Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd

Воробьев, Денис Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd
ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В ЛОМОНОСОВА

00347958В

Биологический факультет

На правг сописи

Воробьев Денис Витальевич

«Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd»

03.00.24 - микология 03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность

1 5 ОПТ 2009

Москва-2009

003479586

Диссертационная работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета имени М.В .Ломоносова

Научные руководители:

Официальные оппоненты

доктор биологических наук,

профессор

Е. С. Лобанова

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Н. Р. Мейчик

доктор биологических наук,

профессор

Е. П. Феофилова

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И. Д. Инсарова

Ведущая организация: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН

Защита состоится «30» октября 2009 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-2, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет. Факс-(095) 939-43-09

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультет МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «30» сентября 2009 года

Ученый секретарь ^^^Ц^МЖ^-Ш^

диссертационного совета, к. б. н. М. А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ктуальность проблемы. В настоящее время не возникает сомнений, что клеточная нка - одна из важнейших динамичных структур клеток микроорганизмов и высших стений (Горшкова, 2007). В талломах симбиотических организмов - лишайников, ормированных гифами гриба, клетками микроводорослей и/или цианобактерий, еточные стенки компонентов выполняют разнообразные функции: селективного навания и специфического контактного взаимодействия партнеров, формирования икальной морфофизиологической структуры таллома, определяют устойчивость шайников к неблагоприятным абиотическим факторам, участвуя в осуществлении мплекса взаимодействий между компонентами симбиотической системы и окружающей дой (Nieboer, 1978; Loppi et al, 1997; Wósten and Wessels, 1997; Бязров, 2005; Sacristán al, 2007; Феоктистов и др, 2009).

Ввиду того, что лишайники представляют целостную систему из нескольких мпонентов, которые трудно разделимы, то изолированная из такой сложной системы «точная стенка» является суммой клеточных стенок отдельных ее компонентов. Однако едует учитывать, что в составе препарата «клеточной стенки» таллома лишайника еобладает клеточная стенка микобионта, т.к. грибной компонент составляет основную лю (90-98%) биомассы таллома (Palmqvist, 2000; Бязров, 2005).

Одним из лимитирующих факторов формирования и роста лишайников in vivo является ажность среды обитания. Известно, что границы влажности, в которых организм изиологически активен, определяют ареал его распространения в наземных экосистемах almqvist, 2000). Можно предположить, что, не имея специализированных структур для глощения и транспорта ионов, ионообменные группы клеточных стенок компонентов шайников играют ключевую роль в процессах поступления в талломы минеральных ществ и воды из атмосферных осадков. Однако механизмы толерантности лишайников к сушиванию, а также процессы поглощения и транспорта ионов талломами лишайников учены недостаточно. Можно предположить, что в этом процессе определенную роль грают белки, относящиеся к классу гидрофобинов, и ионообменные группы клеточных нок.

Хитин-глюкановый комплекс является основным структурным компонентом клеточных нок грибов, участвующих в формировании лишайникового симбиоза, а его состав оотношение компонентов) свидетельствует о важнейших структурных изменениях в ставе клеточных стенок гриба в зависимости от возраста таллома. Необходимо отметить, i хитин-глюкановый комплекс у грибов участвует в процессах поступления и акопления минеральных веществ из атмосферных осадков (Ugrozov et al, 2008). Данные итературы о структурных изменениях в хитин-глюкановом комплексе в зависимости от зраста таллома лишайника отсутствуют.

Процесс формирования талломов лишайников in vivo связан с селективным узнаванием партнеров и их специфическим взаимодействием. Механизмы взаимодействия микобиоята с циано- и фикобионтами различны. У цианолишайников ведущая роль в этом процессе отводится лектинам, белкам или гликопротеинам, способным связывать олигосахаридные остатки с высокой специфичностью, а у фиколишашшков - специфическим АВР-белкам (algal binding protein) микобйонтов, являющихся компонентами их клеточных стенок (Sacristán et al., 2007). В литературе мало данных о специфических АВР-белках микобионтов в составе талломов лишайников. Известно, что они, взаимодействуя с рецепторами клеточных стенок водорослей, приводят к структурной перестройке как клеточных стенок фикобионта, так и цитоплазмы, вызывая деградацию хлоропластов (Sacristán et al., 2007). Можно предположить, что у трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa в состав клеточных стенок молодых частей таллома (апикальная и медиальная зоны) входят как специфические АВР-белки, участвующие в связывании фикобионта таллома - зеленой водоросли рода Соссотуха, так и лектины, осуществляющие селективное узнавание цианобактерий рода Nostoc, формирующих поверхностные цефалодии. Специфические белки клеточных стенок лишайников до настоящего времени изучены недостаточно.

Цель работы. Комплексное изучение состава и функциональной роли ионообменных групп и специфических белков клеточных стенок лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd в связи с особенностями структурной организации его таллома.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) изучить морфоструктурные особенности строения таллома лишайника Р. aphthosa-,

2) охарактеризовать состав ионообменных групп клеточных стенок таллома лишайника Р. aphthosa;

3) определить роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника Р. aphthosa;

4) изучить участие в ионообменном процессе хитин-глюканового комплекса микобионта;

5) выявить специфические нековалентно закрепленные и закрепленные при помощи дисульфидиых связей белки, входящие в состав клеточных стенок таллома Р. aphthosa;

6) установить функциональную роль ионообменных групп и специфических белков клеточных стенок таллома лишайника.

Научная новизна. В работе предложен новый подход к изучению таллома лишайника Р. aphthosa (L.) Willd, основанный на выделении структурно-функциональных зон, которые различаются анатомо-морфологическим строением и биохимическим составом. Впервые установлено, что в составе клеточных стенок лишайника Р. aphthosa присутствуют четыре типа функциональных групп, из них три являются катионообменными (два типа карбоксильных групп и фенольные ОН-группы), и одна - анионообменной (аминогруппы). Впервые определены физико-химические параметры, характеризующие количественный и

качественный состав ионогенных групп клеточных стенок Р. aphthosa, а также интервалы pH, в которых эти группы ионизированы и способны вступать в ионообменные реакции с катионами и анионами внешней среды. Определены параметры, количественно характеризующие способность к набуханию клеточных стенок Р. aphthosa. На основании значений коэффициентов набухания клеточных стенок и таллома лишайника установлена важная роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника. Впервые выделен и проанализирован хитин-глюкановый комплекс из клеточных стенок таллома лишайника Р. aphthosa. Показано, что его состав изменяется в зависимости от зоны таллома, т.е. от возраста лишайника.

Впервые проведено комплексное исследование нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков, входящих в состав клеточных стенок лишайника Р. aphthosa. Показано, что качественный и количественный состав белков клеточных стенок изменяется в зависимости от зоны таллома. Установлено, что у Р. aphthosa некоторые из нековалентно закрепленных белков клеточной поверхности представлены белками со свойствами амилоидов.

Практическое значение. Предложен метод для выделения и анализа хитин-глюкановош комплекса Р. aphthosa, который может быть применен для анализа хитин-глюкапового комплекса других видов лихенизированных и свободноживущих грибов. Разработан новый подход к исследованию белков клеточных стенок Р. aphthosa, который может быть использован в микологических исследованиях.

Полученные в работе результаты о присутствии в составе клеточной поверхности лишайника Р. aphthosa нековалентно закрепленных белков со свойствами амилоидов необходимо учитывать при биотехнологическом использовании биомассы лишайников.

Полученные в работе результаты используются в курсе лекций по «Общей симбиолопш» для студентов биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедр физиологии микроорганизмов и микологии и альгологии биологического факультета МГУ; семинаре кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ; Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора A.C. Бондарцева в Ботаническом институте им. B.JI. Комарова РАН, Санкт-Петербург, 2005; Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы, Казань, 2006; Междисциплинарном микологическом форуме с международным участием, Москва, 2009; конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» с международным участием, Москва, 2009.

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 5 работ. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно

с автором в процессе выполнения работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 173 стр. машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 203 наименования (из них 162 на иностранных языках). Работа содержит 18 таблиц и иллюстрирована 77 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы.

Обзор посвящен роли клеточных стенок лихенизированных грибов в их жизнедеятельности. Представлены имеющиеся данные по химическому составу и строению клеточных стенок симбионтов лишайников. Обсуждаются вопросы участия клеточных стенок лишайников в накоплении различных веществ их слоевищами. Приведены данные о функциональной роли белков клеточных стенок. Рассмотрен вклад белков, относящихся к классу гидрофобинов, в процесс жизнедеятельности грибов и лишайников.

Глава 2. Материалы и методы.

Объектом исследования служил трехкомпонентный листоватый лишайник Peltigera aphthosa (L.) Willi Выбор этого вида обусловлен тем, что по данным литературы можно предположить наличие у него белков, участвующих в формировании фико- и цианолишайников. Кроме того, для Р. aphthosa характерны поверхностные цефалодии, которые возможно отделить от поверхности таллома лишайника, что позволяет получить из трехкомпонентной системы двухкомпонентную.

Для характеристики апикальной, медиальной и базальной зон лишайникового таллома, а также для оценки качества выделенного из них полимерного матрикса клеточных стенок использовали методы световой и электронной сканирующей микроскопии.

Для определения качественного и количественного состава ионообме!Шых групп клеточных стенок проводили потенциометрическое титрование, которое осуществляли методом отдельных навесок (Мейчик и др., 1999). Анализируя полученные кривые зависимости сорбционной способности от pH, определяли число типов ионообменных групп, их количество и константы ионизации. Количество свободных аминогрупп определяли также методом неводного титрования.

Определение содержания воды в интакткых слоевищах лишайника и весового коэффициента набухания клеточных стенок лишайника в воде. Набухшие в воде фрагменты интактных слоевищ лишайников или стандартизованные клеточные стенки обсушивали фильтровальной бумагой и определяли их сырую массу (G/r и G/w, соответственно). Затем образцы высушивали при 60°С до постоянного веса и определяли их сухую массу (Gß и Gd*", соответственно). Весовой коэффициент набухания стандартизованных клеточных стенок (ff ) и содержание воды в интактных слоевищах (Q)

определяли по соответствующим формулам (Гельферих, 1962).

