Thermus thermophilus. Nat Biotechnol 22, 547-553.

59. Jaenicke, R. (2000). Do ultrastable proteins from hyperthermophiles have high or low conformational rigidity? Proc Natl Acad Sci U S A 97, 2962-2964.

60. Johns, G.C., and Somero, G.N. (2004). Evolutionary convergence in adaptation of proteins to temperature: A4-lactate dehydrogenases of Pacific damselfishes (Chromis spp.). Mol Biol Evol 21, 314-320.

61. Jung, Y.H., and Lee, Y. (1997). Escherichia coli rnpB promoter mutants altered in stringent response. Biochem Biophys Res Commun 230, 582-586.

62. Kannan, N., and Vishveshwara, S. (2000). Aromatic clusters: a determinant of thermal stability of thermophilic proteins. Protein Eng 13, 753-761.

63. Kaplan, C.D., and Kornberg, R.D. (2008). A bridge to transcription by RNA polymerase. J Biology 7,39.31-39.34.

64. Kaplan, C.D., Larsson, K.M., and Kornberg, R.D. (2008). The RNA polymerase II trigger loop functions in substrate selection and is directly targeted by alpha-amanitin. Mol Cell 30, 547-556.

65. Karshikoff, A., and Ladenstein, R. (1998). Proteins from thermophilic and mesophilic organisms essentially do not differ in packing. Protein Eng 11, 867-872.

66. Kettenberger, H., Armache, K.J., and Cramer, P. (2004). Complete RNA polymerase II elongation complex structure and its interactions with NTP and TFIIS. Mol Cell 16, 955-965.

67. Komissarova, N., and Kashlev, M. (1997a). RNA polymerase switches between inactivated and activated states By translocating back and forth along the DNA and the RNA. J Biol Chem 272, 15329-15338.

68. Komissarova, N., and Kashlev, M. (1997b). Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded. Proc Natl Acad Sci USA 94, 1755-1760.

69. Korkegian, A., Black, M.E., Baker, D., and Stoddard, B.L. (2005). Computational thermostabilization of an enzyme. Science 308, 857-860.

70. Korndorfer, I., Steipe, В., Huber, R., Tomschy, A., and Jaenicke, R. (1995). The crystal structure of holo-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima at 2.5 A resolution. J Mol Biol 246, 511-521.

71. Korolev, S., Nayal, M., Barnes, W.M., Di Cera, E., and Waksman, G. (1995). Crystal structure of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I at 2.5-A resolution: structural basis for thermostability. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 9264-9268.

72. Korzheva, N., Mustaev, A., Kozlov, M., Malhotra, A., Nikiforov, V., Goldfarb, A., and Darst, S.A. (2000). A structural model of transcription elongation. Science 289, 619-625.

73. Korzheva, N., Mustaev, A., Nudler, E., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. (1998). Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63, 337-345.

74. Kotik, M., and Zuber, H. (1993). Mutations that significantly change the stability, flexibility and quaternary structure of the 1-lactate dehydrogenase from Bacillus megaterium. Eur J Biochem 211, 267-280.

75. Kulbachinskiy, A., Bass, I., Bogdanova, E., Goldfarb, A., and Nikiforov, V. (2004). Cold sensitivity of thermophilic and mesophilic RNA polymerases. J Bacteriol 186, 7818-7820.

76. Kumar, S., and Nussinov, R. (2001). How do thermophilic proteins deal with heat? Cell Mol Life Sci 58, 1216-1233.

77. Kumar, S., Tsai, C.J., and Nussinov, R. (2001). Thermodynamic differences among homologous thermophilic and mesophilic proteins. Biochemistry 40, 14152-14165.

78. Kuznedelov, K., Lamour, V., Patikoglou, G., Chlenov, M., Darst, S.A., and Severinov, K. (2006). Recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase for structural studies. J Mol Biol 359, 110-121.

79. Kuznedelov, К., Minakhin, L., and Severinov, K. (2003). Preparation and characterization of recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase. Methods Enzymol 370, 94-108.

80. Ma, В., Kumar, S., Tsai, C.J., and Nussinov, R. (1999). Folding funnels and binding mechanisms. Protein Eng 12, 713-720.

