Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нековалентные комплексы белков с полиалкиленоксидами
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сорокина, Елена Михайловна, Москва
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биохимии им. А.Н.Баха
На правах рукописи УДК 577.151.02: 678.01
СОРОКИНА Елена Михайловна
НЕКОВАЛЕНТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ БЕЛКОВ С ПОЛИАЛКИЛЕНОКСИДАМИ
03.00.04 — Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научные руководители: д.х.н. И.Н.Топчиева профессор, д.х.н. Б.И.Курганов
Москва 1999 г.
—.2 — Оглавление
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ........................................5
ВВЕДЕНИЕ...................................................................6
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................... ...............8
1.1. Ковалентная модификация белков водорастворимыми полимерами.............8
1.1.1. Строение полимер-белкового конъюгата..............................10
1.1.2. Изменение свойств и стабильности белков при их химической модификации ......................................................14
1.2. Нековалентная модификация белков......................................... 32
1.2.1. Белок—полиэлектролитные комплексы................................32
1.2.2. Свойства ферментов в комплексе с полиэлектролитами.................37
1.2.3. Нековалентные комплексы белков с незаряженными полимерами .......40
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ......................................................48
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ...................................... 49
2.1. Используемые вещества............................................... 49
2.2. Оценка качества блок-сополимера оксида этилена и оксида пропилена..... 50
2.2.1. Очистка блок-сополимера оксидов этилена и пропилена............ 50
2.2.2. Определение состава блок-сополимера оксидов этилена
и пропилена ................................................... 51
2.3. Введение изотопной метки (трития) в полиэтиленгликоль ................ 52
2.4. Получение полимер—белковых комплексов ............................. 53
2.4.1. Получение температурно-индуцированных полимер—белковых
комплексов................................................... . 53
-32.4.2. Получение полимер—белковых комплексов под воздействием повышенного
давления ............................................................................................................53
2.5. Выделение полимер—белковых комплексов ..........................................................58
2.6. Тонкослойная хроматография ..................................................................................59
2.7. Определение содержания белка и полимера ..........................................................60
2.8. Определение ферментативной активности ............................................................61
2.9. Определение термостабильности..............................................................................64
2.10. ос-Химотрипсин и его полимер—белковые комплексы, включенные
в систему гидратированных обращенных мицелл................................................64
2.11. Определение коэффициентов седиментации комплексов
и исходного белка ......................................................................................................65
2.12. Дифференциальная сканирующая калориметрия................................................66
2.13. Метод кругового дихроизма ....................................................................................66
2.14. Метод флюоресцентной спектроскопии................................................................67
2.15. Определение состава комплекса полимер—белок с циклодекстрином методом ИК—спектроскопии ..................................................................................67
2.16. Получение трех-компонентных систем на основе комплексов полиэтиленгликоль-а-химотрипсин и разветвленных полимерных производных циклодекстрина..................................................................................68
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................70
3.1. Полимер—белковые комплексы, полученные при нагревании ..........................70
3.2. Полимер—белковые комплексы, полученные под действием
повышенного давления ............................................................................................78
3.2.1. Комплексы белок—проксанол, полученные под действием повышенного давления.......................................... 79
3.2.2. Комплексы белок—полиэтиленгликоль (ПЭГ), полученные
под действием повышенного давления............................ 81
Характеристика ПЭГ—белковых комплексов...................... 86
Стабильность комплексов в растворе ............................. 88
Ферментативные свойства ПЭГ—ХТ комплексов................... 88
Исследование ПЭГ—ХТ комплексов в системе гидратированных
обращенных мицелл ............................................ 91
Конформационные и гидродинамические свойства
полимер—белковых комплексов ................................. 94
3.3. Термическая стабильность полимер—белковых комплексов ............... 97
3.4. Влияние добавок ПЭГ и проксанолов на термоинактивацию ХТ.......... 101
3.5. Изучение термической денатурации ХТ и его комплексов с полиалкиленоксидами с помощью метода флуоресцентной спектроскопии . . 105
3.6. Взаимодействие полимер—белковых комплексов с циклодекстринами
и их производными ................................................... 107
3.7. Ферментативная активность комплексов полимер-белок в смешивающихся с водой органических растворителях.................... 123
ВЫВОДЫ.............................................................. 130
ЛИТЕРАТУРА.......................................................... 132
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ: GM—CSF — рост—стимулирующий фактор, мономер, гликозилированный 14 кДа пептид,
БПЭК — белок—полиэлектролитный комплекс,
БСА — бычий сывороточный альбумин,
БТНА — 14—бензоил—Ь—тирозин п—нитроанилид,
БТЭЭ — этиловый эфир 14—бензоил—Ь—тирозина,
ДМСО — диметилсульфоксид,
ДСК — дифференциальная сканирующая калориметрия,
ИПЭК — интерполиэлектролитный комплекс,
ММ — молекулярная масса,
ПМР — протонно—магнитный резонанс,
ППО — полипропиленоксид,
Про — блок—сополимер оксидов этилена и пропилена (проксанол, плюроник),
ПЭГ — полиэтиленгликоль,
пэо — полиэтиленоксид,
тех — метод тонкослойной хроматографии,
хт — а—химотрипсин,
цд — циклодекстрин.