Эндогенное содержание ионов определяли титриметрическим методом и потенциометрическим методом с использованием ионселективных электродов.

Содержание общего белка определяли по методу Лоури с использованием спектрофотометрического метода. Присутствие амилоидоподобных белков определяли с помощью метода флуоресцентной спектрофотомерии.

Определение элементного состава слоевищ лишайника и выделенных из них клеточных стенок. Процентное содержание азота, углерода и водорода в слоевищах лишайника и выделенных из них клеточных стенках определяли в Институте общей и неорганической химии им. Курнакова с помощью полуавтоматического СНКт(8)-анализатора фирмы Carbo Erba Instruments (Италия).

Хитин-глюкановый комплекс выделяли согласно пат. 2121505РФ С08В37/02; C12N 1/14 с нашими модификациями.

Определение нековалентно закрепленных и закрепленных с помощью дисульфидных связей белков клеточных стенок проводили с помощью метода электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием белков непосредственно в геле при помощи кумасси и с помощью метода вестерн-блот анализа с последующей визуализацией белков на нитроцеллюлозной мембране.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием Excel 7,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Изучение анатомо-морфологической структуры и биохимического состава таллома лишайника.

На первом этапе исследования с помощью световой и электронной сканирующей микроскопии у Р. aphthosa были выявлены три зоны (апикальная, медиальная и базальная), которые существенно различаются своей структурной организацией (рис. 1).

Апикальная зона таллома Р. aphthosa составляет в среднем 1 см. Диагностирующим признаком апикальной зоны можно считать наличие на ее поверхности ищущих гиф. Их длина и количество уменьшаются по мере приближения к медиальной зоне. На поверхности апикальной зоны происходит закладка цефалодиев, специализированных структур, сформированных азотфиксирующими цианобактериями. Цефалодии легко отделяются от поверхности таллома, так как прикреплены к ней только кончиками ищущих гиф. Под цефалодиями сохраняется верхняя кора таллома лишайника.

Медиальная зона расположена от конца апикальной зоны до основания лопасти таллома. Ее размеры в среднем составляли 2-4 см. На поверхности медиальной зоны отсутствуют ищущие гифы. Многочисленные мелкие цефалодии в виде извитых палочек или мелких дисков погружены в поверхность таллома, а при отделении их от нее на поверхности таллома остаются бесцветные пятна. Изучение под световым микроскопом

срезов таллома в таких местах показало отсутствие пигментов в слое верхней коры и зоны фотобионта под ней.

Базальная зона составляет основную часть таллома лишайника Р. aphthosa. Цефалодии на поверхности этой зоны выявляются в виде крупных, до 3 мм в диаметре, дисков, погруженных в таллом лишайника. При отделении их от таллома наблюдается повреждение поверхности таллома. Под цефалодиями отсутствуют слой верхней коры и зона фотобионта.

Рисунок 1. Морфологическая дифференциация таллома лишайника Р. aphthosa: а - внешний вид трсхкомпонснтного листоватого лишайника; б - схема разделения таллома лишайника Р. aphthosa на апикальную, медиальную и базальную зоны.

Для характеристики биохимического состава исследуемого таллома определено содержание общего белка и основных биогенных элементов в различных зонах Р. aphthosa. Установлено, что наибольшим содержанием и белка, и азота характеризуется апикальная зона, а наименьшим - базальная. Следует отметить, что и в клеточных стенках разновозрастных частей таллома сохраняется аналогичная закономерность по содержанию общего азота (рис. 2, табл. 1).

Известно, что ионы калия, натрия, кальция, нитрат- и хлорид-ионы являются одними из основных в растительных организмах. Они принимают участие во многих биологически важных процессах. Данные об их содержании в талломе лишайников могут свидетельствовать о физиологических особенностях вида.

Наши результаты показывают, что разные по возрасту зоны таллома лишайника не отличаются по содержанию ионов натрия, калия и хлорида. Однако распределение по разным зонам таллома ионов кальция и нитрата неравномерно. По содержанию ионов кальция выделяется апикальная зона. В ней почти в 2 раза больше этих ионов, чем в медиальной зоне, и в 1,5 раза больше, чем в базальной. Известно, что у лишайников ионы

|альция играют роль в водном обмене и в образовании кристаллов оксалата кальция или ,омплексов с лишайниковыми кислотами. Более того, в литературе есть данные об участии 'онов кальция в процессе узнавания компонентов при формировании целостной |имбиотической ассоциации (Sacristán et al, 2007). Таким образом, полученные данные о ысоком содержании кальция в апикальной зоне могут свидетельствовать о том, что для ¡оста клеткам таллома необходима большая концентрация этого элемента (рис. 3). j Содержание нитрат-ионов в талломе лишайника плавно возрастает от апикальной к ¡юдиальной и далее к базальной зоне. В старых частях их почти в 2 раза больше, чем в ролодых (рис. 4). Вероятно, у Р. aphthosa в базальной зоне цианобактерии функционально юлее активны, чем в апикальной, так как в последней цефалодии закреплены на оверхности таллома только кончиками гиф (рис. 3.3, 3.4, 3.6 дисс.).

аблица 1. Общее содержание азота (N, %), в образцах таллома и препаратах клеточных стенок. 1риведены средние значения и их стандартные отклонения (пять биологических повторностей).

Таллом Клеточные стенки

Зона таллома N

апикальная 3,31±0,3 3,43±0,3

медиальная 3,03±0,4 3,29±0,1

базальная 2,81±0,3 2,92±0,2

Ill

апикальная медиальная базальная

'исунок 2. Общее содержание белка (мг/г сухой массы) в разных зонах таллома лишайника. Приведены средние значения и их стандартные отклонения (три биологические повторности).

го

q 90

ш 88 s

I 86

a 84

« 82 ш

ш 80 О

i [

80 г

апикальная медиальная базальная

Рисунок 3. Эндогенное содержание Са2+ (мкмоль/ г сухой массы) в талломе лишайника Р. aphthosa. Приведены средние значения и их стандартные отклонения (три биологические повторности).

Рисунок 4. Эндогенное содержание N03" (мкмоль/г сухой массы) в талломе лишайника Р. aphthosa. Приведены средние значения и их стандартные отклонения (три биологические повторности).

Глава 4. Исследование ионообменных свойств и белков клеточных стенок таллома лишайника Р. aphthosa в зависимости от возраста.

4.1 Оценка качества выделения клеточных стенок.

Выделение клеточных стенок из таллома лишайника Р. aphthosa проводили ло известной методике (Мейчик и др., 1999). На конечной стадии препараты промывали ацетоном, чтобы удалить оставшиеся, возможно, лишайниковые вещества, а затем высушивали в термостате при 55-60°С. Под термином «клеточные стенки» мы

подразумеваем в основном клеточные стенки микобионта, т.к. основную массу таллома лишайника (до 98%) составляет микобионт.

Для оценки качества выделения клеточных стенок проводили микроскопическое исследование препаратов таллома и изолированных из него клеточных стенок, окрашенных флуоресцентным красителем ОЛР1 (4",6-<Иапп<1шо-2-рЬепШп<к>1е). Исследование показало отсутствие в образцах изолированных клеточных стенок внутриклеточных структур, при этом в препаратах сохранялась целостность структуры, тогда как в гифах таллома лишайника отчетливо видно присутствие ДНК.

Д ля доказательства отсутствия в препаратах клеточных стенок внутриклеточных белков нами проведен сравнительный анализ данных электрофореза в полиакриламидном геле выделенных из таллома лишайника клеточных стенок и измельченных частей таллома. На полученных электрофореграммах четко видно отсутствие белковых полос в экстрактах из клеточных стенок (рис. 4.1.3 дисс.), в то время как в экстрактах из таллома обнаружены белки с различной молекулярной массой (рис. 4.1.4 дисс.).

Еще одним доказательством качества полученных препаратов клеточной стенки могут служить результаты сравнительного анализа данных элементного анализа выделенных клеточных стенок и образцов измельченного таллома после выделения общего белка. Как свидетельствуют данные, препараты таллома и клеточной стенки мало отличаются по содержанию азота, углерода и водорода, что также указывает на отсутствие внутриклеточных белков в полученных нами препаратах клеточных стенок (рис. 4.1.5 дисс.).

4.2 Определение качественного и количественного состава ионообменных групп клеточных стенок.

Известно, что одна из важных функций клеточных стенок - поглощение воды и минеральных веществ. Проходя через клеточные стенки, благодаря физико-химическим особенностям этого компартмента, питательные вещества включаются в создание внутренней физиологической среды организма. В работе нами определены ионообменные свойства клеточных стенок, изолированных из разных зон таллома и их возможный вклад в накопление ионов клетками. Определено, что в структуре полимерного матрикса клеточных стенок содержится 4 типа ионогенных групп, способных принимать участие в обменных реакциях с ионами внешней среды: это два типа карбоксильных групп, фенольные ОН-группы и аминогруппы. По качественному составу функциональных групп полимерный матрикс клеточных стенок таллома разных зон не отличается, о чем свидетельствуют значения констант диссоциации (рКД табл. 2). Как видно (табл. 3), во всех вариантах количество катионообменных групп значительно больше, чем анионообменных, т.е. можно заключить, что клеточные стенки лишайника являются природными ионообменниками и обладают, в основном, катионообменными свойствами.

Таблица 2. Параметры кислотно-основного равновесия клеточных стенок, изолированных из разных участков таллома Р. aphthosa.

