Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретический анализ пространственной структуры невалентного фермент-субстратного комплекса ризопуспепсина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Теоретический анализ пространственной структуры невалентного фермент-субстратного комплекса ризопуспепсина"

_РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ггда

(НСТИТУТЛ|ОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

г*

да

На правах рукописи

КАШПАРОВ Илья Валерьевич

ЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ НЕВАЛЕНТНОГО ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО КОМПЛЕКСА РИЗОПУСПЕПСИНА.

03.00.03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степепи кандидата химических наук

Москва-1998

Работа выполнена в лаборатории химии протеолиигческих ферментов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю. А.Овчинникс РАН

Научные руководители — доктор химических наук,

профессор р.М.Попов] доктор химических наук Л. Д.Рум

Официальные оппоненты:

профессор, доктор физико-математических наукН.С. Андреева, профессор, доктор биологических наук Козлов Л.В.

Ведущая организация: Институт биомедицинской химии РАМН

Защита диссертации состоится 1998 г. в ча

заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекуляр биологии им. В. А. ЭнгельгардгаРАНпо адресу; 117984 г.Москва, ул. Вави 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекуляр] биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан "5-0 " КШ^Я 1998 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аспартатные протеиназы относятся к классу широко распространенных эндопептидаз, обнаруживаемых практически во всех таксономических группах животных, растений, микроорганизмов и ретровирусах. Их медико-биологическая значимость определяется участием в контроле ряда процессов жизнедеятельности человека, связанных с пищеварением (пепсин), регуляцией кровяного давления (ренин), метаболизме белков и процессинге гормонов (катепсины Б,Е) и некоторых других. Установление роли аспартатных протеиназ в созревании частиц ретровирусов, вызывающих такие заболевания как СПИД, некоторых видов лейкозов, сарком и опухолей молочных желез определило их значение в качестве мишеней для антивирусной терапии. В результате многих исследований стало очевидным, что целенаправленный поиск эффективных лекарственных средств невозможен без знания деталей каталитического механизма действия этих ферментов и понимания структурных основ их специфичности.

В настоящее время представление о механизме каталитического действия аспартатных протеиназ формируется преимущественно на основе данных рентгенострук-турного анализа. Однако, несмотря на чрезвычайную информативность этого метода, он имеет ряд специфических ограничений. Во-первых, получаемая с его помощью информация касается статического состояния фермента и, следовательно, прямо не отвечает на вопрос о динамических конформационных характеристиках трехмерных структур. Во-вторых, этот метод, за редким исключением, позволяет расшифровывать структуры комплексов ферментов лишь с ингибиторами но не с субстратами. Получаемые данные о многих сериях ингибиторных комплексов демонстрируют отличия этих ингибиторов по своему химическому и пространственному строению как от истинного субстрата, так и друг от друга. Не зная продуктивного расположения субстрата в активном центре, а также актуальных для катализа фермент-субстратных взаимодействий и обусловленных ими конформационных перестроек, — трудно составить достаточно полное и объективное представление о специфике каталитической реакции. Поэтому для решения задачи о каталитическом механизме действия ферментов полезно привлечение методов теоретического конформационного анализа и компьютерного моделирования, позволяющих установить продуктивное расположение расщепляемой связи специфического субстрата относительно каталитически активных групп и предсказать некоторые детали строения возникающих в процессе реакции короткоживущих промежуточных соединений.

Цель настоящей работы состоит в изучении конформационных аспектов каталитического механизма аспартатной протеиназы ризопуспепсина и, прежде всего, структурных особенностей ее невалентных комплексов со специфическим субстратом и промежуточным тетраэдрическим соединением на основе подходов и методов теоретического компьютерного моделирования. Главными задачами исследования

являются

• Выбор структурной модели субстрат-связывающего участка молекулы фермента и апробация расчетного метода.

• Предсказание энергетически предпочтительных конформационных состояний субстрата в активном центре ризопуспепсина на стадии образования невалентного комплекса и их последуклций анализ с целью оценки продуктивности расположения гидролизуемой пептидной группы относительно каталитически активных групп фермента.

• Моделирование структуры тетраздрического промежуточного соединения в комплексе с ризопуспепсином и его анализ с целью установления факторов, существенных для протекания катализа.

• Анализ полученных структурных данных и создание возможной модели каталитического механизма ризопуспепсина.

Научная новизна и практическая ценность работы. С использованием методов теоретического конформационного анализа и компьютерного моделирования предсказаны пространственные структуры комплексов ризопуспепсина со специфическим ингибитором, субстратом и промежуточным тетраэдрическим соединением. Впервые для представителей семейства аспартатных протеиназ данные о структуре фермент-субстратного комплекса были получены с использованием теоретического расчетного метода, позволяющего провести поиск энергетически предпочтительных структурных вариантов олигопептидного лиганда в активном центре фермента на основе анализа всех потенциально разрешенных локальных конформационных состояний его фрагментов. Предложена новая модель каталитического механизма действия аспартатных протеиназ, объясняющая возможность функционирования этих ферментов в щелочном диапазоне значений рН. Полученные результаты позволяют предложить модель дня анализа химических стадий каталитического акта методами квантовой химии. Апробации работы. Результаты данной работы были представлены на Международной конференции "Biocatalysis-95" (Суздаль. Россия, 1995), на Ш-м Международном симпозиуме по биоорганической химии, IUPAC (Сочи, Дагомыс, Россия, 1995), на VII Международной конференции по аспартатным протеиназам (Банф. Канада, 1996), на IV-м Симпозиуме «Химия протсолитических ферментов» (Москва, 1997) на IV-м Международном симпозиуме по биоорганической химии, IUPAC (Биарриц. Франция, 1997), на VII-m Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, Россия, 1998). на Международной конференции "Biocatalysis-98" (Москва, Пущи но, 1998) Публикации. По материалам исследования опубликовано 10 печатных работ. Структура работы. Диссертационная работа изложена на страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов и методов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего ib-O работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выбор объектов

Ризопуспепсин - аспартатная протеиназа из низших грибов, характеризующаяся широкой специфичностью, используется в промышленности для ферментации продуктов, а также при приготовлении специфических восточных блюд. Она отличается от протеи-наз млекопитающих заметной способностью расщеплять субстраты, содержащие в Р, положении остаток лизина. Согласно данным рентгеноструктурного анализа структура ризопуспепсина в свободном состоянии и в комплексах ингибиторами, благодаря особенностям кристаллической упаковки, имеет наименьшие отличия по сравнению с другими известными аспартатными протеиназами. Этот факт позволяет рассматривать ризопуспепсин как наиболее простую модель для изучения каталитического механизма. (Попов, 1994).

В качестве олигопептидных лигандов были выбраны следующие соединения.

1. Гексапептидный субстрат Рго1-РЬе2-Н1зЗ-Ьуз4-РЬе5-Уа1б, с расщепляемой связью между остатками Ьуэ4 и РЬе5.

2. Промежуточное тетраэдрическое соединение Рго1-РЬе2-НЬЗ-Ьуз4¥[С(ОН)г-ЫН]-РЬе5-Уа16

3. Субстратоподобный ингибитор Рго1-РЬе2-НзЗ-РКе4¥[СН2-ЬГН]РЬе5-Уа16, содержащий восстановленную связь между остатками РЬе4 и РЬе5.

Начальный этап исследования состоит в выборе структурной модели субстрат-связывающего участка ризопуспепсина и апробации метода априорного встраивания лиганда путем предсказания геометрии ингибиторного комплекса, структура которого известна. Таким образом, предоставляется возможность сравнения независимо полученных данных теории и эксперимента. Предполагается, что при совпадении геометрии субстратоподобного ингибитора в рассчитанном комплексе с экспериментально известной кристаллической структурой, не должно возникнуть больших сомнений в достоверности результатов аналогичной работы с субстратом, которые не могут столь же однозначным образом быть подтверждены экспериментально.

Следующая часть исследования включает моделирование пространственной структуры невалентных комплексов ризопуспепсина со своим специфическим субстратом и промежуточным тетраэдрическим соединением. Результаты этого этапа позволяют получить представление о предпочтительных конформационных состояниях субстрата на разных стадиях катачитической реакции, о причинах возможных структурных перестроек активного центра при образовании комплекса, а также о причинах предрасположенности системы к изменению валентного состояния субстрата. Не менее важным является и ю, что информация о аруктуре невалентных комплексов позволяет предложить рабочую схему каталитического механизма ризопуспепсина и осуществить целенаправленный выбор квантовохимической модели для изучения химических ста-

дий каталитического акта.

