Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение процесса аморфной агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение процесса аморфной агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Факультет биоинженерии и биоинформатики Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского

На правах рукописи

ПАНЮКОВ ЮЛИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА АМОРФНОЙ АГРЕГАЦИИ БЕЖА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ: ДЕЙСТВИЕ ДЕТЕРГЕНТОВ

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе физических методов измерений НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Е. Н. Добров,

кандидат физико-математических наук,

В. А. Драчев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Н. Б. Гусев

доктор химических наук, профессор А. В. Ефимов

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится 30 октября 2006 г. в 1530 на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 29 сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук — М.В.Медведева

juefy

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Долгое время процессы аморфной агрегации белков изучались в основном в контексте проблем пищевой промышленности. Однако с развитием биотехнологии и увеличением доли лекарственных препаратов на белковой основе в фармацевтике, процессы аморфной агрегации стали создавать серьёзные технические и экономические проблемы и в этих отраслях хозяйства [18]. Это привело к увеличению числа работ, посвященных исследованию процессов аморфной агрегации белков, а выражаясь точнее, работ посвященных поиску путей предотвращения аморфной агрегации. Работами ряда лабораторий было показано, что детергенты1 могут не только ингибировать агрегацию белков, но и разрушать аморфные агрегаты и вызывать ренатурацию белков [15,20-22].

Несколько лет назад, когда выяснилось, что причиной ряда важных заболеваний человека (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) являются именно аморфные агрегаты - предшественники зрелых амилоидов [7, 9], изучение процессов агрегации белков и влияния на эти процессы детергентов стало особенно актуальным.

Белок оболочки (БО)2 вируса табачной мозаики (ВТМ) характеризуется ярко выраженной склонностью к образованию упорядоченных агрегатов (т.н. «полимеров») (рис. 1) [8]. Формирование «полимеров» БО ВТМ происходит за счёт сильных специфических межсубъединичных взаимодействий разных типов [16]. Кроме того, этот белок является удобной моделью и для изучения неупорядоченной (аморфной) агрегации. Процесс термоиндуцированной (52 °С) аморфной агрегации БО ВТМ хорошо воспроизводим и может легко регулироваться путём изменения условий среды [3,17].

Согласно данным рентгено-структурного анализа [16] субъединица БО ВТМ состоит из классического пучка из четырех ос-спиралей, расположенного в вирусной частице вблизи оси вириона и менее упорядоченной части, расположенной ближе к

1 Нам представляется удобным использование старого термина «детергент», поскольку термин «сурфактант» в русском языке используется мало, а сокращением ПАВ во многих случаях пользоваться не удобно.

гСписок сокращений: БО - белок оболочки, ВТМ - вирус табачной мозаики, ДЛС -динамическое лазерное светорассеяние, ДСН - додецилсульфат натрия, ФБ - фосфатный буфер, рН 8,0, ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид, Ат - кажущееся поглощение при длине волны 320 нм, обусловленное светорассеянием (оптачеека^^^у^^^^'-гГ!-

начапьная скорость прироста Am в ходе агрегации.

БИБЛНОТЬКЛ (..•Пет:р(>у(1|

поверхности вириона, на расстояниях более 65 А от его оси (рис. 2). «Внешняя» часть молекулы содержит значительное число гидрофобных остатков, образующих так называемый «гидрофобный гребень» вблизи поверхности вириона. В составе гидрофобного гребня располагаются и все имеющиеся в молекуле БО ВТМ остатки тирозина (2,70,72,139) и триптофана (17, 52,152) [16].

Термоиндуцированная аморфная агрегация БО ВТМ вызывается нарушением баланса между электростатическим отталкиванием молекул белка и их взаимным притяжением, определяемым мужсубъединичными взаимодействиями. Агрегация инициируется за счёт аберрантных взаимодействий частично-разупорядоченных участков гидрофобного гребня молекул белка [3,17].

Ранее нами было показано, что при внесении до начала агрегации анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) в низких концентрациях (15 молекул детергента на одну молекулу белка) полностью ингибирует термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ [4]. Поэтому мгл решили исследовать действие детергентов двух других групп на БО ВТМ. В качестве таковых нами был выбран катионный детергент цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) и неионный детергент Тритон Х-100.

О

СН5-(СНг),о-СН2 — О-Я—о

о

N3 Вг~

СхвНза

додецилсульфат натрия цетштрилгетиламмоиийбромид СНз-С(СНз)г-СНг-С(СНз)г-^^-О-[СН2-СН2-О]10.Н

Тритон Х-100

Целью данной работы было исследование возможных структурных и кинетических механизмов агрегации и дезагрегации БО ВТМ под действием детергентов разных групп. Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать действие анионного детергента ДСН, катионного детергента ЦТАБ и неионного детергента Тритон Х-100 на БО ВТМ при комнатной температуре.

2. Исследовать влияние ДСН, ЦТАБ и Тритон Х-100 на термоиндуцированную (52 °С) аморфную агрегацию БО ВТМ.

3. Изучить процесс индуцированной нагреванием и детергентами аморфной агрегации БО ВТМ методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС).

Научная новизна н практическая значимость работы.

Исследовано действие детергентов трёх разных групп на БО ВТМ при разных условиях среды. Выяснено, что в зависимости от своей природы и условий среды исследованные детергенты могут по-разному влиять на БО ВТМ, причём даже действие одного детергента может меняться на прямо противоположное при изменении его концентрации или температуры.

Обнаружено, что анионный детергент ДСН в концентрациях от 250 мкМ предотвращает термоиндуцированную аморфную агрегацию БО ВТМ, не защищая молекулу белка от термоиидуцированного разупорядочения гидрофобного гребня. В более высоких концентрациях (от 460 мкМ) ДСН вызывает денатурацию этого участка молекулы БО ВТМ при комнатной температуре (25 °С), но этого оказывается не достаточно для индукции агрегации.

Катионный детергент ЦТАБ, известный как «искусственный шаперон» [20, 21], в высоких концентрациях (от 400 мкМ) вызывает реверсию термоиндуцированной агрегации БО ВТМ. Оказалось, однако, что в чрезвычайно низких концентрациях (от 17 мкМ) этот детергент оказывает противоположное действие - не только не ингибирует термоиндуцированную агрегацию, но, напротив, эффективно индуцирует агрегацию БО ВТМ при 25 °С в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7,0-8,0. Результатом такой агрегации является образование детергент-белковых комплексов, в составе которых на одну молекулу белка приходится четыре молекулы детергента. Предположительно, аморфной агрегации под действием ЦТАБ при 25 °С подвергаются нативные молекулы БО ВТМ. Добавление ДСН в ходе агрегации БО ВТМ, индуцированной ЦТАБ, вызывает реверсию агрегации вследствие образования смешанных мицелл из двух детергентов. Использование детергента, несущего противоположный заряд, для удаления «искусственного шаперона» с белка, по-видимому, может представляться в некоторых случаях более удобным вариантом, чем общепринятое использование циклодекстринов [20,21].

Концентрации ЦТАБ ниже индуцирующих агрегацию при комнатной температуре (около 0,00005 %) способны защищать БО ВТМ от агрегации при

длительном хранении при комнатной температуре. Вероятно, ЦТАБ может защитить и другие белки от подобной неприятности.

Обнаружено также, что другой «искусственный шаперон» - неионный детергент Тритон Х-100, подобно ЦТАБ, в высоких концентрациях (около 5 мМ) предотвращает аморфную агрегацию БО ВТМ при 52 °С. Однако в концентрациях более низких (от 460 мкМ) Тритон Х-100 сам вызывает аморфную агрегацию молекул БО ВТМ при 30 °С, которая может быть реверсирована добавлением ДСН. Эффект индукции агрегации БО ВТМ при помощи Тритон Х-100 сильно зависит от температуры, что может объясняться необходимостью частичной денатурацией молекул белка для инициирования процесса агрегации.

Таким образом, звание «искусственных шаперонов» [20, 21] детергенты оправдывают отнюдь не всегда. Более того, влияние конкретного детергента на отдельно взятый белок невозможно предсказать, а можно выяснить лишь экспериментальным путём.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), на XI и XII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2004, 2005), на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006). Работа была апробирована на совместном заседании Учёного Совета Факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М. В. Ломоносова МГУ и Отдела физических методов измерений НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского МГУ и на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 11 печатных

работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 175 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы.

Работа содержит 2 таблицы и 48 рисунков. Список литературы включает 242 литературных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение ВТМ и его БО. В работе использовали препараты дикого (U1) штамма ВТМ. Вирус выращивали на растениях Nicotiana tabacum var. Samsun и выделяли стандартным методом [1]. Выделение БО из вирионов ВТМ проводили ацетатным методом [12].

УФ-спектроскопия. УФ-спектры БО ВТМ, детергентов и их смесей измеряли на двулучевых спектрофотометрах «Shimadzu UV-1601» (Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Япония) или «SPECORD UV-VIS» (Carl Zeiss Jena, Германия) в области 190-350 нм. Для определения концентрации ВТМ и использованных в работе белков использовали коэффициенты поглощения: A = 2,30 для ВТМ, A = 1,30 для БО ВТМ (Dobrov et al., 1977), А= 2,63 для лизоцима, Аз'и' = 0,83 для миоглобина и А2™= 0,65 для БСА. В случае светорассеивающих препаратов спектры истинного поглощения рассчитывали с помощью метода экстраполяции [2,11].

Турбидиметрия. Измерения кинетики прироста оптической плотности (кажущегося поглощения - А32о) проводили на спектрофотометрах «SLM-Aminco DW-2000» (Aminco, США) или «SPECORD UV-VIS» в термостатированных кюветах.

Флуоресцентная спектроскопия. Измерения спектров флуоресценции БО ВТМ проводили на спектрофлуориметре «Hitachi MPF-4» (Hitachi Inc., Япония) в термостатированных кюветах. Для измерения спектров эмиссии в области 300-400 нм использовали УФ-свет с длинной волны 280 нм.

Спектроскопия кругового дихроизма. Спектры КД препаратов вирусов и белков в областях 198-250 и 250-350 нм измеряли на модифицированном дихрографе «Jobin-Ivon Mark V» (Франция). Для области 250-350 нм величины КД выражали в молярных коэффициентах дихроического поглощения, а для области 198-250 нм - в величинах молярной эллиптичности.

Аналитическое ультрацентрифугирование проводили на ультрацентрифуге «Beckman Е» (Beckman, США), оборудованной сканером и мультиплексной оптикой при длине волны 275 нм, при +4 °С и скоростях вращения

от 1000 до 40000 об/мин. Расчет коэффициента седиментации производили обычным методом [1].

Динамическое лазерное светорассеяние. Измерения проводили на установке Photocor Complex (Photocor Instruments Inc., США) с He-Ne лазером (Coherent, USA, Model 31-2082, 632,8 nm, 10 mW) в качестве источника света. Температура образцов поддерживалась при помощи PID temperature controller в пределах 0,1 °С. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов и логарифмической шкалой времени. Обработку автокорреляционных функций и расчёт величин D и Rh осуществляли при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль) [6, 13].

Дифференциальная сканирующая калориметрия. Калориметрические измерения проводили в дифференциальном адиабатическом сканирующем калориметре «ДАСМ-4» (Биоприбор, Россия). Эксперименты проводили при постоянном избыточном давлении 2 атм. Скорость нагрева составляла 1 грал/мин. Обратимость тепловых переходов проверяли путём повторного прогрева образцов.

Определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ) детергентов. Для определения ККМ ЦТАБ и Тритон Х-100 использовали методику спектрофотометрического определения ККМ, предложенную в работе Salette Reis и соавт. [19].

Для определения стехиометрии связывания ЦТАБ с БО ВТМ в

препараты белка (11,5-23 мкМ) добавляли различные концентрации ЦТАБ (5,75-230 мкМ). Образцы инкубировали в течение 48 часов при 25 °С, затем центрифугировали при 15000 об/мин в течение 20 мин при +4 °С в центрифуге «Beckman J2-21» (Beckman, США). Концентрацию БО ВТМ в супернатанте вычисляли из величины Л280» а процент осевшего в ходе центрифугирования белка - из разницы между исходной концентрацией белка и концентрацией белка в супернатанте.

Для определения количества ЦТАБ, оставшегося в супернатанте в случае высоких молярных соотношений [ЦТАБ] : [БО], в супернатант добавляли вторую порцию БО ВТМ (до конечной концентрации 28,8 мкМ). Образцы вновь инкубировали в течении 48 часов, центрифугировали и процент БО ВТМ осевшего в ходе второго центрифугирования рассчитывали, как описано выше.