Зоны таллома лишайника j pKaj 1 COtT. k ASJ

апикальная 1 2,91 -0,54 0,978 11 100

2 4,43 0,75 0,966 6 115

3 7,17 1,30 0,950 11 270

4 10,06 0,89 0,944 6 110

медиальная 1 2,68 -0,63 0,938 11 130

2 4,28 0,60 0,966 6 120

3 7,19 1,13 0,948 12 310

4 9,84 1,04 0,798 9 100

базальная 1 2,78 -0,57 0,943 10 80

2 4,69 1,07 0,951 7 180

3 7,38 1,00 0,940 9 220

4 9,73 1,60 0,876 12 165

j - тип группы; рК,' - константа ионизации группы j - того типа; п! - константа для группы j - того типа; г'ип-. - коэффициент корреляции для групп j - того типа; ASf - количество групп j - того типа; к - число точек на прямой. 1 - аминогруппы, 2 - карбоксильные группы уроновых кислот, 3 -карбоксильные группы феиольных кислот; 4 - фенольные ОН-группы. Значения AS1 выражены в мкмоль на 1 г сухой массы клеточных стенок.

Таблица 3. Количественный состав ионогенных групп клеточных стенок, выделенных из разных участков таллома лишайника Р. aphthosa.

Зоны таллома ¿S2 4S3 AS4

апикальная 100±9 115±10 270±22 110+9 495+33

медиальная 130±12 120±13 310±25 100+9 530±40

базальная 80+10 180±16 220±19 165±13 565+45

пая пап

и - общая катионообмеиная и анионообменная способности клеточных стенок

соответственно. ] - тип группы; Д?"' - количество ионогенных групп) - типа. 1 - аминогруппы, 2 -карбоксильные группы уроновых кислот, 3 - карбоксильные группы фенольных кислот; 4 -

фенольные ОН-группы. ASJ ,5"/ выражены в мкмоль на 1г сухой массы клеточных стенок. Приведены средние значения и их стандартные отклонения (три биологические повторное™).

Количество ионогенных групп в клеточных стенках значительно зависит от возраста таллома В стенках базальной части количество карбоксильных групп уроновых кислот почти вдвое больше, чем в апикальной зоне. Наибольшее количество анионообменных групп находится в медиальной части таллома. Отличие состоит также в том, что клеточные стенки апикальной и медиальной частей таллома содержат в 1,4 раза больше

карбоксильных групп фенольпых кислот, чем стенки базальной зоны (табл. 3).

В разновозрастных частях слоевищ наблюдается разное соотношение карбоксильных и фенольных ОН-групп, которые принадлежат, по-видимому, лишайниковым веществам. Эти результаты свидетельствуют об изменении с возрастом количественного и качественного состава лишайниковых веществ в слоевищах или их соотношения.

4.3 Набухание клеточных стенок.

Одним из важных физико-химическим показателем, который количественно характеризует свойства полимеров клеточных стенок, как ионообменника, является набухание. Причиной набухания ионообменных материалов в водном растворе является наличие гидрофильных групп, причиной нерастворимости - существование поперечных связей. Степень набухания ионообменного материала зависит от свойств ионита и состава внешнего раствора. Известно, что способность к набуханию возрастает с уменьшением степени поперечной связанности, с увеличением общего количества ионогенных групп, с увеличением степени их диссоциации, с уменьшением концентрации раствора и зависит от радиуса гидратированного иона, которым заполняется сорбент. Результаты настоящего исследования показывают, что клетки Р. aphthosa имеют достаточно развитую клеточную стенку, так как в зависимости от возраста доля массы клеточных стенок в общей сухой массе слоевища составляет от 45 до 55%. Величина коэффициента набухания варьирует от 3,3 до 3,8 г Н20/г сухой массы клеточных стенок (рис. 5). Этот параметр в пределах стандартного отклонения не зависит от возраста, что, вероятно, обусловлено приблизительно равным общим содержанием ионогенных групп в клеточных стенках разных по возрасту частей таллома (S,"", табл.3). Следует отметить, что содержание воды в

5 - KCW(Q)

■ клеточные стенки □ таллом

апикальная медиальная базальная

Рисунок 5. Коэффициент набухания К01* клеточных стенок и оводненность таллома (Q) Р. aphthosa и Q - г Н20 на 1 г сухой массы клеточной стенки и таллома соответственно). Приведены средние значения, бары - стандартные отклонения (5-7 биологических повторностен).

клеточных стенках значительно больше, чем в талломе, что указывает на важную роль клеточных стенок в под держании водного гомеостаза в клетках лишайника (рис. 5).

4.4 Анализ хитин-глюканового комплекса.

Известно, что важным структурным компонентом клеточной стенки микобионтов лишайников является хитин, который у этих организмов входит в состав хитин-глюканового комплекса (ХГК). Данных о том, сколько хитина содержится в клеточной стенке микобионта лишайника, как изменяется его содержание в зависимости от возраста таллома, до начала настоящей работы получено не было. В соответствии с известной методикой (пат. 2121505РФ С08В37/02; C12N 1/14) из клеточных стенок, изолированных из таллома Р. aphthosa, выделен и проанализирован ХГК. Согласно полученным нами данным, наибольшей массовой долей хитина характеризуется ХГК апикальной зоны, в которой этот показатель достигает 70% (рис. 6). В базальной зоне содержание хитина в ХГК уменьшается почти в 2 раза, при этом степень деацетилирования ХГК не зависит от возраста и составляет - 20%. Таким образом, с возрастом в хитин-глюкановом комплексе клеточной стенки Р aphthosa увеличивается массовая доля глюканов.

■ хитин □ глюкан

апикальная медиальная базальная

Рисунок б. Содержание хитнна (%) и глюкана (%) в составе хитин-глюканового комплекса в зависимости от возраста таллома лишайника Р. aphthosa. Приведены средние значения, бары — стандартные отклонения (3 биологические повторности).

4.5 Нековалентно закрепленные и закрепленные дисульфидными связями белки клеточных стенок.

В клеточных стенках лишайников присутствуют как структурные, так и слабосвязанные белки, причем к последним, как правило, относят белки, обладающие ферментативной активностью и участвующие в процессе узнавания микобионта, фотобионта и цианобионта

и формирования целостной симбиотической ассоциации.

Обнаружение поверхностных белков проводили в экстрактах, которые получали, используя или буфер Леммли, или диметилсульфоксид (ДМСО). Буфер Леммли позволяет экстрагировать нековалентно закрепленные белки и белки, закрепленные при помощи дисульфидных связей. ДМСО позволяет экстрагировать только нековалентно закрепленные белки.

Для идентификации нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков использовали производное биотина (сульфосукцинимидил-6-(биотинамидо)-гексонат). Это соединение не проникает через цитоплазматическую мембрану и взаимодействует только с белками клеточной стенки, что ранее было показано для дрожжей (Casanova et al, 1992; Mrsa et al, 1997). Следует отметить, что для исследования белков клеточных стенок лишайников этот метод нами применен впервые.

Контролем отсутствия периплазматического и цитоплазматического содержимого на вестерн-блот анализе белков клеточных стенок микобионта и фотобионта был водный экстракт, полученный из измельченного таллома лишайника, предварительно обработанного модифицированным биотином. После визуализации в полученном контроле была идентифицирована одна белковая полоса с молекулярной массой 200 Ша (рис. 7).

Метод биотинилирования клеточных стенок микобионта и фотобионта позволил обнаружить в апикальной зоне 6, в медиальной зоне бив базальной зоне 4 белковых полос с молекулярными массами от 18 до более чем 300 Ша (рис. 8). Белковая полоса, которая идентифицируется в контроле, выявляется и при вестерн-блот анализе. Ответить на вопрос, принадлежит этот белок к белкам клеточных стенок или относится к белкам периплазматического или цитоплазматического содержимого, не представляется возможным. Вероятно, это экстрагированный водой из измельченного таллома цитоплазматический биотинилированный белок. Эти результаты позволяют заключить, что также как в клетках дрожжей модифицированный биотин не проникает через цитоплазматическую мембрану, т.к. в противном случае на вестерн-блот анализе детектировалось бы большее число белковых полос.

Метод биотинилирования позволил выявить белковые полосы, характерные только для апикальной и медиальной зон. Причиной различий в интенсивностях окраски некоторых общих полос в разных зонах, по-видимому, является различная доступность биотина к белковым молекулам, различное содержание лизиновых остатков в молекулах белков или различия в концентрации этих белков в клеточных стенках. В полиакриламидном геле белки, после их переноса на нитроцеллюлозную мембрану, обнаружены не были (рис. 4.5.3.6 дисс.). Мы не исключаем вероятность того, что в идентифицированные нами фракции входят несколько различных белков с близкими молекулярными массами. Вероятно также, что некоторые из детектируемых нами белковых полос являются субъединицами одного белка.

Применение метода электрофореза для идентификации поверхностных белков в экстрактах, полученных из целых частей таллома лишайника с применением буфера Леммли, показало, что в апикальной зоне выявляются 12, в медиальной зоне - 11, а в базальной зоне - 10 белковых полос (рис. 8).

12 3 12 3

А Б

Рисунок 7. Анализ белков питоплазматического содержимого (А - электрофорез в полиакриламидном геле, Б - вестерн-блот анализ; 1 - апикальная зона, 2 - медиальная зона, 3 -базальнан зона).

12 3 12 3

кйа

Рисунок 8. Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (А) и вестерн-блот анализ (Б) экстракта белков, полученного в буфере Леммли (1 - апикальная зона, 2 - медиальная зона, 3 - базальная зона).

Сравнительный анализ двух методов идентификации белков клеточных стенок показал, что на электрофореграмме и при вестерн-блот анализе экстракта белков из целых частей таллома детектируются как общие, так и специфичные белковые полосы. Большее количество белковых полос, выявленных на электрофореграмме, вероятнее всего связано с

тем, что на ней детектируются не только белки клеточных стенок, но и, возможно, белки периплазматического пространства и цитоплазматические белки. На основании этих результатов можно предположить, что некоторые из обнаруженных нами белков на электрофореграмме могут принадлежать белкам клеточных стенок, а лизиновые остатки (сайты связывания биотина) или недоступны для модифицированного биотина, или отсутствуют. Поэтому количество белков в клеточных стенках лишайника Р. aphthosa может быть больше, чем обнаружено методом биотинилирования.