Потенциальные функции н эмпирические параметры

Использованный в расчетах метод атом-атомных потенциалов основан на механической модели, аппроксимирующей молекулу системой точечных масс-атомов без учета их электронно-ядерной структуры и квантовой природы. Общая энергия внутримолекулярных взаимодействий определялась, в соответствии с принципом Борна-Оп-пенгеймера, как аддитивная сумма независимых энергетических вкладов отдельных видов взаимодействий:

и„и+и+и +и+и где

общ= кв утл торс ЭЛ ВС..

1)т - энергия певалеитных взаимодействий; и^ - энергия деформации валентных углов; иторс - энергия вращения вокруг валентных связей; 11м - энергия электростатических взаимодействий; и>с - энергия водородных связей.

Невалентные взаимодействия оценивались по потенциалу Леннарда-Джонса с системой параметров Скотта и Шераги (1970), электростатические взаимодействия в монопольном и дипольном приближениях с парциальными зарядами на атомах, предложенными в работе Момани (1975), при диэлектрической постоянной е=4, соответствующей малой полярности среды в области контактов активного центра и лигаида. Водородные связи описывали потенциалом типа Морзе с оптимальным значением энергии связи 2.0 ккал/моль (Попов, 1968). Торсионные потенциалы вращения вокруг связей субстрата и боковых цепей подвижных остатков взяты из работы Момани (1975). Структурная модель субстрат-связывакнцего участка рнзочуспепсина и конформационные возможности аминокислотных остатков активного центра.

Выбор структурной модели субстрат-связывающего участка ризопуспепсина для моделирования исвалентных комплексов проводился на основе сравнительного анализа кристаллографических структур свободного ризопуспепсина и его ингибиторного комплекса. а также с учеюм результатов конформационного анализа оешков аюиннош центра Азр35 и Лир218. Выявление степени потенциальной подвижности остатков при связывании лигаида, позволило дифференцировать те из них, геометрию которых можно жестко фиксировать в процессе поиска оптимальных конформаций лигандов и остатки, которые необходимо включить в процедуру минимизации энергии.

Анализ ризопуспепсина в свободном состоянии и в комплексе с исследуемым ингибитором методом молекулярного наложения свидетельствует о высокой консервативности его структуры при связывании ингибитора. В образовании карманов связывания принимает участие 48 остатков, находящихся в 7 А от исследуемого ингибитора (Рис. 1). Незначительные конформационные изменения при образовании комплекса затраг ивают лить 5 из них. Остатки Туг77-01у80, представляющего собой часть петли-козырька. прикрывающего каталитическую область от контакта с растворителем, ирс-

Рис. 1 Структурная модель активнного центра ризопуспепсина, включающая 48 аминокислотных остатков(слабый контур), расположенных в 7 А от молекулы ингибитора (жирный контур).

терпевают незначительное трансляционное смещение как единое целое приблизительно на 0.4-0.7А в сторону активного центра, а остаток Аэп119 изменяет ориентацию боковой цепи. Это изменение может быть связано с возможной компенсацией потери водородной связи между АвпПЭ и молекулой воды \V698, уходящей при связывании ингибитора, при переориентации Азп119 в сторону боковой цепи 01и16. Новое состояние Азп 119 сохраняется при этом для всех известных ингибиторных комплексов ризопуспепсина. Таким образом, в качестве начального структурного приближения можно выбрать модель ингибиторного комплекса, в которой боковые цепи всех остатков, кроме Туг77-01у80 фиксируются в экспериментально наблюдаемых минимумах.

Активные центры всех аспартатных протеиназ содержат два остатка аспараги-новой кислоты Акр35 и АБр218 (в нумерации ризопуспепсина) непосредственно участвующих в каталитическом акте. Их взаимодействие в свободных ферментах опосредовано наличием консервативной связанной молекулы воды \V507, а в ингибиторах - гид-роксилыюй или иной группой аналога пептидной связи. Оба остатка располагаются в противоположных доменах белка и сближены в пространстве таким образом, что карбоксильные группы их боковых цепей лежат в одной плоскости. Считается, что компланарность карбоксильных групп АБр35 и Азр218 важна для протекания катализа. Поэтому оценка степени подвижности их боковых цепей представляет определенный инте-

Х^ед

х, <*ед

Рис.2 Карты х1"Х2 потенциальной поверхности боковых цепей каталитических остатков Аэр35 и Аэр218 ризопуспепсина: а - Остатки Аэр35 (жирный контур) и Абр218 (слабый контур) в активном центре свободного фермента на фоне профиля потенциальной поверхности боковой цепи одиночного остатка аспарагиновой кислоты (пунктирная линия); б - потенциальный профиль боковой цепи Азр218 в нативном ризопуспепсине (слабый контур) и в активном центре с заменой 61у37А1а (жирный контур). Цифры на эквипотенциалях обозначают относительную энергию (ккал/моль).

рес. Возникает вопрос о структурных основах стабилизации природной конформации этих остатков в активном центре ризопуспепсина и о потенциальной возможности влияния связывания субстрата на конформационное состояние Аэр35 и Азр218. Поэтому мы исследовали факторы стабилизации природной конформации каталитических остатков АэрЗб и Лэр218 в интерьере активного центра ризопуспепсина.

Представление о конформационной подвижности боковых цепей остатков Аэр35 и Азр218 в каталитическом центре ризопуспепсина и об их оптимальных формах было получено из конформационных карт "/,'—у} их боковых цепей, построенных с шагом 5° с использованием указанных потенциальных функций и параметризации. Оценка конформационных свойств боковых цепей каталитических остатков аспарагиновой кислоты АБр35, Ляр218 ризопуспепсина проводилась с использованием модели построенной по координатам атомов кристаллической структуры 2арг из международного банка

трехмерных структур (Protein Data Bank). Учитывались координаты тех остатков, атомы которых располагались в радиусе 7А от исследуемого. Для Asp35 и Asp218 соответствующий фрагмент белка включал по 18 аминокислот: Asp35-Ser39, Туг77, Leul22-Glvl26, Туг 169, Asp218-Thr221 для Asp35; и Asp35-Ser38, Trpl95, Ile216-Leu223, Ile298-Asp301, Leu34 для Asp218. Специальная проверка показала, что учет большего числа остатков практически не сказывается ни на энергии взаимодействия исследуемых остатков с молекулярным окружением, ни на форме потенциальной поверхности создаваемого поля.

На рис. 2 а представлены конформационные карты х1—х2°статков Asp35 и Asp218 ризопуспепсина на фоне профиля потенциальной поверхности боковой цепи свободного изолированного остатка метиламида Ы-ацетил-Ь-аспарагиновой кислоты, построенной при углах ер, vy основной цепи, взятых из экспериментальных значений Asp35. Низкоэнергетическая область на карте каждого остатка занимает небольшую площадь, ограниченную по ушу х1 в 10°, и несколько большую по углу %2 — 50°. При этом она совпадает с низкоэнергетической областью свободной аминокислоты. Это обстоятельство, а также хорошее соответствие экспериментальных значений углов х' и и рассчитанного минимума потенциальной поверхности свидетельствует о том, что хотя боковые цепи Asp35 и Asp218 в свободной протеиназе ограничены по своей подвижности, тем не менее, не испытывают стерических напряжений. Сопоставление контуров потенциальной поверхности этих остатков в поле белка с профилем свободной ас-парагиновой кислоты показывает, что ограничение информационной свободы боковых заместителей Asp35 и Asp218 по углу х1 в существенной степени обусловлено их взаимодействием со своей основной цепью. Структурные предпосылки ограниченности информационной свободы Asp35, Asp218 по углу хг становятся ясными при рассмотрении информационных карт их боковых цепей в модифицированном активном центре модели.

Конформационный анализ показывает, что пределяющее значение для структуры активного центра ризопуспепсина имеют остатки Gly37 и Gly220 из повторяющегося в аспартатных протеиназах триплета Asp-Thr-Gly. Любой другой остаток в положении 220 (37), содержащий боковую цепь приводит к существенным стерическим затруднениям при его взаимодействии с карбоксилом остатка Asp35 (218) из противоположного домена. Это обстоятельство иллюстрирует конформационная карта % 1 -%2 Asp218 ризопуспепсина, построенная для активного центра, в котором остаток G!y37 заменен на А!а. (Рис.2 б). Как видно, даже такая минимальная модификация запрещает экспериментальный конформационный минимум в области -170°, -170° и смещает его в область -80°, 20°. При этом абсолютное значение энергии стабилизации для боковой цепи Asp218 ухудшается, согласно нашим оценкам, на ~20 ккал/моль. Аналогичные результаты были получены и для остатка Asp35. Таким образом, наблюдаемая консервативность Gly37 (220) и его аналогов у всех без исключения представителей аспартатных протеиназ

обусловлена, по-видимому, тем обстоятельством, что замена этого остатка на любую другую аминокислоту с неизбежностью вела бы к структурным перестройкам, запрещающим продуктивную взаимную ориентацию карбоксильных групп Asp35. Asp218 и нарушающим их взаимодействие с предполагаемым нуклеофилом - консервативной молекулой воды W507.