— 6 — ВВЕДЕНИЕ
В последние годы все большее распространение приобретает метод модификации белковых молекул водорастворимыми синтетическими полимерами, в частности полиэтиленгликолем (ПЭГ), с целью придания им полезных свойств для практического использования, а именно: повышение стабильности при долговременном хранении, повышение устойчивости к действию агрессивных сред, увеличение растворимости как в воде, так и в органических растворителях. Кроме того, следствием модификации является повышение устойчивости белков к протеолитическому расщеплению, и, в ряде случаев, к их необратимой термоинактивации, а также снижение иммуногенности и антигенности белковых препаратов при введении в организм и пролонгирование их действия, что имеет особое значение при создании новых лекарственных средств. В настоящее время ПЭГ—белковые конъюгаты находят широкое применение в медицине. Например, фирмой Enzon Inc. (США) разработаны и выпускаются два таких препарата: ONCASPAR (ПЭГ—Z-аспарагиназа), применяемый для лечения лимфолейкемии, и ADAGEN (ПЭГ-аденозиндезаминаза), применяемый для фермент—восстановительной терапии при наследственных заболеваниях. Фирма PolyMASK Pharmaceuticals pis. (Англия) также широко применяет технологию ПЭГ—модификации пептидов, используемых в медицине. Однако, химическая модификация белков, как правило, приводит к существенной потере их биологической активности. В большинстве случаев методы присоединения полимера основаны на включении дополнительного связующего звена (linker) между полимером и белковой глобулой. Следует отметить, что наличие этих связующих звеньев снижает
возможности использования конъюгатов белков с полимерами в биотехнологических производствах и в медицине. Связующие звенья могут оказаться иммуногенными или содержать расщепляемые связи, вследствие чего цепи полимера могут отщепляться от молекулы белка либо ферментативно, либо в результате химических процессов. Многие связующие звенья изменяют заряд групп на поверхности белковой глобулы, к которым они присоединяются, тем самым влияя на функционирование белка. Использование альдегидных производных водорастворимых полимеров — единственный метод, позволяющий присоединить полимер к белковой глобуле без включения связующего звена, — также приводит к потере биологической активности модифицируемого белка. В связи с этим представляет интерес разработка новых способов модификации, позволяющих не только стабилизировать белки, но и сохранить их биологическую активность. Целью настоящего исследования явилось изучение возможности образования нековалентных комплексов белков с полимерами под действием физических факторов (температуры или давления), что представляется перспективным вследствие более "мягкого" воздействия на белок и простоты процедуры модификации.
— 8 —
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Одним из важных направлений биотехнологии является конструирование фермент-полимерных систем, в которых ферменты сохраняют высокую каталитическую активность и стабильность, отсутствуют диффузионные ограничения, легко отделяется продукт реакции и регенерации фермента. Подобные растворимые фермент—полимерные системы получают за счет ковалентной модификации белка или его комплексообразования с низко— и высокомолекулярными соединениями.