4.6 Амилоидоподобные белки клеточной поверхности.

Для обнаружения поверхностных белков нами был применен также другой способ их экстракции с использованием диметилсульфоксида. Этот способ экстракции позволяет выделить белки, которые обладают свойствами амилоидов. Под термином амилоиды обычно подразумеваются белковые агрегаты, характеризующиеся филаментной морфологией, высоким содержанием ß-слоев (с ß-тяжами, расположенными перпендикулярно оси фибриллы - кросс-Р-структура), относительной устойчивостью к действию протеаз. Амилоидоподобные белки обнаружены у грибов и лишайников и, согласно данным литературы, принимают участие в защите клеток этих организмов от неблагоприятных факторов внешней среды (например, при переходе из одной среды в 1другую).

k Da

—160

- 67

- 45

~24

- 18

kDa

160

Рисунок 9. Электрофорез в иолиакриламидном геле в денатурирующих условиях (а) и веетерн-блот анализ (б) белков, экстрагированных диметилсульфоксидом из таллома Р. aphthosa.

Электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях показал наличие в ДМСО экстракте двух белковых полос (рис. 9). Следует подчеркнуть, что при вестерн-блот анализе в присутствии модифицированного биотина при экстракции и ДМСО, и буфером Леммли эти белковые полосы мы не обнаружили. При этом на вестерн-блот анализе ДМСО экстракта белков детектируется белковая полоса, которая выявляется также на

вестерн-блот анализе экстракта белков, полученного при помощи буфера Леммли. Наличие амилоидных фибрилл в ДМСО экстракте белков из таллома лишайника Р. aphthosa было показано нами также методом флуоресцентной спектрофотомерии с использованием тиофлавина Т (рис. 10). Определено, что при длине волны 490 нм наблюдается максимум флуоресценции (рис. 10). Эти результаты также свидетельствуют в пользу предположения, что поверхностные белки исследуемого лишайника включают амилоидоподобные белки, которые, вероятно, являются гидрофобинами. Присутствие последних доказано и методом световой микроскопии в поляризованном свете после окрашивания препаратов Конго красным.

Длина воякы (км;

Рисунок 10. Интенсивность флуоресценции (условные единицы) белков, экстрагированных диметилсульфоксидом из таллома Р. aphthosa, с Тиофлавином Т (1 - контроль, 2 - экстракт белков).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свойства экстраклеточного матрикса лишайников имеют большое значение для жизнедеятельности этих организмов. Физико-химические свойства клеточных стенок влияют на процессы поступления воды и растворенных веществ в слоевище, а также на процессы транспорта веществ между симбионтами. В работе нами был сделан акцент на исследование клеточных стенок микобионта, т.к. именно микобионт составляет основную массу слоевища таллома (до 98%).

На основании данных анатомо-морфологического строения и биохимического состава были выделены и охарактеризованы в зависимости от возраста три зоны таллома лишайника Р. aphthosa: апикальная, медиальная и базальная. Показано, что зоны таллома различаются не только взаимным расположением компонентов, но и количеством белка, а также эндогенным содержанием ионов кальция и нитрат-ионов. Показано, что максимальная концентрация ионов кальция находится в апикальной зоне, в которой

происходит контактное взаимодействие компонентов и формирование целостной симбиотической системы. Вероятно, ионы кальция в этом процессе играют существенную роль.

Исследование ионообменных свойств клеточных стенок проводили в соответствии с выявленными особенностями строения таллома, в зависимости от возраста его частей. В работе предложены способы оценки чистоты выделенных препаратов клеточных стенок.

Установлено, что в клеточных стенках Р. aphthosa содержится четыре типа ионогенных групп, способных принимать участие в обменных реакциях с ионами внешней среды: это два типа карбоксильных групп, фенольные ОН-группы и аминогруппы. Показано, что по качественному составу функциональных групп полимерный матрикс клеточных стенок таллома разных зон не отличается, о чем свидетельствовали значения констант диссоциации. Во всех вариантах количество катиоиообменных групп значительно больше, чем анионообмеиных. Эти результаты дают основание заключить, что клеточные стенки лишайника Р. aphthosa являются природными ионообменниками и обладают, в основном, катионообменными свойствами.

Показано, что количество ионогенных групп в клеточных стенках значительно зависит от возраста таллома. В стенках базальной части количество карбоксильных групп уроновых кислот почти вдвое больше, чем в апикальной зоне. Наибольшее количество анионообмеиных групп находится в медиальной части таллома. Отличие состоит также в том, что клеточные стенки апикальной и медиальной частей таллома содержат в 1,4 раза больше карбоксильных групп фенольных кислот, чем стенки базальной зоны. В разновозрастных частях слоевищ наблюдается разное соотношение карбоксильных и фенольных ОН-групп, которые принадлежат, по-видимому, лишайниковым веществам. Эти результаты свидетельствует об изменении с возрастом количественного и качественного состава лишайниковых веществ в слоевищах или их соотношения.

Результаты настоящего исследования показывают, что клетки Р. aphthosa имеют достаточно развитую клеточную стенку, так как в зависимости от возраста доля массы клеточных стенок от общей сухой массы слоевища составляет от 45 до 55%. Величина коэффициента набухания варьирует от 3,3 до 3,8 г Н20/г сухой массы клеточных стенок. Этот параметр в пределах стандартного отклонения не зависит от возраста, что, вероятно, обусловлено приблизительно равным общим содержанием ионогенных групп и приблизительно одинаковой степенью поперечной связанности полимеров в клеточных стенках разных по возрасту частей таллома. Показано, что содержание воды в клеточных стенках значительно больше, чем в талломе, что указывает на важную роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника.

Нами был выделен и охарактеризован хитин-глюкановый комплекс (ХГК) из клеточных стенок лишайника Р. aphthosa. Согласно полученным данным, наибольшей массовой долей хитина характеризуется ХГК апикальной зоны, в которой этот показатель достигает

70%. В базальной зоне содержание хитина в ХГК уменьшается почти в 2 раза, при этом степень деацетилирования ХГК не зависит от возраста и составляет ~20%. Таким образом, с возрастом в ХГК клеточной стенки Р. aphthosa увеличивается массовая доля глюканов. Примененный метод выделения и анализа ХГК может быть использован при определении аналогичных свойств других лихенизированных грибов. Уменьшение доли хитина и увеличение доли глюкана от апикальной к базальной зонам приводит к формированию в базальной зоне более массивной клеточной стенки. Возможно, это связано с меньшей степенью сшивки полимеров в клеточных стенках базальной зоны, по сравнению с апикальной.

Впервые для определения нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков таллома лишайника был применен метод биотинилирования клеточных стенок. Нами показано, что качественный состав белков клеточных стенок таллома изменяется в зависимости от его зон, т.е. от возраста. Метод биотинилирования клеточных стенок микобионта и фотобионта позволил обнаружить в апикальной зоне 6, в медиальной зоне бив базальной зоне 4 белковых полос с молекулярными массами от 18 до более чем 300 kDa. Наличие в клеточных стенках апикальной и медиальной зон двух белков, отсутствующих в базальной зоне, вероятно, связано с тем, что эти белки участвуют в специфическом взаимодействии микобионта с фотобионтом и цианобионтом.

Разработанный подход для определения нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков может быть применен для определения аналогичных белков у других видов лихенизированных грибов. Полученные данные могут указывать на участие белков клеточных стенок в процессах формирования лишайникового таллома.

Примененные методические подходы позволили впервые выявить в составе клеточной поверхности таллома лишайника Р. aphthosa амилоидоподобные белки. Предполагается, что эти белки участвуют в обеспечении механизма толерантности таллома лишайника к высушиванию, образуя белковые агрегаты, характеризующиеся филаментной морфологией с высоким содержанием ß-слоев.

ВЫВОДЫ

1. В талломе лишайника Р. aphthosa выделены три функциональные зоны (апикальная, медиальная и базальная), которые различаются анатомо-морфологической структурой и биохимическим составом. Установлено, что наибольшим содержанием белка, азота и ионов кальция характеризуется апикальная зона, а наименьшим — базальная зона.

2. Ионообменные свойства полимерного матрикса экстраклеточного пространства таллома лишайника Р. aphthosa определяются наличием в составе клеточных стенок четырех типов функциональных групп, которые способны принимать участие в обменных реакциях с ионами окружающей среды при соответствующих условиях. Впервые показано, что у Р. aphthosa катионообменные свойства клеточной стенки определяются присутствием в ней

двух типов карбоксильных и фенольными ОН-групп, а анионообмснные - аминогруппами.

3. Объем полимерного матрикса клеточных стенок таллома лишайника является относительно постоянной величиной и мало зависит от ионных условий в окружающей среде.

4. В полимерной структуре клеточной стенки лишайника Р. aphthosa присутствуют азотсодержащие полимеры, представленные как белками, так и хитинглюкановым комплексом (ХГК). содержание которых зависит от возраста таллома. Наибольшей массовой долей хитина характеризуется ХГК апикальной зоны, а наименьшей - ХГК базальной зоны, при этом степень деацетилирования ХГК не зависит от возраста и составляет ~20%. Показано, что с возрастом в хитин-глюкановом комплексе клеточной стенки Р. aphthosa увеличивается массовая доля глюканов.

5. Клеточные стенки апикальной, медиальной и базальной зон таллома лишайника различаются по набору белков, закрепленных нековалентно и с помощью дисульфидных связей.

6. Впервые показано, что некоторые из нековалентно закрепленных белков клеточной поверхности лишайника/', aphthosa представлены белками со свойствами амилоидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей ученой степени кандидата наук

1. Воробьев Д. В, Мейчик Н. Р. Состав ионообменных групп в клеточных стенках микобионта и фотобионта в составе трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. №1. С.18-19.

2. Воробьев Д. В., Безсонов Е. Е, Калебина Т. С, Лобанова Е. С. Характеристика белков «клеточной стенки» лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd. // Бюллетень московского общества испытателей природы. Отдел биологический. 2009. Т. 14. Вып. 2. Приложение 1. С. 29-31.

