Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов получения рекомбинантных белков-цитокинов на примере γ-интерферона, интерлейкина-3 и фактора некроза опухолей- α

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов получения рекомбинантных белков-цитокинов на примере γ-интерферона, интерлейкина-3 и фактора некроза опухолей- α"

На правах рукописи

РГВ од

- 3 янп ?'1Г0

ПЕЧЕНОВ СЕРГЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

Разработка методов получения рекомбинантных белков-цитокинов на примере у-интерферона, интерлейкина-3 и фактора некроза опухолей-а.

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МСЮКВА-2000

Работа выполнена в лаборатории Биотехнологии института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН и на кафедре Биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: Член-корресспоцдент РАМН, доктор химических наук, профессор кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник

Швец В.И.

Вульфсон А.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор доктор биологических наук

Алахов Ю.Б. Честухина Г.Г.

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится * // " у 2000 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 063.41.01 В Московской государственной академии тонкой химической технологии им М.В. Ломоносова, по адресу 117571, Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова (119831, г. Москва, ул. М. Пироговская, 1)

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Лютик А.И.

2

Актуальность проблемы. Лекарственные препараты на основе рекомбинантных белков все более широко используются в клинической практике. 8 настоящее время подавляющее большинство новых белковых препаратов медицинского назначения получается выделением из генетически трансформированных клеток. Среди большого количества микробиологических систем, доступных для продуцирования рекомбинантных белков, грамм-отрицательная бактерия Escherichia coli является одной из широко используемых.

Экспрессия рекомбинантных белков в Е. coli может достигать 50% от всего клеточного белка. Но клеточный аппарат бактериальных систем, за редким исключением, не способствует полной ренатурации рекомбинантного белка. При так называемой "сверхэкспрессии" белка часто образуются тела включения - нерастворимые агрегаты целевого рекомбинантного белка и его комплексы с клеточными белками и небелковыми компонентами, что дает возможность легко отделить целевой белок от водорастворимых клеточных компонентов. Но для получения биологически активного белка необходимо его ренатурировать. Методы выделения, очистки и ренатурации сильно различаются для каждого получаемого рекомбинантного белка. Наличие клеточных примесей - нуклеиновых кислот, гидрофобных компонентов и клеточных белков, снижает эффективность ренатурации, являющейся ключевой стадией получения рекомбинантного белка в биологически активной форме. Позгтому выбор методов выделения и очистки белка определяет правильное и эффективное протекание ренатурации и производительность всего процесса получения рекомбинантного белка. Таким образом, исследование ренатурации является самостоятельной сложной задачей.

Объекты настоящего исследования - рекомбинантные человеческие белки цитокины - гамма-интерферон (у-ИФН), фактор некроза опухолей-альфа (се-ФНО) и интерлейкин-3 (ИЛ-3) - перспективны с точки зрения их медицинского применения. Часто природные белки имеют характеристики, осложняющие их использование, например, низкая стабильность 7-ИФН или высокая токсичность а-ФНО. Создание соответствующих белков-аналогов является актуальной задачей для их внедрения в клиническую практику.

Работа выполнена в соответствии с планом работ по федеральной целевой программе "Государственная поддержка интеграции высшей школы и фундаментальной науки."

Цель работы. Целью работы была разработка эффективных методов выделения, очистки и ренатурации рекомбинантных белксв, экспрессируемых в Е. coli: а-ФНО дикого и мутантного (с пониженной токсичностью) типов, у-ИФН и ИЛ-3; получение аналогов у-ИФН, обладающих повышенной стабильностью и биологической активностью. Особое внимание

уделялось изучению факторов, влияющих на ренатурацию названных рекомбинантных белков.

Научная новизна. Впераые для создания стабильных аналогов у-ИФН человека применен подход, сочетающий введение внутримолекулярной дисульфидной связи и модифицирование структуры С-концевой области.

Изучены особенности и найдены общие закономерности ренатурации у-ИФН, ИЛ-3, гибридного белка - предшественника инсулина человека. Предложен метод поиска оптимальных условий ренатурации на основе анализа вторичной структуры денатурированных белков. Систематизированы подходы к поиску условий ренатурации рекомбинантных белков.

Показано отрицательное влияние некоторых клеточных компонентов и положительное влияние некоторых искусственных добавок на ренатурацию вышеперечисленных белков.

Практическая значимость. В ходе работы получены у-ИФН дикого типа и 4 аналога (комбинации с введением дисульфидной связи, С-концевого укорочения и концевой замены), а-ФНО дикого и мутантного (R32H) типов, ИЛ-3. Показано повышение стабильности и биологической активности полученных аналогов у-ИФН.

Стабильные аналоги у-ИФН, низкотоксичный аналог а-ФНО и ИЛ-3 представляют интерес для проведения клинических испытаний. Оптимизация ренатурации гибридного белка - предшественника инсулина человека может быть использована при разработке эффективной технологии производства человеческого инсулина.

Разработаны высокоэффективные и унифицированные методики получения высокочистых биологически активных рекомбинантных белков в препаративных количествах. Предложены методы удаления гидрофобных клеточных компонентов и нуклеиновых кислот, отрицательно влияющих на ренатурацию.

Предложенные подходы могут быть использованы при выделении, очистке и поиске условий ренатурации других рекомбинантных белков.

Положения, выносимые на защиту.

1) Разработка схем выделения, очистки и ренатурации рекомбинантных белков из биомассы трансформированных клеток Е. coli. Исследование закономерностей ренатурации.

2) Выбор подхода к увеличению активности и стабильности у-ИФН.

3) Разработка унифицированной схемы получения рекомбинантных белков-цитокинов а-ФНО, у-ИФН и ИЛ-3.

Апробация работы. Материалы работы доложены на IV чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 212.11.1998; на научно-технической конференции "Фундаментальные и прикладные вопросы биотехнологии и медицины." ГосНИИОЧБ, Санкт-Петербург, 19-20. 04. 2000; на V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 13-20. 11. 2000.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, 4 работы приняты к печати.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 137 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуодения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 190 наименований и содержит 13 таблиц и 42 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка методов выделения рекомбинантных белков из биомассы трансформированных клеток E.coli.

В ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова созданы штаммы-продуценты ряда рекомбинантных белков человека. Среди них продуценты белков дикого типа и их мутантных аналогов а-ФНО, у-ИФН и ИЛ-3, а также гибридных белков - предшественников инсулина. Продуценты изучаемых белков были предоставлены: у-ИФН - Е.Д. Свердловым с сотр. (лаб. структуры и функции генов человека ИБХ РАН); а-ФНО, а-ФНО (R32H), у-ИФН (мутантные аналоги) и гмбрццный белок - предшественник инсулина - В. Г. Коробко с сотр. (лаб. химии генов ИБХ РАН); ИЛ-3 - А.И. Гуревичем с соавт. (лаб. биотехнологии ИБХ РАН). Образцы биомассы культивированы Т.И. Костроминой с сотр. в группе микробиологии лаб. Биотехнологии на комплексной опытной установке ИБХ РАН.

Уровень экспрессии этих рекомбинантных белков в клетках Е. coli составляет 2449% от всего клеточного белка. При этом образуются нерастворимые белковые комплексы - тела включения (исключение из исследованных белков составляет лишь а-ФНО, продуцируемый в виде растворимого биологически активного белка). Как правило, опубликованные в литературе методы выделения, очистки и ренатурации белков не всегда позволяют достичь высокого выхода целевого продукта, зачастую дороги, трудоемки и требуют больших временных затрат. Отработка методик получения рекомбинантных белков требует изучения особенностей их ренатурации, выбора порядка и оптимизации стадий выделения и очистки. В настоящей работе на всех стадиях очистки белков использовали в основном хроматографические методы, как наиболее селективные, эффективные и легко

поддающиеся оптимизации. Сложность объектов исследования возрастала от сх-ФНО, при получении которого требуется только очистка, к у-ИФН и ИЛ-3, требующим оптимизации ренату рации.

Разработка метода выделения и очистки а-ФНО.

а-ФНО - цитокин, обладающий противоопухолевой и цнтотоксической активностью, является одним из важнейших медиаторов иммунного ответа. Перспективы клинического использования связаны с противоопухолевой, а в сочетании с другими белками, такими как -f-ИФН и икгерлейкины, антивирусной аетивностью. Широкое клиническое изучение и терапевтическое применение а-ФНО сдерживаются из-за его высокой токсичности для организма; для преодоления этой проблемы получают мутакгные формы а-ФНО, обладающие меньшей системной токсичностью и сохраняющие противоопухолевые свойства.

а-ФНО - белок, состоящий из 157 а.о., молекулярная масса около 17 кДа, р! 4,5. Билогическую активность проявляет в виде тримера с молекулярной массой 51 кДа.

В процессе роста клеток Е. coli штамма SG 20050, трансформированных ппазмидой pTNF31A, а-ФНО с делецией двух N-концевых аминокислот накапливается в растворимой биологически активной форме в цитоплазме. Для получения обогащенного раствора а-ФНО и отделения от клеточного дебриса суспензию клеток дезинтегрировали ультразвуком и фильтровали через мембранную кассету. Полученный микрофильтрат содержал целевой а-ФНО (30%) и другие растворимые компоненты клеточной цитоплазмы.

Для последующей очистки а-ФНО была использована ионообменная хроматография. При оптимизации стадий хроматографической очистки пришли к варианту, в котором стадия очистки на катионообменном сорбенте следовала за хроматографией на анионообменном сорбенте. Для предочистки микрофильтрата от гидрофобных примесей использовали нейтральный гамма гель (Н-у-гель) - немодифицированный сорбент, инертный по отношению к гидрофильным соединениям, но удерживающий гедрофобные примеси. Стадия предочистки представила собой фильтрацию через Н-у-гель последующую хроматографию на анионообменном сорбенте QAE^y-геле, функциональные группы которого представлены четвертичным амином. Таким образом были удалены гидрофобные компоненты смеси, нуклеиновые кислоты и другие компоненты кислого характера.

•(Выполнено совместно с Р.В. Тихоновым, группа биотехнологии рекомбинантных белков лаборатории Биотехнологии ИБХ РАН.)

После очистки на Н-у- и ОАЕ^у-геле, а-ФНО хроматографировали на колонке с

фосфо гамма гелем (Р-у-гелем). Полученные фракции были обессолены на колонке с БерЬайех <3-50 и стерильно профильтрованы. Общий выход составил 51%. Результаты очистки а-ФНО приведены в табл. 1.

Чистота а-ФНО после такой очистки была выше 98 % по данным гельэлектрофореза в

полиакрипамидном геле (ДСН-ГЭФ) и ионообменной ВЭЖХ (рис. 1, а). Спектр НД (рис. 1, б) полностью совпал со спектром природного белка. Результаты двенадцати шагов 1М-концевого секвенирования а-ФНО согласуются с известной аминокислотной

последовательностью.

Таблица 1. Выделение и очистка а-ФНО.

Стадия выделения Суммарный белок, мг Содержание а-ФНО I Выход, %

По данным ДСН-ГЭФ, % Мг

Дезинтеграция 1125 24 270 100

Микрофильтрзция 875 30 262 97

Хроматография на Н-у-геле и ОАЕ-у-геле 340 65 221 82

Хроматография на Р-у-геле 158 >95 150 56

Гель-фильтрация на 8ерЬас1ех <3-50 140 >98 137 51

а-ФНО высоко токсичен для организма, и в концентрациях терапевтических доз вызывает анафилактический шок. Системная токсичность и воспалительное действие инициируется его взаимодействием с рецептором ТЫР(375, а цитотоксичность против опухолевых клеток определяется его взаимодействием с рецептором ТЫРР?55. Ранее было показано, что с рецептором ТЫР(355 селективно взаимодействуют аминокислотные остатки 30-34. С целью снижения системной токсичности а-ФНО В.Г. Коробко с сотрудниками был

Рис. 1. (а) - ВЭЖХ а-ФНО на колонке Ар мсорб-Б I -500-Д ЭАЭ, (6) - спектр кругового дихроизма а-ФНО.

создан мутантный аналог с точечной заменой Arg32 на His (R32H). Системная токсичность этого мутанта оказалась в 100 раз ниже, чем у белка дикого типа. Для выделения и очистки а-ФНО R32H была использована схема, разработанная для белка дикого типа, выход и чистота полученных белков были сопоставимы.

Разработка методов выделения, очистки и ренатурации у-ИФН.

Интерфероны - секретируемые белки клеток, проявляют широкий спектр биологического действия: антивирусную и противоопухолевую активность, ингибируют клеточный рост, влияют на дифференцировку клеток, обладают иммунорегулирующим действием. у-ИФН проявляет антивирусное и иммунорегулирующее действия, а высокая антипролиферативная активность у-ИФН (в 100 раз выше чем у а-ИФН) делает его перспективным при терапии онкологических заболеваний. Наибольший эффект дает применение у-ИФН в сочетании с а-ФНО.

Молекула природного -у-ИФН состоит из 143 а. о., молекулярная масса 16775 Да. Количество основных аминокислот (Arg+Lys) превышает количество кислых аминокислот, что делает белок основным (pi 10.4). Биологическую активность у-ИФН проявляет в виде нэковалентно связанного димера. Тепловая денатурация у-ИФН происходит при 52°С и приводит к необратимой агрегации (интерфероны а, р и to выдерживают кратковременный нагрев до 100°С).