1.1. Ковалентная модификация белков водорастворимыми полимерами
С середины 70—х годов началось бурное развитие нового направления белковой инженерии, состоящее в целенаправленном изменении свойств белковых молекул путем их химической модификации водорастворимыми полимерами. В настоящее время известны различные способы получения стабильных полимер—белковых конъюгатов с целью создания новых полезных сочетаний химических и биологических свойств (Hansh С., & Leo A.J., 1979; Martin J.C., 1979; Franke R., 1984; Платэ H.A., Васильев A.E., 1986; Torchilin, V.P., 1991). Модификация белков с использованием полимеров, способных специфически взаимодействовать с аминокислотными остатками, позволяет выяснить структуру белковой молекулы, в частности, строение активного центра, а также изменить свойства нативного фермента. Например, присоединение природных полисахаридов или синтетических полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Платэ НА., Васильев А.Е., 1986) и производные полиаспарагиновой кислоты (Северин С.Е. с соавт., 1979), приводит к изменению иммуногенных и аллергенных свойств антигенных белков, что дает возможность
использовать их в качестве новых лекарственных средств. Так, фирмой Enzon Inc. (США) разработаны и выпускаются два лекарственных препарата (ONCASPAR и ADAGEN), представляющие собой ПЭГ—модифицированные белки. Препарат ONCASPAR (ПЭГ—L—аспарагиназа) представляет собой фермент Х-аспарагиназу, к которой путем химической модификации ковалентно присоединен инертный полимер — ПЭГ. Препарат ONCASPAR применяется для лечения острой лимфолейкемии у пациентов, которые сверхчувствительны к нативным формам L—аспарагиназы. Другой препарат, ADAGEN, представляет собой ПЭГ—модифицированную аденозиндезаминазу (АДА) быка и применяется для фермент—восстановительной терапии при наследственных заболеваниях. Например, препарат ADAGEN применяется для лечения АДА—недостаточности при тяжелом комбинированном иммунодефиците - генетическом заболевании, при котором организм не адекватно вырабатывает АДА. Без достаточного уровня АДА иммунная система пациента развивается неправильно, что выражается в слабой защите или в отсутствии таковой по отношению к инфекционным заболеваниям.
Для ковалентного присоединения к белку водорастворимый полимер должен содержать группы, способные взаимодействовать с функциональными группами белка в условиях, не вызывающих денатурацию последнего. В подавляющем большинстве случаев, эти реакции протекают в водных растворах при рН 6—8. Большая часть работ посвящена модификации полимерами аминогрупп белка. Участие в реакции тиольных групп нежелательно, т.к. их содержание в белках невелико, кроме того они часто необходимы для проявления физиологической активности (Коршак В.В., Штильман М.А., 1984).
— 101.1.1. Строение полимер-белкового конъюгата
Получаемый в результате химической модификации белков конъюгат состоит из белкового и полимерного фрагментов и сочетает в себе свойства каждого из них. В качестве полимерного фрагмента конъюгата наиболее широкое распространение получил полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ, НО-[СН2—СН2—О—]п—Н, является водорастворимым, линейным, нетоксичным, неиммуногенным синтетическим полимером, доступным в широком диапазоне молекулярных масс (Курганов Б.И., Топчиева И.Н., 1991). ПЭГ-белковые конъюгаты характеризуются пониженной иммуногенностью и антигенностью, увеличенным временем циркуляции в кровяном русле, а в ряде случаев повышенной стабильностью. Для понимания причин возникновения новых свойств у ПЭГ—модифицированных белков рассмотрим схему, позволяющую представить соотношение геометрических размеров молекулы белка и полимерных цепей (Курганов Б.И., Топчиева И.Н., 1991) (рис. 1.1). ПЭГ-белковые конъюгаты представляют собой звездообразные структуры, в которых молекула белка находится в центре, а полиэфирные цепи выходят из нее в виде лучей.
ЧОнм
Рис. 1.1. Схематическое изображение конъюгата полиэтиленгликоля с молекулярной массой 5000 Да с белком, имеющим молекулярную массу 30 000 Да (а) и 300 000 Да (б). Приведено из: (Курганов Б.П., Топчиева И.Н., 1991).
Из приведенной схемы (рис. 1.1), на которой изображены конъюгаты белков с ПЭГ-5000 (длина полимерных цепей составляет -40 нм), видно, что длина прививаемых полимерных цепей существенно превышает размеры белковой глобулы. Такое строение конъюгатов приводит к стерическому экранированию молекулы белка по отношению к макромолекулярным лигандам и устраняет белок-белковые взаимодействия, не оказывая влияния на взаимодействие белковой глобулы с низкомолекулярными веществами.