3. Воробьев Д. В., Мейчик Н. Р, Лобакова Е. С, Ермаков И. П, Матвеева Н. П. Ионообменные свойства клеточных стенок, изолированных из таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd. // Микробиология. 2009. Т. 78. №5. С.702-708.

Прочие публикации

4. Нургазиева Д. К, Воробьев Д. В., Кожушный А. П. Диализное культивирование как новый метод получения культур фико- и цианобионтов из лишайников Peltigera aphthosa и Stereocaulon alpinum II Труды международной конференции грибы в природных и антропогенных экосистемах. Спб, 2005. Т. 2. С. 54 - 57.

5. Киташов А. В, Нургазиева Д. К, Воробьев Д. В, Лобакова Е. С. Особенности выделения фототрофных микросимбионтов трехкомпонентных лишайников // Материалы международной научной конференции вопросы общей ботаники: традиции и перспективы. Казань, 2006. Ч. 1. С. 208 - 210.

Подписано в печать: 28.09.2009

Заказ № 2606 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 11S230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воробьев, Денис Витальевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Особенности лишайникового симбиоза 9 1.1.1 Вторичные метаболиты лишайников

1.2 Клеточная стенка нелихенизированных и лихенизированных грибов 13 1.2.1 Хитин

1.3.1.1 Методы выделения хитина и хитин-глюканового комплекса

1.2.3 Глюканы

1.2.4 Хитозан

1.3 Особенности строения клеточной стенки фотобионта 28 1.3.1 Белки клеточной стенки водоросли (фотобионта)

1.4 Особенности строения клеточной оболочки цианобионта

1.5 Методы определения и анализа белков клеточной стенки гриба (микобионта)

1.5.1 Способы гликозилирования белков клеточной стенки

1.5.2 Методы анализа белков, выделенных из клеточных стенок грибов

1.5.3 Способы выделения белков из клеточных стенок грибов

1.5.4 Гидрофобные белки клеточной стенки грибов

1.5.5 Функции белков клеточных стенок

1.6 Роль клеточной стенки в минеральном обмене лишайников 47 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Световая и электронная сканирующая микроскопия

2.2 Выделение клеточных стенок таллома лишайника

2.3 Определение качественного и количественного состава ионообменных групп 54 клеточных стенок таллома лишайника

2.4 Определение содержания свободных аминогрупп в клеточных стенках и 56 слоевищах лишайника методом неводного титрования в уксусной кислоте

2.5 Определение содержания воды в интактных слоевищах лишайника и весового 57 коэффициента набухания клеточных стенок лишайника в воде и растворах

2.6 Получение хитин-глюканового комплекса лишайника P. aphthosa

2.7 Количественная характеристика белковых фракций

2.8 Определение эндогенного содержания ионов в талломе лишайника P. aphthosa

2.9 Элементный анализ

2.10 Электрофоретические методы. Подготовка материала

2.11 Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих 62 условиях

2.12 Окрашивание белков в полиакриламидном геле при помощи кумасси

2.13 Вестерн-блот анализ

2.14 Визуализация белков на нитроцеллюлозной мембране

2.15 Флюоресценция амилоидоподобных белков с Тиофлавином Т

2.16 Визуализация амилоидоподобных белков с помощью Конго красного

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Изучение особенностей анатомо-морфологической структуры и 65 биохимического состава таллома лишайника

3.1 Особенности анатомо-морфологической структуры трехкомпонентного 65 лишайника Peltigera aphthosa

3.2 Общее содержание белка в талломе лишайника

3.3 Эндогенное содержание ионов калия, натрия, кальция, нитрат-ионов и хлорид- 85 ионов в талломе лишайника P. aphthosa

Глава 4. Исследование ионообменных свойств и белков клеточных стенок таллома 92 лишайника P. aphthosa в зависимости от возраста

4.1 Определение чистоты выделенных препаратов клеточных стенок

4.2 Качественный и количественный состав ионообменных групп клеточных стенок 95 таллома лишайника P. aphthosa

4.2.1 Характеристика оводненности слоевища и набухания клеточных стенок 107 таллома лишайника P. aphthosa

4.3 Определение количества свободных аминогрупп в клеточных стенках методом 112 неводного титрования

4.4 Анализ хитин-глюканового комплекса, выделенного из трехкомпонентного 117 лишайника P. aphthosa

4.5 Характеристика состава белков клеточных стенок апикальной, медиальной и 131 базальной зон таллома лишайника P. aphthosa

4.5.1 Анализ SEP-фракции белков, полученной из измельченных частей 132 таллома лишайника P. aphthosa

4.5.2 Анализ SEP-фракции белков, полученной из целых частей таллома 135 лишайника P. aphthosa

4.5.3 Вестерн-блот анализ экстракта SEP-фракции белков, предварительно 139 меченных модифицированным биотином

4.6 Выявление амилоидоподобных белков в талломе лишайника P. aphthosa

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd"

В настоящее время не возникает сомнений, что клеточная стенка — одна из важнейших динамичных структур клеток микроорганизмов и высших растений (Горшкова, 2007). В талломах симбиотических организмов - лишайников, сформированных гифами гриба, клетками микроводорослей и/или цианобактерий, клеточные стенки компонентов выполняют разнообразные функции: селективного узнавания и специфического контактного взаимодействия партнеров, формирования уникальной морфофизиологической структуры таллома, определяют устойчивость лишайников к неблагоприятным абиотическим факторам, участвуя в осуществлении комплекса взаимодействий между компонентами симбиотической системы и окружающей средой (Бязров, 2005; Феоктистов и др., 2009; Nieboer, 1978; Loppi et al., 1997; Wosten, Wessels, 1997; Sacristan et al., 2007).

Ввиду того, что лишайники представляют целостную систему из нескольких компонентов, которые трудно разделимы, то изолированная из такой сложной системы «клеточная стенка» является суммой клеточных стенок отдельных ее компонентов. Однако следует учитывать, что в составе препарата «клеточной стенки» таллома лишайника преобладает клеточная стенка микобионта, т.к. грибной компонент составляет основную долю (90-98%) биомассы таллома (Бязров, 2005; Palmqvist, 2000).

Одним из лимитирующих факторов формирования и роста лишайников in vivo является влажность среды обитания. Известно, что границы влажности, в которых организм физиологически активен, определяют ареал его распространения в наземных экосистемах (Palmqvist, 2000). Можно предположить, что, не имея специализированных структур для поглощения и транспорта ионов, ионообменные группы клеточных стенок компонентов лишайников играют ключевую роль в процессах поступления в талломы минеральных веществ и воды из атмосферных осадков. Однако механизмы толерантности лишайников к высушиванию, а также процессы поглощения и транспорта ионов талломами лишайников изучены недостаточно. Можно предположить, что в этом процессе определенную роль играют белки, относящиеся к классу гидрофобинов, и ионообменные группы клеточных стенок.

Хитин-глюкановый комплекс является основным структурным компонентом клеточных стенок грибов, участвующих в формировании лишайникового симбиоза, а его состав (соотношение компонентов) свидетельствует о важнейших структурных изменениях в составе клеточных стенок гриба в зависимости от возраста таллома. Необходимо отметить, что хитин-глюкановый комплекс у грибов участвует в процессах поступления и накопления минеральных веществ из атмосферных осадков (Ugrozov et al., 2008). Данные литературы о структурных изменениях в хитин-глюкановом комплексе в зависимости от возраста таллома лишайника отсутствуют.

Процесс формирования талломов лишайников in vivo связан с селективным узнаванием партнеров и их специфическим взаимодействием. Механизмы взаимодействия микобионта с циано- и фикобионтами различны. У цианолишайников ведущая роль в этом процессе отводится лектинам, белкам или гликопротеинам, способным связывать олигосахаридные остатки с высокой специфичностью, а у фиколишайников - специфическим АВР-белкам (algal binding protein) микобионтов, являющихся компонентами их клеточных стенок (Sacristan et al., 2007). В литературе мало данных о специфических АВР-белках микобионтов в составе талломов лишайников. Известно, что они, взаимодействуя с рецепторами клеточных стенок водорослей, приводят к структурной перестройке как клеточных стенок фикобионта, так и цитоплазмы, вызывая деградацию хлоропластов (Sacristan et al., 2007). Можно предположить, что у трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa в состав клеточных стенок молодых частей таллома (апикальная и медиальная зоны) входят как специфические АВР-белки, участвующие в связывании фикобионта таллома - зеленой водоросли рода Соссотуха, так и лектины, осуществляющие селективное узнавание цианобактерий рода Nostoc, формирующих поверхностные цефалодии. Специфические белки клеточных стенок лишайников до настоящего времени изучены недостаточно.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) изучить морфоструктурные особенности строения таллома лишайника Р. aphthosa;

2) охарактеризовать состав ионообменных групп клеточных стенок таллома лишайника/*, aphthosa',

3) определить роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника P. aphthosa',

4) изучить участие в ионообменном процессе хитин-глюканового комплекса микобионта;

5) выявить специфические нековалентно закрепленные и закрепленные при помощи дисульфидных связей белки, входящие в состав клеточных стенок таллома P. aphthosa',

Научная новизна

В работе предложен новый подход к изучению таллома лишайника P. aphthosa (L.) Willd, основанный на выделении структурно-функциональных зон, которые различаются анатомо-морфологическим строением и биохимическим составом. Впервые установлено, что в составе клеточных стенок лишайника P. aphthosa присутствуют четыре типа функциональных групп, из них три являются катионообменными (два типа карбоксильных групп и фенольные ОН-группы), и одна - анионообменной (аминогруппы). Впервые определены физико-химические параметры, характеризующие количественный и качественный состав ионогенных групп клеточных стенок P. aphthosa, а также интервалы рН, в которых эти группы ионизированы и способны вступать в ионообменные реакции с катионами и анионами внешней среды. Определены параметры, количественно характеризующие способность к набуханию клеточных стенок P. aphthosa. На основании значений коэффициентов набухания клеточных стенок и таллома лишайника установлена важная роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника. Впервые выделен и проанализирован хитин-глюкановый комплекс из клеточных стенок таллома лишайника P. aphthosa. Показано, что его состав изменяется в зависимости от зоны таллома, т.е. от возраста лишайника.