Полученные данные об ограниченности конформационной подвижности Asp35 и Asp218 в свободном ферменте свидетельствуют о том, что связывание субстрата не должно приводить к существенному изменению конформационного состояния Asp35 и Asp218 даже в пределах их экспериментальных конформационных минимумов, что позволяет фиксировать их боковые цепи при расчете геометрии лигандов в нсвалентных комплексах.

Комплекс ризопуспепсипа с пептидным ингибитором

Метод поиска энергетически предпочтительных конформаций олигопептидного лиганда в активном центре ризопуспепсина основан на фрагментарном подходе, включающем анализ конформационных состояний отдельных фрагментов данного лиганда в силовом поле фермента при постепенном наращивании его длины. Тот факт, что с удлинением цепи чувствительность пептида к своему информационному состоянию возрастает не для всех сочетаний самых выгодных конформаций фрагментов, а лишь для некоторых, привносящих наибольшую дополнительную стабилизацию с остатками активного центра, позволяет избежать перебора всех возможных для него конформаций, и осуществлять поиск конформационного минимума анализируя лишь лучшие по энергии пространственные варианты.

В качестве модельного объекта был выбран гексапептидный фрагмент Prol-Phc2-His3-Phe4vy[CHj-NH]-Phe5-Val6 ингибитора ризопуспепсина, имеющий восстановленную пептидную связь между остатками Phe4 и Phe5. Его структура в комплексе с ризопуспепсином была получена с разрешением 1.8А (Зарг в Protein Data Bank). Считались irmcciin.iMii коордншим томов фермент и молекул связанной воды, расположенных в радиусе 7А от каждого атома ингибитора (всего 48 аминокислотных остатков). Атомы водорода основной и боковой цепи добавлялись согласно стереохимическим правилам. после чего боковые цепи оптимизировались в своих локальных конформационных минимумах. Координаты атомов молекулы ингибитора считались неизвестными, и знания о них не использовались для теоретического предсказания его положения в активном центре фермента. Единственное исключение составили координаты атома азота остатка Pro 1 в положении Р4, то есть достаточно удаленного (-12.5А) от каталитической области, положение которого задавалось интерактивно. На основании проведенного ранее сравнительного анализа структуры ризопуспепсина в свободном состоянии и в комплексе с ингибитором, положение всех остатков лиганд-связывающего участка на этапе поиска

ifi-

s

Рис. 3 Схема и этапы расчета энергетически предпочтительных «информационных состояний олигопептидного лиганда в активном центре ризопуспепсина на примере дипептидного фрагмента Prol-Phe2: а - поиск разрешенных ориентации пролинового цикла; б - уточнение положения пролинового кольца для всех найденных начальных приближений; в - поиск предпочтительных ориентации пептидного линкера между Prol и Phe2; г - поиск предпочтительных положений основной цепи Phe2; д - определение разрешенных конформационных состояний для боковой цепи Phe2 при найденных положениях основной цепи остатка. Пунктиром соединены точки конформационного пространства, относящиеся к самой низкоэнергетической структуре фрагмента.

начальных приближений фрагментов считалось фиксированным, но на стадии пооста-точной минимизации полученных конформаций, эти остатки фермента раскрепощались и оптимизировались в своих экспериментальных локальных минимумах совместно с фрагментами ингибитора.

Для построения конформационных карт и расчета энергии фрагментов рассчитываемого ингибитора при поиске их локальных минимумов в поле фермента использовалась библиотека топологических структур из разработанного нами программного комплекса FAG. При этом модель комплекса представлялась во внутренних координатах (длина связи, валентный угол, двугранный угол) в предположении постоянных длин валентных связей и валентных углов. В расчете учитывались невалентные и электростатические взаимодействия всех валентно несвязанных атомов, водородные связи и заторможенное вращение вокруг ординарных и тс-сопряженных связей боковых и основных цепей остатков. Расчет энергии проводился с использованием потенциальных функций и параметров описанных ранее. Оптимизация геометрии всех найденных разрешенных конформаций для отдельных фрагментов и целой молекулы лиганда проводилась с помощью программы NEWTON комплекса TINKER при использованием стандартного поля Amber-95 с константой диэлектрической проницаемости среды равной 4.

Процедуру поиска оптимальных пространственных форм лиганда и оценку их энергетической предпочтительности рассмотрим на примере дипептида Prol-Phe2 ингибитора ризопуспепсина. Возможные положения в пространстве пролинового цикла в предположении жесткой валентной схемы определяются значениями виртуальных двугранных утлов вращения вокруг ортогональных связей а, ß и у с малой длиной, так что при изменении указанных двугранных утлов положение начального атома азота можно было считать фиксированным (рис.3 а). Анализируя попарно зависимость энергии невалентных взаимодействий как функцию трех пар углов a-ß, а-у и ß-y путем построения конформационных карт (сечений функции потенциальной энергии в координатах указанных двугранных углов) были выя&пены области с низкой энергией, определяющие возможные положения пролинового кольца и карбонильного атома углерода С' относительно остатков субстрат связывающего участка. При этом конформация, близкая к экспериментальной, имела лучшую среди всех найденных структур внутреннюю энергию (-21.2 ккап/моль против -18.4 у ближайшей по энергии конформаций).

Далее фрагмент наращивался на 2 атома, и для лучших значений пары углов a-ß всех найденных вариантов положение пролинового цикла уточнялось путем построения карты y-vi/^Prol) (Рис. 3 б), с последующей оптимизацией во всех найденных структурных вариантов с помощью программы Newton. На следующем этапе исследу-ичея конформационные возможности пептидной группы между остатком Prol. считающимся неподвижным, и Phe2, у Са атома которого находятся метильная группа и карбонильный углерод. Возможные положения этого фрагмента в активном центре

Рис. 4 Совмещение экспериментальной (тонкая линия) и рассчитанной (жирная линия) структур молекулы ингибитора в активном центре ризопуспепсина.

определяются по конформационной карте vj/j- ср2 при фиксированном значении двугранного утла <в пептидной группы равном 180°. Пример варианта сечения потенциальной поверхности, построенной для локальной ориентации остатка Prol близкой к экспериментальной, приведен на рис. 3 в. Наборы найденных разрешенных значений угла служили исходными вариантами для вариации углов <p2-ve2 (рис. 3 г), определяющих положение основной цепи остатка Phe2. При этом боковая цепь Phe2 заменялась на аланиновую. На последующем шаге процедуры для набора конформационных точек по углу <р, определялись возможные положения боковой цепи Phe2 (Рис. 3 г) и проводилась оптимизация дипептидного фрагмента Prol-Phe2. Последующий анализ всех возможных структурных вариантов для остатков фрагмента His3-Val6 молекулы ингибитора проводился по описанной выше схеме.

Результаты моделирования комплекса ризопуспепсина с субстратоподобным пептидным ингибитором представлены на рис. 4. Конформационные параметры его самого низкоэнергетического структурного варианта хорошо соответствуют кристаллографической структуре. Среднеквадратичное отклонение положения атомов экспериментальной и теоретической конформации молекулы ингибитора составило 0.58А при совмещении по атомам основных цепей остатков субстрат связывающего участка. Теоретически рассчитанный комплекс в своей наиболее предпочтительной по энергии пространственной форме сохраняет присущую экспериментальной структуре сеть межмолекулярных контактов, включая консервативные водородные связи между лигандом и подвижной петлей-козырьком.

Геометрические параметры ингибитора и энергетические вклады его остатков в общую энергию невалентпых взаимодействий представлены в таблице 1. Из ее

Таблица 1. Теоретически рассчитанные (верхние значения в ячейках таблицы) п экспериментальные (нижние значения) конформацнонные параметры (град.) и энергетические вклады (ккал/моль) отдельных остатков молекулы ингибитора Рго1-РЬе2-Ш53-РЬе4\у1СН2-МН]-РНе5-Уа16 с восстановленной пептидной связью.

