Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационные аспекты взаимодействия протеиназы ВИЧ-1 с субстратом и ингибитором

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Попов, М. Е., Москва

Ь7

/

.,/ к/

/

V с*

Российская Академия Наук Ордена Трудового Красного Знамени Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

М.Е. ПОПОВ

КОНФОРМАЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОТЕИНАЗЫ ВИЧ-1 С СУБСТРАТОМ И ИНГИБИТОРОМ

03.00.04 — биохимия

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

Е.М.ПОПОВ

доктор химических наук Л.Д. РУМШ

Москва, 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................3

ГЛАВА 1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ФЕРМЕНТ-ЛИГАНД.............................7

Часть 1. Теоретический подход к изучению явления биокатализа........................7

Часть 2. Современные методы компьютерного моделирования взаимодействий

лиганд-рецептор.....................................................................................18

Часть 3. Кристаллографическая структура и каталитические свойства

аспартатных протеиназ........................................................................... 40

ГЛАВА 2. МЕТОД ТЕОРЕТИЧЕСКОГО КОНФОРМАЦИОННОГО АНАЛИЗА.. 65

Часть 1. Постановка задачи и план исследования.................................................65

Часть 2. Метод расчета, потенциальные функции и параметризация..................67

ГЛАВА 3. КОНФОРМАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СВОБОДНОГО СУБСТРАТА, ИНГИБИТОРА И АКТИВНОГО ЦЕНТРА ПРОТЕИНАЗЫ ВИЧ-1 71

Часть 1. Конформационные возможности природного гептапептидного субстрата

протеиназы ВИЧ-1..................................................................................71

Часть 2. Конформационные возможности ингибитора JG-365 ............................ 79

Часть 3. Активный центр протеиназы ВИЧ-1.......................................................87

ГЛАВА 4. КОМПЛЕКС ПРОТЕИНАЗЫ ВИЧ-1 С ИНГИБИТОРОМ JG-365 ......... 96

ГЛАВА 5. КОМПЛЕКС ПРОТЕИНАЗЫ ВИЧ-1 С ПРИРОДНЫМ СУБСТРАТОМ

.....................................................................................................................................103

ГЛАВА 6. МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ПРОТЕИНАЗЫ ВИЧ-1................................115

ВЫВОДЫ...................................................................................................................124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................126

Посвящается памяти отца

ВВЕДЕНИЕ

Одной из важнейших задач современной молекулярной биологии является установление зависимости между пространственной структурой белка и его функцией. Определяющая роль в решении этой проблемы, несомненно, принадлежит исследованиям наиболее многочисленной группы белков — ферментов, где накоплен огромный экспериментальный материал. В настоящее время основой для всех заключений о возможном механизме функционирования фермента на молекулярном уровне служит рентгеноструктурный анализ, а также информация, полученная косвенными методами, к которым принадлежат все виды спектроскопии, а также методы; химической кинетики.

Однако уникальные кристаллографические данные относятся, в основном, к статической структуре, т.е. к морфологии белка и пока лишь в редких особых случаях позволяют получить данные о строении нестабильных состояний (например, фермент-субстратных комплексов). Именно по этой причине на основании одного и того же экспериментального материала предлагается, как правило, не одна, а несколько гипотетических схем ферментативного катализа.

Сейчас становится все более очевидным, что эмпирический подход и полученная из эксперимента информация недостаточна для объяснения, а тем более для количественного описания фермента как биологической машины, осуществляющей при взаимодействии с субстратом целенаправленную функцию по вполне определенному механизму. Полное решение этой задачи требует привлечения теоретических методов исследования.

Настоящая работа представляет собой попытку использования метода теоретического конформационного анализа для количественного описания кон-

формационных стадий непрерывного и спонтанно протекающего процесса ферментативного катализа.

В качестве объекта исследования выбрана аспартатная протеиназа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), которая играет ключевую роль в цикле жизни вирусной частицы, осуществляя процессинг полибелковой цепи и образование зрелых структурных "белков: Вирусная протеиназа также непосредственно V участвует в патогенезе СПИДа, вызывая гидролиз белков инфицированных клеток и, нарушая, тем самым, их нормальное функционирование. Эти особенности делают протеиназу ВИЧ-1 привлекательной мишенью для антивирусной терапии, поскольку ее ингибирование предотвращает образование способных к размножению вирусных частиц.

Протеиназа ВИЧ-1 принадлежит к числу наиболее широко и разносторонне экспериментально изученных аспартатных протеиназ. Для нее определена пространственная структура нативной молекулы и многочисленных ингибиторных комплексов, получено большое количество кинетических данных. Однако ни в одном случае не было составлено полной динамической картины ее каталитического действия. До сих пор остается неизвестным продуктивное расположение субстрата в активном центре фермента, относительно которого высказываются различные, часто взаимоисключающие гипотезы, основанные, в основном, на трехмерных структурах набора ингибиторных комплексов.

Решение этих вопросов, помимо чисто научного, имеет огромное практическое значение для целенаправленного поиска высокоэффективных ингибиторов, которые могут быть использованы как лекарственные средства в терапии СПИД.