81. Macedo-Ribeiro, S., Darimont, В., Sterner, R., and Huber, R. (1996). Small structural changes account for the high thermostability of l4Fe-4S. ferredoxin from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. Structure 4, 1291-1301.

82. Machius, M., Declerck, N., Huber, R., and Wiegand, G. (2003). Kinetic stabilization of Bacillus licheniformis alpha-amylase through introduction of hydrophobic residues at the surface. J Biol Chem 278, 11546-11553.

83. Madigan, M.T., and Oren, A. (1999). Thermophilic and halophilic extremophiles. Curr Opin Microbiol 2, 265-269.

84. Makhatadze, G.I., and Privalov, P.L. (1995). Energetics of protein structure. Adv Protein Chem 47, 307-425.

85. Malhotra, A., Severinova, E., and Darst, S.A. (1996). Crystal structure of a sigma 70 subunit fragment from E. coli RNA polymerase. Cell 87, 127-136.

86. Markovtsov, V., Mustaev, A., and Goldfarb, A. (1996). Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 3221-3226.

87. Maseda, H., and Hoshino, T. (1995). Screening and analysis of DNA fragments that show promoter activities in Thermus thermophilus. FEMS Microbiol Lett 128, 127-134.

88. Matsui, I., and Harata, K. (2007). Implication for buried polar contacts and ion pairs in hyperthermostable enzymes. FEBS J 274, 4012-4022.

89. McClure, W.R. (1985). Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes. Annu Rev Biochem 54, 171-204.

90. McDonald, J.H. (2001). Patterns of temperature adaptation in proteins from the bacteria Deinococcus radiodurans and Thermus thermophilus. Mol Biol Evol 18, 741-749.

91. McDonald, J.H., Grasso, A.M., and Rejto, L.K. (1999). Patterns of temperature adaptation in proteins from Methanococcus and Bacillus. Mol Biol Evol 16, 1785-1790.

92. Meyer, J., Clay, M.D., Johnson, M.K., Stubna, A., Munck, E., Higgins, C., and Wittung-Stafshede, P. (2002). A hyperthermophilic plant-type 2Fe-2S. ferredoxin from Aquifex aeolicus is stabilized by a disulfide bond. Biochemistry 41, 3096-3108.

93. Minakhin, L., Nechaev, S., Campbell, E.A., and Severinov, K. (2001). Recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase, a new tool for structure- based analysis of transcription. J Bacteriol 183, 71-76.

94. Minakhin, L., and Severinov, K. (2003). On the role of the Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 region 4.2 and alpha-subunit C-terminal domains in promoter complex formation on the extended -10 galPl promoter. J Biol Chem 278,29710-29718.

95. Miyazaki, K., Wintrode, P.L., Grayling, R.A., Rubingh, D.N., and Arnold, F.H. (2000). Directed evolution study of temperature adaptation in a psychrophilic enzyme. J Mol Biol 297, 1015-1026.

96. Mukhopadhyay, J., Das, K., Ismail, S., Koppstein, D., Jang, M., Hudson, В., Sarafianos, S., Tuske, S., Patel, J., Jansen, R., et al. (2008). The RNA polymerase "switch region" is a target for inhibitors. Cell 135, 295-307.

97. Murakami, K.S., Masuda, S., Campbell, E.A., Muzzin, O., and Darst, S.A. (2002a). Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science 296, 12851290.

98. Murakami, K.S., Masuda, S., and Darst, S.A. (2002b). Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science 296, 1280-1284.

99. Muslin, E.H., Clark, S.E., and Henson, C.A. (2002). The effect of proline insertions on the thermostability of a barley alpha-glucosidase. Protein Eng 15, 29-33.

100. Nagi, A.D., and Regan, L. (1997). An inverse correlation between loop length and stability in a four-helix-bundle protein. Fold Des 2, 67-75.

101. Nardmann, J., and Messer, W. (2000). Identification and characterization of the dnaA upstream region of Thermus thermophilus. Gene 261, 299-303.

102. Naryshkina, Т., Kuznedelov, K., and Severinov, K. (2006). The role of the largest RNA polymerase subunit lid element in preventing the formation of extended RNA-DNA hybrid. J Mol Biol 361, 634-643.