Остаток Ф CO X* X2 хз Ди

Prol 120 177 -25,7

163 179

Phe2 -82 168 -175 -59 -60 -16,7

-114 158 180 -66 -41

His3 -145 40 -173 -51 63 -39,9

-140 65 180 -49 64

Phc4|\|/| -88 60* 121* -49 -30 -37,1

-99 59* 129* -48 -33

Phc5 -76* 157 171 70 105 -53,6

-84* 165 176 67 97

VaI6 -74 111 61 180 180 -8,4

-113 152 65

* жирным шрифтом выделены углы, принадлежащие восстановленной связи.

рассмотрения следует, что наибольший вклад в стабилизацию комплекса вносит дипептид Phe4[vj/]-Phc5, - фрагмент Р,-Р',, определяющий чувствительность ризопуспепсина к ингибитору. Основную роль в суммарном потенциале взаимодействия для этого дииептида играет энергия электростатических взаимодействий, благодаря целочисленному положительному заряду группы N11, аналога расщепляемой связи. Протоны ее иминного атома азота способны образовывать водородные связи с карбоксильными группами каталитических остатков аспарагиновой кислоты Asp35 и Asp218. При этом рассматриваемый фрагмент молекулы субстрата занимает мссю консервативной молекулы связанной воды W507.

Хорошее совпадение предсказанной геометрии молекулы ингибитора с се экспериментальной конформацией подтвердило адекватность выбранной структурной модели и расчетного метода и позволило перейти к моделированию невалентного фермент-субстратного комплекса. Комплекс рпзопуспеисина с субстратом.

Для предсказания структуры невалентного фермент-субстратного комплекса ризопуспепсина применялся подход аналогичный рассмотренному ранее.

субстрата ризопуспепсина, полученных в отсутствии молекулы связанной воды W507 (комплекс-1, тонкая линия) и в ее присутствии в активном центре (комплекс-2, жирная линия). Соответствующие молекулы воды обозначены кружками: W2 - аналог кристаллографической воды W507 {комплекс-2), W1 -молекула воды, положение которой в комплексе-1 было найдено экспериментально.

Гексапептидный субстрат Prol-Phe2-His3-Lys4-Phe5-Val6 отличается от ингибитора лишь одной заменой в четвертом положении: вместо остатка Phe4[\j/]-CH2 он содержит стандартный остаток Lys, что связано с выраженной лизиновой специфичностью ризопуспепсина. В соответствии с имеющимися в литературе предположениями о возможных состояниях расщепляемой связи субстрата в активном центре, определение низкоэнергетических информационных состояний субстрата в субстрат связывающем участке ризопуспепсина проводилось в двух начальных приближениях: в отсутствие в актином центре молекулы связанной воды VV507 (камтекс-1) и с учеюм взаимодействия с ней (ктчпскс-2). Помимо молекулы лиганда, в процедуру оптимизации на всех этапах включался фрагмент Tyr77-GIy80 (петля-козырек), тогда как координаты остальных остатков субстрат-связывающего участка считались фиксированными.

Все энергетически предпочтительные структурные варианты субстрата принимают в активном центре фермента вытянутую конформацию, со значениями двугранных углов ф. Ц1 основной цепи, характерными для ^-структуры. Центральный фрагмент Lys4-Phe5 (Р^Р',) и каталитические остатки Asp35 и Asp218 активного центра экранированы от растворителя петлей-козырьком. Для каждой структурной модели (с молекулой воды W507 и без нее) конформационный анализ выявил в активном центре несколько близких по энергии пространственных форм со сходным расположением основной, и несколько отличающимися состояниями боковых цепей остатков Lys4 и С-конце-

Таблица 2. Теоретически рассчитанные коиформациоиные и энергетические (ккал/моль) параметры молекулы субстрата Рго1-РЬе2-НкЗ-Ьу54-РЬс5-Уа16 в невалентиых комплексах рцзопуспепснна для двух приближений: с учетом взаимодействия с кристаллографической молекулой воды \V507 (Каиплекс 2), верхние значения в ячейках таблицы) и в отсутствие \V507 в активном центре ризопуспепсииа 0Комплекс 7), нижние значения). Жирным шрифтом выделены углы дипентидного фрагмента Ьуз4-РЬе5, определяющие различие в положении гидролизуемой пептидной связи в найденных невалентных комплексах.

Ост. <Р со XI Х2 хз Х4 ди

Рш1 173 -174 -44,3

172 -178 -44,2

РЬс2 -131 162 -170 -69 -58 -18,3

-139 166 -174 -67 -60 -19,4

НЬЗ -150 43 -164 -55 82 -34,5

-146 36 -170 -50 69 -35,9

Ьув4 -73 20 -177 -73 160 172 174 -114,5

-71 96 162 -62 154 173 172 -109,4

РЬе5 -88 149 180 48 91 -19,5

-154 155 -177 60 98 -16,9

Уа16 -124 154 67 180 180 -5,7

-157 82 53 180 180 -2,8

вого остатка Уа1б.

Две самые предпочтительные по энергии информации - комплекс-! и каиплекс-2 представлены на рисунке 5. С учетом энергетических вкладов всех остатков, включенных в минимизацию, комплекс-2 характеризуется более низкой энергией внутри- и межостаточных взаимодействий (-209.0 против -202.0 ккал/моль). Структурные и энергетические характеристики соответствующих конформаций приведены в таблице 2.

Как следует из таблицы, для субстрата возможна реализация двух конформаций отличающихся друг от друга положением расщепляемой пептидной связи относительш каталитических групп фермента. Различие между ними обусловлено конформационнык состоянием центрального дипептида Ьуз4-РЬе5 (Таб. 2) и затрагивает три его двугранны; угла ш4 5 и ф5. Описанная ситуация, однако, как видно из рис. 5 и таб. 2, не сильнс сказывается на состоянии боковых цепей Ьуз4 и РЬе5. В случае комплекса-1 расщепляема: нептидная группа субстрата располагается относительно каталитических остатков АярЗ: и Азр218 таким образом, что ее карбонильный кислород занимает положение связанно! молекулы воды \V507 (Рис. 5, тонкий контур), во втором случае, связь С'=( гидролизуемой пептидной группы ориентирована в направлении «внешнего» атома С

статка Лэр35 (Рис. 5, жирный контур).

'омплекс-1. Наиболее близкой по строению к ингибиторному комплексу является труктура фермент-субстратного комплекса, найденная при отсутствии в активном центре вязанной молекулы воды \V507. В центре связывания ризопуспепсина молекула убстрата принимает вытянутую конформацию, сходную с таковой у ингибитора, 'асщеплясмая связь между остатками Ьуз4-РЬс5 находится в непосредственной близости т двух карбоксильных групп каталитически активных аспарагиновых кислот Аяр35 и ^р218. Если судить по смещению карбонильного атома углерода ЬуяД, рассматриваемый ипептид по сравнению с ингибитором несколько приподнят (на -0.8 А) над остатками 1эр25 и Ляр218. Характерной особенностью рассматриваемой структуры является то, то в отсутствии в активном центре молекулы воды \V507, ее положение занимает атом ислорода гидролизуемой пептидной связи. В комплексе с ферментом он находится приблизительно в плоскости образуемой четырьмя атомами кислорода боковых цепей АБр35 I А$р218, располагаясь на приблизительно одинаковом расстоянии (3,0 и 3,1 А) от внутренних" атомов О5 этих остатков (рис. 6 а).

(омплекс-2. Альтернативная ориентация субстрата в активном центре ризопуспепсина >ыла найдена путем независимого исследования его информационных возможностей с •четом консервативной молекулы воды \V507, располагающейся в нативном ферменте I плоскости карбонильных групп Авр35 и Азр218. Взаимодействие субстрата с \V507 »граничивает информационную свободу его остатка 1ля4 по двугранному углу у, который I этом случае может принимать лишь значения вблизи 20° (Таб. 2). Такая ситуация, как :ледует из таб. 2 и рис. 5, существенно изменяет возможное положение расщепляемой тептидном связи субстрата между ЬувД и РЬе5 относительно каталитически активных >статков активного центра, не сильно сказываясь на конформационном состоянии их юковых цепей. Так, расстояние между атомами Ср составляет для Ьув4 и РЬе5 -0.5 А, три более существенном различии в положениях атомов карбонильного углерода (1.42 V) и кислорода (2.82 А) расщепляемой связи. Остальные остатки субстрата также не тзменяют своего положения, и, в целом, расположение молекулы лиганда в активном (ентре весьма сходно в обоих случаях.