Выполненная работа является частью большого исследования, направленного на априорное количественное моделирование всех стадий каталитического акта

аспартатных протеиназ. Основной задачей проведенного исследования является определение геометрии невалентного фермент-субстратного комплекса, которая пока не может быть определена с помощью существующих экспериментальных методов. Решение может быть получено путем априорного встраивания субстрата в активный центр фермента. Для проведения этого расчета, однако, необходимо предварительно изучить конформационные свойства самого субстрата, представляющего из себя олигопептид, а также остатков и фрагментов активного центра фермента. Необходимо также подвергнуть проверке расчетный метод, опробовав его вначале на моделировании фермент-ингибиторного комплекса известной структуры. В соответствии с этим исследование подразделяется на несколько этапов, которые подробно описываются в основной части работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, оригинальной части, выводов и библиографии. Предшествующий оригинальной части работы литературный обзор включает три части. В первой рассмотрен теоретический подход к исследованию явления биокатализа, на котором основана данная работа. Во второй части мы сочли необходимым дать обзор распространенных в настоящее время методов «посадки» (docking) ингибиторов в активные центры рецепторов, несмотря на то, что поставленная в^ работе задача гораздо шире воспроизведения структур ингибиторных комплексов.. Третья часть литературного обзора посвящена рассмотрению обширного материала о трехмерных структурах нативных

аспартатных протеиназ и их ингибиторных комплексах, полученных методом

>

рентгеноструктурного анализа.

Экспериментальный раздел диссертации открывается главой 2, содержащей план исследования, а также описание метода расчета, используемых потенциальных функций и эмпирических параметров.

Глава 3 посвящена конформационному анализу молекул фермента и лигандов до их взаимодействия: в первых двух частях этой главы представлены результаты априорного расчета структуры гептапептидных ингибитора и субстрата в их нативном состоянии, а в третьей рассмотрены конформационные возможности фрагментов активного центра и сделан выбор модели субстрат-связывающего участка.

В главе 4 рассмотрен метод встраивания олигопептидного лиганда в активный центр фермента и проведено сопоставление результатов моделирования пространственной структуры фермент-ингибиторного комплекса протеиназы ВИЧ-1 с экспериментальными данными.

Глава 5 посвящена расчету структуры комплексов с протеиназой ВИЧ-1 на разных стадиях катализа (субстрат в комплексе Михаэлиса и на стадии промежуточного тетраэдрического соединения). На основе полученных результатов предлагается механизм каталитического действия протеиназы ВИЧ-1, описанный в главе 6.

Завершают диссертацию основные выводы и список используемой литературы.

Глава 1. Теоретические и экспериментальные методы исследований взаимодействий фермент-лиганд

Часть 1. Теоретический подход к изучению явления биокатализа

Проведенное исследование базируется на предложенном ранее Е.М. Поповым подходе к изучению механизма каталитической реакции [1,2], который исходит не из функции биокатализатора и соответствующих химических и кинетических характеристик процесса, а из строения и динамических конформационных и электронных свойств фермента и субстрата, то есть из структурной организации взаимодействующих молекул [3]. Следовательно, он ориентирован в направлении от структуры к функции и в этом отношении является альтернативой существующим подходам. V

Подход, включающий соответствующий расчетный метод, позволяет представить функцию фермента и механизм его каталитического действия как

неизбежные следствия фермент-субстратных взаимодействий, как проявление тех

»

возможностей, которые заложены в структурных организациях молекул фермента и субстрата в их свободном состоянии.

На рис. 1 приведена конформационная карта ф—ц/ метиламида М-ацетил-Ь-аланина, воспроизводящая потенциальную поверхность свободного элементарного звена основной цепи белковой молекулы белковой молекулы (-СО№1-СаНК-С(ЖН-; Я - боковая цепь любой из стандартных аминокислот, кроме глицина и пролина).

Рис. 1 Конформационная карта метиламида М-ацетил-Ь-аланина и конформационныс точки аминокислотных остатков пепсина, ризопуспепсина, эндотиапепсина и протеиназы ВИЧ (за исключением Gly и Pro)

Контуры эквипотенциальных сечений проведены при значениях 0, 1 и 2 ккал/моль; за нуль отсчета принята энергия в точке ф = = -60°

«

На карту нанесены конформационные точки всех остатков (за исключением Gly и Pro) четырех аспартатных протеиназ: пепсина, ризопуспепсина, эндотиапепсина и протеиназы ВИЧ-1. Как видно из рисунка, конформационные состояния аминокислотных остатков в этих белках занимают на карте свободного монопептида только низко энергетические области.

Подавляющее большинство остатков попадет в области, окаймленные контуром в 1 ккал, и все без исключения остатки — в области, окаймленные контуром в 2 ккал. Такое же расположение у этих ферментов имеют остатки Gly на карте ф—у молекулы метиламида N-ацетилглицина и остатка Pro на кривой потенциальной поверхности U(v|/) метиламида N-ацетил-Ь-пролина.