Перспективным представляется модификация белков с использованием водорастворимых блок—сополимеров окиси этилена и окиси пропилена (проксанолов, Про): НО—[СН2—СН2—О—]п—[СН(СН3)—СН2—О—]т—Н, позволяющая получать конъюгаты с новыми свойствами, обусловленными дифильной природой полимера—модификатора, содержащего наряду с гидрофильными полиэтиленоксидными (ПЭО) блоками гидрофобные, полипропиленоксидные (ППО) блоки. Так, в работах (Ефремова Н.В. с соавт., 1992; Ефремова Н.В., Топчиева И.Н., 1993; ТорсЫеуа Ш., & Ейешоуа КУ., 1994; ТорсЫеуа ег а1., 1995; Ефремова Н.В. с соавт., 1996; МогИаеу У.У. е! а1., 1996) были получены конъюгаты на основе Про и а—химотрипсина (ХТ). По сравнению с ПЭГ—белковыми конъгатами, конъюгаты белков с Про характеризуются большим структурным разнообразием, проявляющимся, во-первых, в возможности присоединения сополимеров с различным числом, составом и расположением блоков, и, во-вторых, в возможности различного расположения полимерных цепей на поверхности белковой глобулы, а также новыми свойствами, такими как способность транслоцироваться через биологические мембраны в клетку (Топчиева И.Н. с соавт., 19946), способность солюбилизировать
нерастворимые в воде биологически активные соединения (Топчиева И.Н. с соавт., 1991), а также способность взаимодействовать с поверхностно-активными веществами различной химической природы.
Схематическое строение конъюгатов с белковой глобулой в центре и ковалентно присоединенными к ней полимерными цепями Про приведено в работе (Топчиева И.Н. с соавт., 1995а) (рис. 1.2). Полимерные цепи. Про могут либо равномерно распределяться по поверхности белковой глобулы и, таким образом, уменьшать связывание белка с макромолекулярными субстратами, антителами и протеолитическими ферментами, либо располагаться в одном месте, образуя домены. При проведении синтеза в водно—органических средах, где гидрофобные взаимодействия между молекулами проксанолов подавлены, образуются конъюгаты с равномерным распределением цепей полимера по поверхности белковой глобулы. В результате синтеза в водных буферных средах, где проксанолы проявляют способность к самоорганизации, обусловленной их дифильной природой (Осипова C.B. с соавт., 1990), возникают условия для их- неравномерного распределения по поверхности белка. Образуются своеобразные внутримолекулярные мицеллы. В работе (Левашов A.B. с соавт., 1981) было показано, что модификация белка происходит только по первичным аминогруппам и не затрагивает другие аминокислотные остатки.
Интерес исследователей к ковалентным конъюгатам белков с ПЭГ и другими гидрофильными полимерами обусловлен, по крайней мере, двумя причинами. Во—первых, рыхлая полимерная оболочка вокруг белка, образующаяся при модификации ПЭГ, позволяет защитить белковую молекулу от взаимодействия с
Рис. 1.2. Схемы строения конъюгатов белков с полиалкиленоксидами: I — с полиэтиленоксидом, IIa — с проксанолом (распределение полимерных цепей неравномерное), Пб, III — с проксанолом (равномерное распределение полимерных цепей). Приведено из (Топчиева И.Н. с соавт., 1995а). Обозначения: 1 — белок, 2 — ПЭО—блок сополимера, 3 — ППО—блок сополимера.
другими белками, в частности, с антителами (Wei J., & Fasman G.H., 1995; Abuchowsky A. et al., 1977b, Lee W.T., & Sehon A.N., 1977), что может быть использовано в иммунологических исследованиях. Во—вторых, благодаря амфифильному характеру полимерных цепей, ПЭГ-белковые конъюгаты обладали способностью растворяться и сохранять высокую каталитическую активность как в воде, так и в растворах органических раство
- Сорокина, Елена Михайловна
- кандидата биологических наук
- Москва, 1999
- ВАК 03.00.04
- Исследование структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека, модифицированных некоторыми производными декстрана и полиэтиленгликолем
- Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd
- Физико-химические свойства основных групп белков крови у различных по экологии и таксономическому положению представителей хрящевых, хрящевых ганоидов и костистых рыб
- Разработка методов получения рекомбинантных белков-цитокинов на примере γ-интерферона, интерлейкина-3 и фактора некроза опухолей- α
- Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов