Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние деформации на каталитическую активностьбелков-ферментов в кристаллическом состоянии.Карбоксипептидаза А.

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние деформации на каталитическую активностьбелков-ферментов в кристаллическом состоянии.Карбоксипептидаза А."

ргб оа

- о шл» 1905

На правах рукописи

ЗЕНЧЕНКО ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

Влияние деформации на каталитическую активность белков-ферментов в кристаллическом состоянии. Карбоксипептидаза А.

03.00.02 - Биофизика •

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущино, 1995 г.

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии наук.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Морозов Виктор Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Бур штейн Эдуард Аронович доктор физико-математических наук Лобышев Валентин Иванович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН.

Защита диссертации состоится У 1995 г. в. Г*

час 3 О мин на заседании диссертационного совета Д200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, г. Пущино, Московской обл.. Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

.Авторефератразослан О г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Нелипович П. А.

общая характеристика работы

Актуальность темы.

Выяснение роли внутримолекулярной подвижности в функционировании биополимеров вообще и в процессе ферментативного катализа в частности является одной из фундаментальных проблем современной молекулярной биофизики. Несмотря на многолетние исследования, пока не существует однозначного и окончательного ответа на вопрос о функциональной необходимости конформационных изменений в процессе каталитического акта.

Традиционно подавляющее большинство исследований свойств белков было выполнено на растворах. Однако изучение механохимических взаимодействий в белках потребовало разработки способов иммобилизации молекул, т.к. еще в 1942г В.А.Энгельгардт и М.Н.Любимова отмечали, что в растворе невозможно строго контролировать прикладываемые нагрузки, и интерпретация результатов сильно затруднена. Прямое доказательство необходимости таких движений можно получить, только если контролируемым образом наложить ограничения на конформаци-онную подвижность глобулы и измерить влияние таких ограничений на удельную активность.

В последнее время было предложено два пути исследования влияния деформации на каталитическую активность. В первом случае молекулы подвергались деформации в гидродинамическом поле (1), во втором глобулы пришивали ковалентно к поверхности полимерного волокна и деформировали вместе с ним (2). В этих исследованиях найдена сильная зависимость активности от деформации, однако оба подхода обладают рядом недостатков. Непостоянная и неконтролируемая деформация белковых молекул в гидродинамическом методе вызывает трудности при интерпретации результатов на молекулярном уровне. Метод, использующий иммобилизацию белка на поверхности эластичного волокна, имеет те же ограничения: силы, прикладываемые таким образом к молекулам, различны по величине и ориентированы случайным образом.

Удобным объектом для изучения механохимических свойств является белковый кристалл. Во-первых, такой выбор объекта позволяет обойти указанные выше затруднения, поскольку молекулы в кристалле расположены строго упорядочение и прикладываемая нагрузка распределяется между молекулами равномерно. Т.к. упа-

t

ковка молекул известна из РСА, то, деформируя кристалл в различных направлениях, мы имеем возможность воздействовать на разные степени свободы белковых молекул. Во-вторых, кристаллизация многих белков-ферментов приводит к сильному снижению их удельной активности даже в отсутствие всяких стерических и диффузионных ограничений (3). Поэтому можно ожидать для таких ферментов, что растяжение кристалла будет снимать ингибирова-ние активности силами кристаллической решетки.

Цель и задачи работы.

Задачей настоящего исследования является разработка нового подхода к изучению механохимических взаимодействий в белках-ферментах, основанного на использовании монокристаллов ферментов в качестве объекта исследования.

Для решения поставленной задачи потребовалось:

1 .Усовершенствовать микрометод, разработанный В.Н.Морозовым для измерения ферментативной активности кристаллических срезов и пленок белков, с целью обеспечения возможности одновременного измерения активности и напряжения в образце, а также стабильности измерений скорости реакции.

2.Провести изучение влияния одноосной механической деформации на каталитическую активность карбоксипептидазы А (CPA).

3.С целью выяснения физических механизмов, лежащих в основе обнаруженных эффектов деформации провести исследование влияния температуры, ингибиторов и денатурирующих агентов на удельную активность кристаллов CPA.

Научная новизна.

Новый микрометод для исследования поведения активности кристаллических образцов под нагрузкой позволил впервые изучить влияние одноосной механической деформации на удельную активность при контролируемой нагрузке в образце. Обнаружено многократное (до 30 раз) увеличение удельной активности в ответ на деформацию образца. Показано, что такой рост активности при растяжении не связан со снятием диффузионных ограничений. Впервые изучено воздействие гуанидин гидрохлорида на кристаллическую карбоксипептидазу А и показано, что эффект возрастания активности при растяжении пропадает в присутствии GuHCl.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что сильное падение ферментативной активности при кристаллизации белка связано с ограничением конформационной подвижности, наложенным силами кристаллической решетки, несмотря на то, что рентгеноструктурные исследования не выявили крупномасштабных движений в процессе связывания аналогов субстратов.

Практическое значение работы.

Результаты проведенного исследования влияния деформации на различные параметры кристаллического среза CPA важны для понимания фундаментальных вопросов молекулярной биофизики: для подтверждения необходимости свободных конформационных движений в каталитическом цикле и выявления связи физических и химических процессов, происходящих в кристаллическом белке под действием различных внешних воздействий.

Полученный впервые эффект возрастания активности при деформации белкового кристалла может послужить основой для разработки методов быстрого внешнего управления скоростью ферментативной реакции.

Впервые примененный в данной диссертации микрометод может быть использован для изучения поведения белковых молекул под нагрузкой и для выяснения влияния различных биотехнологических процессов на каталитические свойства белков.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на Институтской научной конференции (декабрь 1993).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения), выводов, и списка цитируемой литературы. Работа изложена на & страницах, содержит рисунков и ■J таблиц.

материалы и методы.

Метод измерения.

Микрометод измерения, использованный в работе, был разработан В.Н.Морозовым для измерения удельной активности кристаллических срезов белков, подвергаемых одноосной деформации. Измерения проводили в термосгатируемой влажной камере, расположенной на предметном столике микроскопа (рис 1). Образец закрепляли одним концом в держателе, соединенном с микрометрическим винтом 10, а вторым концом приклеивали к кварцевому волокну динамометра 4 и помещали в каплю субстрата 13, свободно висящую на конце микропипеггки 7. Скорость реакции определяли по скорости изменения рН раствора с помощью иридиевого микроэлектрода.

Рисунок I. Схема влажной камеры для измерения активности кристаллических образцов под нагрузкой. 1 - образец, 2 - держатель динамометра. 3 -кварцевое волокно динамометра, 4 - капилляр для отсоса капли. 5,9 - капли серы, 6 - мешалка, 7 - микрокапилляр для формирования капли субстрата, 8 -солевой мостик электрода сравнения, 10 - держатель образца, 11 - иридиевый электрод, 12 - изоляция иридиевого электрода, 13 - микрокапля раствора субстрата.

Выращивание кристаллов и изготовление образцов.

В качестве объекта исследования были выбраны кристаллы карбоксипептидазы А, обработанные глутаровым альдегидом.

9

10

CPA (Reanal) была закристаллизована по методу (4) из 1% раствора белка в 20мМ вероналовом буфере, 1М NaCl, рН=7.5, диализом против низкой концентрации соли при 4'С. Иммобилизацию проводили в течение 6 час в 0.1% растворе GA. Срезы кристаллов делали с помощью санного микротома и хранили в маточном растворе. Перед измерением из них вырезали образцы требуемых размеров с помощью кусочка лезвия бритвы, закрепленного в держателе. Обычно образцы имели размеры длину 300-700мкм, ширину 20-80мкм и толщину 4-10мкм.

В качестве субстрата использовали сложный эфир гиппурил-DL-P-фениллактат натрия (HPLA), который при гидролизе освобождает один протон на молекулу субстрата.

Условия проведения экспериментов.

Эксперименты проводили на кристаллических срезах CPA, вырезанных в направлении [010], в растворе 50мМ HPLA, ЮмМ вероналового буфера, 0.2М NaCl, при t=25'C (если не оговорены особые условия).

результаты и обсуждение.

Удельная активность CPA в кристаллическом иммобилизованном состоянии по отношению к HPLA равна 0.45±0.3мкМ/мг• мин (ФЕ), что составляет 0.5% от ее активности в растворе. Особенностью CPA является значительный разброс величины удельной активности. Было показано, что активность образцов, вырезанных из середины кристаллического среза, всегда выше (до двух раз), чем активность образца, вырезанного из края того же среза. Этот факт отражает, по-видимому, различную степень обработки глутаровым альдегидом поверхности кристалла и его глубинных слоев.

Было обнаружено, что растяжение образца приводит к резкому многократному увеличению скорости реакции. Как видно из рис2 и 3, где показаны типичные результаты измерения зависимости относительной активности V/Vo и напряжения а от степени деформации е(%), существует три области деформации, в которых зависимости относительного роста активности V/Vo(e) и напряжения ст(е) имеют различный характер.

Так, в области обратимых деформаций (до 10%) растяжение приводит к 3-6 кратному линейному росту активности, а сила натяжения подчиняется закону Гука.

е(%) £(%)

Рис.2 Рис.3

Рисунок 2. Относительное увеличение активности кристаллической CPA, в зависимости от кратковременной (40 с) деформации в направлении [010]. Измерения проводили в 50мМ растворе HPLA, в ЮмМ вероналовом буфере, 0.2М NaCI, рН=7.5.

Рисунок 3. Кривая зависимости напряжение-деформация для кристаллического среза CPA.

В области средних деформаций (10-90%) напряжение постоянно и составляет для разных образцов (5-8)* 10s Па. Растяжение приводит к дальнейшему росту активности, но уже не такому резкому и неполностью обратимому. Сброс натяжения уменьшает скорость реакции в два раза.

Дальнейшее растяжение (при е>100%) вызывает слабое падение активности при слабом росте силы натяжения.

Активность изометрически растянутого до е = 60-70% образца уменьшается в течение нескольких часов до половины первоначальной величины, после чего стабилизируется. Измерение концентрационной и температурной зависимостей проводили на образцах, выдержанных в этом режиме около суток.

Концентрационная зависимость активности недеформиро-ванного и растянутого на 66% образца изображена на рис 4. Как видно, несмотря на увеличение скорости реакции, обе зависимости хорошо спрямляются в координатах Лайнуивера-Берка и характеризуются величинами Км = 11 ±0.8 мМ, совпадающими в пределах погрешности эксперимента. Факт постоянства Км при растяжении опровергает предположение, что эффект увеличения скорости реакции обусловлен просто увеличением скорости диффузии субстрата и продуктов в деформированном образце.

1 о

Ui

о

-1 оо

-50

О

50 100 150 200

1/S, М '1

Рисунок 4. Концентрационная зависимость активности кристаллической CPA в исходном (треугольники) и деформированном (ромбы) на 66% состоянии в обратных координатах.

Простые оценки показывают, что толщина образца, используемого в экспериментах, достаточно мала, что диффузионные ограничения не играли роли. В случае низкой концентрации субстрата [S]<<Km толщина критического слоя определяется формулой

где D и Се - коэффициент диффузии и концентрация субстрата в образце, соответственно. Из литературных данных известно для CPA Се =45 мМ и D-3» Юбсм2/сек (5). По нашим данным, Км=П.5мМ и kcat=0.2 сек-', так что для толщины критического слоя получаем hCT = 20 М. При концентрации субстрата 50мМ, пятикратно превышающей Км, толщина диффузионного слоя будет гораздо больше.

При отсутствии диффузионных ограничений наблюдаемая активация деформированного кристалла может быть обусловлена следующими причинами:

1 .Освобождение активных центров, ранее блокированных межмолекулярными контактами;

О)

1 I

2.Образование новых каталитических участков на деформированной и/или развернутой молекуле;

3.Освобождение аллостерических центров, связывание субстрата на которых ускоряет реакцию в активном центре;

4.Снятие конформационных ограничений, наложенных силами кристаллической решетки на конформационную подвижность белковой глобулы.

Однако при ближайшем рассмотрении оказывается, что первые три гипотезы наталкиваются на противоречия.

Так, предположение об освобождении активных центров, ранее блокированных межмолекулярными контактами противоречит постоянству Км. Кроме того, Спилбург с сотрудниками пришли к заключению, что в кристалле CPA "активный центр открыт в раствор и доступен для связывания субстрата" (5).

Нами было обнаружено, что степень ингибирования реакции гидролиза HPLA конкурентным ингибитором карбобензоксигли-цином (Z-Gly) в кристалле составляет 30% и не изменяется при растяжении образца на 60% и 120%. Поскольку при растяжении кристалла остается неизменным не только Км , но и степень ингибирования этой реакции карбобензоксиглицином, приходится отбросить и предположение о возникновении новых каталитических центров на развернутой молекуле.

Гипотеза об освобождении аллостерических центров связывания также не подходит, поскольку в растворе, где, как надо полагать, доступны все такие центры, при увеличении концентрации субстрата наблюдается сильное субстратное ингибирование, которое отсутствует в кристалле (5). Следовательно, освобождение аллостерических центров при растяжении образца должно приводить к замедлению реакции.

Таким образом, только предположение о снятии ограничений конформационной подвижности, наложенных силами кристаллической решетки, не противоречит ни одному из полученных фактов. И именно эта гипотеза явилась основой для построения качественной теории, объясняющей индуцированные деформацией изменения в образце. В пользу необходимости значительных конформационных движений на этапе катализа говорит также тот факт, что увеличение вязкости раствора уменьшает скорость гидролиза HPLA растворенной карбоксипептидазой А (6).

В области малых деформаций наблюдаемую сильную зависимость У/Уо(е) и быструю обратимость при снятии нагрузки легко объяснить непосредственной механической деформацией кристаллической решетки,что частично снимает ограничения на подвижность молекул, однако не вызывает из денатурации. Очевидно, что влияние деформации будет наблюдаться в этой области растяжений, если лимитирующая стадия сопряжена с заметными изменениями формы молекулы. По формуле для работы деформации при расширении сферической полости в упругой изотропной среде (7) можно оценить масштаб энергии перехода между двумя состояниями для молекулы в кристаллической решетке:

^ 2(1 +л) (2)

для объяснения 220-кратного падения активности при кристаллизации ехр(ДСга/ЯТ)=220, (с1-с!о)=3.9 А.

При деформациях больше 10% начинается разрыв межмолекулярных контактов и молекулы "повисают" на ковалентных сшивках, образованных цепочками глутарового альдегида. Концентрация напряжения в точках присоединения сшивок приводит к немедленному разворачиванию глобул. Однако часть молекул, висящих на одной или двух сшивках, могут при этом не испытывать никакой нагрузки, а увеличение доступного объема из-за денатурации соседних молекул приведет к почти полному снятию ограничений для конформационной подвижности этих молекул. Можно предположить, что при длительном выдерживании под нагрузкой часть деформированных молекул будет разворачиваться, напряжение упадет, что позволит другим молекулам перейти в начальное, менее активное состояние. Этим можно объяснить падение удельной активности в изометрическом режиме. При сбросе натяжения после средних и больших деформаций восстановление длины и активности идет в гораздо меньшей степени из-за образования контактов между цепями денатурированных молекул: "повисшие" на сшивках глобулы остаются активированными. Наличием в области средних деформаций двух конкурирующих процессов - активации молекул за счет снятия конформационных ограничений и денатурации глобул - можно объяснить меньший наклон прямой на графике активность-деформация в этой области растяжений.

Влияние обработки гуанидин гидрохлоридом на эстеразную активность кристаллической карбоксипептидазы А имеет сложный характер. Добавление виНС! в раствор субстрата вызывает резкое

160 -г

140 -

120 -

8. 100 Л

i 80 -

60 -

40 -

20 -

120

t, мин

Рисунок 5. Инактивация кристалла CPA в присутствии GuHCl. Измерения активности проводили попеременно в присутствии 3.5М GuHCl (треугольники) и в отсутствии денатуранта (квадраты) на недеформирован-ном образце.

кратковременное увеличение удельной активности фермента и затем медленное экспоненциальное ее падение (рис 5). Инактивация образца происходит только в присутствии субстрата, однако не зависит от наличия GuHCl в растворе, если образец был однократно обработан денатурантом (рис.6). 'Видимо, присутствие субстрата в "расшатанной" денатурантом кристаллической решетке нарушает неустойчивое равновесие глобул и инициирует процесс перехода в более стабильное состояние, в котором большая часть молекул неактивна.

Если [GuHCl] > 3 М, наблюдается обратимое увеличение линейных размеров образца на 30%,. Было также об-

t, мин

Рисунок 6. Инактивация CPA после кратковременного (5 мин) погружения в 3.9М раствор GuHCl, в полулогарифмических координатах. Измерения проводили в растворе субстрата без добавления денатуранта.

наружено, что при деформации образца в присутствии 3.5 М GuHCl эффект увеличения активности полностью исчезает, однако его можно наблюдать на образце, предварительно обработанном 3.5 М GuHCl. В присутствии денатуранта кристаллическая решетка становится более мягкой и подвижной, что облегчает конформаци-онные перестройки в белковой молекуле. Таким образом, присутствие GuHCl уже снимает конформационные ограничения даже в недеформированном кристалле.

На рис 7 изображена температурная зависимость удельной активности кристаллической CPA в интервале температур от 4 до 45' С для образца в нативном и деформированном на 66% состоянии (после 24 час выдерживания в изометрическом режиме для

1,0 -

,5 -

о,о -

Ь

С -.5-

-J

"1,0 --1,5 --2,0 -

3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6

1ЛГ, 10 г К"1

Рисунок 7. Температурная зависисмость удельной активности кристаллической CPA в нативном (квадраты) и растянутом на 66% состоянии (треугольники).

установления равновесия). От 4 до 33 'С обе зависимости хорошо спрямляются в координатах Аррениуса с эффективной энергией активации 11.5 Ккал/моль для недеформированного образца и 13.9Ккал/моль для растянутого. Известно, что энергия активации этой реакции в растворе равна 11.5 кал/моль в интервале 5-50 ° С (6), т.е. при кристаллизации Еа гидролиза HPLA практически не изменилась, несмотря на 220-кратное падение удельной активности. Аналогичное заключение сделали Квиочо и Ричарде для пептидаз-ной активности кристаллической CPA (8). Этот факт можно рассматривать как показатель того, что лимитирующая стадия остает-

^ t

ся неизменной при кристаллизации, а ингибирование активности обусловлено значительным увеличением предэкспоненциального (энтропийного) фактора. Этот энтропийный множитель уменьшается в результате деформации образца, что и приводит к ускорению реакции одновременно с возрастанием энергии активации.

При температуре 33'С на графиках температурной зависимости активности кристаллической CPA в нативном и деформированном состоянии появляется резкий излом, и в диапазоне 33-40° С наклоны прямых примерно равны и соответствуют энергии активации 3.5 Ккал/моль. Показательно, что для пептидазной активности кристаллической CPA Квиочо и Ричарде также наблюдали отклонение от линейности на графике температурной зависимости при t = 39 "С (8). Этот излом обратим, если максимальная температура не превышала 40°С, и, видимо, сигнализирует о внутренних перестройках, происходящих в кристаллической решетке при повышении температуры.

Таким образом, исследования активности ферментов в кристаллическом состоянии позволяют получить новые сведения о физико-химических механизмах, обеспечивающих их функциональную активность. Проведение измерений на отдельных монокристаллах и срезах, подвергаемых контроллируемым деформациям, позволяет приблизится к ответу на один из старых вопросов энзи-мологии о роли больших конформационных движений в работе ферментов.

основные результаты работы

¡.Разработаны методики измерения активности кристаллических срезов карбоксипептидазы А в микрокапле субстрата объемом 10-М0-7 литра методом микроэлектродной техники; изготовления иридиевых микроэлектродов, и одновременного измерения удельной активности и напряжения в образце, подвергаемом одноосному растяжению.

2,Обнаружено сильное влияние одноосной механической деформации кристалла карбоксипептидазы А на ее удельную активность. Увеличение скорости сопровождается увеличением энергии активации реакции.

З.Показано, что существует три области с разным характером зависимости активности от величины деформации: в области малых деформаций (0-8%) наблюдается сильное обратимое уве-

личение удельной активности (до 600% от исходной), в области средних значений (8-80%) эффект увеличения активности частично необратим, и в области больших деформаций (более 80%) растяжение приводит к падению активности.

4.Показано, что наблюдаемые механохимические эффекты не являются следствием изменения диффузионных ограничений в кристалле при деформации, так как величина константы Михаэлиса остается при деформации неизменной.

5.Изучено влияние денатурирующего агента СиНС1 на удельную активность нативного и деформированного кристалла. Показано, что добавление виНО в раствор субстрата резко увеличивает удельную активность на малых временах (3-5 мин) и инактивирует образец в дальнейшем уже вне зависимости от присутствия денату-ранта в растворе субстрата. Также показано, что в присутствии СиНС1 эффект увеличения активности при растяжении полностью исчезает.

6.Предложен качественный механизм, объясняющий характер зависимости активности от деформации. Характер связи изменения энтропийных и энтальпийных активационных параметров реакции при деформации указывает на то, что возможной причиной ме-ханохимического эффекта является снятие ограничений на кон-формационную подвижность молекулы фермента со стороны кристаллической решетки.

Материалы диссертации опубликованы в следующих печатных работах l.V.N.Morozov, A.V.Gorelov, T.A.Zenchenko. - A new micromethod for mechano-chemical research. J.Biochemical Biophysical Methods, 1992, 25, pp. 45-53.

2.3енченко Т.А., Морозов B.H. - Влияние деформации на каталитическую активность карбоксипептидазы А в кристаллическом состоянии. - Биофизика, 1994,39, вып 4, 583-587

3.T.A.Zenchenko, V.N.Morozov - Mechanical deformation enhances catalytic activity of crystalline carboxypeptidase A. - Protein Science, 1995, 4, 251-257.

Цитированная литература.

1.Tirrel М, Middleman S.- Biophys. J, 1978, 23, p 121.

2.Березин И.В., Клибанов A.M., Мартинек К.- УФХ, 1975, 10, сгр 2519-2528.

3.Рапли Дж.А. В кн: Структура и стабильность биологических макромолекул.- М."Мир", 1973г, стр 255-319.

4.Quiocho F.A. & Richards F.M.- Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1964, 52, 833-839.

5.Spilburg С.А., Bethune J.L. & Vallee B.L. Biochemistry, 1977, 16, n6,p 1142-1150.

6.Хоштария Д.Э., Гогуадзе Н.Г.,Ульструп E. Биоорганическая химия, 17, 5, 1991 г, стр 618-625.

7.Френкель Я.И. Кинетическая теория жидкостей. JI., Наука, 1975, с. 592

8.Quiocho F.A, Bishop W.H & Richards F.M.-Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1967, 57, 3, pp 525-534.