Низкая стабильность является препятствием широкого клинического использования у-ИФН. Перспективным подходом преодоления этой проблемы является создание аналогов у-ИФН, обладающих повышенной стабильностью и биологической активностью. Известные способы изменения молекулы у-ИФН - введение остатков цистеина, образующих внутримономерную дисульфидную связь, укорочение С-концевой области и концевая точечная замена.

Для решения этой задачи было необходимо разработать метод выделения, очистки и ренатурации у-ИФН дикого типа, получить мутантные аналоги 7-ИФН сравнить эффективность известных модификаций молекул у-ИФН, создать аналог у-ИФН с максимально повышенной стабильностью и активностью.

Разработка метода выделения, очистки и ренатурации у-ИФН дикого типа.

Для получения рекомбинантного у-ИФН использовали штамм £ со// МН-1, трансформированный плазмидой plFN-y-trp2. Содержание у-ИФН в клетках E.coli составляло до 49% от суммарного белка, накапливающегося в виде тел включения. После дезинтеграции биомассы клеток Е. coli тела включения отделяли центрифугированием и

проводили их отмывку, которая позволила удалить значительное количество водорастворимых примесей.

Для растворения у-ИФН требуется высокая концентрация хаотропного агента - 8 М мочевины при рН 9.4. Попытки ренатурировэть у-ИФН после экстракции приводили к его агрегации из-за присутствия в экстракте нуклеиновых кислот, педрофобных примесей и примесей хлеточных белков.

Для очистки от гидрофобных примесей успешно использовали предочистку экстракта у-ИФН фильтрацией через Н-у-гель. Для удаления нуклеиновых кислот и кислых белков проводили предочистку на ОАЕ-у-геле, у-ИФН при этом не удерживался на колонке.

После предочистки фильтрат хроматографировали на колонке с катионообменным сорбентом - вР-Тоуореаг!, с которой у-ИФН элюировапи в линейном градиенте концентрации ацетата аммония. После хроматографии на БР-Тоуореаг! у-ИФН ренатурировали. Для ренатурации у-ИФН были найдены оптимальные условия: Сгифн 0.15 мг/мл; Смочееины 0.8 СгдНОАс 25 мМ; рН 7.5; 10-3 С.

Окончательная очистка ренатурированного у-ИФН достигалась повторной хроматографией на вР-Тоуореаг!, учитывая изменение свойств белка в результате ренатурации. Фракции, содержащие у-ИФН, обессоливали и фильтровали в стерильных условиях. Результаты выделения, очистки и ренатурации приведены в табл. 2.

Чистота у-ИФН по данным ДСН-ГЭФ в ПААГ и обращенно-фазовой (оф) ВЭЖХ составила более 98%, молекулярная масса димера - 34 кДа (по данным гель-хроматографии на сефадексе в-бО). Результаты 12 шагов Ы-концевого секвенирования согласуются с известной аминокислотной последовательностью у-ИФН. Противовирусная активность составила 2,2х107 МЕ/мг, что соответствовало литературным данным.

Таблица 2. Результаты выделения и очистки у44ФН дикого типа.

Стадия выделения Суммарный белок, мг Содержание у-ИФН Выход, % I

По данным ДСН ГЭФ, % мг

| Дезинтеграция 213 44 104 100

I Отмывка тел включения 141 58 82 79

Экстракция 124 59 74 70

Предочистка на Н-у-геле и ОАЕ-^геле 113 60 68 65

Хроматография на БР-Тоуореаг1 51 92 47 44

Ренатурация 42 92 39 37

Хроматография на ЭР-Тоуореаг! и бессоливание 33 99 32 31 |

Получение мутантных аналогов у-ИФН и исследование их свойств.

Для сравнения известных способов модифицирования структуры у-ИФН и создания

стабильного аналога у-ИФН были созданы следующие аналоги белков:

1 7 69 133 143 (!) Gin----Glu---Ser-Gin-Gin

(II) G Infill) Gln-

(IV) Gln-

(V) Gln-

-Glu— -Cys--Cys--Glu--Cys-

-Cys---Cys— —Ser— -Cys-

—Gin-Gin

-Gin

-Leu

-Leu

у-ИФН, белок дикого типа у-ИФН E7C/S69C у-ИФН E7C/S69C Д10 у-ИФН Q133LA10 у-ИФН E7C/S69C Q133L 410

Все синтезированные в клетках £ coli аналоги у-ИФН накапливались в телах включения. Белки получали по описанной выше схеме, но введение остатков цистеина, концевое укорочение и концевая замена привели к изменению свойств у-ИФН, поэтому конкретные методики выделения и очистки аналогов имели следующие различия: для укороченных аналогов (Л10) не проводился полный цикл отмывок, их очистку перед ренатурацией вели при пониженном рН; все варианты белков, содержащие Cys, очищали в присутствии [3-меркаптоэтанола (Р-МЭ), а замыкание дисульфидных связей в них проводили после ренатурации.

При гель-фильтрации на сефадексе G-50 Superfine ренатурированные аналоги у-ИФН элюировапись в объеме, соответствующем размеру димерной формы белка. Чистота полученных у-ИФН и его аналогов, по данным ДСН-ГЭФ (рис. 2) и оф-ВЭЖХ, достигала 9799%.

123 4567 8 9 10 11

Рис 2. Гель-алектрофореграммы у-ИФН и его мутантов: дорожки 1 и 11 - маркеры молекулярной массы (кДа); 2 - дезинтеграт биомассы; 3 - супернатант дезинтеграта биомассы; 4 - экстракт тел включения; 5 - белок после хроматографии на SP-Toyopearl; 6 - ренатурированный и очищенный на SP-Toyopearl у-ИФН (I); дорожки 710 - ренатурированные и очищенные аналоги у-ИФН (II), (III), (IV) и (V).

(0]х10-3 (йед ст2 с1тЫ-1)

Полученные аналоги у-ИФН были охарактеризованы по их вторжной структуре,

термостабильности, противовирусной

активности и связыванию с антителами, а также по их хроматографическому поведению на обращенно-фазном сорбенте.

Сравнение КД-спектров показало, что введение дисульфидных связей, С-концевые укорочения и концевая замена практически не внесли изменений во вторичную структуру белков (рис. 3).

Термостабильность оценивали по температуре плавления белка, определяемой как середина перехода изменения максимума а-спиральной эллиптичности при 220 нм в зависимости от температуры (рис. 4, а). Наибольший вклад

130 200 210 220 230 240 250

Рис. 3. КД-спектры у-ИФН и его мутантных аналогов.

в повышение термостабильности вносит введение дисульфидной связи, укорочение также способствует повышению термостабильности, и небольшой вклад внесла концевая замена. Сочетание введения дисульфидной связи, С-концевого укорочения и концевой замены привело к максимальному повышению термостабильности (таблица 3).

ЗУ!

0,9 О,В 0,7 0,6 0,5 -0,4 0,3 0,2 0,1 а

\\

♦ «и

» (III

4 II«)

■ (ПО

х (V)

\ч\

относительная представление

20 30 40 50 6» 11} Е0 80 г С

Рис. 4. Тепловая денатурация у-ИФН и аналогов (1)-(\/): а -эллиптичность при 220 нм (Х() как функция от температуры; б • функции в дифференциальной форме (<ЛХ( /сН)

Представление экспериментальных данных в дифференциальном виде (рис. 4, б)

показало, что тепловая денатурация у-ИФН дикого типа и аналога (IV) (без дисульфидной связи) проходит в два этапа, что может соответствовать некосперативному расплетению

различных спиралей молекулы. С-концеаое укорочение с концевой заменой привело к повышению стабильности концевой спирали и посредством этого к повышению стабильности всей молекулы. Введение дисульфидных связей привело к кооперативности расплетения спиралей. Показано, что укорочение С-концевой области молекулы приводит к снижению способности у-ИФН к агрегации в результате тепловой денатурации и к способности укороченных аналогов восстанавливать вторичную структуру после тепловой денатурации.

Исследования эпитопной специфичности анти-у-ИФН моноклонапьных антител с помощью прямого иммуноанапиза (проведено МА Слинкяным в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе) показали, что различия в пространственной структуре участков связывания с антителами у-ИФН дикого типа и его мутантных незначительны, что свидетельствует о незначительности изменений пространственной структуры аналогов.

Полноразмерные аналоги у-ИФН проявляли одинаковую противовирусную активность, С-концевое укорочение привело к четырехкратному увеличению активности ( табл. 3) (активность определяли по подавлению цитопатического действия вируса везикулярного стоматита в культуре диплоидных фибробластов человека, проведено A.A. Бабаянц, лаборатория Интерферонов НИИ Эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф. Гамалеи).

Таблица 3. Температура плавления и биологическая активность у-ИФН и его аналогов.

у-ИФН и его аналоги Т. пл., ÖC Увеличение Т. пл., °С Биологическая I активность, МЕ/мг |

(I)-дикий тип 52 - 2.2х107

(II) - E7C/S69C 68 16 2.2x107

(III) - E7C/SS9C Д10 69 17 8x107

(IV)-Q133L А10 57 5 8x1О7 I

(V) - E7C/S69C Q133L А10 71 19 7,5х107

у-ИФН питт тгта

15

;'-ИФН ETC/SG^C

Г-ИФН

E7C/S69C Д№

у-ИФН Л10 QI33L

—I— 20

25

"1— 15

п11п

а

20

25

25

Исследование хроматографического поведения полученных аналогов у-ИФН методом оф-ВЭЖХ (рис. 5) показало, что все ренатурированные аналоги у-ИФН (пики Ь)

обладают меньшим, чем белок дикого типа временем удерживания на оф-сорбентах и элюкруются раньше, чем

соответствующий денатурированный аналог (пики а). Ренатурированные белки, имеющие в своей

последовательности остатки цистеина, до замыкания дисульфидной связи

злюируются позже, чем белки с замкнутыми связями (пики с), но раньше, чем белки до ренатурации. Для аналогов у-ИФН, не имеющих в своей последовательности остатков цистеина, (I) и (IV), различия в хроматографической подвижности до ренатурации и после минимальны.

Уменьшение времени

/держивания ренатуратов белков с дисульфидными связями и концевым укорочением также может служить косвенным показателем их более жесткой пространственной структуры и соответственно повышенной по сравнению с белком дикого типа стабильностью.

Разработка метода получения ИЛ-3.

Интерлейкины - семейство биологически активных белков, которые действуют на различные типы клеток и участвуют в регуляции иммунных и воспалительных процессов. ИЛ-3 - гликопротеин, продуцируемый Т-лимфоцитами при стимуляции клеток антигеном или митогеном. Рекомбинантный ИЛ-3 применяется при лечении больных с недостаточностью функции костного мозга при прогрессирующих опухолевых заболеваниях.

У-ИФН

С?С/»9СД10<)П31,

Рис. 5. Изменение времен удерживания денатурированных белков (пики а) в результате их ренагурацни (пики b) п после замыкания дисудьфнднон связи (пики с) из обращенно-фазвой колонке DuPont С18.

ИЛ-3 человека содержит 134 а.о. и имеет молекулярную массу 16 кДа. Количество кислых аминокислот (Asp+Glu) превышает количество основных (Arg+Lys), что согласуется с найденным значением изоэлектрической точки (pl 5.6).

В процессе роста клеток £ со/У штамма ВКПМ В-6Э69, трансформированных плазмидой рЗРТЕИЗ, ИЛ-3 накапливается в телах включения, уровень экспрессии составляет 34% от общего клеточного белка.

Тела включения после дезинтеграции и центрифугирования последовательно отмывали буферными растворами, содержащими 1-2 % Тритона Х-100, затем 3.0 М мочевину. Для растворения тел включения использовали 5 М гуанидин гидрохлорцд или 8 М мочевину. Растворение успешно проходит в 8 М мочевине при pH 4-5 в цитратном буферном растворе. При экспрессии белка в тела включения дисульфидные связи замыкаются хаотично и для их восстановления необходимо добавление ß-меркаптоэтанола и ультразвуковое озвучивание.

Попытки провести ренатурацию непосредственно после растворения тел включения приводили к выпадению осадка, в котором содержалось значительное количество ИЛ-3, не способного к дальнейшей ренатурации.

Было установлено, что преципитация отчасти обусловлена низкой растворимостью денатурированного ИЛ-3 и в большей степени образованием нерастворимых комплексов белка с гидрофобными компонентами клетки, что было устранено пропусканием раствора тел включения через колонку с Н^-гелем.

После нахождения оптимальных условий ренатурации (Crp«c-Hci20 мМ; Сп«м 6 мМ; pH 8.5; Сип-з 1 мг/мл, Смсмевины 1-5 М; Ср-мэ 2 мМ; t 8°С) была исследована ее кинетика с помощью оф-ВЭЖХ. Реакция полностью проходит за 5 ч.

Отработанная схема выделения и очистки рекомбинантного ИЛ-3 включает в себя дезинтеграцию биомассы, отмывку и солюбилизацию тел включения, предочистку на Н-у-геле, ренатурацию, катионообменную хроматографию на SP-Toyopearl 650М, обессиливание на Сефадексе G-25. Белок допускает длительное хранение в лисфилизованном виде с сохранением биологической активности. Результаты выделения приведены в табл. 4.

Чистота по данным ДСН-ГЭФ и оф-ВЭЖХ составила более 98 %. Результаты 10 шагов N-концевого секвенирования ИЛ-3 согласуются с известной аминокислотной последовательностью этого белка. Спектр КД соответствует литературным данным. Биологическая активность составила 2х107 МЕ/мг.

Таблица 4. Результаты выделения и очистки ИЛ-3.

I Стадия Суммарный Содержание ИЛ-3 j

I выделения белок, мг по данным ДСН-ГЭФ, % мг Выход, %

I Дезинтеграция 750 34 255 100

, Экстракция 375 60 225 88 I

| Очистка на Н-»/- 338 65 220 86

| геле

| Ренатурация 208 77 160 63

| Хроматография I на БР-Тоуореаг! 141 99 140 55

| Обессоливание 128 99 127 50

Исследование роли и значения факторов, влияющих на ренатурациюрекомбинантных белков*

Ренатурация белков in vitro это ключевая стадия получения рекомбинантиого белка, экспрессируемого в телах включения. Поиск условий ренатурации для конкретного белка, представляет сложную многомерную задачу, решаемую путем постепенного подбора условий среды и оптимизации большого количества факторов. Изучение основных закономерностей ренатурации необходимо не только для ее оптимизации, но и для систематизации этих знаний. Помимо у-ИФН и ИЛ-3, модельным объектом исследования был выбран гибридный белок (ГБ) - предшественник инсулина человека.

Все факторы, влияющие на ренатурацию, можно разделить на две группы. Первая -внутримолекулярные факторы, такие как мутации, делеции рекомбинантиого белка, непосредственному контролю недоступны. Вторая - параметры реакционной среды: рН, температура и природа реакционной среды, концентрация белка и окислительно-восстановительный потенциал (для цистеинсодержащих белков). К особенностям способа получения рекомбинантных белков следует отнести наличие сопутствующих клеточных компонентов - нуклеиновых кислот, гидрофобных компонентов и бактериальных белков.

Выход правильно ренатурированного, биологически активного белка служит критерием влияния факторов и выбора их оптимальных значений.

Исследование влияния параметров реакционной среды.

Влияние клеточных компонентов.

Агрегация является основной причиной потерь рекомбинантиого белка при его выделении, очистке и ренатурации. Эффективность ренатурации у-ИФН при недостаточной

•(Исследование выполнено совместно с Р.В. Тихоновым, группа биотехнологии рекомбинантных белков лаборатории Биотехнологии ИБХ РАН.)

очистке от нуклеиновых кислот снижалась практически до нуля, вызывая полную преципитацию; наличие клеточных белков и гидрофобных примесей также отрицательно влияло на ренатурацию у-ИФН. Клеточные белки и нуклеиновые кислоты слабо влияли на ренатурацию ИЛ-3, но влияние гидрофобных компонентов было сильно отрицательным. При выделении белков полное удаление нуклеиновых кислот легко достигается анионообменной хроматографией, а гидрофобные клеточные примеси также легко удаляются при фильтровании через слабогидрофобный сорбент Н-у-гель.

Влияние рН реакционной среды.

100

Рис. 6. Влияние рН среды на эффективность ренатурации исследованных белков.

рН среды определяет общий заряд и степень гидратации белковой молекулы и непосредственно влияет на эффективность ренатурации (рис. 6).

Анализ вторичной структуры денатурированных белков (в присутствии хаотропных агентов) показал структурообразующее влияние рН среды (рис. 7, 8). Была найдена для всех исследованных белков общая тенденция - при рН оптимальном для проведения ренатурации, содержание а-спирапьных и р-складчатых элементов

вторичной структуры наиболее близко к вторичной структуре нативного белка.

[0]х10-3 град см2 дмоль-1 —о—рН5.0

зо

о

3 20

О

10 о

10 рН

нм

Рис. 7. КД-спектры (а) денатурированного у-ИФН при различных значениях рН в сравнении со спектром ренатурированного белка; соответствующее содержание

Рис. 8. Содержание элементов вторичной структуры денатурированного ИЛ-3 (а) и S-сульфонатов ГБ (б)Б при различных значениях pH (незакрашенные символы отображают содержание соответствующей структуры в ренатурированном белке).

Предполагается, что этим же способом могут быть оптимизированы параметры среды и при ренатурации других белков.

Влияние концентрации белка и температуры среды.

Биологическую активность у-ИФН проявляет в виде нексвалентно связанного цимера. Вероятность образования правильно сложенного мономера обратно пропорциональна концентрации белка, а вероятность образования димера повышается при повышении концентрации бепка. Оптимум концентраций при его ренатурации у-ИФН 0.1 VI г/мл.

Для ИЛ-3 и ГБ оптимальная концентрация белка (1 и 1.4 мг/мл соответственно) эграничмвается областью агрегации при повышении концентрации и минимальным значением окислительно-восстановигельнсго потенциала, необходимого для замыкания чисульфидных связей, при понижении концентрации белка.

Наиболее эффективно ренатурация всех исследованных белков протекает при температуре 0-2аС, однако для каждого конкретного белка максимальная температура, при «оторой выход реакции еще удовлетворителен, различна.

Влияние окислительно-восстановительного потенциала.

Все исследованные белки, кроме у-ИФН дикого типа, являются .(истеинсодержащими. Условия и способы образование нативных дисульфидных связей в <аждом из исследованных белков различаются. Замыкание внутримономерной цисульфццной связи в а-ФНО происходит непосредственно в клетке В. coli- Ренатурация

мутантных аналогов у-ИФН, содержащих в своей

последовательности остатки

цистеина, проходит в присутствии р-МЭ замыкание дисульфидной связи инициируется добавлением слабого окислителя уже после приобретения молекулой нативной

пространственной конформации. Для предотвращения окисления тиольных групп остатков цистеина растворение и предом истка ИЛ-3 проводили в присутствии р-МЭ (10 мМ). Замыкание единственной внутримолекулярной дисульфидной связи происходит под действием кислорода воздуха при снижении концентрации [5-МЭ до 2 мМ. Добавление катализаторов тиол-дисульфидного обмена снижает выход ренатурированного белка (рис. 8).

Гибрвдный белок (ГБ) - предшественник инсулина человека был использован как модельный объект для исследования тиол-дисульфидного обмена.

Ренатурация ГБ сопровождается образованием трех дисульфидных связей в проинсулиновой части молекулы. Было найдено, что ренатурация Э-сульфоната ГБ проходит более эффективно, чем окислительная ренатурация ГБ с восстановленными сульфгидрильными группами, между концентрациями белка и окислительного и восстановительного агентов существует оптимальное соотношение, которое характеризует инициирующее реакцию образования дисульфидной связи значение потенциала. Для различных концентраций белка оптимальные концентрации агентов выражаются мольным соотношением:

Э-ЗОз-группа : Р-МЭ: цистин = 1 : 2.8 : 0.4, причем поддержания потенциала в ходе реакции не требуется.

Таким образом, при окислительной ренатурации белков с одной дисульфидной связью инициация ее образования происходит при снижении концентрации восстанавливающего агента, либо после добавления окислительного агента, контроля потенциала реакции не требуется, но необходимо избегать тиол-дисульфидного обмена, который приводит к межмолекулярному замыканию дисульфидных связей, что, в свою очередь, приводит к агрегации и прецигагтацми белка. При ренатурации белков с

90 ,80

170-з-

ГО

§■60-

3 50

{340-1 о

|зо

#20 ■е

0510

□ без цистина □2 мМ цистина 04 цистина

а.

7,5

8,5

9,5

10,5 рН

Рис. 9. Ренатурация ИЛ-3 при различных рН и концентрациях цистина.

несколькими дисульфидными связями тиол-дисульфидный обмен необходим для перегруппировки неправильно замкнутых дисульфидных связей в нативные.

Влияние природы реакционной среды.

Природа реакционной среды - тип и ионная сила буферного раствора - оказывает влияние на эффективность ренатурации. Выбор типа буферного компонента реакционной смеси обычно определяется значением рН, при котором проводится ренатурация. Общей закономерностью является проведение ренатурации при низкой концентрации буферного компонента (10-30 мМ). Добавление хзотропных агентов приводит к уменьшению агрегации молекул в межмолекулярных белковых образованиях при ренатурации, вследствие ослабления водородных и/или ионных межмолекулярных взаимодействий.

Оптимизация условий ренатурации позволила достигнуть эффективности 80-90% чля всех исследованных белков. Было изучено влияние различных факторов на эенатурацию рекомбинантных белков. Совокупное воздействие этих факторов определяет структуру белка. При оптимальных для ренатурации условиях молекула белка обладает наиболее близкой к нативной вторичной структурой. Нарушение структуры белка в результате взаимодействия с различными структурообразующими компонентами, такими сак нуклеиновые кислоты, гидрофобные клеточные компоненты и клеточные белки, ;пособными вступать во взаимодействие с формирующейся молекулой, отрицательно шияет на ренатурацию - обрзование нативной пространственной структуры. При включении или нейтрализации этих препятствующих ренатурации факторов роль >стальных заключается в поддержании прохождения процесса в сторону образования штивной структуры белка.

Унифицированная схема получения рекомбинантных белков.

Были разработаны эффективные схемы получения рекомбинантных белков в сепаративных количествах. При сохранении индивидуальности методик для каждого белка, ¡ыла достигнута высокая степень схематической унификации всего процесса получения ¡иологически активных рекомбинантных белков (рис. 10). Схемы были унифицированы по орядку стадий выделения очистки и ренатурации, по применяемым сорбентам

Выработан единый подход к решению задач выделения и поиску оптимальных словий ренатурации, который состоит в (1) выборе методов выделения и солюбилизации ел включения; (2) подборе условий хроматографической очистки белка до ренатурации; (3) сследовании ренатурации и ее закономерностей, поиске оптимальных условий енатурации; (4) оптимизации стадий очистки белка до и после ренатурации.

Предочистка

Ренатура цмя

Биомасса

Выделение белка

Очистка

Продукт

Биомасса Биомасса Биомасса Дезинтеграция Дезинтеграция Дезинтеграция

I \ I

МФ

О

ТВ

ТВ

I Н-у-гель | | Н-у-гель I | Н-у-гель

1| в- -З» ¿V-!»

ОАЕ-у-гель

(ЗАЕ-у-гель

:;я5Р-Тоуореаг1

Г'

Р-7-гель [ 15Р-Тоуореаг1 I ^Р-Тоуорс-аг!

е-

«-ФИО

ил-з

ИФН--У

Рис. 10. Унифицированная схема получения рекомбинантных белков - цитокиное. МФ - микрофильтрация, ТВ - тела включения.

Отработанные подходы и принципы решения задач выделения, очистки и ренатурации рекомбинантных а-ФНО, у-ИФН и ИЛ-З были перенесены на более сложный объект - гибридный белок - предшественник инсулина человека. Выделенный, очищенный и ренатурированный ГБ был подвергнут ферментативному гидролизу. Полученный инсулин всесторонне охарактеризован.

Выводы.

1. Получены и охарактеризованы рекомбинантные белки: а-ФНО дикого и мутантного (R32H) типов, у-ИФН дикого типа и четыре мутантных аналога (E7C/S69C, E7C/S6SC ДЮ, Q133L Д10, E7C/S69C Q133L Д10), ИЛ-3. Все полученные цитокины переданы на предкпинические испытания.

2. Разработаны эффективные методы выделения, очистки и ренатурации рекомбинантных цитокинов в препаративных количествах с общим выходом 30-50% (80-90% на стадии ренатурации), унифицированные схематически и по использованию хроматографических методов выделения и очистки. Препаративный уровень соответствует получению порядка 10000 терапевтических доз субстанций.

3. Изучено влияние температуры, концентрации белка и состава среды на ренатурацию и найдены их оптимальные значения для всех исследованных белков. Показано отрицательное влияние на ренатурацию таких клеточных примесей, как нуклеиновые кислоты и гидрофобные компоненты и предложены простые и эффективные методы их удаления.

4. Изучена зависимость вторичной структуры денатурированных бепков от рН среды и найдено, что белки обладают близкой к нативной вторичной структурой при рН, оптимальном для ренатурации. Предполагается, что анализ вторичной структуры белка позволит унифицировать путь поиска оптимальных условий ренатурации.

5. Исследовано влияние введения ковалентной дисульфидной связи, С-концевого укорочения и концевой замены на стабильность и биологическую активность у-ИФН. Показано, что мутантный аналог у-ИФН с дисульфидной связью, С-концевым укорочением и концевой заменой (E7C/S69C Q133L А10) обладает наибольшей по сравненю с белком цикого типа термостабильностью и биологической активностью.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. А.Н. Вульфсон, Р.В. Тихонов, С.Е. Печенов, В.Е. Клюшниченко, А.И. Мирошников. Методы получения рекомбинантных белков-цитокинов. II. Эффективный метод выделения, очистки и ренатурации рекомбинантного у-интерферона человека. Биоорган, химия. 1997. Т 23. № 9. С. 721-726.

2. V.E. Klushnichenko, R.V. Tikhonov, S.E. Pechenov, S.A Yakimov, L.N. Shingarova, V.G. Korobko, A.N. Wulfson. Methods of preparation of recombinant cytokine proteins. III. Freeflow electrophoresis in the production of mutant human recombinant Tumor Necrosis Factor-alpha. Protein Expression and Purification. 1998. V. 14 P. 261-266.

3. P.B Тихонов, C.E. Печенов, В.И. Швец, А.Н Вульфсон. Методы получения рекомбинантных белков-цитокинов. IV. Ренатурация рекомбинантного человеческого интерлейкина-3. Биоорган химия. 2001, в печати.

A. R.V. Tikhonov, S.E. Pechenov, I.A. Belacheu, S.A. Yakimov, V.E. Klyushnichenko, E.F. Boldireva, V.G. Korobko, H. Tunes De Sousa, J.E. Thiemann, L. Vilela, A.N. Wulfson. Recombinant human insulin. VIII. Isolation of fusion protein-S-sulfonate, biotechnological precursor of human insulin, from the biomass of transformed Escherichia coli cells. Protein Expression and Purification. 2001, в печати.

5. R.V. Tikhonov, S.E. Pechenov, I.A. Belacheu, S.A. Yakimov, V.E. Klyushnichenko, H. Tunes De Sousa, J.E. Thiemann, L. Vilela, A.N. Wulfson. Recombinant human insulin. IX. Investigation of factors, influencing the folding of fusion protein-S-sulfonates, biotechnological precursors of human insulin. J. Protein Engineering. 2001, в печати.

6. S.E. Pechenov, R.V. Tikhonov, L.N. Shingarova, V.G. Korobko, M.A. Slinkin, V.E. Klyushnichenko, A.A. Babaiantz, D.L. Beliaev, V.P. Kuznetzov, V.l. Shvetz, A.N. Wulfson. Methods of preparation of recombinant cytokine proteins. V. -y-IFN mutants. Increasing stability and biological activity. J. Protein Engineering. 2001, в печати.

7. А.Н. Вульфсон, Е.Д. Свердлов, P.A. Крыкбаев, Т.И. Костромина, В.Е. Клюшниченко, С.А. Якимов, Р.В. Тихонов, С.Е. Печенов, И.П. Юнда. Лабораторный регламент на экспериментальное производство субстанции рекомбинантного у-интерферона человека. ЛР-12315-01-96 ИБХ РАН. 1996. С. 1-64.

8. АН. Вульфсон, В.Г. Коробко, Л.Н. Шингарова, Т.И. Костромина, С.А. Якимов, Р.В. Тихонов, С.Е. Печенов, И.П. Юнда. Лабораторный регламент на экспериментальное производство субстанции рекомбинантного фактора некроза опухолей-ос человека. ЛР-12315-02-96 ИБХ РАН. 1996. С. 1-56.

9. А.Н. Вульфсон, А.И. Гуревич, P.C. Есипов, Т.И. Костромина, С.А. Якимов, Р.В. Тихонов, С.Е. Печенов, И.П. Юнда. Лабораторный регламент на экспериментальное производство субстанции рекомбинантного интерлейкина-3 человека. ЛР-12315-03-96 ИБХ РАН. 1996. С. 1-47.

10. АН. Вульфсон, Р.В. Тихонов, С.А. Якимов, С.Е. Печенов, В.Е. Клюшниченко И.А. Белачеу, И.П. Юнда.: Исследование факторов, влияющих на трансформацию рекомбинантных белков, экспрессируемых в Е. coli, при разработке схем их выделения (инсулин, у-ИФН, фактор некроза опухоли-а, интерлейкин-3). Тезисы докладов IV чтений, посвященных памяти академика Ю.А Овчинникова. ИБХ РАН им М.М. Шемякина и Ю. А Овчинникова. Москва. 1998. С. 32.

11. С.Е. Печеное, P.B. Тихонов, В.И. Швец, А.Н. Вульфсон. Поиск стабильных аналогов у-интерферона и их исследование. Тезисы докладов юбилейной научно-технической конференции "Фундаментальные и прикладные вопросы биотехнологии и медицины." ГосНИИОЧБ, Санкт-Петербург. 2000. С. 48.

12. Р.В. Тихонов, С.Е. Печенов, А.Н. Вульфсон. Ренатурация биотехнологических предшественников - ключевая стадия получения рекомбинантного инсулина человека. Тезисы докладов юбилейной научно-технической конференции "Фундаментальные и прикладные вопросы биотехнологии и медицины." ГосНИИОЧБ, Санкт-Петербург. 19-20 апреля, 2000. С. 53.

13. С.Е. Печенов, Р.В. Тихонов, В.И. Швец, А.Н. Вульфсон. Получение и свойства стабильных мутантных аналогов гамма-интерферона человека. Тезисы докладов V чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова. Москва. 2000. С. 43.

14. Р.В. Тихонов, С.Е. Печенов, А.Н. Вульфсон. Унифицирование подходов к оптимизации условий ренатурации рекомбинантных белков (гибридные белки -предшественники инсулина, гамма-интерферон и его аналоги, интерлейкин-3). Тезисы докладов V чтений, посвященных памяти академика Ю.А Овчинникова, ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова. Москва. 2000. С. 48.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Печенов, Сергей Евгеньевич

Список сокращений.

Введение.

1. Литературный обзор "Методы получения рекомбинантных белков, структура и свойства фактора некроза опухолей-a, у-интерферона и интерлейкина-3."

1.1 Методы получения рекомбинантных белков.

1.1.1 Выбор системы экспрессии при получении рекомбинантных белков.

1.1.2 Ренатурация белка in vivo в Е. coli.

1.1.3 Ренатурация in vitro белков, экспрессируемых в

Е. coli в виде тел включения.

1.2 Фактор некроза опухолей альфа - структура и свойства.

1.2.1 Продукция a-фактора некроза опухолей человека (а-ФНО).

1.2.2 Молекулярная структура а-ФНО.

1.2.3 Биологически активная форма а-ФНО.

1.2.4 Изучение функционально важных участков молекулы а-ФНО.

1.2.5 Механизмы противоопухолевого и цитотоксического действия а-ФНО.

1.2.6 Токсичность а-ФНО.

1.2.7 Методы получения а-ФНО.

1.3 Гамма-интерферон: структура и биологическое действие.

1.3.1 Анализ первичной структуры гамма-интерферона у-ИФН). а) Анализ последовательности нуклеотидов гена б) Последовательность аминокислот природного у-ИФН в) Последовательность аминокислот рекомбинантного у-ИФН из трансформированных клеток Е. coli.

1.3.2 Вторичная и третичная структура у-ИФН.

1.3.3 Влияние С- и N-концевых аминокислотных последовательностей молекулы у-ИФН на конформацию и биологическую активность.

1.3.4 Механизм биологического действия у-ИФН.

1.3.5 Стабильность у-ИФН и методы ее повышения.

1.3.6 Методы выделения и очистки у-ИФН, экспрессируемого в Е. coli.

1.4. Интерлейкин-3: структура и биологическое действие.

1.4.1 Биосинтез ИЛ-3 клетками.

1.4.2 Молекулярная структура ИЛ-3.

1.4.3 Механизм биологического действия ИЛ-3.

1.4.4 Методы выделения и очистки ИЛ-3, экспрессируемого Е. coli.

2. Обсуждение результатов

2.1 Разработка метода выделения и очистки а-ФНО.

2.1.1 Разработка метода выделения и очистки а-ФНО дикого типа.

2.1.2 Выделение и очистка мутантного а-ФНО.

2.2 Выделение и очистка у-ИФН. Получение стабильных аналогов у-ИФН и их исследование.

2.2.1 Разработка метода выделения, очистки и ренатурации у-ИФН дикого типа.

2.2.2 Получение мутантных аналогов у-ИФН и исследование их свойств.

2.2.2.1 Выделение, очистка и ренатурация мутантных аналогов у-ИФН.

2.2.2.2 Изучение влияния введения дисульфидной связи, С-концевого укорочения и концевой замены и их комбинаций на свойства у-ИФН.

2.3 Разработка метода выделения, очистки и ренатурации ИЛ-3 человека, экспрессируемого в клетках Е. coli.

2.4 Исследование ренатурации.

2.4.1 Исследование влияния параметров реакционной среды.

2.5.1.1 Влияние клеточных компонентов.

2.4.1.2 Влияние рН реакционной среды.

2.4.1.3 Влияние концентрации белка и температуры среды.

2.4.1.4 Влияние окислительно-восстановительного потенциала.

2.4.1.5 Влияние природы реакционной среды.

2.4.2 Кинетика ренатурации.

2.5 Унифицированная схема получения рекомбинантных белков.

3. Экспериментальная часть.

4. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов получения рекомбинантных белков-цитокинов на примере γ-интерферона, интерлейкина-3 и фактора некроза опухолей- α"

Биотехнология рекомбинантных белков медицинского назначения в настоящее время является одной из наиболее перспективных, динамически развивающихся областей науки и производства в мире. На мировом рынке реализуются уже около 100 коммерческих лекарственных препаратов на основе рекомбинантных белков, которые составляют все более реальную альтернативу обычным лекарственным средствам. Ещё десятки препаратов, прошедших клинические испытания, находятся на стадии регистрации и начала производства. Большое количество белков находятся на клинических испытаниях [1].

Цитокины - полипептиды, относящиеся к семейству гормоноподобных молекул, которые действуют на различные типы клеток и участвуют в регуляции иммунных и воспалительных процессов. Человеческие белки-цитокины - фактор некроза опухолей-альфа (а-ФНО), гамма-интерферон (у-ИФН), и интерлейкин-3 (ИЛ-3) - перспективны с точки зрения их медицинского применения. а-ФНО обладает противоопухолевой и цитотоксической активностью. Возможное клиническое использование а-ФНО связано с его противоопухолевой, а в сочетании с у-ИФН и интерлейкинами антивирусной активностью [2]. у-ИФН проявляет противовирусное, антипролиферативное и иммунорегулирующие действия. Применяется для лечения различных заболеваний, в том числе и таких тяжелых, как рак и артрит [3, 4]. Механизм действия ИЛ-3 исследуется до сих пор, но уже имеются данные о применении его как лекарственного препарата при лечении больных с недостаточностью функции костного мозга при прогрессирующих опухолевых заболеваниях, лечении рака легких и апластической анемии [5, 6]. Важно отметить, что в различных физиологических процессах цитокины действуют синергично; так, эффект а-ФНО усиливается у-ИФН при действии на злокачественные опухоли [7].

Часто природные белки имеют характеристики, осложняющие их терапевтическое использование. Клинические испытания а-ФНО ограничиваются высокой системной токсичностью при концентрациях выше 500 Е/мл крови [8]. Низкая стабильность у-ИФН создает сложности при медико-биологических испытаниях, при приготовлении и хранении лекарственных препаратов [9, 10]. В отличие от других цитокинов и интерферонов, у-ИФН не содержит в своей последовательности остатков цистина, а биологическую активность проявляет в виде нековалентно связанного димера, что и обуславливает его низкую стабильность. Многообещающим походом к решению таких проблем является создание методами белковой инженерии мутантных аналогов а-ФНО с меньшей системной токсичностью и воспалительными свойствами и аналогов у-ИФН, обладающих повышенной стабильностью и биологической активностью.

Для широкого исследования свойств белков и проведения клинических испытаний требуется разработка эффективных методов их получения. В настоящее время подавляющее большинство новых белковых препаратов медицинского назначения получается выделением из генетически трансформированных клеток. Среди большого количества микробиологических систем, доступных для продуцирования рекомбинантных белков, грам-отрицательная бактерия Escherichia coli является одной из широко используемых.

Экспрессия рекомбинантных белков в Е. coli может достигать 50% от всего клеточного белка. Но клеточный аппарат бактериальных систем, за редким исключением, не способствует полной ренатурации рекомбинантного белка. При так называемой "сверхэкспрессии" белка часто образуются тела включения -нерастворимые агрегаты целевого рекомбинантного белка и его комплексы с клеточными белками и небелковыми компонентами. Образование тел включения дает возможность легко отделить целевой белок от водорастворимых клеточных компонентов. Но для получения биологически активного белка необходимо его ренатурировать. Как правило, опубликованные в литературе методы получения белков не всегда позволяют достичь высокого выхода целевого продукта, зачастую дороги, трудоемки и требуют больших временных затрат.

Методы выделения, очистки и ренатурации сильно различаются для каждого получаемого рекомбинантного белка. Наличие клеточных примесей -нуклеиновых кислот, гидрофобных компонентов и клеточных белков, снижает эффективность ренатурации, являющейся ключевой стадией получения рекомбинантного белка в биологически активной форме. Поэтому выбор методов выделения и очистки белка определяет правильное и эффективное протекание ренатурации и производительность всего процесса получения рекомбинантного белка. Таким образом, исследование ренатурации является самостоятельной важной задачей.

Разработка эффективных методов получения названных рекомбинантных белков являлась основной задачей настоящей работы. Большое внимание уделялось исследованию ренатурации.