Минимизация энергии с учетом \V507 оказывает влияние и на положение зстатков фрагмента Тут77-С1у80 фермента, - части конформационно лабильной Р-пстли, трикрывающей каталитическую область ризопуспепсина от контактов с растворителем. 3 процессе минимизации энергии этот фрагмент претерпевает небольшое смещение в :торону от активного центра и занимает позицию сходную с положением в свободном ферменте. При этом происходит перераспределение ряда направленных иежмолскулярных контактов между субстратом и петлей-козырьком. Так, имеющаяся V ингибитора водородная связь между основной цепью РЬе5 и 01у78 исчезает с эдноврсмснным образованием связи между ЫН-группой 01у78 и карбонилом Ьуя4

Рис. 6 Взаимное расположение гидролизуемой пептидной группы субстрата, каталитических остатков Asp35, Asp218 и нуклеофильных молекул воды и соответствующие межатомные расстояния в рассчитанных субстратных комплексах ризопуспепсина комплекс-1 (а) и комплекс-2 (б).

субстрата, а боковая цепь Asp79 несколько удаляется от основной цепи His одновременно образуя связь с его имидазолом. 'Гот факт, что конформационное состоят флепа в невалентном комплексе Михаэлиса близко к таковому в свободном фермент позволяет предположить, что сама возможность смещения петли-козырька от нативж конформации к конформации, наблюдаемой в ингибиторных комплексах, более важ! для стабилизации промежуточного, а не основного состояния.

Боковая цепь субстратного остатка Lys4 может принимать два положения, одном из них она взаимодействует с карбонильными группами боковых цепей Asp3 Glu 16 и Asnll9, а в альтернативном - с остатком Asp79 петли-козырька. Первое пол жение является, при этом, несколько более предпочтительным. Роль остатка Asp79 определении лизиновой специфичности ризопуспепсина ранее рассматривалась в цел< ряде работ. Полученные нами результаты позволяют уточнить характер этой роли определить ее в основном как ориентирующую, тогда как остаткам Glu 16, Asp33 и Asnl можно приписать структурную, стабилизирующую роль. В этом случае Asp79 нахо; 1цийся на доступной растворителю поверхности белка может служить своеобразнь «липким местом» для центрального дипептида молекулы субстрата при его первичш контакте с протеиназой, а два других остатка, недоступных растворителю, стабили; ровать структуру окончательного комплекса. Таким образом, можно полагать, что поддержание лизиновой специфичности ризопуспепсина отвечает структурный ко плекс, включающий у этого фермента 4 аминокислоты: Asp79, Asp33, Glul6 и Asnl ]

Наибольший интерес в исследовании каталитического механиз

изопуспепсина представляют особенности расположения расщепляемой связи субстрата тносительно каталитических групп фермента. Гидролизуемая пептидная связь между статками Ьуэ4 и РЬе5 располагается в непосредственной близости от двух карбонилов аталитических аспарагиновых кислот Аэр35 и Азр218 и координированной с ними осрсдстпом водородных связей консервативной молекулы воды \V507. Атом кислорода У507, находящейся между каталитическими остатками АэрЗб и Азр218, располагается а расстоянии 2.9 А от атакуемого карбонильного атома углерода, таким образом, чю ектор нуклеофильной атаки ориентирован приблизительно ортогонально плоскости псп-идной группы. Точное расположение атомов водорода \V507 в невалентном комплексе егтосредственно до начала реакции установить не удается, так как конформационный нализ свидетельствует о наличии множества практически изоэнергетических локаль-ых минимумов. На рис. б б приведен один из вариантов с симметричным расположс-¡ием протонов.

Кислород карбонильной группы субстрата сближен с боковой цепью каталити-сского остатка АэрЗб и располагается от его "внешнего" атома 0й на расстоянии 3.05 ^ (Рис. 6 б).

Весьма существенной особенностью рассматриваемого фермент-субстратного омплекса является то, что его самый низкоэнергетический конформер характеризуется шизким к идеальному (-177°) значением двугранного вращения вокрут расщепляемой вязи субстрата. Таким образом, расчет свидетельствует об отсутствии каких-либо стру-.турных предпосылок для стерического искажения гидролизуемон пептидной субстрата руппы при его взаимодействии с остатками активного центра ризопуспепсина, и тровергает постулированное в ряде работ утверждение о необходимости такой реформации для эффективного протекания каталитического процесса. Наши результаты юзволяют утверждать, что сохранение всех энергетически выгодных контактов между I основной и бокопой цепями рассматриваемого фрагмента субстрата и их локальным ю.чскулярным окружением возможно для полученной) нами сфумурног» вариант без сакой-либо деформации расщепляемой связи.

Описанный структурный вариант комплекса обладает более низкой (на -7.0 ккал; -юль) энергией внутри- и межостаточных взаимодействий, чем рассмотренный ранее :а\тлекс-1. Кроме того, в независимом исследовании по моделированию невалентных )>ермент- субстратных комплексов ретровирусной протеиназы Н1\М было показано, 1То конформация этого типа является единственно возможной для субстратов. :одержащих в Р'( положении остаток пролина. Два этих обстоятельства позволяют • тверждать. что именно структура камппекс-2 ризопуспепсина должна рассматриваться ! качестве продуктивной.

Таблица 3. Расстояния (А) между атомом № боковой цепи Ьух4 субстрата < некоторыми остатками ризопуспепсииа в невалеитных комплексах с субстратол и промежуточным соединением.

О5 АврЗЗ О' аи16 О5 А8П119

Каиплекс-1 2.86 3.19 3.23

Камплекс-2 2.84 3.11 3.19

Интермедиат 2.47 2.84 2.72

Комплекс ризопуспепсииа с промежуточным тетраэдрическим соединением.

Катализ аспартатными протеиназами протекает по общеосновному механизм; одна из стадий которого включает образование промежуточного тетраэдрического сс единения, валентно не связанного с ферментом. Структура короткоживущего интерме диата представляет несомненный интерес в решении вопроса о механизме катализе однако его строение в комплексе не доступно определению экспериментальными мете дами. Этот недостаток в некоторой мере компенсируются возможностью расшифровк комплексов ферментов с различными негидролизуемыми пептидными соединениям! представляющими собой аналог промежуточного состояния. Очевидная ограниченност такого подхода состоит в том, что он не позволяет однозначно судить о деталях стро< ния реального интермедиата. Альтернативное решение проблемы состоит в привлече нии теоретических методов исследования. Поэтому мы предприняли попытку пос1ро< ния теоретической модели комплекса ризопуспепсииа с промежуточным соединение?,

Наиболее близким аналогом промежуточного состояния субстрата, ка отмечалось, является ингибиторный комплекс. Именно он и был выбран в качеств базовой структуры при построении модели. Преимущество данного начального пр! ближения состоит и том, что в структуре выбранного нами ингибитора аналог аго.\ карбонильного углерода имеет тетраэдрическое строение, аналогичное таковому интермедиате.

Характеристики участка промежуточного аддукта содержащего интересующи нас гем-диол: (длины связей, значения валентных углов, парциальные заряды на ат< мах) устанавливались на основе квантовомеханического анализа, с использованием м тода СN00, соединения следующей структуры:

жирная линия) в активном центре ризопуспепсина (слабая линия), "идролизуемая связь располагается между остатками Lys4 и Phe5 вблизи )стагков активного центра Asp35 и Asp218. Водородные связи показаны 1унктиром, Крестиками в кружках обозначены молекулы связанной воды.

глов принимались аналогичными для соответствующих углов в этане (Н3С—СН3), >статкс Lys (C-N;H,) , остатке Thr (С-ОН).

Остаток Plie (Р,) ингибитора заменялся на Lys с начальными конформационными [араметрами боковой цепи, характерными для субстратного комплекса (табл.2). Оптимизация модифицированного ингибитора проводилась с использованием программы -JEWTON комплекса TINKER в силовом поле Amber-95, модифицированном с учетом юлученных параметров. Структура полученная после 500 циклов минимизации с радиентом 0.01 ккал'моль представлена на рисунке 7.

В обнаруженной оптимальной конформации атом углерода расщепляемой группы 1есколько (0.8Л) смещается от положения аналогичного атома в ингибиторе. Между ем, в комплексе с аддуктом сохраняются все контакты, характерные для ингибиторного гомилекса, включая консервативные водородные связи. Весьма существенные изменения |ретерпевает в комплексе с аддуктом боковая цепь субстратного остатка Lvs4. По срав-|ению с субстратными комплексами Михаэлиса, она существенно улучшает свои кон-акгы с остатками Asp33, Glulô и Asnl 19 (Табл. 3). При этом все три протона атома № ,ys4 способны к образованию сильных водородных связей с указанными остатками, îcib основания полагать, что дополнительная стабилизация боковой цепи Lys4 в

/

Рис. 8 Взаимное расположение гидролизуемой связи и каталитических остатков Азр35, Аэр218 и соответствующие межатомные расстояния в комплексе ризопуспепсина с промежуточным тетраэдрическим соединением.

А»р)8

А»р21»

результате укорочения описанных водородных связей, обеспечивает лучшую фиксациь чувствительной группы субстрата относительно каталитических групп ризопуспепси на, потенцируя роль ориентационного фактора в катализе. Таким образом, эти данны свидетельствует в пользу концепции о предрасположенности активного центра ферме! та к стабилизации именно переходного состояния.

Весьма интересной особенностью рассматриваемого комплекса является асимметри в расположении гем-диола относительно каталитических групп Asp35 и Asp218 (Phi 8). При этом углерод расщепляемой связи располагается несколько ближе к карбоксил Asp35, таким образом, что гидроксильные группы способны образовывать прочны водородные связи с обоими атомами кислорода боковой цепи (2.8А и 2.72А), тогда кг расстояние для образования водородной связи с боковой цепью Asp218 является меж оптимальным, хотя и возможным (3.35А). В последнем случае гидроксил, располагай щийся между каталитическими Asp35 и Asp218, является самым близким донором пр> тона на уходящую группу. Эта структурная особенность объясняет природу асимметри констант рКа каталитических остатков аспарагиновых кислот в ингибиторных компле сах (Smith, 1996). Полученные результаты в совокупности с другими имеющимися эк периментальными данными позволяют предложить возможный механизм действия р зопуспепсина.

Каталитический механизм действия ризопуспепсина.

Для ферментов семейства аспартатных протеиназ, включая протеиназы высцп организмов и ретровирусов, был предложен целый ряд моделей каталитическ! механизмов. Наиболее общепринятые концепции предполагают участие молекулы вод связанной с каталитическими остатками аспарагиновой кислоты (W507 в случ ризопуспепсина), и располагающейся в плоскости карбоксильных групп их 6okobi цепей. Слабая нуклеофильность воды, однако, практически исключает эффективн}

таку резонансно стабилизированной амидной группы субстрата и продвижение системы ¡о координате реакции, если невозможен одновременный перенос протона с W507 на одходящий акцептор, и электрофильная активация субстрата путем протонированием тома кислорода.

Так как основность кето-группы субстрата и нуклеофилыюсть воды невелики, о атака карбонильного углерода и протонирование кислорода субстрата должны совершаться одновременно, в едином элементарном акте. Межатомные расстояния в олученных нами комплексах свидетельствуют о возможности переноса протона на убстрат как с боковой цепи остатка Asp35 (в том случае, если Asp35 протежирован на редкатапитической стадии, как это предполагают существующие концепции), так и епосредственно с W507 по мере развития нуклеофильной атаки (рис.9а).

Предположение о необходимости протонирования Asp35 в свободном ферменте на стадии образования невалентного комплекса Михаэлиса непосредственно до начала уклеофильной атаки субстрата молекулой воды, является, по-видимому, наиболее лабым местом предложенных концепций. Обнаруженная способность аспартатных ротеиназ функционировать при нейтральных (ренин) и даже щелочных (один из |утантов протеиназы HIV-1) значениях рН, предполагает существование механизма, беспечивающего не только изначальную асимметрию свойств Asp35 и Asp218 в условиях резвычайно симметричного молекулярного окружения активного центра, но и оддержание аномально высоких значений рКа для обоих остатков аспарагиновой ислоты. До сих пор. однако, не было предложено сколько-нибудь правдоподобного бъяснсния того, каким образом может обеспечиваться возникновение и поддержание казанных свойств активного центра. Напротив, относительно недавно было убедительно оказано, что вевободной ретровирусной протеиназе HIV-1 боковые цепи обоих остатков аталитических аспарагиновых кислот находятся в ионизированном состоянии, и что симметрия в их физико-химических свойствах проявляется лишь в ингибиторном омплсксс с пспсiniином - аналоге именно переходного, а не основного сосгояния аталитической системы (Smith, 1995). Так как области активного центра вблизи аталитических остатков у ретровирусных протеиназ и у протеиназ эукариот практически еотличимы друг от друга, то разумно предположить, что аналогичная ситуация праведлива и для протеиназ высших организмов.

В этом случае вариант с переносом протона на субстрат непосредственно с W507 южет оказаться более предпочтительным, так он не требует предположения о овышении рКа Asp35 в до значений порядка 7.0-7.5 (в случае ренина) или даже до 8.5.0 (рН оптимум одного из мутантов ретровирусной ВИЧ протеиназы HIV-1) и. icm аммм. позволяет объяснить способность ряда представителей этого семейства »ерментов функционировать щелочном диапазоне значений рН. Следует также отметить.

>ГЧ

к, v

Л \ №507

•✓Ч ,7

АБр35

А$р218

ы ю

Азр218

Азр218

Рис. 9 Схема каталитического механизма ризопуспепсииа, предложенная на основании полученных структурных данных о комплексах ризопуспепсииа с субстратом и промежуточным тетраэдрическим соединением. А - нуклеофильная атака с одновременным переносом протона веды на кислород гидролизуемой связи субстрата; Б - образование теграэдрического промежуточного соединения с возможностью перенос протона на АэрЗб (В) и возможностью центрального гидроксила

ппиппя ппт-пна ня \лгаяяимо гоуппу. Г -поотонирование азота уходящей группы и освобождение продуктов

пиплпиатг. г\г\пи

го структурные данные о расположении расщепляемой связи в полученных нами »мплексах не исключают возможности переноса протона на кислород расщепляемой |язи субстрата с боковой цепи Азр35 (то есть согласно ранее предложенным механизмам) 1Я тех протеиназ, которые имеют оптимум каталитической активности при низких тениях рН.

Атака нуклеофилом с одновременным переносом протона с молекулы воды на ,'бстрат приводит к образованию тетраэдрического промежуточного соединения, ¡тойчивость которого в комплексе с ризопуспепсином предположительно может юличиваться благодаря установлению контактов между его гидроксильными группами каталитическими остатками АэрЗб и Азр218 (Рис.9 б, в).

Конечная стадия реакции - разрыв гидролизуемой связи, не может завершиться :з протонирования азота уходящей группы по причине его высокой основности. Анализ груктур полученных комплексов свидетельствует о том, что ближайшим донором ротона на атом азота может являться одна из гидроксильных групп промежуточного >единения, располагающаяся между АэрЗб и Азр218. Перенос протона на азот (Рис.9б) образование продуктов реакции завершает каталитический цикл (Рис. 9г), после чего 1 стема возвращается в исходное состояние.

Мы полагаем, что высказанное предположение о схеме каталитического механизма гйствия поддается независимой проверке с привлечением вычислительных методов зантовой химии. Имеющиеся данные о строении комплексов ризопуспепсина могут казаться полезными для выбора структурной модели при проведении такого исследования.

ВЫВОДЫ

1. Предложена структурная модель субстрат-связывающего участка изопуспепсина и апробирован метод расчета, позволяющий предсказывать геометрию лигопептидных лигандов в активном центре этого фермента.

2. На основании предложенной модели путем априорного расчета предсказана родуктивная ориентация специфического субстрата в активном центре ризопуспепсина.

3. Определена вероятная структура комплекса ризопуспепсина с гтраэдрическим промежуточным соединением. В соответствии с расчетной геометрией онором протона для атома азота расщепляемой связи может являться одна из гтдроксильных групп промежуточного соединения, а именно та, которая располагается ежду каталитическими остатками аспарагиновых кислот АБр3 5 и Авр218 изопуспепсина.