Впервые проведено комплексное исследование нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков, входящих в состав клеточных стенок лишайника P. aphthosa. Показано, что качественный и количественный состав белков клеточных стенок изменяется в зависимости от зоны таллома. Установлено, что у P. aphthosa некоторые из нековалентно закрепленных белков клеточной поверхности представлены белками со свойствами амилоидов.

Практическая значимость

Предложен метод для выделения и анализа хитин-глюканового комплекса Р. aphthosa, который может быть применен для анализа хитин-глюканового комплекса других видов лихенизированных и свободноживущих грибов. Разработан новый подход к исследованию белков клеточных стенок P. aphthosa, который может быть использован в микологических исследованиях.

Полученные в работе результаты о присутствии в составе клеточной поверхности лишайника P. aphthosa нековалентно закрепленных белков со свойствами амилоидов необходимо учитывать при биотехнологическом использовании биомассы лишайников.

Полученные в работе результаты используются в курсе лекций по «Общей симбиологии» для студентов биологического факультета МГУ.

Апробация работы

Результаты исследования были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедр физиологии микроорганизмов и микологии и альгологии биологического факультета МГУ; семинаре кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ; Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. B.JI. Комарова РАН, Санкт-Петербург, 2005; Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы, Казань, 2006; Междисциплинарном микологическом форуме с международным участием, Москва, 2009; конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» с международным участием, Москва, 2009.

Публикации

Всего по материалам диссертации опубликовано 5 работ. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения работы.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 173 стр. машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 203 наименования (из них 162 на иностранных языках). Работа содержит 18 таблиц и иллюстрирована 77 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Воробьев, Денис Витальевич

выводы

1. В талломе лишайника P. aphthosa выделены три функциональные зоны (апикальная, медиальная и базальная), которые различаются анатомо-морфологической структурой и биохимическим составом. Установлено, что наибольшим содержанием белка, азота и ионов кальция характеризуется апикальная зона, а наименьшим - базальная зона.

2. Ионообменные свойства полимерного матрикса экстраклеточного пространства таллома лишайника P. aphthosa определяются наличием в составе клеточных стенок четырех типов функциональных групп, которые способны принимать участие в обменных реакциях с ионами окружающей среды при соответствующих условиях. Впервые показано, что у Р: aphthosa катионообменные свойства клеточной стенки определяются присутствием в ней двух типов карбоксильных и фенольными ОН-групп, а анионообменные - аминогруппами.

4. В полимерной структуре клеточной стенки лишайника P. aphthosa присутствуют азотсодержащие полимеры, представленные как белками, так и хитинглюкановым комплексом (ХГК), содержание которых зависит от возраста таллома. Наибольшей массовой долей хитина характеризуется ХГК апикальной зоны, а наименьшей - ХГК базальной зоны, при этом степень деацетилирования ХГК не зависит от возраста и составляет ~20%. Показано, что с возрастом в хитин-глюкановом комплексе клеточной стенки P. aphthosa увеличивается массовая доля глюканов.

6: Впервые показано, что некоторые из нековалентно закрепленных белков клеточной поверхности лишайника P. aphthosa представлены белками со свойствами амилоидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании данных анатомо-морфологического строения и биохимического состава были выделены и охарактеризованы в зависимости от возраста три зоны таллома лишайника P. aphthosa: апикальная, медиальная и базальная. Показано, что зоны таллома различаются не только взаимным расположением компонентов, но и количеством белка, а также эндогенным содержанием ионов кальция и нитрат-ионов. Показано, что максимальная концентрация ионов кальция находится в апикальной зоне, в которой происходит контактное взаимодействие ' компонентов и формирование целостной симбиотической системы. Вероятно, ионы кальция в этом процессе играют существенную роль.

Установлено, что в клеточных стенках P. aphthosa содержится четыре типа ионогенных групп, способных принимать участие в обменных реакциях с ионами внешней среды: это два типа карбоксильных групп, фенольные ОН-группы и аминогруппы. Показано, что по качественному составу функциональных групп полимерный матрикс клеточных стенок таллома разных зон не отличается, о чем свидетельствовали значения констант диссоциации. Во всех вариантах количество катионообменных групп значительно больше, чем анионообменных. Эти результаты дают основание заключить, что клеточные стенки лишайника P. aphthosa являются природными ионообменниками и обладают, в основном, катионообменными свойствами.

Показано, что количество ионогенных групп в клеточных стенках значительно зависит от возраста таллома. В стенках базальной части количество карбоксильных

154 групп уроновых кислот почти вдвое больше, чем в апикальной зоне. Наибольшее количество анионообменных групп находится в медиальной части таллома. Отличие состоит также в том, что клеточные стенки апикальной и медиальной частей таллома содержат в 1,4 раза больше карбоксильных групп фенольных кислот, чем стенки базальной зоны. В разновозрастных частях слоевищ наблюдается разное соотношение карбоксильных и фенольных ОН-групп, которые принадлежат, по-видимому, лишайниковым веществам. Эти результаты свидетельствует об изменении с возрастом количественного и качественного состава лишайниковых веществ в слоевищах или их соотношения.

Результаты настоящего исследования показывают, что клетки P. aphthosa имеют достаточно развитую клеточную стенку, так как в зависимости от возраста доля массы клеточных стенок от общей сухой массы слоевища составляет от 45 до 55%. Величина коэффициента набухания варьирует от 3,3 до 3,8 г Н20/г сухой массы клеточных стенок. Этот параметр в пределах стандартного отклонения не зависит от возраста, что, вероятно, обусловлено приблизительно равным общим содержанием ионогенных групп и приблизительно одинаковой степенью поперечной связанности полимеров в клеточных стенках разных по возрасту частей таллома. Показано, что содержание воды в клеточных стенках значительно больше, чем в талломе, что указывает на важную роль клеточных стенок в поддержании водного гомеостаза в клетках лишайника.

Нами был выделен и охарактеризован хитин-глюкановый комплекс (ХГК) из клеточных стенок лишайника P. aphthosa. Согласно полученным данным, наибольшей массовой долей хитина характеризуется ХГК апикальной зоны, в которой этот показатель достигает 70%. В базальной зоне содержание хитина в ХГК уменьшается почти в 2 раза, при этом степень деацетилирования ХГК не зависит от возраста и составляет ~20%. Таким образом, с возрастом в ХГК клеточной стенки Р. aphthosa увеличивается массовая доля глюканов. Примененный метод выделения и анализа ХГК может быть использован при определении аналогичных свойств других лихенизированных грибов. Уменьшение доли хитина и увеличение доли глюкана от апикальной к базальной зонам приводит к формированию в базальной зоне более массивной клеточной стенки. Возможно, это связано с меньшей степенью сшивки полимеров в клеточных стенках базальной зоны, по сравнению с апикальной.

Впервые для определения нековалентно закрепленных и закрепленных дисульфидными связями белков таллома лишайника был применен метод биотинилирования клеточных стенок. Нами показано, что качественный состав белков клеточных стенок таллома изменяется в зависимости от его зон, т.е. от возраста. Метод биотинилирования клеточных стенок микобионта- и фотобионта позволил обнаружить в апикальной зоне 6, в медиальной зоне бив базальной зоне 4 белковых полос с молекулярными массами от 18 до более чем 300 kDa. Наличие в клеточных стенках апикальной и медиальной зон двух белков, отсутствующих в базальной зоне, вероятно, связано с тем, что эти белки участвуют в специфическом взаимодействии микобионта с фотобионтом и цианобионтом.

Примененные методические подходы позволили впервые выявить в составе клеточной поверхности таллома лишайника P. aphthosa амилоидоподобные белки. Предполагается, что эти белки участвуют в обеспечении механизма толерантности таллома лишайника к высушиванию, образуя белковые агрегаты, характеризующиеся филаментной морфологией с высоким содержанием Р-слоев.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воробьев, Денис Витальевич, Москва

1. Альберт А., Сержент Е. Константы ионизации кислот и оснований. Д.: Химия, 1964. 140с.

2. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Иконников Н.В. Меланиновый комплекс гриба Inonotus obliguus // Прикл. биохим. и микробиол. 2000. Т. 36. №4. С. 439-440. Беккер З.Э. Физиология грибов и их практическое использование. М.: Наука. 1963. 163 с.

3. Белозерская Т.А. Гидрофобины грибов: структура и функции // Микология и фитопатология. 2001. Т. 35. В. 11. С. 3-11.

4. Блюм О. Б., Брунь F.A. Сезонная и субстратзависимая изменчивость электрофоретических спектров, белков лишайников» рода Parmelia II Экология. 1986. №4. С. 18-23.

5. Брунь Г.А'. Макромолекулярная систематика лишайников. Достижения и перспективы развития // Актуальные проблемы экспериментальной лихенологии в СССР / Под. ред. Н.С. Голубковой. Д.: Труды Ботанического Института им. В.Л. Комарова, 1991. Вып. 1. С. 12-21.

6. Быкова В.М., Немцев. С.В. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. С. 7-23.

7. Бязров Л.Г. Лишайники индикаторы радиоактивного загрязнения. 2005. М.: КМК. 476 с.

8. Вайннггейн Е. А. Лишайниковые вещества вторичного происхождения. Л.: Деп. ВИНИТИ №210-83, 1982. 4.1-3. 717 с.

9. Гальбрайх Л.С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение // Соросовский образовательный журнал. 2001. №1. С. 51-56.

10. ТелБферих Ф: Иониты.Mi: Иностранная литература^9621 490 е. . Голубкова ILC. К вопросу о происхождении и путях эволюции' лишайникового симбиоза»-// Новости-систематики низших растений; СПб.: Наука. 1993. Т. 29: С. 84104.