Таким образом, конформационные возможности аминокислотных остатков аспартатных протеиназ полностью определяются взаимодействиями валентно несвязанных атомов в пределах участка -CONH-C"HR-CONH- то есть ближними взаимодействиями. Несмотря на наличие средних и дальних межостаточных взаимодействий, обуславливающих образование трехмерных структур, в молекулах аспартатных протеиназ (как и в молекулах других белков [3]) не реализуются состояния остатков с повышенной энергией ближних взаимодействий. Более того, распределение конформационных точек (ф-v)/) остатков на картах молекул метиламидов N-ацетил-а-аминокислот находится в хорошем соответствии со случайным распределением состояний несвязанных монопептидов по величинам свободной энергии Из этого факта следует вывод, важный для последующего рассмотрения. Он касается одного из принципов структурной организации белков, который утверждает, что в нативной конформации фермента имеется фактически полная гармония (согласованность) между всеми межмолекулярными взаимодействиями [3, 4]. Этот же факт свидетельствует о несостоятельности всех

концепций ферментативного катализа, в которых постулируется наличие в нативной конформации фермента или какой-либо ее части напряжений и принудительных деформаций.

Что касается субстратов (в данном случае это сравнительно короткие пептиды), то, согласно теории структурной организации олигопептидов [3, 4], их пространственное строение описывается ограниченным набором низкоэнергетических структур, в которых, как и в белках, имеет место согласованность всех внутриостаточных и межостаточных невалентных взаимодействий. Отсутствие у олигопептидов полной структурной детерминации обусловлено малым энергетическим вкладом средних и дальних взаимодействий. Следовательно, до возникновения специфических контактов и образования продуктивного невалентного комплекса, молекулы фермента и субстрата находятся в равновесном состоянии и совершают в растворе беспорядочные перемещения. Фермент имеет высокоорганизованную трехмерную структуру, а субстрат, обладающий значительно большей внутренней конформационной свободой, представляет собой набор обратимых флуктуирующих пространственных форм.

Рассмотрим теперь вопрос о том, что представляет собой явление биологического катализа с термодинамической точки зрения. Прежде всего здесь следует отметить самопроизвольный характер каталитической реакции, начинающейся со случайных контактов между ферментом и субстратом. По мере своего протекания она должна, согласно второму началу термодинамики, сопровождаться уменьшением свободной энергии Гиббса, AG (Р, Т = const.), связанной с изменениями энтальпии, АН, и энтропии, AS, фундаментальным соотношением AG = АН - TAS1. Свободная энергия, энтальпия и энтропия — функции состояния и, следовательно, их изменения не зависят от конкретного

механизма процесса, а определяются только конечными и начальными состояниями системы. Важно подчеркнуть справедливость и обратного заключения — знание величин АО, АН, АЛ' перехода из одного состояния системы в другое ничего не говорит о пути этого перехода.

Процессы, протекающие самопроизвольно в изолированных макроскопических системах, связаны с беспорядочным движением микроскопических составляющих. Они могут быть разделены на две группы явлений, принципиально отличающихся по своей природе, механизмам действия и последствиям.

Первую группу составляют явления, в которых хаотизация как системы в целом, так и каждой ее отдельной части (фазы, компонента) непрерывно возрастает по мере развития процесса. Движение системы к равновесному состоянию сводится к переходу всех микрочастиц от менее вероятных состояний к более вероятным, то есть к монотонному возрастанию энтропии всех составных частей системы во всех возможных отношениях. Отклонения от этой тенденции (флуктуации) малы и, главное, обратимы, а поэтому практически не оказывают влияния на ход самого процесса; обычно ими пренебрегают.*

К первой группе явлений относятся растворение, диффузия, теплопроводность,

осмос, кинетика и катализ многих химических реакций. Все они статистичны по

«

своей природе, обратимы и могут быть представлены путем непрерывной деформации равновесных состояний: Описывающие их поведение закономерности не зависят от строения микрочастиц. Фазовые превращения в таких процессах относятся к переходам первого рода. Явления этой группы можно считать естественными объектами исследования равновесной термодинамики и статистической физики, и использовать для их феноменологического описания и статистической трактовки модели идеального газа и идеального раствора.

Вторую группу образуют явления, которые также протекают самопроизвольно и без нарушения второго начала термодинамики. Однако, в отличие от равновесных процессов, где все части системы хаотизируются и вносят положительный вклад в общее увеличение энтропии, процессы данной группы сопровождаются диспропорционированием энтропии — уменьшением ее в одной части системы и ростом в другой. Фазовые превращения здесь относятся к переходам второго рода. Такой феномен возможен только при наличии в системе наряду с обратимыми флуктуациями также необратимых или, следуя терминам И. Пригожина [5], бифуркационных флуктуации.

Бифуркации играют решающую роль в скачкообразном изменении свойств и детерминации механизма спонтанного процесса — его инициации, развитии и завершении, в конечном счете, в создании новых, упорядоченных структур, названных Пригожиным диссипативными структурами. Примерами таких стационарных состояний вдали от положения равновесия являются конвекция жидкости с образованием ячеек .Бернара, лазерное когерентное излучение, химическая реакция Белоусова — Жаботинского и периодический процесс «хищник—жертва» в экологии. Непременными условиями возникновения диссипативных структур можно считать следующие.

1. Система должна обмен