4. На основании геометрии расчетных структур невалентных комплексов изопуспепсина с субстратом и промежуточным тетраэдрическим соединением предло-;ена модель каталитического механизма, позволяющая объяснить способность ряда спартатных протеиназ функционировать в щелочном диапазоне значений рН.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Е.М. Попов, И.В. Кашпаров, М.Е. Попов. Представления о механизме дейслш аспартатных прогеиназ. Общая теория биологического катализа. Успехи био химии, 1994, т.34, стр.40-82

2. Е.М. Попов, И.В. Кашпаров, М.Е.Попов. Механизм действия аспаргатнь прогеиназ. 1. Теория и метод. Биоорган, химия, 1996, т.22, стр. 323-338

3. I.V Kashparov, М.Е. Popov, Е.М. Popov. Mechanism of action of aspart proteinases. Adv. Exp. Med. Biol., 1998, v.436, p.115-121

4. M.E. Popov, I.V Kashparov, E.M Popov. Theory and method of a priori computati( of catalytic acts of aspartic and serine proteinases. Proceedings of the VII International Aspartic Proteinase Conference, Banff, Alberta, Canada, 1996, p.2

6. I.V Kashparov, M.E. Popov, E.M. Popov. Mechanism of action of aspart proteinases. Proceedings of the VIIIft International Aspartic Proteinase Conferenc Banff, Alberta, Canada, 1996, p.9.

6. M.E. Popov, I.V Kashparov, E.M Popov. Mechanism of action of aspartic proteinase Proceedings of the IV International Symposium on Bioorganic Chemistry (IUP/1 Meeting), Biarritz, France, 1997

7. M.E. Popov, I.V Kashparov, E.M. Popov. Mechanism of action of aspartic proteas« Structural organisation of substrates, inhibitors and of the active sites of hum immunodeficiency virus protease and rliizopuspepsin. Proceedings of the Thi International Symposium on Bioorganic Chemistry, Dagomys, Russia, 1995, p.1

8. И.В. Кашпаров, M.E. Попов, Е.М.Попов. Теоретическое моделирован структур невалентных комплексов аспартатных протеиназ специфическими субстратами и механизм действия ферментов. X Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Санкт-Петербург, Pocci 1998, Рефераты докладов и сообщений № 4, стр. 76

9. M.E. Popov, I.V Kashparov, Е.М. Popov. Catalytic mechanism proposed on l base of theoretical modeling of nonbonded complexes with specific substrat International Conference Biocatalysis 98, Puschino, Russia, p.4

10. I.V Kashparov, M.E. Popov, E.M. Popov. Computer-aided modeling of the substra and tetrahedral intermediates in the active site of aspartic proteinases HIV-1 a Rliizopuspepsin. International Conference Biocatalysis 98, Puschino, Russia, p.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Кашпаров, Илья Валерьевич, Москва

/- / ... / и! и Ц... ' / ' ■■ ........ 6)

О" ^ V." ! , г'".*'',

I:

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А.

ЭНГЕЛЬГАРДТА

И.В. КАШПАРОВ

ТЕОРЕТИЧЕСКИМ АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ НЕВАЛЕНТНОГО ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО КОМПЛЕКСА РИЗОПУСПЕПСИНА.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Е.М.ПОПОВ

доктор химических наук Л.Д. РУМШ

Москва, 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................3

ГЛАВА I. РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ

АСПАРТАТНЫХ ПРОТЕИНАЗ.......................................................................................7

Часть 1. Концепции ферментативного катализа..........................................7

Часть 2. Химия протеолиза..........................................................................12

Часть 3. Рентгеноструктурный анализ аспартатных протеиназ...............18

Часть 4. Современные представления о механизме каталитического акта

аспартатных протеиназ.................................................................................29

ГЛАВА II. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ИССЛЕДОВАНИЮ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА............................................................................46

Часть 1. Конформационная и электронная задачи катализа.....................46

Часть 2. Постановка задачи и план исследования.....................................50

Часть 3. Метод теоретического конформационного анализа.

Потенциальные функции и эмпирические параметры..............................52

ГЛАВА III. СТРУКТУРНАЯ МОДЕЛЬ СУБСТРАТ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО

УЧАСТКА РИЗОПУСПЕПСИНА И АПРОБАЦИЯ РАСЧЕТНОГО МЕТОДА.......56

Часть 1. Объекты исследования...................................................................56

Часть 2. Структурная модель активного центра........................................57

Часть 3. Комплекс ризопуспепсина с пептидным ингибитором..............65

ГЛАВА IV. НЕВАЛЕНТНЫЕ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ

РИЗОПУСПЕПСИНА......................................................................................................78

Часть 1. Фермент-субстратный комплекс михаэлиса................................78

Часть 2. Комплекс ризопуспепсина с промежуточным тетраэдрическим

соединением...................................................................................................88

ГЛАВА V. СХЕМА КАТАЛИТИЧЕСКОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ

РИЗОПУСПЕПСИНА......................................................................................................95

ВЫВОДЫ........................................................................................................................102

Список литературы........................................................................................................103

ВВЕДЕНИЕ.

Аспартатные протеиназы относятся к классу широко распространенных эндо-пептидаз, обнаруживаемых практически во всех таксономических группах животных, растений, микроорганизмов и ретровирусах. Их медико-биологическая значимость определяется участием в контроле ряда процессов жизнедеятельности человека, связанных с пищеварением (пепсин), регуляцией кровяного давления (ренин), метаболизме белков и процессинге гормонов (катепсины Б,Е) и некоторых других. Установление роли аспартатных протеиназ в созревании частиц ретровирусов, вызывающих такие заболевания как СПИД, некоторых видов лейкозов, сарком и опухолей молочных желез определило их привлекательность в качестве мишеней для антивирусной терапии. В результате многих исследований стало очевидным, что целенаправленный поиск эффективных лекарственных средств невозможен без знания деталей каталитического механизма действия этих ферментов и понимания структурных основ их специфичности.

В настоящее время представление о механизме каталитического действия аспартатных протеиназ формируется преимущественно на основе данных рентгеност-руктурного анализа. Однако, несмотря на чрезвычайную информативность этого метода, он имеет ряд специфических ограничений. Во-первых, получаемая с его помощью информация касается статического состояния фермента и, следовательно, прямо не отвечает на вопрос о динамических конформационных характеристиках трехмерных структур. Во-вторых, этот метод, за редким исключением, позволяет расшифровывать структуры комплексов ферментов лишь с ингибиторами, но не с субстратами. Получаемые данные о многих сериях ингибиторных комплексов демонстрируют отличия этих ингибиторов по своему химическому и пространственному строению как от истинного субстрата, так и друг от друга. Не

зная продуктивного расположения субстрата в активном центре, а также актуальных для катализа фермент-субстратных взаимодействий и обусловленных ими кон-формационных перестроек, — трудно составить достаточно полное и объективное представление о специфике каталитической реакции.

Поэтому для решения задачи о каталитическом механизме действия аспартатных протеиназ полезно привлечение методов теоретического конформаци-онного анализа и компьютерного моделирования. Преимущество теоретического подхода заключается в его принципиальной возможности исследовать любые конформационные состояния и количественно оценивать основные факторы, формирующие наиболее вероятные пространственные формы.

Настоящая работа посвящена теоретическому анализу пространственной структуры невалентного фермент-субстратного комплекса аспартатной протеиназы ризопуспепсина на стадиях комплекса Михаэлиса и промежуточного тетраэдрического соединения. Основные задачи данного исследования состояли в а) выборе структурной модели субстрат-связывающего участка молекулы фермента и апробации расчетного метода; б) предсказании энергетически предпочтительных конформационных состояний субстрата в активном центре ризопуспепсина на стадии образования невалентного комплекса и их последующем анализе с целью оценки продуктивности расположения гидролизуемой пептидной группы относительно каталитически активных групп фермента; в) моделировании структуры тетраэдрического промежуточного соединения в комплексе с ризопуспепсином и ее анализе с целью установления факторов, существенных для протекания катализа; г) создании рабочей модели каталитического механизма ризопуспепсина для ее последующего теоретического анализа квантовохимическими методами.

Диссертация состоит введения, основной части, включающей пять глав, а также выводов и библиографии.

Изложению оригинальной части работы предшествует литературный обзор (Глава I). Он состоит из 4 частей. В двух первых рассмотрены представления о протеолитических реакциях аспартатных протеиназ, сложившиеся в период до становления рентгеноструктурного анализа. Две последующие части посвящены рассмотрению результатов рентгеноструктурного анализа аспартатных протеиназ и стереохимических моделей каталитического акта, предложенных на основании полученных структурных данных.

Во второй главе рассматриваются основы теоретического подхода к решению проблем ферментативного катализа, а также предполагаемый план исследования.

Глава III посвящена вопросам выбора структурной модели субстрат-связывающего участка ризопуспепсина и апробации расчетного метода на примере моделирования ингибиторного комплекса ризопуспепсина, структура которого известна. В этой же главе рассмотрена и экспериментальная часть диссертации. В ней описан использованный нами метод поиска и расчета наиболее энергетически предпочтительных конформационных состояний олигопептидных лигандов (субстратов и субстратоподобных ингибиторов) в активных центрах ферментов.

В главе IV рассмотрены результаты моделирования пространственной структуры комплексов ризопуспепсина с гексапептидным субстратом на разных стадиях каталитической реакции. Глава разбита на две части, каждая из которых отражает результаты полученные для конкретной модели (субстрат в комплексе Михаэлиса и на стадии промежуточного тетраэдрического соединения).

В главе V рассмотрена схема каталитического механизма ризопуспепсина, предложенная на основании полученных расчетных данных.

Завершают диссертацию основные выводы и список используемой литературы.

Благодарности.

Автор приносит низкий поклон светлой памяти своего научного руководителя и Учителя, ныне покойного Евгения Митрофановича Попова за постановку темы и неоценимую, отеческую помощь в ее осуществлении, а также своему научному руководителю Льву Давыдовичу Румшу за поддержку и руководство, без которого это исследование не могло бы быть завершено.

Автор благодарит сотрудников лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН Л.М. Гинодмана и Т.В. Ротанову за дружеское участие, обсуждение результатов, полезные рекомендации и помощь в работе. Сугубая благодарность Т.М. Ивановой и Д.А. Левицкому за неоценимую помощь в подготовке рукописи и ее обсуждение.

ГЛАВА I. РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ АСПАРТАТНЫХ ПРОТЕИНАЗ.

Часть 1. КОНЦЕПЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

На протяжении многих десятилетий, вплоть до конца 60-х годов нашего столетия, изучение ферментов, в том числе и аспартатных протеиназ, опиралось, с одной стороны, на результаты химических и физико-химических исследований ферментативных и неферментативных, модельных реакций, а с другой — на теорию гомогенного катализа, формальную кинетику и равновесную термодинамику. На формирование представлений о механизме каталитического действия ферментов в то время еще не оказал влияние один из важнейших факторов, который мог бы помочь в интерпретации имеющихся экспериментальных данных и послужить основой для создания общей теории биокатализа. Имеется в виду отсутствие в то время знаний о трехмерных структурах и конформационных возможностях ферментов и должного понимания принципов пространственной организации белковых молекул. Известными могли быть лишь функции биокатализаторов, их химическое строение и кинетико-термодинамические характеристики процессов, тогда как неизвестными оставались осуществляющие эти функции молекулярные структуры ферментов и субстратов. Недостающая информация в той или иной мере компенсировалась интеллектом, интуицией и фантазией исследователей. При этом вольно или невольно предполагалось, что явление биокатализа в принципе не отличается от химического катализа, а механизм действия ферментов можно познать, проводя исследования в направлении от функции к структуре.

До возникновения рентгеноструктурного анализа белков был высказан целый ряд самых разнообразных, часто противоречивых, а иногда и взаимоисключающих, чисто гипотетических предположений о механизме биокатализа.

В 1954 году Г. Эйринг, Л. Ламри и Дж. Спайке [1] предложили гипотезу, связывающую механизм ферментативного каталитического акта с деформацией и напряжением молекулы субстрата при ее сорбции в активном центре фермента. По существу, гипотеза явилась симбиозом двух ранее уже существовавших предположений о движущих силах биокатализа. Одно прямо следовало из концепции, сформулированной в 1925 году Г. Эйрингом, в которой, в свою очередь, была использована мысль Ю. Либиха, развитая затем Л. Плейфером [2], о приведении субстрата при взаимодействии с катализатором в состояние сильного внутреннего напряжения. Второе предположение было выдвинуто в 1930 году Дж. Холдейном [3] и позднее детализировано Л. Полингом [4]. Оно заключалось в допущении пространственной комплементарности и химической дополнительности активного центра фермента не равновесной структуре субстрата, как в концепции «замка и ключа» Э. Фишера [5], а промежуточному состоянию последнего на пути к конечным продуктам реакции.

Гипотеза Эйринга, Ламри и Спайкса вошла в науку под названием концепции «дыбы» или концепции «лилипутов». Первое подчеркивает принудительный характер механической деформации гибкого субстрата жестким ферментом. Второе название делает акцент на том обстоятельстве, что дестабилизация субстрата, происходящая при переводе его структуры в высокоэнергетическое переходное состояние, осуществляется за счет кооперативного эффекта многочисленных слабых невалентных взаимодействий атомов лиганда и активного центра.

Другая гипотеза, ставшая не менее популярной, была предложена в 1958 году Д. Кошландом. Автор также исходит из предположения о недостаточности чисто статических отношений между ферментом и субстратом в духе концепции «замка и ключа» для объяснения многостадийной ферментативной реакции. Однако Кошланд подходит к этому вопросу с несколько иной позиции. Главная новация его гипотезы заключается в постулировании такого продуктивного соответствия между ферментом и субстратом, которое достигается при специфических, вызываемых только данным субстратом, конформационных изменениях активного центра [6,7]. Поэтому гипотеза получила название концепции индуцированного соответствия. Предполагается, что структура нативного фермента не является полностью комплементарной ни равновесной молекуле субстрата, ни его метастабильному переходному состоянию. Стерическая комплементарность, ведущая к химической дестабилизации чувствительного места субстрата, возникает в результате принудительной переориентации функциональных атомных групп активного центра фермента.

Таким образом, согласно концепции «дыбы», энергия невалентных фермент-субстратных взаимодействий расходуется на деформацию субстрата, а согласно концепции индуцированного соответствия — на деформацию фермента, который уже потом активирует субстрат. У. Дженкс [8] полагает, что в реальной ситуации неравновесность обеих молекул возникает одновременно.

До того, как стали известны кристаллографические структуры ферментов, было выдвинуто много других гипотетических представлений о биокатализе. Они не содержали принципиально новых моментов, а по существу являлись вариациями на две заданные темы — «деформация и напряжение» и «индуцированное

соответствие». Почти всем высказанным в этот период точкам зрения на механизм ферментативного катализа присущи следующие характерные черты.

Во-первых, во всех случаях непременно предположение о необходимости конформационных и конфигурационных изменений молекул субстрата и (или) фермента в процессе образования комплекса Михаэлиса. Иное мнение в этом вопросе имели Ф. Каруш, К. Линдестрем-Ланг и Дж. Шелманн [9,10], которые полагали, что молекулы фермента в растворе не имеют определенного пространственного строения, а пребывают в состоянии, близком к статистическому клубку. Поэтому каталитическому акту предшествует индуцированная фермент-субстратными взаимодействиями структурная адаптация фермента, то есть смещение его конформационного равновесия в сторону каталитически активной формы.

Во-вторых, утверждается, что назначение изменений равновесного состояния субстрата состоит в приближении его структуры к переходному состоянию, а фермента — в сближении и принятии наиболее благоприятной для последующей реакции продуктивной ориентации каталитически активных групп относительно чувствительного места субстрата.

В-третьих, все необходимые для катализа изменения молекулярной геометрии фермента и субстрата носят насильственный характер. Иными словами, предполагается, что возникающие на стадии образования невалентного комплекса Михаэлиса энергетически неблагоприятные контакты есть главный фактор эффективного снижения энергии активации в уравнении Аррениуса и, следовательно, ускорения ферментативной реакции. Однако нигде не обсуждается конкретный механизм трансформации энергии большого числа слабых невалентных контактов между атомами в энергию механической деформации

локального участка субстрата, приводящей к изменению валентных взаимодействий между единичными атомами этого участка. В-четвертых, все концепции трактуют результаты экспериментальных исследований

ферментативных реакций, привлекая методы равновесной термодинамики и формальной кинетики, разработанные для гомогенных газовых реакций, то есть, применяя закон действия масс, уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса, теорию активированного комплекса Эйринга-Поляни и т.д.

Наконец, в-пятых, все концепции являются чисто феноменологическими и при трактовке явления биологического катализа исходят из знания функции и некоторых эмпирических параметров процесса ее реализации. Описательный характер концепций, лишенных доказательной силы и предсказательных возможностей, был обусловлен отсутствием информации о пространственном строении ферментов и природе структурной организации белковых молекул. Вынужденное следование от функции к структуре привело к появлению множества представлений о биокатализе.

До расшифровки трехмерных структур белков было предложено еще несколько концепций биокатализа, в которых, в отличие от упомянутых выше, постулировалось, следуя теории Э.С. Бауэра [11], изначальная неравновесность нативных молекул ферментов. В концепции Ю.И. Хургина, Д.С. Чернавского и С.Э. Шноля [12] фермент представляется упругим