11. Горшкова Т.А. Растительная клеточная'стенка?как динамичная,система. М.: Наука.2007. 429 с.

12. Дебриер Ж., Бабак В.Г. Межфазовые свойства амфифильных систем на основе природных полимеров производных хитина // Российский химический журнал.2008. №1. С. 75-83.

13. Любимова Е.Г. Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированногоаскомицета Cladonia rangiferina (L.) F. H. Wigg. // Автореферат на соисканиеученой степени кандидата биологических наук. М.: МГУ. 2005.

14. Мейчик Н. Р., Ермаков И. П., Савватеева М. В. Ионогенные группы клеточнойстенки корней пшеницы // Физиология растений. 1999. Т. 46 № 5. С. 742-747.

15. Мейчик Н.Р., Матвеева Н.П., Николаева Ю.И., Чайкова А.В., Ермаков И.П.

16. Особенности состава ионогенных групп полимерного матрикса оболочкипыльцевого зерна лилии // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 1103-1111.

17. Окснер А.Н. Определитель лишайников СССР. Л.: Наука. 1974. т.2.

18. Рощина В.В. Хемосигнализация у пыльцы // Усп. совр. биологии. 1999. Т. 119. №6.1. С. 557-566.

19. Симахара К1, Окоути К., Икеда М. Новый метод выделения хитина ракообразных с использованием протеолитической бактерии Pseudomonas maltophilia / Пер. с англ. КЕ-57231. Киев: Всесоюзный центр переводов. 1984. 15 с.

20. Урьяш В.Ф., Кокурина Н.Ю. Влияние кислотногно гидролиза на теплоемкость и физические переходы хитина и хитозана // Вестник нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2007. №3. С. 98-104.

21. Феоктистов А.С., Киташов А.В., Лобакова Е.С. Характеристика лектинов трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер 16. Биология. 2009. №1. С. 26-29.

22. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука. 1983. 230 с. Феофилова Е. П., В. М. Терешина, А. С. Меморская. Хитин мицелиальных грибов, методы выделения, идентификации и физико-химические свойства// Микробиология. 1995. Т. 64. № 1. С. 27-31. '

23. Шатаева Л. А., Кузнецова Н. Н., Елышн Г. Е. Карбоксильные иониты в биологии. Л.: Наука. 1979. 286 с.

24. Abramova N., Sertil О., Mehta S., Lowry С. V. Reciprocal regulation of anaerobic and aerobic cell wall mannoprotein gene expression in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 2001. 183: 2881-2827.

25. Adams D. J. Fungal cell wall chitinases and glucanases. Microbiology. 2004. 150: 20292035.

26. Aguado C., Ruiz-Herrera J., Iranzo M., Sentandreu R., Mormeneo S. Reaggregation and binding of cell wall proteins from Candida albicans to structural polysaccharides. Res Microbiol. 1998. 149 (5): 327-338.

27. Aguilar-Uscanga В., Francois J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. // Lett. Appl. Microbiol. 2003. 37: 268-274.

28. Andersen A., Hovmand M.F., Jonsen I. Atmosferic heavy metal deposition in the Copenhagen area//Environ. Pollut. 1978. 17: 133-151.

29. Bough W.A., Solter W.L., Wu A.C.M., Perkins B.E. Influence of manufacturing variables on the characterictics effectiveness of chitosan products // Biotechnol., Bioengin. 1978.20(12): 1931-1943.

30. Brodo I. M. Lichenes Canadenses Exsiccati: Fascicle III. Bryologist. 1984. 87: 97-111. Brodo I.M., Sharnoff S.D., Sharnoff S. Lichens of North America. Yale University Press. London. 2001. P. 503-522.

31. Biidel B. Taxonomy of lichenized procaryotic blue-green algae // Reisser W., ed. Algae and symbiosis. Bristol, UK: Biopress. 1992. P. 301-324.

32. Cabib E., Roberts R., Bover B. Synthesis of the yeast cell wall and its regulation // Annu. Rev. Biochem. 1982. 51: 763-793

33. Cabib E. The synthesis and degradation of chitin // Adv. Enzymol. 1987. 59: 59-101.

34. Chaffin W.L., Lopez-Ribot J. L., Casanova M., Gozalbo D., Martinez J. P. Cell wall and secreted proteins of Candida albicans: identification, function, and expression // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. 62(1): 130-180.

35. Chang K. L. В., Tsai G., Lee J., Fu W.-R. Heterogeneous N-deacetylation of chitin in alkaline solution// Carbohydrate Research. 1997. 303: 327-332.

36. Chen R.H., Jiahn S.C. Advances in chitin science, EUCHIS-99. Potsdam. 1999. P. 361366.

37. Conzelmann A., Riezman H., Desponds C., Bron C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid //EMBO J. 1988. 7(7): 2233-2240.

38. Dahlman L., Nasholm Т., Palmqvist K. Growth, nitrogen uptake, and resource allocation in the two tripartite lichens Nephroma arcticum and Peltigera aphthosa during nitrogen stress//New Phytologist. 2002. 153: 307-315.

39. De Vries O.M.H., Fekkes M.P., Wosten H.A.B., Wessels J.G.H. Insoluble hydrophobin complexes in the wall of Schizophyllum commune and other filamentous fungi // Arch. Microbiol. 1993. 159: 330-335.

40. Elix J.A. Biochemistry and< secondary metabolites // Nash TH III (ed) Lichen biology. Cambridge-University Press. Cambridge. 1996. P. 154-180.

41. Fahselt D.', Hageman C. Isozyme banding pattern, in two stands of Cetraria arenaria Karnef//Bryologist. 1983. 86(2): 128-134:

42. Fahselt D. UV absorbance by thallus extracts of Umbilicate lichens // Lichenologist. 1993. 25 (4): 415-422

43. Farkas V. Biosynthesis of cell walls of fungi // Microbiol: Rev. 1979. 43: 117-144.

44. Foster A.B., Hackman R.H. Application of ethylenediaminetetra acetic acid in the isolation of crustacean chitin //Nature. 1957. 180: 40-44.

45. Friedman M. В., Cormack B. P. Multiple seguence signals determite the distribution of GPI-proteins between the plasma membrane and cell wall in Saccharomyces cerevisiae II Microbiology. 2004. 150: 3105-3114.

46. Fukamizo Т., Ohkawa Т., Sonoda K., Toyoda H., Nishiguchi Т., Ouchi S., Goto S.

47. Chitinous components of the cell wall of Fusarium oxysporum// Bioscience,

48. Biotechnology and Biochemistry. 1992. 56(10): 1632-1636.

49. Galloway D. J. Flora of New Zealand Lichens. Hasselberg, Wellington. 1985.

50. Gardas A., DePriest P.Т., Grube M., Tehler A. Multiple origin of lichens symbiosis infungi suggested by SSU rDNA phylogeny // Science. 1995. 268: 1492-1495.

51. Garty J., Galun M., Kessel M. Localization of heavy metals and other elementsaccumulated in the lichen thallus //New Phytologist. 1979. 82(2): 159-168.

52. Gooday G.W., Green D., Fawecett W., Shaw S. Sporopollenin formation in the ascosporewall of Neurospora crassa II Arch. Microbiol. 1974. 101: 145-151.

53. Gooday G.W. Cell envelope diversity and dynamics in yeasts and filamentius fungi // J.

54. Appl. Bacteriol. Symp. Suppl. 1993. 74: 12S-20S.

55. Gooday G.W., Trinci A.PJ. The Eucaryotic Microbial Cell. Society General Microbiology Symposium // Eds. Gooday G.W., Lloid D., Trinci A.P.J. Cambridge University Press. 1980. P. 207-257.

56. Gooday G.W. Cell walls. // Gow N.A.R., Gadd G.M., eds. The growing fungus. London, UK: Chapman and Hall. 1995. P. 43-62.

57. Gow N.A.R. Growth and guidance of the fungal hypha // Microbiology. 1995. 140: 31933205.

58. Gow N.A.R. Tip growth and polarity // Gow N.A.R., Gadd G.M., eds. The growing fungus. London, UK: Chapman and Hall. 1995. P. 277-299.

59. Grignon С., Sentenac H. рН and ionic conditions in the apoplast //Annual Revew of Plant Physiology. 1991. 42: 103-128.

60. Guevara R., Armesto J.J., Caru M. Genetic diversity of Nostoc microsymbionts from Gunnera tinctoria revealed by PCR-STRR fingerprinting // Microb. Ecol. 2002. 44(2):127-136.

61. Guilford W.J., Schneider D.M., Labovitz J., Opella S.J. High-Resolution Solid-State C-13 NMR-Spectroscopy of Sporopollenins from Different Plant Taxa // Physiology. 1988. 86(1): 134-136.

62. Hageman C., Fahselt D. Intraspecific variability of isozymes of the lichen Umbilicaria mammalata II Can. J. Bot. 1984. 62(4): 617-628.

63. Hageman C., Fahselt D. Relationships within the lichen family Umbilicariaceae based on enzyme electromorph data // Lichenologist. 1992. 24(1): 91-100.

64. Hale M.E. Cortical structure in Physcia and Phaeophyscia II Lichenologist. 1983. 15(2): 157-160.

65. Hauck M., Paul A., Spribille T. Uptake and toxicity of manganese in epiphytic cyanolichens // Environ. Exp. Bot. 2006. 56: 216-224.

66. Hauck M., Huneck S. Lichen Substances Affect Metal Adsorption in Hypogymnia physodes // J. Chem. Ecol. 2007. 33: 219-223.

67. Hernando F. L., Estevez J. J., Cebrian M., Poulain D., Ponton J. Identification of Candida albicans cell wall antigens lost during subculture in synthetic media // J. Med. Vet. My col. 1993.31(3): 227-237.

68. Herzig R. Passive biomonitoring with lichens as a part of an integrated biological measuring system for monotoring air pollution in Switzerland // International J. Environmental Analytical Chemistry. 1989. 35: 43-57.

69. Hoiczyk E., Hansel A. Cyanobacterial Cell Walls: News from an Unusual Prokaryotic Envelope//J. Bacteriol. 2000. 182: 1191-1199.

70. Holbrook I.B., Leaver A.G. A procedure to increase the sensitivity of staining by Coomassie brilliant blue G250-perchloric acid solution // Annal. Biochem. 1976. 75(2): 634-6.

71. Honegger R. Qestions about pattern formation in the algal layer of lichens with stratified (heteromerous) thalli//Bibl. Lichenol. 1987. 25: 59-71.

72. Honegger R. Functional aspects of the lichens symbiosis // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1991. 42: 553-578.

73. Honegger R. Tansley Review No. 60. Developmental biology of lichens // New Phytologist. 1993. 125: 659-677.

74. Jentoft N. Why are proteins O-glycosylated? // Trends Biochem Sci. 1990. 15(8): 291294.

75. Kauppi M. Fluorescence microscopy and microfluorometry for the examination ofpollution damage in lichens // Ann. Bot. Fenn. 1980. 17(2): 163-173.

76. Klis F. M. Review: cell wall assembly in yeast // Yeast. 1994. 10: 851-869.

77. Klis F. M., Boorsma A., De Grot P. W. J. Cell wall construction in Saccharomycescerevisiae II Yeast. 2006. 23: 185-202.

78. Klis F.M., Ram A.F.J., De Groot P.W.J. A Molecular and Genomic View of The Fungal Cell Wall / Biology of the Fungal Cell, 2nd Edition. The Mycota VIII. R.H. Howard and N.A.R. Gow (Eds.)// Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2007.

79. Knops J.M.H., Nash T.N., Boucher V.L., Schlesinger W.H. Mineral cycling and epiphytic lichens implications at the ecosystem level // Lichenologist. 1991. 23 (3): 309-321.

80. Kotecek P., Raclavsky V. Comparison of chitin content in the apical and distal parts fungal hyphae in Basidiobolus ranarum, Neurospora crassa and Coprinus sterguilinus II Folia Microbiol. 1999. 44(4): 397-400.

81. Ma A.M., Shan L.J., Wang H.J., Du Z.P., Xie B.J. Partial characterization of a hydrophobin protein Po.HYDl purified from the oyster mushroom Pleurotus ostreatus II World J. Microbiol Biotechnol. 2008. 24: 501-507.

82. Madhavan P., Ramachandran Nair K.G. Chitosan from prawn waste // Fishery Technol. 1974. 11(1): 50-53.

83. Meychik N. P., Yermakov I. P. A new approach to the investigation on the tonogenic groups of root cell walls // Plant and Soil. 1999. 217: 257-264.

84. Mima S., Miya M., Iwamoto R. Chitin and chitozan // Ed. S. Hirano, S. Tokura. The Japaness Society of Chitin and Chitosan. 1982. P. 21-25.

85. Motoyama Т., Kojima N., Horiuchi H., Ohta A., Takagi M. Isolation of a chitin synthase gene (chs C) of Aspergillus nidulans II Biosci. Biotech. Biochem. 1994. 58(12): 22542257.

86. Mrsa V., Seidl Т., Gentzsch M., Tanner W. Specific labelling of cell wall proteins by biotinylation. Identification of four covalently linked O-mannosylated proteins of Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1997. 13: 1145-1154.

87. Nanninga N. Morphogenesis of Escherichia coli II Microbiol. Mol. Rev. 1998. 62: 181203.

88. Nieboer E., Puckett K.J., Grace B. The uptake of nickel by Umbilicaria muhlenbergii: a physicochemical process // Canad. J. Bot. 1976b. 54(8): 724-733.

89. Nieboer E., Richardson D.H.S., Tomassini F.D. Mineral uptake and release by lichens: an overview//Bryologist. 1978. 81(2): 226-246.

90. Northcote D.H. The biology and chemistry of cell walls of higher plant, algae, fungi // N.Y.L.: Acad. Press. 1963.

91. NucTga L.A., Petrova V.A., Kever E.E., Makarova T.V. Hydrolysis of Chitin-Gkucan Complex of Aspergillus niger Fungus with Phosphoric Acid // Russian Journal of Applied Chemistry. 2002. 75(11): 1864-1867.

92. Nyoshi H., Shimuda R., Watanabe K., Onodera K. Characterization of Some Fungal Chitosans //Biosci. Biotech. Biochem. 1992. 56(12): 1901-1905.

93. Oliveira M.B.M., Zangan G.T. Effect of glucose on a-glucan degradation in Polyporus circinatus // J. Bacterid. 1981. 145: 171-174.

94. Peveling E. Elektronenoptische Untersuchungen an Flechten IV. Die Feinstructur einiger

95. Flechten mit Cyanophyceen Phycobionten. // Protoplasma. 1969b. 68 p.

96. Rai A. Cyanolichens: Nitrogen metabolism // Cyanobacteria in symbiosis / Rai A.,

97. Bergman В., Rasmussen U. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, 2002. 97-115 p.

98. Richardson D.H.S. Metal uptake in lichens // Symbiosis. 1995. 18(2): 119-127.

99. Roberts G.F.A. Advances in chitin science / 7th ICCC, 3-5 September 1997 // Lyon,1. France. 1997. P. 22-31.

100. Roux C. Etude ecologique et phytosociologique des peuplements licheniques saxicolec-calcicoles du sus-est de la France // Bibliotheca Lichenologica. Vaduz. Bd. 15. 1981. 558 S.

101. Sentandreu R., Northcote D. H. The structure of a glycopeptide isolated from the yeast cell wall // Biochem J: 1968. 109(3): 419-432.

102. Shimoi H., Kitagaki H., Ohmori H., Iimura Y., Ito K. Sedlp is a major cell wall protein of Saccharomyces cerevisiae in the stationary phase and is involved in lytic enzyme resistance//J. Bacteriol. 1998. 180(13): 3381-3387.

103. Schultz J., Mosbach K. Studies on lichen enzymes. Purification and properties of an orcellinate depside hydrolase obtained from Lasallia pustulata. Eur // J. Biochem. 1971. 22:153-157.

104. Sietsma Т.Н., Wessels J.G.H. Solubility of (l-3)-P-D/(l-6)-p-D-glucan in fungal walls: Importance of presumed'linkage between glucan and chitin // J. Gen. Microbiol: 1981. 125:209-212.

105. Sietsma J.H., Wessels J.G.H. Apical Wall Biogenesis. The Mycota I. Growth, Differentation and'Sexuality. Kiies, Fisher (Eds.)»// Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2006.

106. Smith D.C. The symbiotic condition (review) // Symbiosis. 1992. 14: 3-15.

107. Smith D.C., Douglas A.E. The biology of symbiosis // London, UK: Edward Arnold.1987.

108. Stark S., Kytoviita M.-M., Neumann A.B. The phenolic compounds in Cladonia lichens are not antimicrobial in soils // Oecologia. 2007. 152: 299-306.

109. Stevens W.F., Win N.N., Ng Ch.H. Advances in chitin science // 7th ICCC. Lyon, 1997. pp. 40-47.

110. Strahl-Bolsinger S., Gentzsch M., Tanner W. Protein O-mannosylation // Biochim Biophys Acta. 1999. 1426(2): 297-307.

111. Swanson A., Fahselt D., Smith D. Phenolic levels in Umbilicaria americana in relation to enzyme polymorphism, altitude and sampling date // Lichenologist. 1996. 28(4): 331339.

112. Thompson E.W., Preston R.D. Proteins in the cell wall of some green algae // Nature. 1967.213:684-85.

113. Ugrozov V.V., Artamonova S.D., Sharnina F.F., Ivshin V.P., Grunin L.Y., Kataeva L.I. Water Vapor Sorption by Chitin-Containing Materials// Colloid Journal. 2008. 70(6): 780-783.

114. Vediyappan G., Bikandi J., Braley R., Chaffin W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins // Electrophoresis. 2000.21(5): 956-961.

115. Vg W.L., NgT.F., Rwan H.S. // Ferns Microbiol. Lett. 2000. 185(2): 139-145.

116. Vicente C., Legaz M.E. Lichen enzymology // Galun M., ed. CRC handbook oflichenology, vol. 1. Boca Raton, FL, USA: CRC Press. 1988. P. 239-284.

117. Vitikainen O. Three new species of Peltigera (lichenized Ascomycetes) // Annls. Botfennici. 1985. 22: 291-298.

118. Wessels J.G.H., Sietsma J.H. Encyclopedia of Plant Physiology New Series 13 ed. // Heidelberg: Springer-Verlag. 1981. PP. 352-394.

119. Wessels J.G.H. Gene expression during fruiting in Schizophyllum- commune II Mycolofical Research. 1992. 98: 609-620.

120. Wirth V. Die Silikatflechten-Gemeinschaften in ausseralpinen Zentraleuropa // Dissertationes Botanicae. Cramer, Lehre. Bd. 17. 1972. S. 1-306.

121. Wojchiechowicz D., Lu C.-F., Kurjan J., Lipke P.N. Cell surface anchorage and ligand-binding domains of the Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell.Biol. 1993. 13: 22554

122. Wosten H.A.B., Wessels J.G.H. Hydrophobins, from molecular structure to multiplefunctions in fungal development // Mycoscience. 1997. 38: 363-374.

123. Wosten H.A.B., Richter M., Willey J.M. Structural proteins involved in emergence ofmicrobial aerial hyphae // Fungal Genet. Biol. 1999. 27(2-3): 153-160.

124. Wosten H.A.B. Hydrophobins: Multipurpose Proteins // Annu. Rev. Microbiol. 2001. 55:

Информация о работе

Воробьев, Денис Витальевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.24

Диссертация

Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воробьев, Денис Витальевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd"

Заключение Диссертация по теме "Микология", Воробьев, Денис Витальевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воробьев, Денис Витальевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ионообменные группы и белки клеточных стенок таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd
ВАК РФ 03.00.24, Микология