103. Nikiforov, V.G. (1971). Hybrid RNA polymerases formed from core enzymes and sigma factors of E. coli and thermophilic B. megaterium. FEBS Lett 16, 74-76.

104. Nudler, E., Kashlev, M., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. (1995). Coupling between transcription termination and RNA polymerase inchworming. Cell 81, 351-357.

105. Opalka, N., Chlenov, M., Chacon, P., Rice, W.J., Wriggers, W., and Darst, S.A. (2003). Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell 114, 335-345.

106. Orlova, M., Newlands, J., Das, A., Goldfarb, A., and Borukhov, S. (1995). Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 92, 4596-4600.

107. Osipiuk, J., and Joachimiak, A. (1997). Cloning, sequencing, and expression of dnaK-operon proteins from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Biochim Biophys Acta 1353, 253265.

108. Pack, S.P., and Yoo, Y.J. (2004). Protein thermostability: structure-based difference of amino acid between thermophilic and mesophilic proteins. J Biotechnol 111, 269-277.

109. Pack, S.P., and Yoo, Y.J. (2005). Packing-based difference of structural features between thermophilic and mesophilic proteins. Int J Biol Macromol 35, 169-174.

110. Pemberton, I.K., Muskhelishvili, G., Travers, A.A., and Buckle, M. (2000). The G+C-rich discriminator region of the tyrT promoter antagonises the formation of stable preinitiation complexes. J Mol Biol 299, 859-864.

111. Perederina, A., Svetlov, V., Vassylyeva, M.N., Tahirov, Т.Н., Yokoyama, S., Artsimovitch, I., and Vassylyev, D.G. (2004). Regulation through the secondary channel—structural framework for ppGpp-DksA synergism during transcription. Cell 118, 297-309.

112. Perutz, M.F., and Raidt, H. (1975). Stereochemical basis of heat stability in bacterial ferredoxins and in haemoglobin A2. Nature 255, 256-259.

113. Ramirez-Romero, M.A., Masulis, I., Cevallos, M.A., Gonzalez, V., and Davila, G. (2006). The Rhizobium etli sigma70 (SigA) factor recognizes a lax consensus promoter. Nucleic Acids Res 34, 1470-1480.

114. Razvi, A., and Scholtz, J.M. (2006). Lessons in stability from thermophilic proteins. Protein Sci 15, 1569-1578.

115. Ring, B.Z., Yarnell, W.S., and Roberts, J.W. (1996). Function of E. coli RNA polymerase sigma factor sigma 70 in promoter-proximal pausing. Cell 86, 485-493.

116. Roberts, C.W., and Roberts, J.W. (1996). Base-specific recognition of the nontemplate strand of promoter DNA by E. coli RNA polymerase. Cell 86, 495-501.

117. Roberts, J.W., Yarnell, W., Bartlett, E., Guo, J., Marr, M., Ко, D.C., Sun, H., and Roberts, C.W. (1998). Antitermination by bacteriophage lambda Q protein. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63, 319-325.

118. Robinson, C.R., and Sauer, R.T. (1998). Optimizing the stability of single-chain proteins by linker length and composition mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA 95, 5929-5934.

119. Ross, W., Gosink, K.K., Salomon, J., Igarashi, K., Zou, C., Ishihama, A., Severinov, K., and Gourse, R.L. (1993). A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase. Science 262, 1407-1413.

120. Ross, W., and Gourse, R.L. (2005). Sequence-independent upstream DNA-alphaCTD interactions strongly stimulate Escherichia coli RNA polymerase-lacUV5 promoter association. Proc Natl Acad Sci USA 102, 291-296.

121. Rozovskaya, T.A., Chenchik, A.A., and Beabealashvilli, R. (1982). Processive pyrophosphorolysis of RNA by Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Lett 137, 100-104.

122. Rudd, M.D., Izban, M.G., and Luse, D.S. (1994). The active site of RNA polymerase II participates in transcript cleavage within arrested ternary complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 8057-8061.

123. Rudd, M.D., and Luse, D.S. (1996). Amanitin greatly reduces the rate of transcription by RNA polymerase II ternary complexes but fails to inhibit some transcript cleavage modes. J Biol Chem 271, 21549-21558.

124. Russell, R.J., Hough, D.W., Danson, M.J., and Taylor, G.L. (1994). The crystal structure of citrate synthase from the thermophilic archaeon, Thermoplasma acidophilum. Structure 2, 1157-1167.

125. Sadeghi, M., Naderi-Manesh, H., Zarrabi, M., and Ranjbar, B. (2006). Effective factors in thermostability of thermophilic proteins. Biophys Chem 119, 256-270.

126. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. (Cold Spring Harbour Press.).

127. Sanchez, R., Roovers, M., and Glansdorff, N. (2000). Organization and expression of a Thermus thermophilus arginine cluster: presence of unidentified open reading frames and absence of a Shine-Dalgarno sequence. J Bacteriol 182, 5911-5915.

128. Sanderova, H., Hulkova, M., Malon, P., Kepkova, M., and Jonak, J. (2004). Thermostability of multidomain proteins: elongation factors EF-Tu from Escherichia coli and Bacillus stearothermophilus and their chimeric forms. Protein Sci 13, 89-99.

129. Sandman, K., Krzycki, J.A., Dobrinski, В., Lurz, R., and Reeve, J.N. (1990). HMf, a DNA-binding protein isolated from the hyperthermophilic archaeon Methanothermus fervidus, is most closely related to histones. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 5788-5791.

130. Sato, S., Nakada, Y., Kanaya, S., and Tanaka, T. (1988). Molecular cloning and nucleotide sequence of Thermus thermophilus HB8 trpE and trpG. Biochim Biophys Acta 950, 303-312.

131. Serrano, L., Bycroft, M., and Fersht, A.R. (1991). Aromatic-aromatic interactions and protein stability. Investigation by double-mutant cycles. J Mol Biol 218, 465-475.

132. Shiraki, K., Nishikori, S., Fujiwara, S., Hashimoto, H., Kai, Y., Takagi, M., and Imanaka, T. (2001). Comparative analyses of the conformational stability of a hyperthermophilic protein and its mesophilic counterpart. Eur J Biochem 268, 4144-4150.

133. Siddhikol, C., Erbstoeszer, J.W., and Weisblum, B. (1969). Mode of action of streptolydigin. J Bacteriol 99, 151-155.

134. Singer, G.A., and Hickey, D.A. (2003). Thermophilic prokaryotes have characteristic patterns of codon usage, amino acid composition and nucleotide content. Gene 317, 39-47.

135. Sosunov, V., Sosunova, E., Mustaev, A., Bass, I., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. (2003). Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J 22, 22342244.

136. Sosunova, E., Sosunov, V., Kozlov, M., Nikiforov, V., Goldfarb, A., and Mustaev, A. (2003). Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA 100, 15469-15474.

137. Steitz, T.A. (1998). A mechanism for all polymerases. Nature 391, 231-232.

138. Sterner, R., and Liebl, W. (2001). Thermophilic adaptation of proteins. Crit Rev Biochem Mol Biol 36, 39-106.

139. Stetter, K.O. (1999). Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEBS Lett 452, 2225.

140. Struck, J.C., Toschka, H.Y., and Erdmann, V.A. (1988). Nucleotide sequence of the 4.5S RNA gene from Thermus thermophilus HB8. Nucleic Acids Res 16, 9042.

141. Suhre, K., and Claverie, J.M. (2003). Genomic correlates of hyperthermostability, an update. J Biol Chem 278, 17198-17202.

142. Svetlov, V., Belogurov, G.A., Shabrova, E., Vassylyev, D.G., and Artsimovitch, I. (2007). Allosteric control of the RNA polymerase by the elongation factor RfaH. Nucleic Acids Res 35, 56945705.

143. Svetlov, V., Vassylyev, D.G., and Artsimovitch, I. (2004). Discrimination against deoxyribonucleotide substrates by bacterial RNA polymerase. J Biol Chem 279, 38087-38090.