При использовании инструментальных методов сбор данных, их анализ и все необходимые расчёты выполняли с помощью специального программного обеспечения, которым оборудованы приборы. Последующую обработку данных осуществляли при помощи программы Origin 7.5 (MicroCal Software, Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами было показано, что анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) в низких концентрациях (примерно 15 молекул детергента на одну молекулу белка) эффективно ингибирует термоивдуцированную агрегацию БО ВТМ [4]. В ходе наших экспериментов выяснилось, что катионньхй детергент ЦТАБ в концентрациях от 2 мкМ не только не ингибирует термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ, но заметно ускоряет этот процесс.

Действие ЦТАБ на БО ВТМ при комнатной температуре. Оказалось, что ЦТАБ в низких концентрациях (от 17 мкМ) индуцирует аморфную агрегацию БО ВТМ даже при комнатной температуре причём в 10 мМ нейтральном фосфатном буфере (ФБ) (при такой низкой молярности ФБ термоиндуцированной агрегации не наблюдается).

Обнаруженный феномен индукции агрегации низкими концентрациями ЦТАБ представляется весьма удивительным. Как правило, детергенты используются для предотвращения агрегации и разрушения агрегатов [15,20-22]. В нашем случае 17

Выделены аминокислотные остатки тирозина Рис. 1. Фазовая диаграмма агрепщионных (темно.серыс) и триптофана (светло-серые). Ось

форм БО ВТМ [8]. вириона проходит вертикально слева.

температуре.

В использовавшихся нами условиях ЦТАБ не вызывал агрегации других исследованных белков - яичного лизоцима, миоглобина из сердца лошади и бычьего

сывороточного альбумина.

Начальная скорость прироста оптической плотности (Vin) в ходе аморфной агрегации, индуцированной ЦТАБ при 25 °С сильно зависела от концентрации детергента (рис. 3). При агрегации различных концентраций БО ВТМ Fin увеличивалась с повышением [ЦТАБ]:[БО] до 10:1, при дальнейшем увеличении [ЦТАБ]:[БО] начинала падать, и при молярном соотношении с белком выше 25:1 ЦТАБ уже не индуцировал аморфную агрегацию БО ВТМ при 25 °С.

Как известно, главная (и, возможно, единственная) функция БО ВТМ заключается в формировании целого ряда упорядоченных белковых агрегатов (в т.ч. вирионов) [8]. Поэтому не исключено, что обнаруженный нами индуцирующий

200 300

СЦТАБ-МКМ

Рис. 3. Зависимость начальной скорости прироста Л320 от концентрации ЦТАБ в ходе агрегации БО ВТМ, индуцируемой ЦТАБ при 25 °С в 10 мМ ФБ. Концентрации БО ВТМ: 5,75 (/), 11,5 (2), 17,25 мкМ (3).

-3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 log [ФБ]

Рис. 4. Зависимость начальной скорости агрегацию эффект ЦТАБ будет проявляться прироста Л320 от концентрации ФБ в ходе _

агрегации 11,5 мкМ БО ВТМ, и в °™ошении Ря*а Других белков, для

индуцируемой 34,3 мкМ ЦТАБ которых характерно образование длинных ([ЦТАБ]:[БО] = 3:1) при 25 "С (1),

агрегации, индуцируемой 460 мкМ Тритон Упорядоченных агрегатов (актина,

Х-100 ([Тритон]:[БО] = 40:1) при 30 °С (2). Нулина). Поскольку известные (3) - для сравнения зависимость для

термоипдуцированпой (52 °С) агрегации амилоидогенные белки и пептиды (амилоид

р, а-синуклеин, прионный белок и др.) также проявляют способность формировать и длинные упорядоченные, и аморфные агрегаты, не исключено, что их аморфная агрегация также может быть индуцирована при физиологических условиях низкими концентрациями ЦТАБ.

-- —г- —+-<

0 2 4 б 8 10

Гщ в ходе термоиндуцированной аморфной агрегации БО ВТМ характеризуется весьма необычной зависимостью от ионной силы среды (рис. 4, кривая 3) [3], однако, У-т в ходе аморфной агрегации БО ВТМ, индуцированной микромолярными концентрациями ЦТАБ, мало зависела от ионной силы среды (рис. 4, кривая 1), что говорит о различиях в механизмах между двумя видами агрегации.

Для определения величины ККМ ЦТАБ в условиях наших экспериментов мы воспользовались методикой спектрофотометрического определения ККМ [19]. Исходя из полученных данных можно заключить, что в условиях наших

экспериментов молекулы ЦТАБ самоассоциируются в мицеллы начиная с концентраций 250-300 мкМ. Таким образом, аморфная агрегация БО ВТМ при комнатной температуре индуцируется свободными молекулами ЦТАБ, а не мицеллами детергента. К сожалению, нам не удалось измерить ККМ ЦТАБ в присутствии белка потому, что спектр БО ВТМ имеет мощный максимум поглощения в используемой для определения ККМ области.

Из данных, представленных на рис. 5 (а), видно, что в случае трёх исследованных нами концентраций БО ВТМ процент агрегированного белка линейно зависит от молярного соотношения [ЦТАБ]:[БО], но не от абсолютных концентраций компонентов. Весь, имеющийся в системе белок, осаждается при 15000 $ при молярном соотношении [ЦТАБ]:[БО] равном примерно 4:1.

Для ответа на вопрос, остаётся ли ЦТАБ в супернатантс после центрифугирования при молярных соотношениях [ЦТАБ]:[БО] выше 4:1, в супернатанты после первого центрифугирования добавлялась вторая порция белка и

4 6 8 [ЦТАБ]: [БО]

Рис. 5. Определение стехиометрии комплексов ЦТАБ с БО ВТМ, формирующихся в ходе агрегации при 25 °С в 10 мМ ФБ. Концентрации БО ВТМ: 11,5 (1), 17,15 (2) и 23 мкМ (3).

10 20 I, мни

Рис. 6. Реверсия аморфной агрегации 11,5 мкМ БО ВТМ, индуцированной 103,5 мкМ ЦТАБ ([ЦТАБ]:[БО] = 9:1) при 25 °С (1) и индуцированной 460 мкМ ([Тритон]:[БО] = 40:1) при 30 °С (2). ДСН добавлялся в соотношениях:

[ДСН]:[ЦТАБ] = 3:1. [ДСН]:[Тритон] = 1:5 ПОмМФБ).

после повторной инкубации препараты вновь центрифугировались. Три линии,

соответствующие разным исходным концентрациям белка на рис. 5 (б), пересекают ось абсцисс при значениях [ЦТАБ]:[БО] между 4 и 5. Таким образом, весь избыточный ЦТАБ остаётся в системе свободным, готовым связать новую порцию БО ВТМ, что свидетельствует о кооперативности взаимодействий

детергента с белком.

По нашим данным, спектры собственной флуоресценции нативного БО ВТМ (5,75 мкМ) и белка в присутствии низких концентраций ЦТАБ (5,75-17,25 мкМ), зафиксированные через 5 минут после начала агрегации, практически не отличаются. Это свидетельствует о том, что, ЦТАБ, индуцируя аморфную агрегацию белка, не нарушает его третичную структуру, по крайней мере, на начальных стадиях агрегации.

В последние годы, особенно после работ лаборатории ОеНтап, ЦТАБ стал широко известен, как «искусственный шаперои», предотвращающий агрегацию денатурированных молекул белков после разбавления из высоких концентраций мочевины или гуанидин хлорида [20-21]. В экспериментах, проведённых лабораторией веНтап, использовались концентрации ЦТАБ около 0,6 мМ [20]. Мы обнаружили, что гораздо более низкие концентрации ЦТАБ индуцируют агрегацию нативных молекул БО ВТМ при комнатной

УФ-спектры

250 280 X, нм

Рис. 7. Истинные поглощения 5,75 мкМ БО ВТМ в 10 мМ ФБ при 25 °С в отсутствии ЦТАБ (1), после инкубации (75 мин) с [ЦТАБ]:[БО] = 3:1 (2), через 2 часа после реверсии агрегации при помощи [ДСН]:[ЦТАБ] = 3:1; ресуспендированный осадок (4) и супернатант (5) после центрифугирования 15000 &

температуре, а более высокие концентрации детергента, использованные в работах веНтая, агрегацию при комнатной температуре действительно не вызывают.

Добавление анионного детергента ДСН в ходе аморфной агрегации БО ВТМ, индуцируемой катионным детергентом ЦТАБ, вызывает реверсию агрегации. Как видно из рис. 6 (кривая 7), добавление [ДСН]:[ЦТАЪ] — 3:1 приводит к падению величины Лзго, что свидетельствует о реверсии процесса агрегации. Опытами с

добавлением других концентрации ДСН

200

I °

"е г У -5

Б--ю

|-И

(б)

1 ь

¥

-о- 2 1.1.

200 210

220 230 X, нм

240 250

показано, что именно молярное соотношение детергентов равное 3:1 является оптимальным для реверсии ЦТАБ-индуцированной агрегации БО ВТМ с помощью ДСН.

Однако падение величины Л32о происходит при этом не до нулевого значения. Наличие в системе остаточной оптической плотности свидетельствует о присутствии светорассеивающих частиц. Для определения их природы нами был поставлен следующий эксперимент. БО ВТМ подвергался инкубации в

Рис. 8. Спектры КД в «ближнем» (а) и присутствии ЦТАБ при 25 °С, затем в

«дальнем» (б) УФ-свете исходного (7) и си добавляли ДСН, что вызвало освобождённого из агрегатов (2) БО ВТМ

в 10 мМ ФБ при 25 °С. Агрегация была реверсию агрегации. Препарат индуцирована добавлением ЦТАБ до „„

молярного соотношения [ЦТАБ]:[БО] = Центрифугировали и измеряли УФ-

3:1 и через 10 мин реверсирована спектры супернатанта и

добавлением ДСН до молярного

соотношения [ДСН]:[ЦТАБ] = 3:1. ресуспендированного осадка.

Как видно из спектров, представленных на рис. 7, в осадке (кривая 5) отсутствует белок. Спектр осадка имеет максимум только в коротковолновой области, на 193,4 нм, а, следовательно, является спектром детергента (или смеси детергентов). Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что остаточная оптическая плотность в системе после

реверсии ЦТАБ-индуцированной агрегации при помощи ДСН обусловлена исключительно детергентами, но не белком.

Возможность разрушить агрегаты при помощи ДСН позволила изучить структуру молекул БО ВТМ, вышедших из агрегатов, методом КД-спектросопии. Спектры нативного БО ВТМ и спектры БО ВТМ, освобожденного из агрегатов, представленные на рис. 8, и в «ближнем» и в «дальнем» УФ-свете практически не отличаются. Следовательно, после освобождения из состава агрегатов молекулы БО ВТМ находятся в нативном состоянии с исходной вторичной и третичной структурой.

Известно, что молекула БО ВТМ содержит 16 отрицательно заряженных и 13 положительно заряженных групп [24]. Таким образом, электростатическое связывание четырех молекул ЦТАБ с субъединицей БО ВТМ должно приводить субъединицу белка в близкое к электронейтральному состояние. Поэтому наиболее вероятным механизмом ЦТАБ-индуцированной агрегации БО ВТМ является нейтрализация отрицательных зарядов субъединиц белка путём связывания положительно заряженных «головок» молекул детергента и формирование дополнительных гидрофобных участков на поверхностях субъединиц белка за счёт «хвостов» молекул детергента. Связывание молекул ЦТАБ с субъединицами БО ВТМ приводит одновременно к уменьшению электростатического отталкивания между молекулами белка и к повышению общей гидрофобности поверхности субъединиц белка. Совокупное действие этих двух факторов приводит к тому, что молекулы БО ВТМ слипаются за счёт гидрофобных межсубъединичных взаимодействий образовавшихся за счёт присоединения детергента, а также за счёт уже имеющихся гидрофобных участков на поверхности субъединиц белка.

Большинство отрицательно заряженных аминокислотных остатков локализовано на поверхности субъединицы БО ВТМ и не учас твует в формировании пар зарядов внутри молекулы [16], Четыре карбоксильных группы (Е50, D77, Е95 и El06) в составе вириона формируют знаменитые «каспаровские» карбоксил-карбоксилатные пары. В свободном белке эти группы существуют в свободном состоянии и, таким образом, могут быть первыми кандидатами для связывания ЦТАБ.

Ослабление эффекта индукции агрегации при молярных соотношениях [ЦТАБ]:[БО] выше 10:1 мы объясняем следующей схемой. Присутствие в системе дополнительного количества молекул ЦТАБ приводит к гидрофобным

взаимодействиям «хвостов» «избыточных» молекул детергента с гидрофобными сайтами белка, а также к гидрофобным взаимодействиям между «избыточными» молекулами ЦТАБ и молекулами ЦТЛБ, электростатически связанными с субъединицами БО ВТМ. Результатом таких взаимодействий является образование «шубы» положительных зарядов на поверхности субъединиц белка, состоящей из «головок» детергента и собственных положительных зарядов аминокислотной последовательности белка. Формирование такой «шубы» усиливает электростатическое отталкивание между субъединицами БО ВТМ и препятствует агрегации.

На основании полученных данных мы предполагаем, что реверсия ЦТАБ-индуцированной агрегации БО ВТМ под действием ДСН обусловлена формированием смешанных мицелл, в состав которых входят оба детергента. Гидрофобные и электростатические взаимодействия между молекулами ДСН и ЦТАБ. по-видимому, оказываются сильнее взаимодействий ЦТАБ с отрицательно заряженными сайтами на поверхности субъединиц БО ВТМ. По крайней мере, часть образующихся смешанных мицелл должна иметь крупный размер, чтобы обуславливать заметное светорассеяние и оседать при 15000 g. Наличие как положительных, так и отрицательных зарядов на поверхности смешанных мицелл по всей вероятности и обуславливает их способность к формированию ассоциатов.

Обнаруженный нами факт того, что ЦТАБ-индуцированная агрегация БО ВТМ происходит, по-видимому, без потери молекулами белка их нативной структуры ещё раз демонстрирует «шаперонные» свойства ЦТАБ в системе, сильно отличающейся от систем, описанных в работах Gellman [20-21].

Использование для удаления детергента с белка пары, состоящей из катионного и анионного детергентов, может в некоторых случаях быть более удобным, чем использование 4,8 мМ циклодекстрина, применяемого лабораторией Gellman [20] (необходимые концентрации противоположно заряженного детергента существенно ниже концентраций плохо растворимых циклодекстринов).

Мы обнаружили также, что ЦТАБ может индуцировать при 25 °С (10 мМ ФБ) агрегацию даже цельных вирионов ВТМ. Такая агрегация не сопровождается разрушением вирионов и также реверсируется добавлением ДСН.

Кроме того, оказалось, что добавление концентраций ЦТАБ ниже индуцирующих агрегацию (1,44-2,9 мкМ) препятствует агрегации БО ВТМ, вызванной длительным (несколько суток) хранением при комнатной температуре. Увеличение оптической плотности препаратов белков в ходе длительной инкубации при комнатной температуре обычно связано с денатурацией и последующей

агрегацией и/или с бактериальным

600000

20 30 1, мин

Рис. 9. Зависимость интенсивности лазерного светорассеяния (а) и гидродинамического радиуса (б) от времени в ходе термоиндуцированной агрегации 5,75 мкМ БО ВТМ (50 мМ ФБ) - кривые 1 ив ходе агрегации 11,5 мкМ БО ВТМ, индуцированной 34,3 мкМ ЦТАБ при 25 °С (10 мМ ФБ) - кривые 2. Линии на рис. (б) проведены в соответствии с уравнением. В случае термоиндуцированной агрегации (¡¡= 1,80, для агрегации, индуцированной ЦТАБ, с!( = 1,74.

проростом. Оказалось, что даже чрезвычайно низкие концентрации ЦТАБ (0,00005 %) способны защищать БО ВТМ (а, возможно, и другие белки) от подобных неприятностей.

Методом ДЛС нами был проведён сравнительный анализ кинетики термоиндуцированной агрегации БО ВТМ и агрегации, индуцированной ЦТАБ при 25 °С. ДЛС - мощный и продуктивный метод исследования, давно уже успешно использующийся для решения самых разнообразных задач биохимии, биофизики и молекулярной биологии. Как видно из рис. 9 (б) (кривые 1), в случае термоиндуцированной агрегации БО ВТМ в начальный момент измерений в системе обнаруживаются агрегаты с гидродинамическим радиусом (Ль) около 20 нм, которые мы назвали стартовыми агрегатами. Как оказалось, стартовых агрегатов не зависит от концентрации

белка. В ходе прогрева при небольших временах в системе обнаруживается только один тип агрегатов, мы их назвали базовые агрегаты. Через несколько минут после начала агрегации зависимость Я^) для базовых агрегатов подчиняется степенному закону. \ = , где I -

время начала выполнения уравнения, R'h соответствует Rh при / = t, К] - константа, df - фрактальная размерность. В случае термоиндуцированной агрегации ф = 1,80. Подчинение зависимости Rh(t) степенному закону и значение d( в пределах 1,70-1,85 свидетельствуют о том, что формирование базовых агрегатов происходит в режиме, при котором скорость агрегации лимитируется диффузией частиц, и каждое столкновение частиц приводит к слипанию [14].

В случае термоиндуцированной агрегации в момент достижения интенсивностью лазерного светорассеяния постоянной предельной величины распределение агрегатов по размерам становится бимодальным. В системе появляется второй тип агрегатов - суперагрегаты. В этот момент размер базовых агрегатов перестаёт увеличиваться и останавливается на величине 135 нм. Предельный размер базовых агрегатов не зависит от концентрации БО ВТМ.

Мы полагаем, что суперагрегаты формируются за счёт слипания базовых агрегатов, т.к. только подобным образом можно объяснить переходы между частицами при постоянстве интенсивности светорассеяния.

В отличие от термоиндуцированной агрегации, в ходе агрегации, индуцированной ЦТАБ, рост размеров агрегатов во времени происходит монотонно (рис. 9 (б), кривые 2). Полидисперсности в системе не обнаруживается. Увеличение размеров агрегатов начинается с величины примерно 100 нм, характеризующей размер стартовых агрегатов, который не зависит от концентраций компонентов системы. Рост размеров агрегатов во времени следует степенному закону при временах выше 13 мин, и величина d[ при этом составляет 1,74, т.е. с t = 13 мин агрегация, индуцированная ЦТАБ, выходит на режим, при котором скорость агрегации лимитируется скоростью диффузии частиц.

Таким образом, методом ДЛС в ходе термоиндуцированной (52 °С) аморфной агрегации БО ВТМ зафиксировано разделение популяции агрегатов на два типа: базовые агрегаты и суперагрегаты. В случае агрегации БО ВТМ, индуцированной ЦТАБ, такого феномена не обнаружено.

Действие ДСН на БО при комнатной температуре. Оказалось, что анионный детергент ДСН в молярном соотношении с белком 40:1 и выше вызывает разупорядоченис гидрофобного гребня молекулы БО ВТМ (по данным флуоресцентной спектроскопии) при комнатной температуре. Причём этот эффект не

зависит от ионной силы среды. Как оказалось, такого разупорядочения под действием ДСН, однако, не достаточно для индукции агрегации БО ВТМ при комнатной температуре.

Действие Тритон Х-100 на БО ВТМ при комнатной температуре. В

самые последние годы наблюдается стремительное увеличение числа белков и пептидов, используемых в медицинской практике. В связи с этим одной из

важнейших задач фармакологии становится защита этих пептидов и белков от денатурации, агрегации, протеолиза, адсорбции прочих проблем в ходе их изготовления и, особенно, хранения. Известно, что одним из наиболее эффективных средств такой защиты

10 15 20 25 30

/)МИН являются детергенты, и чаще всего -

Рис. 10. Регистрируемая по приросту А32о пеионные t5> 10' 18> 231 Поэтому мы

¡S^TStS?аГреГаЦИИ 1W № Б° Р™и ИЗУЧИТЬ Действие неиотюго ВТМ (100 мМ ФБ) в присутствии 0,46 мМ у

Тритон Х-100 при 25 (/), 30 (2), и 35 °С (?). детергента Тритон Х-100 на БО ВТМ.

Как оказалось, и Тритон Х-100 индуцирует агрегацию БО ВТМ при температурах, близких к комнатной. Однако концентрации Тритон Х-100, необходимые для индукции агрегации оказываются на порядок выше концентраций ЦТАБ, необходимых для индукции агрегации при 25 °С.

Как видно из рис. 10, при 25 °С в присутствии 460 мкМ Тритон Х-100 прирост у432о в системе, содержащей БО ВТМ, ещё невелик. Однако при увеличении температуры в этих условиях на каждые 5 °С скорость прироста оптической плотности резко увеличивается. Обнаруженный характер температурной зависимости индукции агрегации и наличие лаг-периода на кривых увеличения оптической плотности БО ВТМ по всей вероятности должен свидетельствовать об участии денатурационных изменений в процессе аморфной агрегации БО ВТМ, индуцированной Тритон Х-100. Напомним, что ни в случае термоиндуцированной агрегации, ни в случае агрегации, индуцируемой ЦТАБ при 25 °С, лаг-период не обнаруживается.

В пользу предположения о денатурационных изменениях в молекулах БО ВТМ в ходе аморфной агрегации, индуцированной Тритон Х-100, говорит и обнаруженное нами снижение температуры плавления 11,5 мкМ БО ВТМ в присутствии 460 мкМ Тритон Х-100 по данным ДСК с 41 до 37 °С.

По нашим данным, молекулы Тритон Х-100 самоассоциируются в мицеллы при концентрациях около 500 мкМ. Таким образом, концентрации Тритон Х-100, индуцирующие аморфную агрегацию БО ВТМ, находятся в районе ККМ детергента.

Как видно из рис. 4 (кривая 2), зависимости начальной скорости прироста А320 от молярности ФБ для агрегации БО ВТМ, индуцированной Тритон Х-100 при 30 °С, весьма сходна с таковой для термоиндуцированной агрегации, но резко отличается от той, которая наблюдается в случае агрегации, индуцированной ЦТАБ при 25 °С.

Мы полагаем, что мицеллы Тритон Х-100 взаимодействуют с молекулами белка и вызывают их частичную денатурацию. Вероятно, эта денатурация происходит в области гидрофобного гребня, т.к. именно данный участок субъединицы БО является наименее стабильным [3, 17]. Сидящие на мицеллах частично-денагурированные молекулы БО ВТМ взаимодействуют с другими свободными или связанными с мицеллами субъсдшгацами белка с формированием крупных агрегатов, состоящих из молекул белка и мицелл Тритон Х-100.

Оказалось, что аморфная агрегации БО ВТМ, индуцированная Тритон X-100, может быть обращена добавлением [ДСН]:[Тритон Х-100] = 1:5 (рис. 6, кривая 2). Опытами с добавлением различных концентрации ДСН было показано, что именно данное молярное соотношение детергентов является оптимальным для реверсии Тритон-индуцированной агрегации БО ВТМ.

Нам представляется наиболее вероятным, что реверсия Тритон-ипдуцированной агрегации БО ВТМ, как и реверсия ЦТАБ-индуцировашюй агрегации, может быть обусловлена превращением мицелл Тритон Х-100 в смешанные мицеллы Тритон + ДСН. Причём, как видно, для такого превращения оказывается достаточным присутствия одной молекулы ДСН на 5 молекул Тритон X-100.

В пользу идеи о реверсии Тритон-индуцированной агрегации БО ВТМ под действием ДСН за счёт образования смешанных мицелл говорит факт наличия

остаточной оптической плотности в системе после реверсии агрегации. Эта остаточная оптическая плотность, по нашему мнению, как и в случае реверсии ЦТАБ-индуцированной агрегации, обусловлена крупными светорассеивающими ассоциатами смешанных мицелл, в состав которых входят два детергента.

Действие ЦТАБ, ДСН и Тритон Х-100 на термоипдуцпрованную аморфную агрегацию БО ВТМ. Как видно из рис. 11 (кривая 2), при добавлении ДСН в ходе агрегации БО ВТМ при 52 °С, происходит понижение величины Аца. Величина Л320 падает почти до нуля при абсолютной концентрации детергента равной примерно 250 мкМ.

При добавлении ЦТАБ в ходе термоиндуцированной агрегации БО ВТМ, величина А32о приближается к нулю значению при концентрациях ЦТАБ выше 400

мкМ (рис. 11, кривая 1). Опытами с другими концентрациями белка и детергентов показано, что максимальный эффект достигается именно при данных концентрациях ДСН и ЦТАБ. Таким образом, и ДСН, и ЦТАБ способны вызывать реверсшо

термоиндуцированной аморфной

агрегации БО ВТМ.

Мы предполагаем следующий механизм реверсии

термоиндуцированной агрегации БО ВТМ под действием ДСН или ЦТАБ. Молекулы детергента связываются «хвостами» с гидрофобными гребнями субъединиц БО, уже частично вовлеченными в аберрантные межсубъединичные взаимодействия, ведущие к формированию агрегатов. Взаимодействие хвостов детергентов с БО ВТМ приводит к скоплению зарядов «головок» молекул детергента, связанных с участками гидрофобных гребней разных субъединиц БО. Электростатическое отталкивание одноимённых зарядов ведёт к разрыву межсубъединичных связей и, как следствие, к разрушению белковых агрегатов.

10 /, мин

Рис. 11. Реверсия термоиндуцированной (52 °С) аморфной агрегации 11,5 мкМ БО ВТМ (50 мМ ФБ) под действием 400 мкМ ЦТАБ (/), 250 мкМ ДСН (2) и 5 мМ Тритон Х-100

(5)-

Как видно из рис. 11 (кривая 3), Тритон Х-100 вызывает реверсию термоиндуцированной агрегации БО ВТМ в концентрациях от 5 мМ. Реверсия и ингибирование термоиндуцированной агрегации БО в этом случае являются, по нашему мнению, следствием полного покрытия субъединиц белка мицеллами детергента и, как следствие, защитой от взаимодействий с другими субъединицами.

Таким образом, катионный детергент ЦТАБ и пеионнный дегергент Тритон Х-100 индуцируют аморфную агрегацию БО ВТМ при температурах, близких к комнатной. Причём необходимые для индукции агрегации концентрации Тритон X-100 оказываются примерно в 20 раз выше, чем необходимые концентрации ЦТАБ. Анионный детергент ДСН предотвращает и реверсирует термоиндуцированную (52 °С) аморфную агрегацию БО ВТМ, однако, ни при каких из исследованных нами условий не индуцирует аморфную агрегацию БО.

На основании всех полученных данных можно заключить, что агрегационные характеристики БО ВТМ (и, возможно, других белков) могут быть изменены в любую сторону действием различных детергентов. Однако подбор детергентов и условий их действия, вероятно, представляет собой отдельную задачу для каждого белка.

выводы

1. Обнаружено, что свободные молекулы катионного детергента ЦТАБ в концентрациях от 17 мкМ индуцируют аморфную агрегацию молекул БО ВТМ при комнатной температуре (25 °С) в нейтральном ФБ, результатом чего является формирование детергент-белковых комплексов с соотношением [ЦТАБ]:[БО] равном всего 4:1. Предположительно агрегации подвергаются нативные молекулы БО ВТМ.

2. Методом динамического лазерного светорассеяния в ходе термоиндуцированной (52 °С) аморфной агрегации БО ВТМ зафиксировано разделение популяции агрегатов на два типа: базовые агрегаты и суперагрегаты. В случае агрегации БО ВТМ, индуцированной ЦТАБ, такого явления не обнаружено.

3. Мицеллы неионного детергента Тритон Х-100 (концентрации детергента от 460 мкМ) индуцируют аморфную агрегацию БО ВТМ при 30 °С. Индукция агрегации, по-видимому, происходит после частичной денатурации молекул белка.

4. Анионный детергент ДСН ни при каких из исследованных нами условий не индуцирует аморфную агрегацию БО ВТМ.

5. Все три исследованных нами детергента оказывают реверсирующее действие на термоивдуцированную (52 °С) аморфную агрегацию БО ВТМ: ДСН в концентрациях выше 250 мкМ, ЦТАБ в концентрациях выше 400 мкМ, Тритон Х-100 в концентрациях от 5 мМ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Панюков Ю. В., Рафикова Э. Р. «Ингибирование аморфной агрегации белков низкими концентрациями додецилсульфата натрия». Тезисы докладов XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Секция биология. Москва, 12-15 апреля 2004, с. 123. Рафикова Э. Р., Панюков Ю. В., Арутюнян А, М., Ягужинский Л. С., Драчёв В.

A., Добров Е. Н. «Низкие концентрации Оз-Ыа ингибируют аморфную агрегацию белка оболочки вируса табачной мозаики и влияют на стабильность белка». Биохимия, 2004, том 69, вып. 12, с. 1683-1690.

Курганов Б, И., Чеботарёва Н, А., Панюков 10. В., Добров Е. Н., Федуркина Н.

B., Мицкевич Л. Г. «Кинетика агрегации белков». III съезд биофизиков России. Воронеж, 24-29 июня 2004. Тезисы докладов, том I, с. 60.

Панюков 10. В., Немых М. А. «Обратимая аморфная агрегация вируса табачной мозаики и его белка оболочки при комнатной температуре индуцируемая цетилтриметиламмонийбромидом». XVII зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7-10 февраля 2005. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 46. Панюков Ю. В., Немых М. А. «Влияние ионных дегергентов на аморфную агрегацию белка оболочки вируса табачной мозаики». Материалы XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва, 12-15 апреля 2005, том II, с. 31.

Панюков 10. В., Немых М. А., Добров Е. Н. «Возможные механизмы индуцированной детергентами аморфной агрегации белков». II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 25-27 мая 2005. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 100.

Пашоков Ю. В., Рафикова Э. Р., Добров Е. Н. «Неупорядоченная а!регация белка оболочки вируса табачной мозаики, при комнатной температуре индуцируемая цетилтриметиламмонийбромидом». Доклады академии наук, 2005, том 402, вып. 6, с. 835-837.

Панюков Ю. В., Добров Е. Н., Курганов Б. И. «Изучение тепловой агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики методом динамического лазерного светорассеяния». Международный симпозиум «Молекулярные механизмы

регуляции функции клетки». Тюмень, 12-16 сентября 2005. Материалы симпозиума, с. 95-98.

9. Yuliy V. Panyukov, Maria A. Nemykh, Elvira R. Rafikova, Boris I. Kurganov, Lev S. Yaguzhinsky, Alexander M. Arutyunyan, Vladimir A. Drachev, and Evgeny N. Dobrov «Low cetyltrimethylammonium bromide concentrations induce reversible amorphous aggregation of tobacco mosaic virus and its coat protein at room temperature». The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2006, volume 38, issue 4, pp. 533-543.

10. Markossian, K. A., Kurganov, В. I., Levitsky, D. I., Khanova, H. A., Chebotareva, N. A., Samoilov, A. M., Eronina, Т. В., Fedurkina, N. V., Mitskevich, A. M., Merem'yanin, A. V., Kleymenov, S. Y., Makeeva, V. F., Muronetz, V. I., Naletova, I. N., Shalova, I. N., Asiyants, R. A., Schmalhausen, E. V., Saso, L., Panyukov, Y. V., Dobrov, E. N., Yudin, I. K., Timofeeva, A. C., Muranov, К. O., and Ostrovsky, M. A. «Mechanism of the chaperone-like activity» (pp. 89-171) in Protein Folding: New Reseach. Nova Science Publishers, Inc., 2006.

11. Панюков, Ю. В., Козловский, В. С. «Агрегирующее и дезагрегирующее действие детергентов на белок оболочки вируса табачной мозаики». 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 17-21 апреля 2006. Сборник тезисов, с. 87.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Практикум по общей вирусологии (2002). Издательство МГУ.

2. Ксенофонтов А. Л. и др. (2005). Мол. биол., 40, 172-179.

3. Орлов В. Н. И др. (2001). Биохимия, 66, 195-204.

4. Рафикова Э. Р. и др.(2004). Биохимия, 69,1683-1690.

5. Arakawa Т. & Kita Y. (2000). J. Pharm. Sci, 89,646-651.

6. Baussay К. ct al. (2004). Int. J. Biol. Macromol., 34,21-28.

7. Bucciantini M. et al. (2002). Nature, 416, 507-511.

8. Butler P.J.G. (1984). J. Gen. Virol., 65,253-279.

9. Chiti F. et al. (2002). Nat. Struct. Biol., 9, 137-143.

10. Chou D. K. et al. (2005). J. Pharm. Sci., 94, 1368-1381.

11. Dobrov E. N. et al. (1977). Biochim. Biophys. Acta, 475, 623-637.

12. Fraenkel-Conrat H. (1957). Virology, 4,1-4.

13. Goldin A. A. (1991). Opt. Spectrosk.. 71.485-489.

14. Lin M. Y. et al. (1989). Proc. Royal Soc. A., 423, 71-87.

15. McMeekin T. L. et al. (1949). J. Biol. Chem., 71,3606-3609.

16. Namba K. et al. (1989). J. Mol. Biol., 208, 307-325.

17. Rafikova E. R. et al. (2003). Int. J. Biochem. Cell Biol., 35,1452-1460.

18. Randoph T. W. & Jones L, S. (2002). Pharm. Biotechnol., 13, 159-175.

19. Reis S. et al. (2004). Anal. Biochem., 334,117-126.

20. Rozema D. & Gellman H. S. (1996). J. Biol. Chem., 271,3478-3487.

21. Rozema D. & Gellman H. S. (1996). Biochemistry, 35, 15760-15771.

22. Tandon S. & Horowitz P. (1986). J. Biol. Chem., 261,15615-15681.

23. Webb S. D. et al. (2003). J. Pharm. Sci., 92, 715-729.

24. Wittmann-Liebold B. & Wittmann H.G. (1967). Mol. Gen. Genet., 100, 5818-5822.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от01.12.99 г. Подписано к печати 14.09.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 80 экз. Заказ 611. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

/л&бА

lïfN

I0- 2 1 8 8 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Панюков, Юлий Валерьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Агрегация белков

1.1. Классификация агрегации белков по структуре агрегатов

1.2. Упорядоченная агрегация белков

1.3. Неупорядоченная (аморфная) агрегация белков

1.4. Связь агрегации белков с заболеваниями человека и животных

1.4.1. Амилоидные заболевания

1.4.2. Приоиные инфекции

1.4.3. Прочие заболевания

1.5. Влияние детергентов на агрегацию белков

1.5.1. Понятие детергентов

1.5.2. Индукция и ингибирование детергентами аморфной агрегации белков

1.5.3. Индукция и ингибирование детергентами амилоидной агрегации 50 белков

1.5.4. Детергенты как "искусственные шапероны"

2. БО ВТМ как модель для изучения агрегации белков

2.1. Структура вириона ВТМ

2.2. Упорядоченная агрегация БО ВТМ ("полимеризация")

2.2.1. Разнообразие упорядоченных агрегатов БО ВТМ

2.2.2. Структура БО ВТМ в составе вирионов ВТМ

2.2.3. Структура БО ВТМ в составе 20Б-дисков

2.3. Неупорядоченная (аморфная) термоиндуцированная агрегация БО ВТМ

2.3.1. Зависимость термоиндуцированной агрегации БО ВТМ от условий 65 среды

2.3.2. Температура термической денатурации БО ВТМ

2.3.3. Частично развернутая форма БО ВТМ

2.3.4. Механизм термической денатурации БО ВТМ

2.3.5. Кинетический анализ прироста мутности при термоиндуцированной 72 агрегации Б О ВТМ

2.3.6. Взаимодействия белковых молекул в ходе термоиндуцированной 73 агрегации БО ВТМ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы

2. Накопление и выделение вирионов ВТМ

3. Выделение белка оболочки ВТМ

4. УФ-спектроскопия

5. Определение истинного поглощения светорассеивающих систем методом 76 экстраполяции

6. Турбидиметрия

7. Флуоресцентная спектроскопия

8. Спектроскопия кругового дихроизма

9. Аналитическое ультрацентрифугирование '

10. Динамическое лазерное светорассеяние

11. Дифференциальная сканирующая калориметрия

12. Определение ККМ детергентов методом УФ-спектроскопии (методика Reis и 80 соавт.)

13. Определение стехиометрии связывания ЦТАБ и БО ВТМ

14. Математические расчёты

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Влияния детергентов разных групп на термоиндуцированную (52 °С) 82 аморфную агрегацию БО ВТМ

1.1. Анионный детергент ДСН

1.1.1. Ингибирование термоиндуцированной агрегации БО ВТМ

1.1.2. Реверсия термоиндуцированной агрегации БО ВТМ при помощи ДСН

1.2. Катионный детергент ЦТАБ

1.2.1. Низкие концентрации ЦТАБ значительно ускоряют ход 88 термоиндуцированной агрегации БО ВТМ

1.2.2. ЦТАБ в высоких концентрациях проявляет свойства "искусственного 88 шаперона" в отношении БО ВТМ

1.3. Неионный детергент Тритон Х-100 в зависимости от концентрации по- 91 разному влияет на термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ

2. Влияния трёх разных детергентов на БО ВТМ при комнатной 93 температуре

2.1. Индукция аморфной агрегации ВТМ и его БО при 25 °С катионным 93 детергентом ЦТАБ

2.1.1. Зависимость кинетики прироста мутности от соотношения 93 компонентов в ходе агрегации БО ВТМ, индуцируемой ЦТАБ

2.1.2. Влияние ионной силы среды на кинетику индуцированной ЦТАБ 96 агрегации БО ВТМ

2.1.3. Структура молекул БО ВТМ в составе ЦТАБ-индуцированных 96 агрегатов

2.1.4. Стехиометрия детергент-белковых комплексов

2.1.5. Определение ККМ ЦТАБ по методике, предложенной Reis и соавт.

2.1.6. Реверсия ЦТАБ-индуцированной агрегации БО ВТМ при помощи 102 ДСН

2.1.7. Структура молекул БО ВТМ, освобождённых из ЦТАБ- 105 индуцированных агрегатов

2.1.8. Сравнение кинетики ЦТАБ-индуцированной (при 25 °С) и 107 термоиндуцированной (при 52 °С) агрегации БО ВТМ методом ДЛС

2.1.8.1. Изучение методом ДЛС термоиндуцированной агрегации БО 107 ВТМ

2.1.8.2. Изучение методом ДЛС ЦТАБ-индуцированной агрегации БО 117 ВТМ

2.1.9. Сравнение кинетики ЦТАБ-индуцированной агрегации БО ВТМ 119 разными методами

2.1.10. "Сверхнизкие" концентрации ЦТАБ препятствуют агрегации БО 120 ВТМ в процессе хранения на комнатной температуре

2.1.11. Агрегация цельных вирионов ВТМ, индуцируемая ЦТАБ при 25 °С

2.2. Влияние анионного детергента ДСН на БО ВТМ при комнатной температуре

2.3. Индукция аморфной агрегации БО ВТМ неионным детергентом Тритон Х

2.3.1. Зависимость кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 125 от температуры

2.3.2. Зависимости кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 128 при 30 °С от соотношения компонентов

2.3.3. Определение ККМ Тритон Х-100 по методике, предложенной Reis и 128 соавт.

2.3.4. Зависимость кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 130 при 30 °С от ионной силы среды

2.3.5. Изучение влияния Тритон Х-100 на БО ВТМ методом ДСК

2.3.6. Изучение методом ДЛС аморфной агрегации БО ВТМ, 132 индуцированной Тритон Х-100 при 30 °С

2.3.7. Реверсия ДСН аморфной агрегации БО ВТМ, индуцированной Тритон 133 Х-100 при 30 °С

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Влияние детергентов разных групп на термоиндуцированную (52 °С) 136 аморфную агрегацию БО ВТМ

2. Влияние детергентов разных групп на БО ВТМ при комнатной температуре 143 ВЫВОДЫ 155 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БО - белок оболочки

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВТМ - вирус табачной мозаики

ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

ДСН - додецилсульфат натрия

КД - круговой дихроизм

ККА - критическая концентрация ассоциации

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

ТГЭ - трансмиссивные губкообразные энцефалопатии

ТДАБ -тетрадециламмоиийбромид

ТСН - тетрадецилсульфата натрия

ФБ - фосфатный буфер

ЦПБ - цетилпиридинийбромид

ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение процесса аморфной агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики"

Долгое время процессы аморфной агрегации белков изучались^ основном^ в контексте проблем пищевой промышленности. Однако с развитием биотехнологии и увеличением доли лекарственных препаратов на белковой основе в фармацевтике, процессы аморфной агрегации стали создавать серьёзные технические и экономические проблемы и в этих отраслях хозяйства. Это привело к увеличению числа работ, посвященных исследованию процессов аморфной агрегации белков, а выражаясь точнее, работ посвященных поиску путей предотвращения аморфной агрегации. Работами ряда лабораторий было показано, что детергенты могут не только ингибировать агрегацию белков, но и разрушать аморфные агрегаты и вызывать ренатурацию белков.

Несколько лет назад, когда выяснилось, что причиной ряда важных заболеваний человека (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) являются именно аморфные агрегаты - предшественники зрелых амилоидов, изучение процессов агрегации белков и влияния на эти процессы детергентов стало особенно актуальным.

Белок оболочки (БО) вируса табачной мозаики (ВТМ) характеризуется склонностью к образованию ряда упорядоченных агрегатов (т.н. «полимеров»). Формирование «полимеров» БО ВТМ происходит за счёт сильных специфических межсубъединичных взаимодействий разных типов. Ранее в нашей лаборатории было показано, что БО ВТМ является достаточно удобной моделью и для изучения неупорядоченной (аморфной) агрегации. Процесс термоиндуцированной (52 °С) аморфной агрегации БО ВТМ хорошо воспроизводим и может легко регулироваться путём изменения условий среды.

Наш интерес к проблеме влияния детергентов на агрегацию этого белка первоначально был также связан с задачей предотвращения аморфной агрегации. Из анализа литературы выяснилось, что не существует единой схемы, в которую могло бы уложиться всё разнообразие эффектов, вызываемых детергентами в отношении белков и пептидов. Это подвигло нас на исследование влияния на агрегациониые свойства БО ВТМ де тергентов трёх разных групп: анионного, катионного и неионного.

Целыо данной работы было исследование возможных структурных и кинетических механизмов агрегации и дезагрегации БО ВТМ под действием детергентов разных групп. Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать действие анионного детергента додецилсульфата натрия (ДСН), катионного детергента цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) и неионного детергента Тритон Х-100 на БО ВТМ при комнатной температуре.

2. Исследовать влияние ДСН, ЦТАБ и Тритон Х-100 на термоиндуцированную (52 °С) аморфную агрегацию БО ВТМ.

3. Изучить процесс индуцированной нагреванием и детергентами аморфной агрегации БО ВТМ методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС).

Научная новизна и практическая значимость работы

Исследовано действие детергентов трёх разных групп на БО ВТМ при разных условиях среды. Выяснено, что в зависимости от своей природы и условий среды исследованные детергенты могут по-разному влиять на БО ВТМ, причём даже действие одного детергента может меняться на прямо противоположное при изменении его концентрации или температуры.

Обнаружено, что анионный детергент ДСН в концентрациях от 250 мкМ предотвращает термоиндуцированную аморфную агрегацию БО ВТМ, не защищая молекулу белка от термоиндуцированного разупорядочения гидрофобного гребня. В более высоких концентрациях (от 460 мкМ) ДСН вызывает денатурацию этого участка молекулы БО ВТМ даже при комнатной температуре (25 °С), но этого оказывается не достаточно для индукции агрегации.

Катионный детергент ЦТАБ, известный как «искусственный шаперон», в высоких концентрациях (от 400 мкМ) вызывает реверсию термоиндуцированной агрегации БО ВТМ. Оказалось, однако, что в чрезвычайно низких концентрациях (от 17 мкМ) этот детергент оказывает противоположное действие - не только не ингибирует термоиндуцированную агрегацию, но, напротив, эффективно индуцирует агрегацию БО ВТМ при 25 °С в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,0-8,0. Результатом такой агрегации является образование детергент-белковых комплексов, в составе которых на одну молекулу белка приходится четыре молекулы детергента. Предположительно, аморфной агрегации под действием ЦТАБ при 25 °С подвергаются нативные молекулы БО ВТМ. Добавление ДСН в ходе агрегации БО ВТМ, индуцированной ЦТАБ, вызывает реверсию агрегации вследствие образования смешанных мицелл, состоящих из двух детергентов. Использование детергента, несущего противоположный заряд, для удаления «искусственного шаперона» с белка, по-видимому, может представляться в некоторых случаях более удобным вариантом, чем общепринятое использование циклодекстринов.

Концентрации ЦТАБ ниже индуцирующих агрегацию при комнатной температуре (около 0,00005 %) способны защищать БО ВТМ от агрегации при длительном хранении при комнатной температуре. Вероятно, ЦТАБ может защитить и другие белки от подобных неприятностей.

Обнаружено также, что другой «искусственный шаперон» - неионный детергент Тритон Х-100, подобно ЦТАБ, в высоких концентрациях (около 5 мМ) предотвращает аморфную агрегацию БО ВТМ при 52 °С. Однако в концентрациях более низких (от 460 мкМ) Тритон Х-100 сам вызывает аморфную агрегацию молекул БО ВТМ при 30 °С, которая может быть реверсирована добавлением ДСН. Эффект индукции агрегации БО ВТМ при помощи Тритон Х-100 сильно зависит от температуры, что может объясняться необходимостью частичной денатурацией молекул белка для инициирования процесса агрегации.

Таким образом, звание «искусственных шаперонов» детергенты оправдывают отнюдь не всегда. Более того, влияние конкретного детергента на отдельно взятый белок невозможно предсказать, а можно выяснить лишь экспериментальным путём.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Панюков, Юлий Валерьевич

1. Обнаружено, что свободные молекулы катионного детергента ЦТАБ в

концентрациях от 17 мкМ индуцируют аморфную агрегацию молекул БО ВТМ

является формирование детергент-белковых комплексов с соотношением

[ЦТАБ];[БО] равном всего 4:1. Предположительно агрегации подвергаются

нативные молекулы БО ВТМ.

2. Методом динамического лазерного светорассеяния в ходе термоиндуцированной

агрегатов на два типа: базовые агрегаты и суперагрегаты. В случае агрегации БО

ВТМ, индуцированной ЦТАБ, такого явления не обнаружено. 3. Мицеллы неионного детергента Тритон Х-100 (концентрации детергента от 460

агрегации, по-видимому, происходит после частичной денатурации молекул

белка. 4. Анионный детергент ДСН ни при каких из исследованных нами условий не

индуцирует аморфную агрегацию БО ВТМ.

5. Все три исследованных нами детергента оказывают реверсирующее действие на

концентрациях выше 250 мкМ, ЦТАБ в концентрациях выше 400 мкМ, Тритон

Х-100 в концентрациях от 5 мМ. БЛАГОДАРНОСТИ

Сердечно благодарю своих научных руководителей - Евгения Николаевича

Доброва и Владимира Александровича Драчёва за всестороннюю поддерлску, знания и

опыт, нолученные мною за время работы, а такл^е за бесконечное терпение. Выражаю

глубочайшую признательность проф. Б. И. Курганову за тесное сотрудничество, и

интерес к работе. Благодарю всех сотрудников отдела физических методов измерений НИИ

ФХБ МГУ: В. Козловского, П. В. Калмыкова, Н. Н. Магретову, В. Н. Мичурину, а

также Марию Немых за поддержку и помощь в экспериментальной работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панюков, Юлий Валерьевич, Москва

1. Атабеков, И. Г. (2002). Практикум по общей вирусологии. Издательство МГУ, Москва. Донсон, Р., Эллиот, Д., Эллиот, У., Джонс, К. (1991). Справочник биохомика. Издательство «Мир», Москва. Еронина, Т. Б., Чеботарева, Н. А., Ливанова, Н. Б., Курганов, Б. И. (2001). Кинетика денатурации гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика. Биохимия, 66,555-

2. Ксенофонтов, А. Л., Козловский, В. С Кордюкова, Л. В., Радюхин, В. А., Тимофеева, А. В., Добров, Е. Н. (2005). Определение концентрации и размера агрегатов в препаратах вируса гриппа про спектрам истинного цоглощения в УФ-свете. Молекулярная биология, 40, 172-

3. Курганов Б. И. (1998). Кинетика тенловой агрегации белков. Биохимия, 63, 430-

4. Курганов, Б. И. и Тончиева, И. Н. (1998). Рефолдинг белков с участием искусственных шаперонов. Биохимия, 63, 491-

5. Курганов, Б. И. (2002а). Кинетика агрегации белков. Количественная оценка шаперонпой активности в тестах, основанных на подавлении агрегации белков. Биохимия, 67, 492-

6. Курганов Б. И. (20026). Оценка активности молекулярных шанеронов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков. Успехи биологической химии, 42, 89-

7. Курганов, Б. И., Рафикова, Э. Р., Добров, Е. Н. (2002). Кинетика тепловой агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики. Биохимия, 67, 631-

8. Ленинджер, А. (1985). Основы биохомии (в Зх томах). Издательство «Мир», Москва. Маркосяп, К. А. и Курганов, Б. И. (2004). Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация белков. Формирование телец включения и агресом. Биохимия, 65, 1196-1

9. Орлов, В. Н., Арутюнян, А. М., Куст, В., Литманович, Е. А., Драчев, В. А., Добров, Е. Н. (2001). Макроскопическая агрегация белка оболочки вируса табачной мозаики. Биохимия, 66, 195-

10. Остерман, Л. А. (1983). Исследование биологических и макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом радиоизотронными методами. Издательство «Наука». 156

11. Рафикова, Э. Р., Панюков, Ю. В., Арутюнян, А. М., Ягужинский, Л. С Драчёв, В. А., Добров, Е. И. (2004). Низкие концентрации Ds-Na ингибируют аморфную агрегацию белка оболочки вируеа табачной мозаики и влияют на стабильность белка. Биохимия, 69,1683-1

12. Скрипкин, А., Волынская, А. В., Шишков, А. В., Гольданский, В. И. (1981). Механизм связывания додецилсульфата натрия с лизоцимом. Молекулярная биология, 15, 1364-1

13. Травень, В. Ф. (2004). Органическая химия (в 2х томах). Издательство Москва. Фридрихсберг, Д. А. (1984). Курс коллоидной химии. Издательство Ленинград. Щукин, Е. Д., Нерцов, А. В., Амелина, Е. А. (2004). Коллоидная химия. Издательство «Высшая школа», Москва. Abgar, S., Vanhoudt, S., Aerts, Т., Clauweart, J. (2001). Study of the chaperoning mechanism of bovine lens a-crystallin, a member of the a-small shock superfamily. BiophysicalJoumal, 80, 1986-1

14. Adler, M. Lee, G. (1999). Stability and surface activity of lactate dehydrogenase in spraydried trehalose. Journal of Pharmaceutical Sciences, 88, 199-

15. Alberts, В., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2004). Essential cell biology, 2"* edition. Garland Science. Anson, M. (1939). The denaturation of proteins by synthetic detergents and bile salts. Journal of General Physiology, 23, 239-

16. Arakawa, Т., Kita, Y. (2000). Protection of bovine serum albumin from aggregation by Tween

17. Journal of Pharmaceutical Sciences, 89, 646-651. AugListeyn, R. С (2004). a-Crystallin: a review of its structure and function. Clinical and Experimental Optometry, 87, 356-

18. Bam, N. В., Cleland, J. L, Randolph, T. W. (1996). Molten globule intermediate of recombinant human growth hormone: stabilization with surfactants. Biotechnology 12, 801-809. «Химия», «Академкнига», 157

19. Bauer, R., Carrotta, R., Rischel, C. (2000). Characterization and isolation of intermediates in P-lactoglobuIin heat aggregation at high pH. Biophysical Journal, 79, 1030-1

20. Baussay, K., Bon, L. C Nicolai, Т., Durand, D., Busnel, J. P. (2004). Influence of the ionic strength on the heat-induced aggregation of the globular protein |3-lactoglobulin at pH

21. International Journal of Biological Macromolecules, 34, 21-

22. Baynes, B. M., Wang, D. I. C, Trout, B. (2005). Role of arginine in the stabilization of proteins against aggregation. Biochemistry, 44, 4919-4

23. Bettelheim, F. A. (2002). Kinetics of chaperoning of dithiothreitol-denatured a-lactalbumin by a-crystallin. International Journal of Biological Macromolecules, 30, 161-

24. Bettelheim, F. A., Ansari, R., Cheng, Q. F., Zigler, J. S. (1999). The mode of chaperoning of dithiothreitol-denatured a-lactalbumin by a-crystallin. Biochemical and Biophysical Research Communications, 261, 292-

25. Bisaglia, M., Tessari, I., Pinato, L., Bellanda, M., Giraudo, S., Fasano, M., Bergantino, E., Bubacco, L., Mammi, S. (2005). A topological model of the interaction between asynuclein and sodium dodecyl sulfate micelles. Biochemistry, 44, 329-

26. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. В., Teplow, D. B. (2003). Amyloid p-protein assembly: AP40 and AP42 oligomerize through distinct pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100, 330-

27. Bloomer, A.C., Champness, J.N., Bricogne, G., Staden, R., Klug, A. (1978). Protein disc of tobacco mosaic virus at 2.8 A resolution showing the interaction within and between subunits. Nature, 276, 362-

28. Bolton, D. C McKinley, M. P., Prusiner, S. B. (1982). Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science, 218, 1309-1

29. Bon, C. L., Nicolai, Т., Durand, D. (1999). Growth and structure of aggregates of heatdenatured P-lactoglobulin. International Journal of Food Science and Technology, 34, 451-

30. Bruijn, L. I., Houseweart, M. K., Kato, S., Anderson, K. L., Anderson, S. D., Ohama, E., Reaume, A. G., Scott, R. W., Cleveland, D. W. (1998). Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SODl mutant independent from wild-type SODl. Science, 281, 1851-1854. 158

31. Bueler, H., Aguzzi, A., Sailer, A., Greiner, R. A., Autenried, P., Aguet, M., Weissmann, C. (1993). Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell, 13, 1339-1

32. Butler, P.J.G. (1984). The current picture of the structure and assembly of tobacco mosaic virus. Journal of General Virology, 65, 253-

33. Calzolai, L., Lysek, D. A., Guntert, P., von Schroetter, C Riek, R., Zahn, R., Wuthrich, K. (2000). NMR structures of three single-residue variants of the human prion protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, 8340-8

34. Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. (1997). Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice. Pharmaceutical Research, 14, 969-

35. Carrotta, R., Bauer, R., Waninge, R., Rischel, C. (2001). Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in p-lactoglobulin heat aggregation. Protein Science, 10, 1312-1

36. Caspar, D. L. (1963). Assembly and stability of the tobacco mosaic virus particle. Advances in Protein Chemistry, 18, 37-

37. Ceciliani, F., Pergami, P. (2001). Infective proteins: the prion puzzle. Current Protein Peptide Science, 2, 191-

38. Champness, I. N., Bloomer, A. C Bricogne, G., Buttler, P. J. G., Klug, A. (1976). The structure of protein disk of tobacco mosaic virus to 5 A resolution. Nature, 259, 20-

39. Chen, S., Ferrone, F., Wetzel, R. (2002). Fluntingtons disease age-of-onset linked to polyglutamine aggregation nucleation. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America, 99, 11884-11

40. Chen, S. H., Teixeira, J. (1986). Structure and fractal dimension of protein-detergent complexes. Physical Review Letters, 57, 2583-2

41. Chirita, C. N., Necula, M., Kuret, J. (2003). Anionic micelles and vesicles induce tau fibrillization in vitro. Journal of Biological Chemistry, 278, 25644-25

42. Chirita, C. N., Kuret, J. (2004). Evidence for an intermediate in tau filament formation. Biochemistry,?,, 1704-1

43. Chiti, F., Bucciantini, M., Capanni, C, Taddei, N., Dobson, С M., Stefani, M. (2001). Solution conditions can promote formation of either amyloid protofilaments or mature fibrils from the HypF N-terminal domain. Protein Science, 10, 2541-2547. 159 of

44. Chiti, F., Webster, P., Taddei, N., Clark, A., Stefani, M., Ramponi, G., Dobson, C. M. (1999). Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96, 3590-3

45. Chou, D. K., Krishnamurthy, R., Randolph, T. W., Carpenter, J. F., Manning, M. C. (2005). Effects of Tween 20 and Tween 80 on the stability of Albutropin during agitation. Journal of Pharmaceutical Sciences, 94, 1368-1

46. Clayton, D. F., George J. M. (1998). The synucleins: a family of proteins involved in synaptic function, plasticity, neurodegeneration and disease. Trends in Neiirosciences, 21, 249-

47. Cohen A. S., Calkins E. (1959). Electron microscopic observations on a fibrous component in amyloid of diverse origins. Nature, 183, 1202-1

48. Considine, Т., Singh, H., Patel, H. A., Creamer, L. K. (2005a). Influence of binding of sodium dodecyl sulfate, aW-trans-v&tinol, palmitate, and and 8-anilino-lof p- naphthalenesulfonate on the heat-induced unfolding aggregation lactoglobulin B. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 3197-3

49. Considine, Т., Singh, H., Patel, H. A., Creamer, L. K. (2005b). Influence of binding of sodium dodecyl sulfate, all-/7-fl«5-retinol, and 8-anilino-l-naphthalenesulfonate on the high-pressure-induced unfolding and aggregation of p-lactoglobulin B. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 8010-8

50. Conway, K. A., Lee, S. J., Rochet, J. C, Ding, T. Т., Harper, J. D., Williamson, R. E., Lansbury, P. T. (2000). Accelerated oligomerization by Parkinsons disease linked asynuclein mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, 571-

51. Creighton, T. E. (1993). In W.H.Freeman and Co., Proteins. Structures and Molecular Properties. NeM York: Plenum Press. Cummings, С J., Mancini, M. A., Antalffy, В., DeFranco, D. В., Orr, H. Т., Zoghbi, H. Y. (1998). Chaperone suppression of aggregation and altered subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCAl. Nature Genetics, 19, 148-

52. Damaschun, G., Damaschun, H., Fabian, H., Gast, K., Krober, R., Wieske, M., Zirwer, D. (2000). Conversion of yeast phosphoglycerate kinase into amyloid-like structure. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 39, 204-211. 160

53. Devlin, J. G., Carver, L. A., Bottomley, S. P. (2003). The selective inhibition of serpin aggregation by the molecular chaperone, a-crystallin, indicates a nucleation-dependent specificity. Journal of Biological Chemistry, 278, 48644-48650. DiFiglia, M., Sapp, E., Chase, K. 0., Davies, S. W., Bates, G. P., Vonsattel, J. P., Aronin N. (1997). Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science, 211, 1990-1

54. Ding, Т., Lee, S., Rochet, J., Lansbury, J. (2002). Annular a-synuclein protofibrils are produced when spherical protofibrils are incubated in solution or bound to brainderived membranes. Biochemistry, 41, 10209-10

55. Dobson, C. M. (1999). Protein misfolding, evolution and disease. Trends in Biochemical Sciences, 24, 329-

56. Dobrov, E. N., Kust, S. V., Yakovleva, 0. A., Tikchonenko, T. I. (1977). Structure of single-stranded virus RNA in situ. II. Optical activity of five tobacco mosaic-like viruses and their components. Biochimica et Biophysica Ada, 475, 623-

57. Dormont, D. (2002). Prion diseases: pathgenesis and public health concerns. FEBS Letters, 529, 17-

58. Duggan, E. L., Luck, F. M. (1948). The combination of organic anions with serum albumin. IV. Stabilization against urea denaturation. Journal of Biological Chemistry, 172, 205-

59. Eckhardt, B. M., Oeswein, .1. Q., Bewley, T. A. (1991). Effect of freezing on aggregation of human growth hormone. Pharmaceutical Research, 8, 1360-1

60. Elofsson, U. M., Dejmek, P., Paulson, M. A. (1996). Heat-induced aggregation of Plactoglobulin studied by dynamic light scattering. International Dairy Journal, 6, 343357. 161

61. Fawzi, N. L., Chubukov, V., Clark, L. A., Brown, S., Head-Gordon, T. (2005). Influence of denatured and intermediate state of folding on protein aggregation. Protein Science, 14,993-1

62. Fezoui Y., Teplow D. B. (2002). Kinetic studies of amyloid p protein fibril assembly. Differential effects of a-helix stabilization. Journal of Biological Chemistry, 111, 36948-36

63. Fink, A. (1998). Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Folding and Design, 3, R9-R

64. Follmer, C, Pereira, F. V., Da Silveira, N. P., Carlini, С R. (2004). Jack bean urease (EC 3.5.1.5) aggregation monitored by dynamic and static light scattering. Biophysical Chemistry, III, 19-?,

65. Forno, L. (1996). Neuropathology of Parkinsons disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 55, 259-

66. Fraenkel-Conrat, H. (1957). Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Virology, 4, 1-

67. Fraenkel-Conrat, H., Williams, R.S. (1955). Reconstitution of active tobacco mosaic virus from its inactive protein and nucleic acid components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 41, 690-

68. Fuda, E., Bhatia, D., Pyle, D. L., Jauregi, P. (2005). Selective separation of P-lactoglobulin from sweet whey using CGAs generated from the cationic surfactant СТАВ. Biotechnology and Bioengineering, 90, 532-

69. Ganesh, C, Zaidi, F. N., Udgaonkar, J. В., Varadarajan, R. (2001). Reversible formation of on-pathway macroscopic aggregates during the folding of maltose binding protein. Protein Science, 10, 1635-1

70. Gelamo, E.L., Silva, C.H.T.P., Imasato, H., Tabak, M. (2002). Interaction of bovine (BSA) and human (FISA) serum albumins with ionic surfactants: modelling. Biochimica et Biophysica Acta, 1594, 88-

71. Gelamo, E.L. Tabak, M. (2000). Spectroscopic studies on the interaction of bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 56, 2255-2

72. Ghosh, S., Banerjee, A. (2002). A multitechnique approach in protein/surfactant interaction study: Physicochemical aspects of sodium dodecyl sulfate in the presence of trypsin in aqueous medium. Biomacromolecules, 3, 9-16. 162 Spectroscopy and

73. Glenner, G. G., Wong C. W. (1984). Alzheimers disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochemical and Biophysical Research Communications, 120, 885-

74. Goedert, M. (2001). a-Synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Reviews. Neiiroscience, 2, 492-

75. Goelet, P., Lomonosoff, G. P., Butler, P. J. G., Akam, M. E., Gait, M. J., Karn, J. (1982). Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 79, 5818-5

76. Graw, J. (2004). Congenital hereditary cataracts. International Journal of Developmental Biology, 48, 1031-1

77. Graw, J., Neuhauser-Klaus, A., Klopp, N., Selby, P. В., Loster, J., Favor, J. (2004). Genetic and allelic heterogeneity of Cryg mutations in eight distinct forms of dominant cataract in the mouse. Investigative Ophthalmology Visual Science, 45,1202-1

78. Greenfield, N., Fasman, G. D. (1969). Gomputed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry, 12, 1290-1

79. Guijarro, J. I., Sunde, M., Jones, J. A., Gampbell, I. D., Dobson, C. M. (1998). Amyloid fibril formation by an SH3 domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95, 4224-4

80. Guo, X. H., Zhao, N. M., Chen, S. H., Texeira, J. (1990). Small-angle neutron scatttering study of the structure of proteiiVdetergent complex. Biopolymers, 29, 335-

81. Gutekunst, C. A., Li, S. H., Yi, H., Mulroy, J. S., Kuemmerle, S., Jones, R., Rye, D., Ferrante, R. J., Hersch, S.M., Li, X.J. (1999). Nuclear and neuropil aggregates in Huntingtons disease: relationship to neuropathology. Journal of Neuroscience, 19, 2522-2

82. Hall, D., Minton, A, P. (2005). Turbidity as a probe of tubulin polymerization kinetics: A theoretical and experimental re-examination. Analytical Biochemistry, 345, 198-

83. Hartley, D. M., Walsh, D. M., Ye, C. P., Diehl, Т., Vasquez, S., Vassilev, P., M, Teplow, D. В., Selkoe, D. J. (1999). Protofibrillar intermediates of amyloid (3 protein induce acute electrophysiological changes and progressive neurotoxicity in cortical neurons. Journal of Neuroscience, 19, 8876-8

84. Hoffmann, M. A., van Mil, P. J. (1999). Heat-induced aggregation of P-lactoglobulin as a function of pH. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 1898-1905. 163

85. Horwitz, J. (1992). a-Crystailin can function as a molecular chaperone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89, 10449-10

86. Hoshi, M., Sato. M., Matsumoto. S., Noguchi, A., Yasutake, K., Yoshida, N., Sato, K. (2003). Spherical aggregates of p-amyloid (amylospheroid) show high neurotoxicity and activate tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-Зр. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100, 6370-6

87. Izutsu, K., Yoshioka, S., Terao, T. (1994). Stabilizing effect of amphiphilic excipients on the freeze-thaving and freeze-drying of lactate dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering, 43, 1102-1

88. Jain, R. K., Chang, W. Т., Geetha, C Joyce, P. B. M., Gorr, S. U. (2002). In vitro aggregation of the regulated secretory protein chromogranin A. Biochemical Journal, 368,605-

89. Jarrett, J. Т., Berger, E. P., Lansbury, P. T. Jr. (1993). The carboxy terminus of the Pamyloid protein is critical for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis of Alzheimers disease. Biochemistry, 32, 4693-4

90. Jockusch, H. (1966). Temperaturesensitive mutanten des Tabakmosaikvirus, I. In vivoVerhalten. Zeitschrift fur Vererbungslehre, 98, 320-

91. Jones, M. N., Manley, P. (1980). Interaction between lysozyme and n-alkyl aulphates in aqueous solution. Journal of the Chemical Society. Faraday Transactions, 76, 654

92. Jones, S., Manning, J., Kad, N. M., Radford, S. E. (2003). Amyloid-forming peptides from p2-microglobulin. Insights into the mechanism of fibril formation in vitro. Journal of Molecular Biology, 325, 249-

93. Khanova, H. A., Markossian, K. A., Kurganov, B. I., Samoilov, A. M., Kleimenov, S. Y., Levitsky, D. I., Yudin, I. K., Timofeeva, A. C Muranov, K. 0., Ostrovsky, M. A. (2005). Mechanism of chaperone-like activity. Suppression of thermal aggregation of pL-crystallin by a-crystallin. Biochemistry, 44, 15480-15

94. Klement, I. A., Skinner, P. J., Kaytor, M. D., Yi, H. (1998). Ataxin-1 nuclear localization and aggregation: role in polyglutamine-induced disease in SCAl transgenic mice. Ce//, 95, 41-

95. Klug, A. (1979). The assembly of tobacco mosaic virus: structure and specifity. Harvey lectures,! A, 141-172. 164

96. Koimo, Т., Murata K., Nagayama K. (1999). Amyloid-like aggregates of a plant protein: a case of a sweet-tasting protein, monellin. FEBS Letters, 454, 122-

97. Kodaka, M. (2004a). Requirements of generating sigmoidal time-course aggregation in nucleation-dependentpokymerization model. Biophysical Chemistry, 107, 243-

98. Kodaka, M. (2004b). Interpretation of concentration-dependence in aggregation kinetics. Biophysical Chemistry, 109, 325-

99. Kopito, R. R. (2000). Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. Trends in Cell Biology, 10, 524-

100. Kreilgaard, L., Frokjaer, S., Flink, J. M., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. (1999). Effect of additives on the stability of Humicola lanuginose lipase during freeze-drying and storage in the dried solid. Journal of Pharmaceutical Sciences, 88, 281-

101. Kreilgaard, L., Jones, L. S., Randolph, T. W., Frokjaer, S., Flink, J. M., Manning, M. C Carpenter, J. F. (1998). Effect of Tween 20 on freeze-thawing- and agitation-induced aggregation of recombinant human factor XIII. Journal of Pharmaceutical 87, 1597-1

102. Lambert, M. P., Barlow, A. K., Chromy, B. A., Edwards, C Freed, R., Liosatos, M., Morgan, T. E., Rozovsky, I., Trommer, В., Viola, K. L., Wals, P., Zhang, C, Finch, С E., Krafft, G. A., Klein, W. L. (1998). Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Api.42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95, 6448-6

103. Lampi, K. J., Ma, Z., Shih, M., Shearer, T. R., Smith, .1. В., Smith, D. L., David, L.L. (1997). Sequence analysis of РАЗ, РВЗ, and PA4 crystallins completes the identification of the major proteins in young huian lens. Journal of Biological Chemistry, 212, 2268-2

104. Lanio, M. E., Alvarez, C Pazos, F., Martinez, Y., Casallanovo, F., Abuin, A., Schreier, S., Lissi, E. (2003). Effects of sodium dodecyl sulfate on the conformation and hemolytic activity of St I and St II, two isotoxins purified from Stichodactyla Toxicon, 41, 65-70. Lee M.J., Lee S. J. J. (2002). Characterization of cytoplasmic a-synuclein aggregates. Journal of Biological Chemistry, 277, 48976-48

105. Leffers, K. W., Schell, J., Jansen, K., Lucassen, R., Kaimann, Т., Nagel-Steger, L., Tatzelt, J., Riesner, D. (2004). The structural transition of the prion protein into its pathogenic helianthus. Sciences, 165

106. Lin, M. Y., Linsday, H. M., Weitz, D. A., Ball, R. C Klein, R., Meakin, P. (1989). Universality of fractal aggregates as probed by light scattering. Proceedings of the Royal Society of London. Series A, Malhemalical and Physical Sciences, 423, 71-

107. London, J., Skrzynia, C Goldberg, M. E. (1974). Renaturation of coli tryptophanase after exposure to 8 M urea. European Journal of Biochemistry, 47, 409-

108. Lovestone, S., McLoughlin, D. M. (2001). Protein aggregates and dementia: is there a common toxicity? Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 72, 152-

109. Lundahl, P., Greijer, E., Sandberg, M., Cardell, S., Eriksson, K. (1986). A model for ionic and hydrophobic interactions and hydrogen bonding in sodium dodecyl sulfate-protein complexes. Biochimica et Biophysica Ada, 873, 20-

110. Lunkes, A., Lindenberg, K. S., Ben-Haiem, L., Weber, C Devys, D., Landwehrmeyer, G В., Mandel, J. L., Trottier, Y. (2002). Proteases acting on mutant huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell, 10, 259-

111. Maa, Y. F. Hsu, C. C. (1997). Protein denaturation by combined effect of shear and airliquid interface. Biotechnology and Bioengineering, 54, 503-

112. Maa, Y. F. Hsu, С (1998). Investigation of fouling mechanisms for recombinant human growth hormone sterile filtration. Journal of Pharmaceutical Sciences, 87, 808-

113. Mallucci, G, Collinge, J. (2005). Rational targeting for prion therapeutics. Nature reviews. Neuroscience, 6, 23-

114. Mandahar, C.L (1985). Plant viruses, V.I Structure and replication. CRC Press. Inc. Boca Raton. Florida. Mao, Y., Wei, W., Zhang, J., Zhang, S. (2002). Interaction process between ionic surfactant and protein probed by series piezoelectric quartz crystal technique. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 52, 19-

115. Markossian, K. A., Kurganov, B. L, Levitsky, D. L, Khanova, H. A., Chebotareva, N. A., Samoilov, A. M., Eronina, T. В., Fedurkina, N. V., Mitskevich, L. G., Meremyanin, A. V., Kleymenov, S. Y., Makeeva, V. F., Muronetz, V. I., Naletova, I. N., Shalova, I. N., Asryants, R. A., Schmalhausen, E. V., Saso, L., Panyukov, Y. V., Dobrov, E. N., 166

116. Mcleod, A., Walker, I., Zheng, S., Hayward, С P. (2000). Loss of Factor VIII activity during storage in PVC containers due to adsorption. Haemophilia, 66, 89-92. McMeekin, T. L., Polis, B. D., DellaMonica, E. S., Custer, J. H. (1949). A crystalline compound of p-lactoglobulin with dodecyl sulfate. Journal of Biological Chemistry, 71,3606-3

117. Meunier, V., Nicolai, Т., Durand, D. (2001). Structure of aggregating kappa-carrageenan factor studied by light scattering. International Journal of Biological Macromolecules, 28, 157-

118. Milhavet, 0., Lehmann, S. (2002). Oxidative stress and the prion protein in transmissible spongiform encephalopathies. Brain Research. Brain Research Reviews, 38, 328-

119. Militello, V., Casarino, C, Emanuele, A., Giostra, A., PuUara, F., Leone, M. (2004). Aggregation kinetics of bovine serum albumin studied by FTIR spectroscopy and light scattering. Biophysical Chemistry, 107, 175-

120. Moechars, D., Dewachter, I., Lorent, K., Reverse, D., Baekelandt, V., Naidu, A., Tesseur, I., Spittaels, K., Haute, C. V., Checler, F., Godaux, E., Cordell, В., Van Leuven, F. (1999). Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. Journal of Biological Chemistry, 274, 6483-6

121. Modler, A. J., Gast, K., Lutsch, G., Damaschun, G. (2003). Assembly of amyloid protofibrils via critical oligomers a novel pathway of amyloid formation. Journal of Molecular Biology, 325, 135-

122. Moren, A. K., Khan, A. (1995). Phase equilibria of an anionic surfactant (sodium dodecyl sulfate) and an oppositely charged protein (lysozyme) in water. Langmuir, 11, 36363

123. Moriyama, Y., Takeda, K. (1999). Re-formation of the helicity structure of human serum albumin by the addition of small amount of sodium dodecyl sulfate after the disruption 167

124. Nakano, Т., Graf, T. (1991). Goose-type lysozyme gene of the chicken: sequence, genomic organization and expression reveals major differences to chicken-type lysozyme gene. Biochimica el Biophysica Ada, 1090, 273-

125. Namba, K., Pattanayek, R., Stubbs, G. (1989). Visualization of intact tobacco mosaic virus at 2.9 A resolution by X-ray fiber diffraction. Journal of Molecular Biology, 208, 307

126. Necula, M., Chirita, С N., Kuret, J. (2003). Rapid anionic micelle-mediated a-synuclein fibrillization in vitro. Journal of Biological Chemistry, 278, 46674-46

127. Necula, M., Kuret, J. (2004). A static laser light scattering assay for surfactant-induced tau fibrillization. Analytical Biochemistry, 333, 205-

128. Nema, S., Avis, K. E. (1993). Freeze-thaw studies of a model protein, lactate dehydrogenase, in the presense of cryoprotectants. Journal of Parenteral Science and Technolog):, 47, 76-

129. Oberg, K., Chrunyk, B. A., Wetzel, R., Fink, A. (1994). Nativelike secondary structure in interleukin-lp inclusion bodies by attenuated total reflectance FTIR. Biochemistry, 33, 2628-2

130. Oliveira, K. M., Valente-Mesquita, V. L., Botelho, M. M., Sawyer, L., Ferreira, S. T. Polikarpov, I. (2001). Crystal structures of bovine (3-Iactoglobulin in the orthorhombic space group C222(l). Structural differences between genetic variants A and В and features of the Tanford transition. European Journal of Biochemistry, 268, 477-

131. Oosawa, F., Kasai, M. (1962). A theoiy of linear and helical aggregations of macromolecules. Journal of Molecular Biology, 4, 10-

132. Orlov, V. N., Kust, S. V., Kalmykov, P. V., Krivosheev, V. P., Dobrov, E. N., Drachev V. A. (1998). A comparative differential scanning calorimetric study of tobacco mosaic virus and of its coat protein ts mutant. FEBS Letters, 433, 307-

133. Pan, J. C, Wang, J. S., Cheng, Y., Yu, Z., Rao, X. M., Zhou, H. M. (2005). The role of detergent in refolding of GdnHCl-denatured arginine kinase from shrimp Fenneropenaens Chinensis: the solubilization of aggregate and refolding in detergent solutions. Biochemistry and Cell Biology, Ъ, 140-146. 168

134. Paulson, H., Bonini, N., Roth, K. (2000). Polyglutamine disease and neuronal cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, 12957-12

135. Pertinhez, T. A., Bouchard, M., Smith, R. A. G., Dobson, C. M., Smith, L. J. (2002). Stimulation and inhibition of fibril formation by a peptide in the presence of different concentrations of SDS. FEBS Letters, 529, 193-

136. Pertinhez, T. A., Bouchard, M., Tomlinson, E. J., Wain, R., Ferguson, S. J., Dobson, C. M., Smith, L. J. (2001) Amyloid fibril formation by a helical cytochrome. FEBS Letters, 495,184-

137. Perutz, M. F., Johnson, Т., Suzuki, M., Finch, J. T. (1994). Glutamine repeats as polar zippers: Their possible role in inherited neurodegenerative diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91, 5355-5

138. Perutz, M., Staden, R., Moens, L., De Baere, I. (1993). Polar zippers. Current Biology, 3, 249-

139. Pots, A. M., ten Grotenhuis, E., Gruppen, H., Voragen, A., de Kruif, K. G. (2003). Thermal aggregation of patatin studied in Situ. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 4600-4

140. Prusiner, S. (1982). Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 216, 136

141. Prusiner, S. B. (1998). Prions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95, 13363-13

142. Rafikova, E. R., Kurganov, B. I., Arutyunyan, A. M., Kust, S. V., Drachev, V. A., Dobrov E. N. (2003). A mechanism of macroscopic (amorphous) aggregation of the tobacco mosaic virus coat protein. International Journal of Biochemistry Cell Biology, 35, 1452-1

143. Rakocevic-Stojanovic, V., Eavrnic, D., Nestorovic, В., Dozic, S., Cvetkovic, D. (2005). Congenital myopathy with uniform type 1 fibers. Acta Myologica, 24, 162-

144. Randoph, T. W. Jones, E. S. (2002). Protein-surfactant interactions. Pharmaceutical Biotechnology, 13, 159-175. 169

145. Reis, S., Moutinho, C. G., Matos, C, Castro, В., Gameiro, P., Lima, J. (2004). Noninvasive methods to determine the critical micelle concentration of some bile acid salts. Analytical Biochemistry, 334, 117-

146. Reynolds, J.A., Tanford, C. (1970a). Binding of dodecyl sulfate to proteins at high binding ratio. Possible implications for the state of proteins in biological membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 66, 1002-1

147. Reynolds, J.A., Tanford, C. (1970b). The gross conformation of protein-sodium dodecyl sulfate complexes. Journal of Biological Chemistiy, 245, 5161-5

148. Ross, C Poirier, M., Wanker, E., Amzel, M. (2003). Polyglutamine fibrillogenesis: the pathway unfolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stales of America, 100, 1-

149. Rozema, D., Gellman, H. S. (1996a). Artificial chaperone-assisted refolding of carbonic anhydrase B. Journal of Biological Chemistry, 271, 3478-3

150. Rozema, D., Gellman, H. S. (1996b). Artificial chaperone-assisted refolding of denaturedreduced lysozyme: modulation of the competition between renaturation and aggregation. Biochemislry, 35, 15760-15

151. Saborio, G. P., Permanne, В., Soto, C. (2001). Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature, 411, 810-

152. Santos, N. C Castanho, M. A. (1996). Teaching light scattering spectroscopy: the dimension and shape of tobacco mosaic virus. Biophysical Journal, 71, 1641-1

153. Schilsky, M. L., Fink, S. (2006). Inlierited metabolic liver disease. Current Opinion in Gastroenterology, 22, 215-222. 170

154. Schuier, J., Frank, J., Saenger, W., Georgaiis, Y. (1999). Thermally induced aggregation of human transferrin receptor studied by iight-scattering techniques. BiophysicalJoiirnal, 11, 1117-1

155. Schweers, 0., Schonbrunn-Hanebeck, E., Marx, A., Mandelkow, E. (1994). Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for Pstructure. Journal of Biological Chemistry, 269, 24290-24

156. Selkoe, D. J. (1999). Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimers disease. TVfl/Mre, 399, A23-

157. Shirahama, K., Tsujii, K., Takagi, T. (1974). Free-boundary electrophoresis of sodium dodecyl sulfate-protein polypeptide complexes with special reference to SDSpolyacrylamide gel electrophoresis. Journal of Biochemistry (Tokyo), 75, 309-

158. Sipe, J. D., Cohen, A. S. (2001). History of the amyloid fibril. Journal of Structural Biology, 130, 88-

159. Skrzynia, C, London, J., Goldberg, M. E. (1974). The tryptophanase from Escherichia coli К12. Ill Further characterization of hybrids between the apo- and holoenzyme. Journal of Biological Chemistry, 249, 2325-2

160. Sontag, E., Nunbhakdi-Craig, V., Lee, G., Brandt, R., Kamibayashi, C Kuret, J., White, C. L. 3rd, Mumby, M. C, Bloom, G. S. (1999). Molecular interactions among protein phosphatase 2A, tau, and microtubules. Implications for the regulation of tau phosphorylation and the development of tauopathies. Journal of Biological Chemistry, 214, 25490-25

161. Soto, C. (2001). Protein misfolding and disease; protein refolding and therapy. FEBS Letters, 498, 204-

162. Soto, С (2003). Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neuroscience, 4, 49-

163. Speed, M. A., Wang, D. I., King, J. (1996). Specific aggregation of partially folded polypeptide chains: the molecular basis of inclusion body formation. Nature Biotechnology, 14, 1283-1

164. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. (1997). a-Synuclein in Lewy bodies. Nature, 388, 839-

165. Stahl, N., Prusiner, S. B, (1991). Prions and prion proteins. FASEB journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental, 5, 2799-2807. 171

166. Sun, Y., MacRae, T. H. (2005). The small heat shock proteins and their role in human disease. FEBS Journal, 111, 26U-2

167. Sun, C Yang, J., Wu, X., Huang, X., Wang, F., Liu, S. (2005). Unfolding and refolding of bovine serum albumin induced by cetylpyridinium bromide. Biophysical Journal, 88, 3518-3

168. Tanaka, S., Oda, Y., Ataka, M., Onuma, K., Fujiwara, S., Yonezawa, Y. (2001). Denaturation and aggregation of hen egg lysozyme in aqueous ethanol solution studied by dynamic light scattering. Biopolymers, 59, 370-

169. Tandon, S., Horowitz, P. (1986). Detergent-assisted refolding of guanidinium chloridedenatured rhodanese. The effect of lauryi maltoside. Journal of Biological Chemistry, 261, 15615-15

170. Tandon, S., Horowitz, P. (1987). Detergent-assisted refolding of guanidinium chloridedenatured rhodanese. The effect of the concentration and type of detergent. Journal of Biological Chemistry, 262, 4486-4

171. Tandon, S., Horowitz, P. (1989). Reversible folding of rhodanese. Presence of intermediate(s) at equilibrium. Journal of Biological Chemistry, 264, 9859-9

172. Tandon, S., Horowitz, P. (1990). The detection of kinetic intermediate(s) during refolding of rhodanese. Journal of Biological Chemistry, 265, 5967-5

173. Tanford, C. (1968). Protein denaturation. Advances in Protein Chemistry, 23, 121-

174. Taniguchi, M., Taniguchi, T. (1975). Thermally induced conformational changes of tobacco mosaic virus and their protein assemblies. Biochimica et Biophysica Acta, 386, 1-

175. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. (2002). Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science,29(i, 1991-1

176. Temussi, P. A., Masino, L., Pastore, A. (2003). From Alzheimer to Huntington: why is a structural understanding so difficult? The EMBO Journal, 22, 355-

177. Thurow, H. Geisen, H. (1984). Stabilization of dissolved proteins against denaturation at hydrophobic interfaces. Diabetologia, 27, 212-

178. Tsugita, A., Gish, D. Т., Young, J., Fraenkel-Conrat, H., Knight, С A., Stanley, W. M. (1960). The complete amino acid sequence of the protein of tobacco mosaic virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 46, 1463-1469. 172

179. Tycko, R. (2003). Insights into the amyloid folding problem from solid-state NMR. Biochemistry,il, 2,151-3

180. Tzannis, S. T. Prestrelski, S. J. (1999). Activity-stability considerations of trypsinogen during spray drying: Effect of sucrose. Journal of Pharmaceutical Sciences, 88, 351

181. Uversky, V. (2002). Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics. Protein Science, 11, 739-

182. Uversky, V., Li, J., Fink, A. (2001). Evidence for a partially folded intermediate in asynuclein fibril formation. Journal of Biological Chemistry, 216, 10737-10

183. Vaiana, S. M., Emanuele, A., Palma-Vittorelli, M. В., Palma, M. U. (2004). Irreversible formation of intermediate BSA oligomers requires and induces conformational changes. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 55, 1053-1

184. Walsh, D. M., Hartley D. M., Kusumoto Y., Fezoui Y., Condron M. M., Lomakin A., Benedek G. В., Selkoe D. J., Teplow D. B. (1999). Amyloid-p protein fibrillogenesis. Structure and biological activity of protofibrillar intermediates. Journal of Biological Chemistry, 274, 25945-25

185. Wang, K., Kurganov, B. I. (2003). Kinetics of heat- and acidification-induced aggregation of firefly luciferase. Biophysical Chemistry, 106, 97-

186. Wang, K., Spector, A. (1994). The chaperone activity of bovine a-crystallin. Interaction with other lens crystallins in native and denatured states. Journal of Biological Chemistry,269, 13601-13

187. Watase, K., Weeber, E. J., Xu, В., Antalffy, В., Yuva-Paylor, L., Hashimoto, K., Kano, M., Atkinson, R., Sun, Y., Armstrong, D. L., Sweatt, J. D., Orr, H. Т., Paylor, R., Zoghbi, H. Y. (2002). A long CAG repeat in the mouse Seal locus replicates SCAl features and reveals the impact of protein solubility on selective neurodegeneration. Neuron, 34,905-

188. Waugh, D. F. (1957). A mechanism for the formation of fibrils from protein molecules. Journal of Cellular and Comparative Physiology, 49, 145-

189. Webb, S. D., Cleland, J. L., Carpenter, J. F., Randolph, T. W. (2003). Effects of annealing lyophilized and spray-lyophilized formulations of recombinant human interferongamma. Journal of Pharmaceutical Sciences, 92, 715-729. 173

190. Weissmann, C. (2005). Birth of a proin: Spontaneous generation revisited. Cell, 122, 165-

191. Weitz, D. A., Huang, J. S., Lin, M. Y., Sung, J. (1985). Limits of the fractal dimension for irreversible kinetic aggregation of gold colloids. Physical RevieM Letters, 54, 14161

192. Weitz, D. A., Lin, M. Y. (1986). Dynamic scaling of clustermass distributions in kinetic colloid aggregation. Physical Review Letters, 57, 2037-2

193. Wetzel, R. (1994). Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends in Biotechnology, n, 193-

194. Wetzel, R. (1996). For protein misassembly, its the "I" decade. Cell, 86, 699-

195. Wetzel, R., Chrunyk, B. A. (1994). Inchision body formation by interleukin-lp depends on the thermal sensitivity of a folding intermediate. FEBS Letters, 350, 245-

196. Wiseman, R. L., Powers, E. Т., Kelly, J. W. (2005). Partitioning conformational intermediates between competing refolding and aggregation pathways: Insights into transthyretin amyloid disease. Biochemistry, 44, 16612-16

197. Wittmann-Liebold, В., Wittmann, H.G. (1967). Coat proteins of strains of two RNA viruses: comparison of their amino acid sequences. Molecular General Genetics, 100,5818-5

198. Wyss-Coray Т., Mucke, L. (2002). Inflammation in neurodegenerative disease a doubleedged sword. Neuron, 35, 419-432. Xu, Q., Keiderling, T. (2004). Effect of sodium dodecyl sulfate on folding and thermal stability of acid-denatured cytochrome c: A spectroscopic approach. Protein Science, 13, 2949-2

199. Yamamoto, N., Hasegawa, K., Matsuzaki, K., Naiki, H., Yanagisawa, K. (2004). Environment- and mutation-dependent aggregation behavior of Alzheimer amyloid-p protein. Journal ofNeurochemistry, 90, 62-

200. Yamamoto, S., Hasegawa, K., Yamaguchi, L, Tsutsumi, S., Kardos, .1., Goto, Y., Gejyo, F., Naiki, H. (2004). Low concentrations of sodium dodecyl sulfate induce the extension of |32-microglobulin-related amyloid fibrils at a neutral pH. Biochemistry, 43, 1107511

201. Yan, S. D., Zhu, H., Zhu, A., Golabek, A., Du, H., Roher, A., Yu, J., Soto, C. (2000). Receptor-dependent cell stress and amyloid accumulation in systemic amyloidosis. Nature Medicine, 6, 643-651. 174

202. Sodium dodecyl sulfate induced structural changes in triclinic lyzozyme. Biochemystry, 16, 1418-1

203. Zerovnik, E. (2002). Amyloid-fibril formation. Proposed mechanisms and relevance to conformation disease. European Journal of Biochemistry, 269, 3362-3

204. Zhu, M., Fink, A. L. (2003). Lipid binding inhibits a-synuclein fibril formation. Journal of Biological Chemistry, 278, 16873-16

205. Zoghbi H., Orr H. (2000.) Glutamine repeats and neurodegeneration. Annual Review of Neuroscience, 23, 217-247. 175