Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярных механизмов и регуляции биосинтеза белка у растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Искаков, Булат Кудайбергенович, Алматы

/ / Ц ^ / - / ■ V--"

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ - АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И БИОХИМИИ имени М. А. АЙТХОЖИНА

.....[везИДЛ^^Т (9Р

1 ^^^ —*—* ИСКАКОВ Булат^К^даМерпТншйч ^ л рОС

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРШх МЕХАНИЗМОВ И РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗ^ ВЕЛКА У РАСТЕНИЙ

03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация

в виде научного доклада на соискание ученой степени юктора биологических наук

Алматы - 1997

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина МН-АН РК

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Л. П. Овчинников; доктор химических наук, член-корр. РАН, профессор А. А. Краевский; доктор биологических наук, профессор 10. Л. Дорохов.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита состоится "Л9 " С>Ь1997 г. в '¡О*' часов на заседании

диссертационного совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией в виде научного знакомиться в библиотеке

Биологического факультета V

Диссертация в виде научного ,г ,яа«з разослана " е^сс^иг-ё^ ^ 1997 г.

7

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук В. Н. Каграманов

МЪО-Щ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Изучение механизмов и регуляции биоситеза белка - одна из главных задач молекулярной биологии. Контроль экспрессии генов на уровне трансляции матричных (м)РНК у прокариот известен уже на протяжении многих лет и лишь относительно недавно был надежно продемонстрирован на молекулярном уровне для эукариотических организмов. В настоящее время уже хорошо описано несколько примеров трансляционного контроля экспрессии генов в эукариотических клетках: мРНК гена С€N4 у дрожжей; мРНК белков теплового шока 22 кДа и 70 кДа у ОюяорИНа; мРНК ферритина и трансферринового рецептора, а также многие мРНК вирусов животных и растений. Изучение этих примеров показало, что первичная структура мРНК заключает в себе не только информацию о кодируемом белке, но и полный набор сведений о самой мРНК как о функционирующей молекуле. Информация второго рода расшифровывается труднее и далеко не все элементы структуры, существенные для функционирования мРНК, выявлены в настоящее время. Даже в тех случаях, когда они известны, чаще всего не ясно, каким компонентам транслирующего аппарата адресована эта информация и как она распознается и реализуется.

Многочисленные работы последних лет показывают, что важную роль в модуляции эффективности трансляции мРНК играют их 5'-нетранслируемые последовательности (5'-НТП). Основными структурными чертами 5'-НТП, влияющими на эффективность трансляции эукариотических мРНК, являются: наличие и стабильность вторичной структуры; присутствие и взаимное погттЛт,ожение "ложных" инициирующих кодонов и соответствующих им ...ыТых рамок трансляции; определенное нуклеотидное окружение вблизи ложных" и "истинных" инициирующих кодонов; доступность 5'-концевой ¡(-структуры мРНК.

Однако, несмотря на очевидную значимость, ни одна из этих черт, ни даже 11 озокупность не могут охватить всего многообразия факторов, регулирующих ; | " ансляцию мРНК в эукариотических клетках. Большая роль в этом отводится мому аппарату трансляции. Из 12 белковых факторов инициации трансляции ¡ул^рцот (еГР) некоторые (е1Р4Е, -4Г, -4А) могут связываться с 5'-концевой ; -структурой и участвовать в АТФ-зависимом расплетании вторичной эуктуры 5'-НТО мРНК. Активность факторов трансляции (е!Р2, -4В, -4Е, -

4F, eEFl, eEF2) может регулироваться посредством ковалентных модификаций. Кроме того, в последнее время появляются работы по изучению низкомолекулярных РНК и вторичных продуктов метаболизма, которые, по-видимому, могут участвовать в регуляции процесса трансляции. Следует помнить также, что мРНК в эукариотических клетках находятся в комплексе со специфическими белками, образуя рибонуклеопротеидные комплексы -информосомы, и что белки информосом также могут регулировать эффективность трансляции мРНК.

Таким образом, эукариотические мРНК транслируются с различными эффективностями как in vivo, так и in vitro. Молекулярные механизмы такой неравной трансляции еше не выяснены, однако экспериментальные данные свидетельствуют, что в их основе лежит взаимодействие мРНК с компонентами белок-синтезирующего аппарата. Влияние eis- и írans-действующих регуляторных факторов на эффективность трансляции мРНК у растений изучено гораздо слабее, чем у животных.

Хотя основные пути биогенеза мРНК и этапы их трансляции в клетках животных и растений сходны, исследования последних лет свидетельствуют, что между ними имеется существенная разница в механизмах регуляции биосинтеза белка. Как показано в работах нескольких групп исследователей, многие белковые факторы трансляции растений отличаются от своих аналогов из клеток животных по структуре и не являются взаимозаменяемыми в гетерологичных бесклеточных системах синтеза белка. Нами впервые показано, что в растительных системах, по-видимому, отсутствует регуляция синтеза белка посредством фосфорилирования факторов инициации eíF2 и элонгации eEF2, надежно установленная и хорошо изученная для клеток животных.

Все эти факты свидетельствуют, что молекулярные механизмы и регуляция биосинтеза белка у растений требуют самостоятельного детального изучения. Знание этих механизмов позволит направленно создавать растения с качественно новыми хозяйственно-ценными признаками, открывает возможность для борьбы с вирусными заболеваниями.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению молекулярных механизмов и регуляции биосинтеза белка в клетках высших растений с целью поиска механизмов трансляционного контроля, характерных для клеток растений, а также с целью сравнения их с таковыми у клеток животных и выявления возможных различий между ними.

В задачи исследования входило:

1. Выделение, характеристика белковых факторов инициации (eIF2) и элонгации (eEF2) трансляции из зародышей пшеницы и изучение регуляции их активностей посредством фосфорилирования.

2. Поиск продуктов вторичного метаболизма растений, обладающих способностью специфически влиять на процесс трансляции, и изучение механизма их действия.

3. Идентификация и характеристика преинициаторных трансляционных комплексов в экстрактах зародышей пшеницы и выяснение причин их накопления.

4. Поиск и характеристика малых шггошшматических РНК клеток зародышей пшеницы. Изучение их биогенеза, свойств и возможных функций в регуляции трансляции.

Научная новизна и практическая ценность работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые широкое и систематическое исследование молекулярных механизмов регуляции биосинтеза белка у растений в сравнении с таковыми у животных. Установлено, что между ними имеются существенные различия. Кроме того, данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют, что в клетках растений могут функционировать специфические, отличные от животных, механизмы трансляционного контроля.

Впервые изучены параметры взаимодействия фактора инициации трансляции e!F2 зародышей пшеницы с GDP и GTP. Измеренные константы диссоциации этих комплексов свидетельствуют, что сродство фактора eIF2 растений к GDP лишь в 10 раз выше, чем к GTP, в то время как в клетках животных это превышение оценивается в 100-300 раз. Эти результаты свидетельствуют, что механизм регуляции активности растительного фактора eIF2 может существенно отличаться от механизма регуляции аналогичного фактора клеток животных, а также во многом объясняют отсутствие ингибирующего действия низких концентраций двуспиральных (дс)РНК на синтез белка в клетках растений.

Также впервые показано, что фактор элонгации 2 (eEF2) из зародышей пшеницы способен фосфорилироватьея в условиях in vitro посредством eEF2-специфичной Са2+/калмодулин-зависимой киназы, полученной из ретикулоцитов кролика. При этом фосфорилированный фактор eEF2 зародышей пшеницы теряет свою активность в бесклеточной системе трансляции так же как и его

фосфорилированный животный аналог. Однако в экстрактах из различных растительных объектов не удалось обнаружить эндогенной eEF2-фосфоршшрующей активности. Эти данные свидетельствуют что, хотя активность фактора eEF2 растений потенциально может регулироваться фосфорилированием, данный механизм регуляции, по-видимому, не реализуется в клетках растений.

Впервые обнаружено, что полипроантоцианидин (И ПА) - полифенольное соединение из верблюжьей колючки Alhagi kiigisorum S. в концентрации 1-5 мкМ практически полностью ингибирует синтез белка в бесклеточных системах трансляции, специфически связываясь с фактором eIF2 и блокируя его способность формировать тройной комплекс [GTP*eIF2*Met-tRNAj |. Эти данные свидетельствуют, что вещества вторичного метаболизма могут играть важную роль в регуляции белкового синтеза в клетках растений.

Впервые в клетках высших растений обнаружены 45S рибонуклео-протеидные (РНП) частицы, содержащие значительное количество быстрометящейся н о во с и н тез и ро r а н н о й РНК, обладающей матричной активностью. Изучение компонентного состава и физико-химических свойств 45S частиц свидетельствует, что они представляют собой 48S преинициаторные трансляционные комплексы, содержащие 40S рибосомные субчастицы, факторы инициации, GTP, Met-tRNA¡ и мРНП. Накопление таких комплексов в цитоплазме клеток растений указывает на существование факторов, контролирующих последовательность этапов инициации после связывания мРНП с 40S, но до присоединения 60S субчастиц.

Впервые в составе 45S РНП частиц зародышей пшеницы обнаружена малая РНК длиной около 135 нуклеотидов (обозначенная как 5,3S РНК). Показано, что 5,3S РНК локализуется также в полисомах и 80S рибосомах, но не обнаруживается в безрибосомных субклеточных фракциях. После диссоциации 80S рибосом в буфере с высокой ионной силой 5,3S РНК остается в комплексе с 40S субчастицей.

Установлено, что при нормальной температуре (25°С) 5,3S РНК присутствует в составе лишь 5-10% рибосом, тогда как после теплового шока (1ч при 37°С) ее количество увеличивается в 5 раз и от 25 до 50% рибосом становятся 5,3S РНК-содержащими. Кроме того установлено, что выделенная 5,3S РНК прочно и специфически связывается с фактором инициации eIF2, но не взаимодействует с элонгационным фактором eEF2. Эти данные свидетельствуют, что 5,3S РНК может участвовать в регуляции синтеза белка у зародышей пшеницы при тепловом шоке на уровне инициации трансляции.

Работа имеет теоретическое и методическое значение для последующих исследований по выяснению регуляторных механизмов биосинтеза белка и представляет интерес для специалистов в области молекулярной биологии, вирусологии и физиологии растений. Обнаруженное ингибирующее действие ППА на функцию фактора eIF2 предполагает возможность использования его в качестве тонкого инструмента при изучении механизмов и регуляции трансляции в эукариотических бесклеточных системах, поскольку он весьма специфично ингибирует функцию фактора eIF2 как зародышей пшеницы, так и ретикулоцитов кролика. Очищенный препарат ППА передан для проведения научно-исследовательских работ в лаборатории Техасского Университета (г. Остин, США) и Кентского Университета (г. Кантербери, Англия). Очищенные препараты факторов eIF2, eIF4E, eEF2 зародышей пшеницы передавались в различные научно-исследовательские лаборатории в России: Институт белка PAII, МГУ им, М. В. Ломоносова, Новосибирский Институт биоорганической химии, а также в других странах: Кентский Университет (Англия), Институт Фридриха Миш ера (Швейцария). В эти же, а также во многие другие организации передавался высококачественный экстракт из зародышей пшеницы, который использовался для in vitro трансляции.

Структура работы. Диссертация изложена в форме научного доклада. Материалы, использованные в диссертации, получены самостоятельно и в соавторстве с сотрудниками лаборатории белка и нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина - С.К.Смаиловым, С.М.Шайхиным, А.В.Ли, Е.В.Кожановым, Н.С.Полимбетовой, К.И.Мадиным, С.Ш.Жаныбековой. Всем коллегам автор выражает благодарность. Особую благодарность автор приносит академику А. С. Спирину за поддержку и постоянный интерес к данной работе.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на многих конференциях и симпозиумах, в том числе: 14-м Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988); Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989); 19-й конференции ФЕБО (Рим, 1989); Международном симпозиуме "Регуляция трансляции" (Рига, 1989); Республиканской конференции "Современные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989); 10-м Советско-Французском симпозиуме "Организация и экспрессия геномов эукариот и прокариот" (Киев, 1990); 2-м съезде

Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990); 3-м Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, 1991); 14th International tRNA Workshop (Ридзина, Польша, 1991); Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды" (Иркутск, 1991); Международной конференции "Protein biosynthesis" (Пущино, 1991); 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991); 1-м Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино,

1991); 3-й конференции "Translational Control" (Колд Спринг Харбор, США,

1992); 2-м Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993); 4-м Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, Нидерланды, 1994); Международной конференции "Baev memorial conference" (Москва, 1996); "Translational control" (Колд Спринг Харбор, США, 1996); Международном симпозиуме по стрессу и ассимиляции неорганического азота (Москва, 1996); 10-м вирусологическом конгрессе (Иерусалим, Израиль, 1996).

Диссертация обобщает результаты 28 экспериментальных работ, опубликованных в отечественных и зарубежных журналах, а также в монографии "Информосомы растений" (М.А. Айтхожин, Б.К. Искаков). Работа выполнена при финансовой поддержке Академии наук Казахстана, Международного научного фонда (грант MYH000), фонда INTAS (грант 93-2549).

Использованные сокращения. 40S СЧ. 60S СЧ - 40S и 60S субчастицы рибосом; 5'-НТП - 5'-нетранслируемая последовательность мРНК; БТШ - белки теплового шока; ДС-Na - додецилсульфат натрия; дсРНК - двуспиральная РНК; НАД - никотинамидадениндинуклеотид; ПААГ - полиакриламидный гель; ППА - полипроантоцианидин; РНП - рибонуклеопротеид; ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид; ЭДТА - этиле идиаминтетрауксусная кислота; eEF - эукариотический фактор элонгации трансляции; meEF - eEF млекопитающих; peEF - eEF растений; elF - эукариотический фактор инициации трансляции; eIF2(aP) - фактор eIF2, фосфорилированный по а-субъединице; melF - elF млекопитающих; ре IF - elF растений; HRI - гемин-регулируемый ингибитор (протеинкиназа, активируемая при дефиците гемина); Met-tRNA, - инициаторная тРНКМет, ацидированная метионином; р! - изоэлектрическая точка: PKR -протеинкиназа, активируемая дсРНК; mPKR - PKR млекопитающих; pPKR -PKR растений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ НА

УРОВНЕ БЕЛКОВЫХ ФАКТОРОВ ТРАНСЛЯЦИИ

Синтез белка в клетках про- и эукариот представляет собой комплексный процесс, состоящий из многих стадий и включающий в себя большое число компонентов. Собственно синтез полипептидов обеспечивается рибосомными субчастицами, с которыми взаимодействуют трансляционные ферменты (факторы инициации, элонгации и терминации), мРНК и аминоацил-тРНК.

Среди белков, входящих в состав аппарата трансляции эукариотических клеток, идентифицировано более, чем 20 фосфопротеинов, (J. W. В. Hershey, 1989, J.Biol.Chem., Vol. 264, рр.20823-20826). Это указывает, что их фосфорилирование/дефосфорилирование может служить механизмом регуляции трансляции. Действительно, в ретикулоцитах кролика впервые были обнаружены и охарактеризованы механизмы регуляции активности двух ключевых факторов трансляции - фактора инициации 2 (eIF2) и фактора элонгации 2 (eEF2). Оба механизма основываются на фосфорилировании факторов специфическими протеинкиназами, что сопровождается ингибированием синтеза белка. Эти механизмы были позднее обнаружены и в других клетках животных, а также у дрожжей, что позволило считать фосфорилирование eIF2 и eEF2 универсальными механизмами регуляции трансляции для всех эукариотических клеток.

Процесс трансляции для растительных объектов изучен значительно слабее, и предполагается, что он регулируется так же, как и в клетках животных. Однако, в последнее время стали накапливаться данные, свидетельствующие о различиях в трансляционных аппаратах животных и растительных клеток. Например, б