144. Svingor, A., Kardos, J., Hajdu, I., Nemeth, A., and Zavodszky, P. (2001). A better enzyme to cope with cold. Comparative flexibility studies on psyclirotrophic, mesophilic, and thermophilic IPMDHs. J Biol Chem 276, 28121-28125.

145. Szilagyi, A., and Zavodszky, P. (2000). Structural differences between mesophilic, moderately thermophilic and extremely thermophilic protein subunits: results of a comprehensive survey. Structure 8, 493-504.

146. Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H.C., and Weinzierl, R.O. (2008). Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J Biol 7, 40.

147. Tanner, J.J., Hecht, R.M., and Krause, K.L. (1996). Determinants of enzyme thermostability observed in the molecular structure of Thermus aquaticus D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 25 Angstroms Resolution. Biochemistry 35, 2597-2609.

148. Temiakov, D., Zenkin, N., Vassylyeva, M.N., Perederina, A., Tahirov, Т.Н., Kashkina, E., Savkina, M., Zorov, S., Nikiforov, V., Igarashi, N., et al. (2005). Structural basis of transcription inhibition by antibiotic streptolydigin. Mol Cell 19, 655-666.

149. Thompson, M.J., and Eisenberg, D. (1999). Transproteomic evidence of a loop-deletion mechanism for enhancing protein thermostability. J Mol Biol 290, 595-604.

150. Tomazic, S.J., and Klibanov, A.M. (1988). Mechanisms of irreversible thermal inactivation of Bacillus alpha-amylases. J Biol Chem 263, 3086-3091.

151. Toulokhonov, I., and Landick, R. (2006). The role of the lid element in transcription by E. coli RNA polymerase. J Mol Biol 361, 644-658.

152. Toulokhonov, I., Zhang, J., Palangat, M., and Landick, R. (2007). A central role of the RNA polymerase trigger loop in active-site rearrangement during transcriptional pausing. Mol Cell 27, 406419.

153. Travers, A.A. (1980). Promoter sequence for stringent control of bacterial ribonucleic acid synthesis. J Bacteriol 141, 973-976.

154. Trivedi, S., Gehlot, H.S., and Rao, S.R. (2006). Protein thermostability in Archaea and Eubacteria. Genet Mol Res 5,816-827.

155. Unsworth, L.D., van der Oost, J., and Koutsopoulos, S. (2007). Hyperthermophilic enzymes-stability, activity and implementation strategies for high temperature applications. FEBS J 274, 40444056.

156. Van de Casteele, M., Chen, P., Roovers, M., Legrain, C., and Glansdorff, N. (1997). Structure and expression of a pyrimidine gene cluster from the extreme thermophile Thermus strain Z05. J Bacteriol 179, 3470-3481.

157. Van den Burg, В., Vriend, G., Veltman, O.R., Venema, G., and Eijsink, V.G. (1998). Engineering an enzyme to resist boiling. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 2056-2060.

158. Vassylyev, D.G., Sekine, S., Laptenko, O., Lee, J., Vassylyeva, M.N., Borukhov, S., and Yokoyama, S. (2002). Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature 417, 712-719.

159. Vassylyev, D.G., Svetlov, V., Vassylyeva, M.N., Perederina, A., Igarashi, N., Matsugaki, N., Wakatsuki, S., and Artsimovitch, I. (2005). Structural basis for transcription inhibition by tagetitoxin. Nat Struct Mol Biol 12, 1086-1093.

160. Vassylyev, D.G., Vassylyeva, M.N., Perederina, A., Tahirov, Т.Н., and Artsimovitch, I. (2007a). Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase. Nature 448, 157-162.

161. Vassylyev, D.G., Vassylyeva, M.N., Zhang, J., Palangat, M., Artsimovitch, I., and Landick, R. (2007b). Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase. Nature 448, 163-168.

162. Vassylyeva, M.N., Svetlov, V., Dearborn, A.D., Klyuyev, S., Artsimovitch, I., and Vassylyev, D.G. (2007). The carboxy-terminal coiled-coil of the RNA polymerase beta'-subunit is the main binding site for Gre factors. EMBO Rep 8, 1038-1043.

163. Vetriani, C., Maeder, D.L., Tolliday, N., Yip, K.S., Stillman, T.J., Britton, K.L., Rice, D.W., Klump, И.Н., and Robb, F.T. (1998). Protein thermostability above 100 degreesC: a key role for ionic interactions. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 12300-12305.

164. Vieille, C., and Zeikus, G.J. (2001). Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol Mol Biol Rev 65, 1-43.

165. Villbrandt, В., Sobek, H., Frey, В., and Schomburg, D. (2000). Domain exchange: chimeras of Thermus aquaticus DNA polymerase, Escherichia coli DNA polymerase I and Thermotoga neapolitana DNA polymerase. Protein Eng 13, 645-654.

166. Vogt, G., Woell, S., and Argos, P. (1997). Protein thermal stability, hydrogen bonds, and ion pairs. J Mol Biol 269, 631-643.

167. Wang, D., Bushnell, D.A., Westover, K.D., Kaplan, C.D., and Kornberg, R.D. (2006). Structural basis of transcription: role of the trigger loop in substrate specificity and catalysis. Cell 127, 941-954.

168. Wang, D., and Hawley, D.K. (1993). Identification of a 3'—>5' exonuclease activity associated with human RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 843-847.

169. Weisburg, W.G., Giovannoni, S.J., and Woese, C.R. (1989). The Deinococcus-Thermus phylum and the effect of rRNA composition on phylogenetic tree construction. Syst Appl Microbiol 11, 128134.

170. Westover, K.D., Bushnell, D.A., and Kornberg, R.D. (2004). Structural basis of transcription: nucleotide selection by rotation in the RNA polymerase II active center. Cell 119, 481-489.

171. Wieland, Т., and Faulstich, H. (1991). Fifty years of amanitin. Experientia 47, 1186-1193.

172. Wintrode, P.L., Miyazaki, K., and Arnold, F.H. (2001). Patterns of adaptation in a laboratory evolved thermophilic enzyme. Biochim Biophys Acta 1549, 1-8.

173. Wooll, J.O., Wrabl, J.O., and Hilser, V.J. (2000). Ensemble modulation as an origin of denaturant-independent hydrogen exchange in proteins. J Mol Biol 301, 247-256.

174. Xiao, L., and Honig, B. (1999). Electrostatic contributions to the stability of hyperthermophilic proteins. J Mol Biol 289, 1435-1444.

175. Xue, Y., Hogan, B.P., and Erie, D.A. (2000). Purification and initial characterization of RNA polymerase from Thermus thermophilus strain HB8. Biochemistry 39, 14356-14362.

176. Yang, X., and Price, C.W. (1995). Streptolydigin resistance can be conferred by alterations to either the beta or beta' subunits of Bacillus subtilis RNA polymerase. J Biol Chem 270, 23930-23933.

177. Zaccai, G. (2000). How soft is a protein? A protein dynamics force constant measured by neutron scattering. Science 288, 1604-1607.

178. Zavodszky, P., Kardos, J., Svingor, and Petsko, G.A. (1998). Adjustment of conformational flexibility is a key event in the thermal adaptation of proteins. Proc Natl Acad Sci USA 95, 74067411.

179. Zaychikov, E., Martin, E., Denissova, L., Kozlov, M., Markovtsov, V., Kashlev, M., Heumann, H., Nikiforov, V., Goldfarb, A., and Mustaev, A. (1996). Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science 273, 107-109.

180. Zenkin, N., Naryshkina, Т., Kuznedelov, K., and Severinov, K. (2006a). The mechanism of DNA replication primer synthesis by RNA polymerase. Nature 439, 617-620.

181. Zenkin, N., Yuzenkova, Y., and Severinov, K. (2006b). Transcript-assisted transcriptional proofreading. Science 313, 518-520.

182. Zhang, G., Campbell, E.A., Minakhin, L., Richter, C., Severinov, K., and Darst, S.A. (1999). Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell 98, 811-824.

183. Zhou, X.X., Wang, Y.B., Pan, Y.J., and Li, W.F. (2008). Differences in amino acids composition and coupling patterns between mesophilic and thermophilic proteins. Amino Acids 34, 25-33.

Информация о работе

Миропольская, Наталия Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Анализ структурно-функциональных особенностей РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus Aquaticus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы