Изучение полиморфизмов некоторых саркомерных белков человека и их значения для функционирования мышечных тканей

Плугов, Александр Геннадиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение полиморфизмов некоторых саркомерных белков человека и их значения для функционирования мышечных тканей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение полиморфизмов некоторых саркомерных белков человека и их значения для функционирования мышечных тканей"

На правах рукописи

Плугов Александр Геннадиевич

Изучение полиморфизмов некоторых саркомерных белков человека и их значения для функционирования мышечных

тканей

Специальности: 03 00 04 «Биохимия» 03 00 15 «Генетика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре биологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов и в Институте биохимии им. А.Н.

Баха РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Чернов Николай Николаевич Шишкин Сергей Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Козельцев Владислав Львович Лимборская Светлана Андреевна

Ведущая организация - НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится т^—1 « 2006 г в ' Л часов на заседании

диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая,

Д.б.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета доктор фарм. наук, доцент

^^гиткйлы^ Лагуткина т. П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы: В современной биохимии и генетике человека важное место занимают исследования целого комплекса проблем, которые обусловлены существованием выраженного молекулярного полиморфизма [Perry S.V. 2001; Лимборская С.А. с соавт. 2002; Dos Remedies С. G. et al. 2003]. В частности, многими авторами показано, что изучение белкового полиморфизма необходимо для выяснения молекулярных основ вариабельности в функционировании различных систем организма, как в норме, так и при патологии [Beaudet A.L. et al. 1989; Schiaffino S., Reggiani C. 1996; Шишкин C.C. с соавт. 2004].

К настоящему времени проведено значительное число исследований, свидетельствующих о том, что биохимический полиморфизм весьма характерен для мышечных белков самых разных организмов, в частности, для мышечных белков человека [Barton P.J.R.; Buckingham М.Е. 1985; Schiaffino S., Reggiani С. 1996; Berg J.S. et al, 2001]. Особый интерес при этом, естественно, привлекают саркомерные белки, поскольку они непосредственно обеспечивают мышечное сокращение и, следовательно, их полиморфизм должен оказывать существенное влияние на состояние и функционирование отдельных мышц и даже всей мышечной системы, в целом.

Активные исследования полиморфизма саркомерных белков ведутся уже более 20 лет и, по-видимому, внимание к данному разделу биохимии мышц не снижается, а, напротив, в нем постепенно формируются все новые подразделы и направления [Breitbart R.E. et al. 1987; Beggs A.H. et al. 1992; Schiaffino S., Reggiani C. 1996; Perry S.V. 2001; Berg J.S. et al. 2001; Greaser M.L. et al. 2005]. Одним из таких относительно новых и весьма актуальных направлений стали исследования однонуклеотидных полиморфизмов (SNP's) в генах различных саркомерных белков, которые уже привели к получению принципиально важной информации о природе некоторых мышечных заболеваний [Beggs А.Н., et al. 1990; Richard I., et al. 1995; Шишкин C.C. 1997; Горбунова В.H. с соавт. 2000]. Важно отметить, что результаты подобных разработок достаточно быстро находят практическое применение, в частности в диагностике различных наследственных болезней [Beggs A.H., et al. 1990; Richard I., et al. 1995; Горбунова В.H. с соавт. 2000].

личных SNP's в генах человека с определенными позитивными признаками (для обобщенного обозначения которых в англоязычной литературе используется термин "physical performance") [Payne J., Montgomery H. 2003; Yang N., 2003; Perusse L. et al. 2003; Wolfarth B. et al. 2005]. Несколько групп исследователей из США, Канады, Германии, Финляндии и ряда других западных стран фактически создали международный консорциум, который занят отслеживанием всех публикаций по данной проблематике, их анализом и созданием особой генетической карты, показывающей локализацию соответствующих генов [Perusse L. et al. 2003; Wolfarth В. et al. 2005]. Соответственно, исходя из целей, связанных с обеспечением "physical performance", важное значение приобретают исследования SNP's в генах, которые кодируют белки, непосредственно вовлеченные в функционирование скелетной мускулатуры.

Цель и задачи исследования: изучение биохимического полиморфизма некоторых тканеепецифичных мышечных белков человека, представляющих основные структурные компоненты саркомера, и ассоциаций отдельных полиморфных вариантов с особенностями функционирования мышечных тканей в норме и при отдельных формах мышечной патологии.

Для достижения вышеуказанной цели решались следующие задачи исследования:

1) провести сравнительное изучение белковых паттернов поперечнополосатых мышц человека.

2) охарактеризовать ДНК-полиморфизм в нескольких участках генах MYH7 и гена ТРМ1 у спортсменов, а также пациентов с кардиомиопатиями и их ближайших родственников.

3) провести сравнительное изучение распределения генотипов и частот аллелей для полиморфизма Я577Х гена ACTN3 в представительной выборке этнических русских и в группе профессиональных спортсменов.

4) охарактеризовать распределение генотипов и частот аллелей для однонук-леотидного полиморфизма rs3731746 в гене TTN в представительной выборке этнических русских и в группе профессиональных спортсменов.

5) исследовать полиморфизм в гене CANP3 у некоторых пациентов с миодис-трофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

Научная новизна работы. Получены новые данные о полиморфизме пяти тканеепецифичных мышечных белков человека - тяжелая р-цепь миозина, а-тропомиозин, а-актинин-3, тайтин и кальпаин 3. Обнаружены межиндивидуальные количественные и качественные изменения тропомиозиновых белков в скелетных мышцах человека. В гене MYH7 не было выявлено гетерозиготности в группах спортсменов, но гетерозиготность оказалась у некоторых пациентов с кардиомиопатиями. Впервые в представительной выборке этнических русских и в группе профессиональных спортсменов РФ получены данные о распределении генотипов и частотах аллелей для однонуклеотидного

полиморфизма rs3731746 в гене TTN, приводящего к аминокислотной замене Т17556М. Обнаружена и зарегистрирована в международной базе данных "Nucleotide" NCBI новая мутация - динуклеотидная АС деления (номер -AY823489, gi56126469) в гене CANP3 у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

Теоретическая и практическая значимость. Разработана оригинальная модификация рестрикционного анализа для полиморфизма R577X rsl815739 в гене ACTN3, которая обеспечивает параллельно с генотипипированием контроль над качеством рестрикции. Результаты генотипирования по полиморфизму R577X нашли практическое применение при предварительном отборе молодых спортсменов - пловцов в СДЮШ Олимпийского резерва СКА (Санкт-Петербург), что зарегистрировано соответствующим свидетельством о внедрении. Получены данные о распределении генотипов и частот аллелей для полиморфизма rs3731746 (Т17556М) в гене TTN, которые позволяют рекомендовать проведение соответствующего генотипирования для профилизации молодых спортсменов. При изучении полиморфизмов в четырех участках генов MYH7 (экзоны 13, 9 и 20) и ТРМ1 (экзоны 5 и б с интроном между ними) получены данные, которые свидетельствуют, что для обеспечения целенаправленных поисков мутаций в соответствующих генах необходим специальный отбор лиц с потенциально высоким риском «синдрома внезапной смерти». Результаты исследований полиморфизма в гене CANP3 и обнаружение динуклеотидной делеции (АС) у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников представляют определенное значение для улучшения ДНК-диагностики при данной форме миодистрофии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Проведены исследования биохимического полиморфизма пяти тканеспе-цифичных мышечных белков человека - тяжелая р-цепь миозина, а-тропомио-зин, а-актинин-3, тайтин и кальпаин 3.

2) Выявлены различия в распределении генотипов и частот аллелей для полиморфизма R577X гена ACTN3 в представительной выборке этнических русских и в группе профессиональных спортсменов РФ. Показано, что среди профессиональных спортсменов в целом увеличено присутствие лиц с генотипом RR при снижении - с генотипом XX. Различия оказались наиболее выражены в подгруппах пловцов и лыжников.

3) По результатам изучения распределения генотипов и частот аллелей для однонуклеотидного полиморфизма rs3731746 в гене ТТЛ/ показано, что по сравнению с контрольной выборкой (не занимающиеся спортом) среди профессиональных спортсменов увеличено присутствие лиц с генотипом ММ и снижено число гетерозигот; эти отличия особенно выражены в подгруппах лыжников и пловцов.

4) Обнаружена и зарегистрирована в международной базе данных

"Nucleotide" NCBI новая мутация - динуклеотидная делеция (АС, номер -AY823489, gi56126469) в гене CANP3 у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на Всероссийской с международным участием школе-конференции «Физиология мышц и мышечной деятельности» (2005 г., г. Москва); на Межрегиональной научно-практической конференции «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» (2005 г., Самара); на Международной научной конференции «Актуальные проблемы спорта высших достижений и подготовки спортивного резерва к участию в XXIX Олимпийских играх 2008 г. в г. Пекине (КНР). (2006 г., Беларусь, г. Минск), и др.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 1 в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы (254 источника) и приложений. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 37 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовались биопсийные (полученные у добровольцев) и аутопсийные образцы скелетных мышц, а также миокарда человека. Образцы венозной крови (3-4мл) получали методом венепункции при соблюдении принципа добровольности. ДНК выделялась из крови методом хлороформ-фенольной экстракции.

При проведении исследований генетических полиморфизмов были использованы также ДНК-коллекции спортсменов, лиц, не занимающиеся профессиональным спортом, пациентов с диагнозом «кардиомиопатия» и «миодис-трофия Эрба-Рота», составленные в лаборатории биомедицинских исследований ИНБИ РАН к.б.н. Крахмалевой И.Н. и м.н.с. Столяровой Е.А.

Амплификационную смесь для проведения простой полимеразной цепной реакции составляли по Chamberlain J.S. at all., 1990. Программа амплификации подбиралась с учетом разницы в температурах отжига праймеров. ПЦР-продукты анализировались в пластинах б% ПААГ с последующей окраской этидиумом бромидом.

Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) проводили по Orita М. et all., 1989. Денатурированные ДНК-ампликоны разделяли в пластинах 12% ПААГ. Гели окрашивали методом серебрения.

Для анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов при генотипи-ровании SNP's в генах ACTN3 и MYH7 использовали рестриктазу Ddel (фирма Sigma).

Секвенирование проводили по заказу в Межинститутском центре коллективного пользования «Геном» при Институте молекулярной биологии РАН или в Центре Биоинженерии РАН. Анализ присланных результатов секвенирования осуществлялся с использованием компьютерной программы «Chromas». Данные о соответствующих последовательностях ДНК генов человека брали из банка данных NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih. gov/).

Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-PCR) в модификации метода выщепления 5' концевой метки проводили в приборе фирмы «Ар-plera» (США), модель 7300, используя специальный набор реактивов - SNP Genotyping Assay Mix (каталожный номер С 2914757_1), который содержал специфичные праймеры и ДНК-зонды с конъюгированными флуоресцентными красителями, а также набор TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase-UNG, содержащий все другие необходимые компоненты для реакции амплификации и детекции ее продуктов. Эти наборы были отобраны и заказаны по базе данных www.appliedbiosystems.com.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты электрофоретического фракционирования и идентификации некоторых саркомерныж мышечных • ■ белков. Одномерный электрофорез в 7,5 % ПААГ (рис. 1А) позволил выявить в анализируемых пробах по 2-3 белковых фракции, соответствующие по электрофоретической подвижности белкам с экстремально высокими молекулярными массами (от фракции, обозначенной индексом «А» до фракции «Б»). На основании данных о элкетрофоретической подвижности, а также масс-спектрометрического анализа удалось установить, что фракция «В» представлена тяжелыми цепями миозина, а фракция «С» - мышечными изоформами а-актинина. Вместе с тем, данная методика не позволила уверенно разделять изоформы тяжелых цепей миозина. В этом плане лучшего результата удалось добиться фракционированием мышечных белков в пластинах ПААГ с понижающимся градиентом концентрации (градиент акриламида 8-4% при соотношении акриламид/бисакриламид - 98,57/1,43) (рис. 1В). По результатам масс-спектрометрического анализа было показано, что фракции, обозначенные индексом «А», соответствуют тяжелой ß-цепи сердечного миозина (кодируется геном MYH7), а фракции «В» и «С» - тяжелой цепи миозина IIa и тяжелой цепи миозина lib. Не смотря на гораздо более высокую разрешающую способность в отношении разделения изоформ тяжелых цепей миозина, данная методика также представляется не достаточно эффективной для уверенного выявления межиндивидуальных различий по указанным изоформам и, конечно, с ее помощью принципиально невозможно детектировать структурные изменения белков, вызванные мутациями в кодирующих их генах. Подобные тонкие изменения белков, а также и различные другие проявления полиморфизма можно изучать с помощью двумерного электрофореза по О'Фарреллу [Шишкин

С.С. 2004]. В изученной выборке спортсменов (п=23) удалось обнаружить межиндивидуальную количественную и качественную изменчивость тропомиозиновых белков (рис 1С). Более чем в половине всех исследованных образцов с помощью компьютерной денситометрии регистрировалось соотношение а-тропомиозин/р-тропомиозин £ 1, у 22% - наоборот доминировала р-изоформа, а у 4 человек (~18%) в зоне а-тропомиозина детектировались две близко расположенные фракции. При масс-спектрометрическом анализе было установлено, что фракция, обозначенная ос*, является продуктом экспрессии не гена ТРМ1, а гена ТРМЗ. Несмотря на хорошие результаты, полученные при фракционировании тропомиозиновых белков, нельзя не отметить, что основные модификации двумерного электрофореза по О'Фарреллу не обеспечивают фракционирование высокомолекулярных мышечных белков, что определяет необходимость использования для исследования их полиморфизма различных ДНК-технологий.

»^'fl Ь? - ♦ t i í? Ч! 1 А S * . 1 * „ ч" -«*<■ II 13» KP М Mgj " 'lJffiK» MI Iii 12345 6 78 9 1 ,ь А p мг.м) ; j / "" 100 — ШщЯ * - ^r^S^ iilllSie^eillii 4 > S - ^ **** <•**« ww* + ' - -Мм, 4Mb /аМмк ^ .,..., ^ M& 1 1 » 4 1 4 1 fi » 10 il

JS" j kSSL im ^

1 V 3

Рис 1А.Электрофорез в 7,5% ПААГ. Дорожки: 1-3 - икроножные мышцы; 4-5 желудочки миокарда; 6-8 - длинные мышцы спины; 9- коммерческий препарат маркеров молек. масс.

Рис. 1В. Электрофорез в ПААГ. с понижающейся концентрацией акриламида. Дорожки 1-9 - m. biceps brachii; 10-11 миокард.

Рис 1С . Двумерный электрофорез по О'Фарреллу. Полиморфизм тропомиозиновых белков скелетных мышц человека (m. vastus lateralis). Стрелками показаны идентифицированные с помощью массспектрометрии фракции а-тропомиозина, ß-тропомиозина и а*-тропомиозина.

Изучение полиморфизма R403Q (1208 A-+G) в гене ß- тяжелой цепи миозина (MYH7) у профессиональных спортсменов и больных кардиомиопатией (КМ). В работе Marian AJ., Mares A. et al. (1995) описан

однонуклеотидный полиморфизм 1208 A-»G гена MYH7, выявленный авторами в двух не родственных семьях больных гипретрофической кардиомиопатией. Для анализа полиморфизма 1208 A->G Marian AJ, Mares A. et al. применили метод анализа длин рестрикционных фрагментов. В доступной литературе не удалось найти структуру праймеров, необходимых для амплификации нужного участка гена MYH7. Осуществив поиск потенциальных праймеров с использованием компьютерной программы «Oligo», мы отобрали прямой (5' ctttgctacttgccttttccttc 3') и обратный (5' cctgcccacecattatcatc 3') праймеры, которые оказались вполне пригодными для проведения простой ПЦР. Проанализировав 27 образцов ДНК элитных спортсменов и 23 образца ДНК больных кардиомиопатией нам не удалось обнаружить ни одного носителя аллеля 1208 А.

SSCP- анализ экзанов 9 и 20 гена MYH7, а также экзонов 5 и 6 гена ТРМ1 с интроном между ними у больных КМ и элитных спортсменов. На наличие полиморфизмов в экзоне 20 обследовано 18 человек. У близкого родственника пациентки «К» с КМ обужена гетерозиготность (С/А) в районе данного экзона (рис. 2А( 2В). SSCP анализ экзона 9 проведен для 20 профессиональных спортсменов и 8 больных КМ. Не было выявлено ни каких полиморфных вариантов ни у одного из обследованных спортсменов. У одного больного КМ, возможно, обнаружена однонуклеотидная делеция AG в позиции 832 (экзон 9). SSCP анализ экзонов 5 и б гена ТРМ 1 с интроном между ними у больных КМ (п=24) не выявил полиморфных вариантов в данной области генома.

пациентки «К» с КМ (дорожка 2) и ее здорового отца (дорожка 1).

Рис. 2В. Результаты сиквенирования ампликонов экзона 20 гена МУН7 пациентки с КМ «К» (снизу) и ее отца (сверху). Стрелками показано положение полиморфного нуклеотида - гетерозиготность С/А у здорового отца и гомозиготность (С) у больной дочери.

Рис. 2С. Результаты секвенирования ампликона области зкзона 9 гена МУН7 у больного КМ. В позиции 60 Ы- не идентифицированный нуклеотид.

Разработка модификации рестрикционного анализа полиморфизма 11577Х (Г51815739; 1747 С-»Т) в гене АСТ№. В доступной литературе не удалось найти структуру праймеров, необходимых для амплификации нужного участка гена АСТМЗ. Осуществив поиск потенциальных праймеров с использованием компьютерной программы «ОИдо», мы отобрали два прямых и два обратных праймера (Таблица 1). Все 4 возможные комбинации олигонуклеотидов были опробованы в качестве праймеров для простой ПЦР. Наилучший результат (отсутствие неспецифичных продуктов и высокий выход) был получен для пары праймеров I и IV (рис.ЗВ), которая и использовалась в дальнейшей работе. Особенностью полученных ампликонов является то, что они содержат не один, а два сайта рестрикции для Рс)е1. Таким образом, благодаря присутствию второго (мономорфного сайта) каждый получаемый ампликон при обработке рестриктазой Ойе1 должен подвергнуться рестрикции (что ведет к повышению электрофоретической подвижности относительно контроля) и это автоматически становиться своеобразным внутренним контролем на качество рестрикции в каждой анализируемой пробе.

Таблица 1.

Обозначение Вид праймера (количество нуклеотидов) Последовательность

I Прямой (20) 5' сасЬдсЬдсссЬЬЬсЪд^Ъд 3'

II Прямой (20) 5' сЬдасЪдададсдаддЬдсс 3'

III Обратный (19) 5' ЬЪЪаЪссааЬсссасдЬдд 3'

IV Обратный (19) 5' дсаддЪддсасЪдассаЪа 3'

Е . зв да—- М 13 3(51:891» И 1 2 1 4 4 й Т II У 1и 11 12 15

Рис. ЗА Структура полученного нами ампликона 15 экзона гена АСГОЗ. Серым выделены места посадки прямого (I) и обратного (IV) праймеров, соответственно. Первый и последний нуклеотиды 15 экзона обведены овалами. Жирным шрифтом обозначены сайты рестрикции для йс1е1. Место однонуклеотидного полиморфизма обведено квадратом, стоп кодон подчеркнут.

Рис. ЗБ. Ампликоны экзона 15, полученные с использованием праймеров I и IV.

Рис. ЗС. Рестрикционный анализ полиморфизма Я577Х. Дорожки 1, 13-гомозиготность по аллелю Х577; дорожки 2,3,10,11 - гомозиготность по алле-лю Л577; дорожки 4-7- гетерозиготы; 12- контрольная проба, инкубация в буфере без добавления Ос1е1; М- стандартные маркерные фрагменты ДНК-продукты гидролиза рВЯ322 рестриктазой А1и1.

Распределение гомо- и гетерозигот по 5МР И577Х гена АСТИЗ в группах элитных спортсменов и у лиц, профессионально не занимающихся спортом (контрольная группа). Полученные результаты о встречаемости аллелей БМР 1747С-»Т гена АСТЫЗ и распределении генотипов в изученной выборке этнических русских (контрольная группа,п=65) оказались достаточно близкими к соответствующим данным для европеоидов и составили 577Я - 0,585, 577Х - 0,415.

Рис. 4А. Результаты анализа распределения генотипов по БМР Я577Х (1747 С->Т) в гене АСТЫЗ в обобщенной группе профессиональных спортсменов (группа 1, п=85) и в контрольной группе - этнические русские, не занимающиеся спортом (группа 2, п=б5). Ряд 1 - гомозиготы по аллелю Я577; ряд 2 - гетерозиготы; ряд 3 - гомозиготы по Х577

Рис. 4В. Полиморфизм Я577Х гена ЛСГЛ/3 в группах профессиональных спортсменов: пловцы (группа 1, п=21), лыжники (группа 2, п=1б), гребцы (группа 3, п=35), игроки в водное поло (группа 4, п=1б), и в контроле (лица, не занимающиеся спортом) (группа 5, п=65). Ряд 1 - гомозиготы по аллелю Я577; ряд 2 - гетерозиготы; ряд 3 - гомозиготы по Х577.

При сравнении результатов генотипирования контрольной группы и группы элитных спортсменов (кандидаты в мастера спорта - 38, мастера спорта - 33, мастера спорта международного класса -11 и заслуженные мастера спорта - 3) было обнаружено снижение в полтора раза представленности генотипов XX при сохранении количества генотипов Ю< и соответствующем повышении генотипов в группе элитных спортсменов по сравнению с контролем (рис. 4А), что соответствует данным литературы. Более яркие различия в распределениях генотипов по БМР Я577Х (1747 С->Т) в гене ЛСТЛ/З обнаружились после группировки полученных данных по видам спорта (рис. 4В). В выборке элитных ватерполистов (п=1б) частоты встречаемости альтернативных аллелей 577(1 и 577Х оказались равными 0,5625 и 0,4375, соответственно, то есть фактически не отличались от контрольной группы. Напротив, распределение генотипов в выборке элитных пловцов (п = 21) резко отличалось от контрольной группы. В указанной выборке вообще не оказалось ни одного элитного пловца с генотипом XX. Частоты встречаемости альтернативных аллелей 577Я и 577Х в выборке элитных пловцов оказались равными 0,69 и 0,31, соответственно, и достоверно отличались от аналогичных показателей в контрольной группе (р < 0,05). При определении частот встречаемости альтернативных аллелей 577Я и 577Х в выборке элитных лыжников (п=1б) были получены величины 0,72 и 0,28 соответственно, которые также достоверно отличались от контроля (р < 0,05). При этом половина всех обследованных элитных лыжников имела генотип ЯЯ и только у одного из них оказался генотип XX. Результаты определения частот встречаемости альтернативных аллелей 57711 и 577Х в выборке элитных гребцов (п=35) дали показатели 0,63 и 0,37 соответственно, что достоверно свидетельствует о накоплении в данной выборке аллеля 577Я по сравнению с контролем.

Результаты генотипирования по (Т17556М) в гене ТТЫ у

профессиональных спортсменов в сравнении с контрольной группой (лица, профессионально не занимающиеся спортом). В контрольной группе показано доминирование генотипа ТТ (частоты аллелей - р = 0,76 и я = 0,24). Параллельно с контрольной группой было проведено генотипирование по БМР ге373174б (Т17556М) в представительной выборке профессиональных спортсменов (п=83), среди которых - 28 мастеров спорта; 10 мастеров спорта международного класса; 2 заслуженных мастера спорта и 36 кандидатов в мастера спорта (кроме того, в эту группу вошло также 7 обладателей 1-го разряда). Встречаемость генотипов ММ в данной выборке оказалась почти в два раза выше, чем в контроле (Рис. 5А). Особое внимание привлекло также непропорциональное снижение встречаемости гетерозигот среди спортсменов. Расчет частот аллелей в выборке элитных спортсменов дал показатели несколько отличающиеся от контроля - р = 0,73, д = 0,27, соответственно, но

при этом наблюдавшееся распределение генотипов (ТТ = 54, ТМ = 13 и ММ = 16) существенно отклонялось от ожидаемых показателей при состоянии равновесия Харди-Вайнберга (расчетные величины при п=83: ТТ - 44,2, ТМ -32,7 и ММ - 6,1). Анализ результатов генотипирования спортсменов, сгруппированных по профессиональной ориентации (Рис. З.5.), дополнительно подчеркнул накопление генотипов ММ в подгруппе профессиональных пловцов (п=19) и, особенно, у элитных лыжников (гонки, п=17, только мастера спорта и мастера спорта международного класса). В последней подгруппе встречаемость генотипов ММ почти в три раза превышала контрольный уровень, а встречаемость гетерозигот оказалась в четыре раза меньше чем в контроле. Вместе с тем, необходимо отметить, что в достаточно представительной подгруппе профессиональных гребцов (п = 47) распределение генотипов было сходным сданными, полученными для контрольной выборки.

Рис.5А. Результаты генотипирования БИР (Т17556М) в гене ТТЛ/ у профессиональных спортсменов (п=83) - группа 2 в сравнении с контрольной выборкой (п=44) - группа 1. Частоты встречаемости генотипов ряд 1 - ТТ; ряд 2 - ТМ и ряд 3 - ММ представлены в процентах к размеру выборки.

Рис. 5В. Результаты генотипирования БИР Т17556М гена ТТЫ в подгруппах профессиональных спортсменов в сравнении с контрольной группой, (п=44) -диаграмма 1. Группа 2 - гребцы (п=47). Группа 3 - пловцы (п=19). Группа 4 -элитные лыжники (п=17). Частоты встречаемости генотипов ряд 1 - ТТ; ряд 2 -ТМ и ряд 3 - ММ представлены в процентах к размеру выборки.

Определение динуклеотидной делеции в гене кальпаина 3 (СД№3) в семьях, отягощенных миодистрофией Эрба-Рота. При изучении образцов ДНК из коллекции «Миопатии» в ампликонах экзонов 20-21 гена САЫРЗ у пяти человек были обнаружены необычные проявления гетерозиготности, которая регистрировалась непосредственно при электрофоретическом анализе ампликонов в виде появления двух дополнительных медленно мигрирующих

полос, располагавшихся очень близко друг к другу. Трое из этих лиц являлись близкими родственниками (семья «М» - мать и двое ее детей), а двое других не имели с данной семьей родственных связей. При секвенировании клонированных ампликонов, соответствующих указанным участкам гена CANP3 удалось выявить динуклеотидную делецию (ДАС в экзоне 21), которая по всей видимости описана впервые. По полученным результатам были подготовлены документы для регистрации данной мутации в международной базе данных "Nucleotide" NCBI, где она к настоящему времени зарегистрирована под номером -AY823489, gi56126469.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что определенные модификации методов электрофоретического фракционирования белков из мышечных тканей человека в сочетании с масс-спектрометрической идентификацией позволяют выявлять полиморфизм некоторых саркомерных белков (тяжелые цепи миозина, актинин, тропомиозин) и, в частности, двумерным электрофорезом по О'Фарреллу обнаружены качественные и количественные изменения тропомиозиновых белков в скелетных мышцах.

2. Изучение трех участков гена MYH7 (SNP 1208 A-+G в экзоне 13, а также полиморфизмы в экзонах 9 и 20) и одного участка гена ТРМ1 (экзоны 5 и б с интроном между ними) не выявило гетерозиготности в группах спортсменов, но гетерозиготность в гене MYH7 была обнаружена у некоторых пациентов с кардиомиопатиями.

3. Разработана модификация рестрикционного анализа для выявления одно-нуклеотидного полиморфизма rsl815739 в гене ACTN3, приводящего к образованию стоп-кодона (R577X), которая позволяет параллельно дифференцировать различные генотипы и контролировать качество рестрикции за счет присутствия в получаемом ампликоне и полиморфного, и мономорфного сайтов рестрикции.

4. По результатам сравнительного анализа распределения генотипов и частот аллелей для полиморфизма R577X гена ACTN3 в представительной выборке этнических русских и в группе спортсменов РФ показано, что среди спортсменов в целом увеличено присутствие лиц с генотипом RR и снижено - с генотипом XX; обнаруженные различия оказались наиболее выражены в подгруппах пловцов и лыжников.

5. Охарактеризованы распределение генотипов и частоты встречаемости аллелей для однонуклеотидного полиморфизма rs3731746 в гене TTN, приводящего к аминокислотной замене Т17556М, в выборке этнических русских и в группе спортсменов РФ; показано, что по сравнению с контрольной выборкой среди спортсменов увеличено присутствие лиц с генотипом ММ и снижено число гетерозигот; эти отличия особенно выражены в подгруппах лыжников и пловцов.

6. Обнаружена (зарегистрирована в международной базе данных "Nucleotide" NCBI, номер - AY823489, gi56126469) новая мутация - динуклеотидная делеция (АС) в гене CANP3, присутствующая у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крахмалева И.Н., Столярова Е.Б., Плугов А.Г., Шишкин С.С. Сравнительные исследования SNP's в генах ACTN3 и GHR для профилизации спортсменов. Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок// Сборник статей. Гл. ред. А.И. Григорьев. Из-во ЗАО «Фон». Москва, 2004. - С.66-75.

2. Семин С.Н., Крахмалева И.Н., Виноградова О.Л., Нетреба А.И., Столярова Е.Б., Плугов А.Г., Шаховская Н.И., Шишкин С.С. Синдром, внезапной смерти и элитный спорт// Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок. Сборник статей. Гл. ред. А.И. Григорьев. Из-во ЗАО «Фон». Москва, 2004. - С.81-88

3. Шишкин С.С., Крахмалева И.Н., Столярова Е.Б., Плугов А.Г., Князев А.И., Хотченков В.П. Молекулярно-генетические подходы к профилизации спортсменов// Синдром внезапной смерти и элитный спорт. Матер. Всеросс. с межд. участием школы-конф. «Физиология мышц и мышечной деятельности» (1-4 фев. 2005 г. Москва). Из-во ООО «Телер». Москва, 2005. - С.100.

4. Крахмалева И.Н., Шишкин С.С,, Шаховская Н.И., Столярова Е.Б., Плугов А.Г., Князев А.И., Хоменков В.Г., Шевелев А.Б., Чернов H.H. ДНК-технологии, выявляющие SNP's, в решении некоторых вопросов прикладной биохимии// Приклад, биохимия и микробиол. - 2005. - т.41. - №3. - С.303-307.

5. Шишкин С.С., Крахмалева И.Н., Шаховская Н.И., Столярова Е.Б., Плугов А.Г., Князев А.И. ДНК-диагностика миодистрофии Эрба-Рота (LGMD2A) в России и некоторые проблемы анализа SNP's в генах мышечных белков// Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике, (сб. статей). Новосибирск. Из-во «Альфа-Виста» 2005. - вып. 8. - С.98-107.

6. Шишкин С.С., Плугов А.Г., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Крахмалева И.Н., Столярова Е.Б. Некоторые тенденции в развитии протеомики, а также других постгеномных технологий и опыт преподавания клинической биохимии в РУДН // Матер. Межрегион, научно-практ. Конф. «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» (сб. статей) Из-во ООО «Содружество Плюс». Самара, 2005. - С.472-474,

7. Плугов А.Г., Крахмалева И.Н., Чернов H.H., Шишкин С.С. Особенности распределения полиморфизма гена ACTN3 (R577X) в группах элитных спортсменов и у лиц, не занимающихся спортом// Материалы VI Международ-

ной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», 8-10 Декабря 2005г., Москва. - С. 385 - 386.

8. Плугов А.Г., Крахмалева И.Н., Князев А.И., Столярова Е.Б., Шишкин С.С. Изучение SNP's в шести генах мышечных белков и проблема профилизации спортсменов// Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок. Сборник статей. Гл. ред. А.И. Григорьев. Из-во ООО «Анита Пресс». Москва. - 2006. -С.63-80

9. Шишкин С.С., Плугов А.Г., Крахмалева И.Н., Столярова Е.Б. Изучение полиморфизмов некоторых мышечных белков и проблема профилизации спортсменов// Материалы Межд. научн. конф. «Актуальные проблемы спорта высших достижений и подготовки спортивного резерва к участию в XXIX Олимпийских играх 2008 г. в г. Пекине (КНР). (Беларусь, г. Минск, 1-2.06.06) 2006 г. Из-во Белорусского Гос. Ун-та физ. Культуры. - 2006. - С.221-226.

10. Чернов H.H., Плугов А.Г., Шишкин С.С. Компьютерные технологии в исследованиях ассоциаций ДНК- полиморфизмов с высокой мышечной работоспособностью на примере однонуклеотидного полиморфизма (1747 С-»Т) в гене ACTN3// Научно-практический журнал ОТКРЫТОЕ ОБРАЗОВАНИЕ. - 2006. - №3. - С. 36-38

Плугов Александр Геннадиевич (Россия) "Изучение полиморфизмов некоторых саркомерных белков человека и их значения для функционирования мышечных тканей"

С помощью биохимических и молекулярно-генетических методов изучены полиморфизмы пяти саркомерных мышечных белков человека. Обнаружены межиндивидуальные количественные и качественные изменения тропомиозиновых белков в скелетных мышцах человека. Разработана оригинальная модификация рестрикционного анализа для полиморфизма R577X в гене ACTN3, которая обеспечивает параллельно с генотипипированием контроль над качеством рестрикции. По результатам сравнительного анализа распределения генотипов и частот аллелей для полиморфизма R577X гена ACTN3 в выборке этнических русских и в группе спортсменов показана, что среди спортсменов в целом увеличено присутствие лиц с генотипом RR и снижено - с генотипом XX. Обнаруженные различия оказались наиболее выражены в подгруппах пловцов и лыжников. В гене MYH7 обнаружена гетерозиготность у некоторых пациентов с кардиомиопатиями. Впервые в представительных выборках этнических русских и спортсменов РФ получены данные о распределении генотипов и частотах аллелей для полиморфизма rs3731746 в гене TTN, приводящего к аминокислотной замене Т17556М. Обнаружена новая мутация динуклеотидная АС делеция в гене CANP3 (номер AY8234S9, gi56126469) у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

Alexander G. Plugov (Russia). "The study of polymorphisms in some human sarcomere proteins and their significance for muscle tissue functioning" By use some methods of biochemistry and molecular genetics are studied polymorphisms of five sarcomere proteins. Interindividual quantitative and qualitative changes of tropomyosins in human skeletal muscles are found. Original modification of the restrictional analysis for the detection of polymorphism R577X rsl815739 in gene ACTN3 which provides in parallel with genotyping the control for the quality of the restriction is developed. Results of genotyping on polymorphism R577X revealed in group of athletes the increasing of quantity of persons with RR genotype and the decreasing of quantity of persons with XX genotype. The found out distinctions appeared are most expressed in subgroups of swimmers and skiers. In MYH7 gene heterozygosity has appeared at some patients with cardiomyopathy. For the first time in representative sample of ethnic Russian and in group of athletes of the Russian Federation data about distribution of genotypes and allele frequencies for SNP rs3731746 in gene TTN, leading to replacement T17556M are obtained. A new dinudeotide deletion (AC) at the beginning of exon 21 was identified in five individuals with heterozygous CANP3 gene (number in the international database "Nucleotide" NCBI - AY823489, gi56126469).

Подписано в печать Формат 60x90/16 Объем 1,00 п л. Тираж 100 экз. Заказ № 10110625

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912Y772801001

Адрес: 117292, г. Москва, ул. Дмитрия Ульянова, д. 8, кор. 2. Тел. 740-76-47,125-22-73. http, //www iiniverprmt ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Плугов, Александр Геннадиевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Основные белки, участвующие в обеспечении мышечного сокращения, и влияние полиморфизмов в генах этих белков на особенности функционирования мышечных тканей (обзор литературы).

1.1. Саркомерная организация мышечных волокон и основные сарко-мерные белки, участвующие в обеспечении мышечного сокращения.

1.2. Полиморфизмы некоторых саркомерных белков (генный полиморфизм, альтернативный сплайсинг, постсинтетические модификации и др.).

1.3. Биомедицинские аспекты исследований полиморфизмов саркомерных белков. '

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Реактивы, биологические материалы и медицинская документация.

2.1.1.Реактивы.

2.1.2. Биологические материалы.

2.1.3. Медицинская документация.

2.2. Методы электрофоретического фракционирования и анализа мышечных белков.

2.2.1. Приготовление препаратов мышечных белков из образцов мышечной ткани.

2.2.2. Модификации ПААГ-'электрофореза, использованные для разделения мышечных белков.

2.2.3. Методы детекции и анализа электрофоретических белковых фракций.

2.2.4. Подготовка белковых образцов для масс-спектрометрии и проведение анализа триптических пептидов.

2.3. Методы получения препаратов ДНК и формирования ДНК-коллекций.

2.4. Методы исследования ДНК-полиморфизмов.

2.4.1. Простая ПЦР и рестрикционный анализ.

2.4.2. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP). •

2.4.3. Подготовка ампликонов для ДНК-секвенирования и проведение анализа нуклеотидных последовательностей.

2.4.4. Метод дискриминации аллелей с помощью ПЦР в реальном времени (RT-PCR).

2.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. Полученные результаты и их обсуждение.

3.1. Электрофоретическое<фракционирование и анализ, полиморфизма некоторых саркомерных белков.

3.2. Общие характеристики использованных ДНК-коллекций и аннотаций на содержащихся в них препаратах (лица, составлявшие контрольные группы и спортсмены).

3.3. Изучение полиморфизмов в гене р тяжелой цепи миозина (MYH7) и в'гене а-тропомиозина (ТРМ1) у здоровых доноров, не занимающихся спортом, у спортсменов и пациентов с кардиомиопатиями. ®®

3.4. Изучение полиморфизма R577X (rsl815739; 1747 С->Т) в гене ACTN3.

3.4.1. Разработка модификации рестрикционного анализа полиморфизма R577X в гене ACTN3,

3.4.2. Результаты изучения полиморфизма R577X в гене ACTN3 в группе этнических русских.

3.4.3. Результаты изучения полиморфизма R577X в гене ACTN3 в группах пловцов и других спортсменов, занимающихся иными видами спорта.

3.5. Изучение полиморфизма Т17556М (rs3731746) в гене тайтина у здоровых доноров, не занимающихся спортом, у пловцов и других спортсменов, занимающихся иными видами спорта.

3.6. Определение динуклеотидной делеции в гене кальпаина 3 (CANP3) в семьях, отягощенных миодистрофией Эрба-Рота. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 99 ВЫВОДЫ. 104 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. 105 ПРИЛОЖЕНИЯ. 125 БЛАГОДАРНОСТИ.

ACTN3 kb

MALDI-MS

MYH7 NCBI

PBS Pi

RT-PCR

ОМИМ (OMIM)

ТЕМЕД

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ ген а-актинина килобаза - тысяча нуклеотидных оснований в нуклеиновых кислотах масс-спектрометрия пептидов на основе использования лазер ной десорбции (matrix-assisted iaser-desorption ionization -mass spectrometry) ген р-тяжелой цепи миозина национальный центр биотехнологической информации в США (National Centre for Biotechnology Information)

-фосфатн151Й буфер изоэлектрическая точка полимеразная цепная реакция в реальном времени додецилсульфат натрия однонуклеотидный полиморфизм одноцепочечный конформационный полиморфизм трис {гидроксиметил} аминометан ген тайтина аминокислотные остатки в белках белковый (ые) продукт (ы) генной экспрессии бычий сывороточный альбумин гипертрофическая кардиомиопатия дилатационн,ые кардиомиопатии дезоксирибонуклеиновая кислота килодальтон легкая цепь миозина метиленбисакриламид относительная молекулярная масса матричная (информационная) рибонуклеиновая кислота нуклеотидные пары в нуклеиновых кислотах наследственные нервно-мышечные болезни компью терная база данных (OMIM - On line Mendelian Inheritance of Man) о менделирующих признаках человека (БПГЭ и наследственные болезни), входящая в банк данных NCBI полиакриламидный гель персульфат аммония полимеразная цепная реакция рибонуклеиновая кислота синдром внезапной смерти

М,М,1У,М'-тетраметилэтилендиамин тяжелая цепь миозина ген тропомиозина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение полиморфизмов некоторых саркомерных белков человека и их значения для функционирования мышечных тканей"

Актуальность темы.

В современной биохимии человека важное место занимают исследования целого комплекса проблем, которые обусловлены существованием выраженного белкового полиморфизма [16; 19; 187; 24; 75]. В частности, многими авторами показано, что изучение белкового полиморфизма необходимо для выяснения молекулярных основ вариабельности в функционировании различных систем организма, как в норме, так и при патологии [40; 207; 75]. При этом установлено, что белковый полиморфизм является следствием различных причин, в частности, полилокусностью, полиаллелизмом, альтернативным сплайсингом, постсинтетическими модификациями и другими [51; 40; 41; 187; 44].

С завершением в 2001 »г. международного проекта "Геном человека" [106; 232] исследования белкового полиморфизма вышли на принципиально новый уровень. Характерной чертой этих исследований стало сочетанное использование традиционных биохимических методов и ряда методологических разработок, созданных в рамках новых, так называемых геномных и постгеномных научных дисциплин (геномика, протеомика, биоинформатика и др.) [245; 39; 1, 24J. Как результат, важное место в изучении белкового полиморфизма стали занимать протеомные технологии, включающие методы масс-спектрометрии, а также модификации полимеразной цепной реакции в реальном времени и дру-гие[57; 220; 189; 238].

К настоящему времени проведено значительное число исследований свидетельствующих о том, что биохимический полиморфизм весьма характерен для мышечных белков самых разных организмов, в частности, для мышечных бел ков человека [36; 207; 187; 44]. Особый интерес при этом, естественно, обращен на саркомерные белки, поскольку они непосредственно обеспечивают мышечное сокращение и, следовательно, их полиморфизм должен оказывать существенное влияние на состояние и функционирование отдельных мышц и даже всей мышечной системы в целом.

Активные исследования полиморфизма саркомерных белков ведутся уже более 20 лет и, по-видимому, внимание к данному разделу биохимии мышц не снижается, а, напротив, в нем постепенно формируются все новые подразделы и направления [51; 41; 207; 187; 44; 97]. Одним из таких относительно новых и весьма актуальных направлений стали исследования однонуклеотидных полиморфизмов (SNP's) в генах различных саркомерных белков, которые уже привели к получению принципиально важной информации о природе некоторых мышечных заболеваний [42; 203; 23; 10]. Важно отметить, что результаты подобных разработок достаточно быстро находят практическое применение, в частности в диагностике различных наследственных болезней [42; 203; 10].

Кроме того, значительное внимание привлекают недавно появившиеся сообщения о том, что определенные SNP's в генах некоторых саркомерных белков могут быть ассоциированы с определенными позитивными свойствами мышечной системы человека, в частности с высокой мышечной работоспособностью [247; 198; 171]. Эти находки представляются принципиально важными в контексте активно развивающихся исследований ассоциаций определенных аллелей различных SNP's в генах человека с определенными позитивными признаками (для обобщенного обозначения которых в англоязычной литературе используется термин "physical performance") [184; 247; 188; 246]. Несколько групп исследователей из США, Канады, Германии, Финляндии и ряда других западных стран фактически создали международный консорциум, который занят отслеживанием всех публикаций по данной проблематике, их анализом и созданием особой генетической карты, показывающей локализацию соответствующих генов [188; 246]. В 2005 г. эта карта уже включала сведения о 140 генах, расположенных на аутосомах, о 4 генах - на X хромосоме и о 16 мито-хондриальных генах [246]. Соответственно и, исходя из целей, связанных с обеспечением "physical performance", важное значение приобретают исследования SNP's в генах, которые кодируют белки, непосредственно вовлеченные в функционирование скелетной мускулатуры.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение биохимического полиморфизма некоторых тканеспецифичных мышечных белков человека, представляющих осЯовные структурные компоненты саркомера (толстые и тонкие нити, Z-диски, а также тайтиновые нити), и ассоциаций отдельных полиморфных вариантов с особенностями функционирования мышечных тканей в норме и при отдельных формах мышечной патологии.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

1). Провести сравнительное изучение белковых паттернов поперечнополосатых мышц человека с использованием различных электрофоретических и про-теомных методов.

2). С помощью последовательного проведения ПЦР, а затем SSCP-исследования или рестрикционного анализа и секвенирования охарактеризовать ДНК-полиморфизм в нескольких участках генах MYH7 и гена ТРМ1 у спортсменов, а также пациентов с кардиомиопатиями и их ближайших родственников.

3).1Провести сравнительное изучение распределения генотипов и частот аллелей для полиморфизма R577X гена ACTN3 в представительной выборке этнических русских и в группе профессиональных спортсменов.

4). Охарактеризовать распределение генотипов и частот аллелей для однонук-леотидного полиморфизма rs3731746 в гене TTN в представительной выборке этнических русских и в группе профессиональных спортсменов РФ

5). Исследовать полиморфизм в гене CANP3 у некоторых пациентов с миодист-рофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

Научная новизна работы.

Получены новые данные о биохимическом и генетическом полиморфизме пяти тканеспецифичных мышечных белков человека - тяжелая р-цепь миозина, а-тропомиозин, а-актинин-3, тайтин и кальпаин 3, которые представляют основные структурные компоненты саркомера - толстые и тонкие нити, Z-диски, а также тайтиновые нити, соответственно. В частности, обнаружены межиндивидуальные количественные и качественные изменения тропомиозиновых белков в скелетных мышцах человека. Кроме того, при изучении с помощью ПРЦ и последующего SSCP и/или рестрикционого анализа не было выявлено гетеро-зиготности в группах спортсменов, но гетерозиготность в гене MYH7 казалась у некоторых пациентов с кардиомиопатиями, что подтвердило прямое секвениро-вание соответствующих участков.

Впервые в представительной выборке этнических русских и в группе профессиональных спортсменов РФ получены данные о распределении генотипов и частотах аллелей для однонуклеотидного полиморфизма rs3731746 в гене 777V, приводящего к аминокислотной замене Т17556М.

Обнаружена и зарегистрирована в международной базе данных "Nucleotide" NCBI новая мутация - динуклеотидная АС делеция (номер - AY823489, gi56126469) в гене CANP3 у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

Научно-практическая значимость.

В развитии молекулярно-генетических исследований, имеющих целью про-филизацию спортсменов, может найти применений разработанная оригинальная модификация рестрикционного анализа для однонуклеотидного полиморфизма rsl815739 в гене ACTN3, которая (благодаря присутствию в получаемом ампликоне полиморфного и мономорфного сайтов рестрикции) обеспечивает параллельно с генотипипированием контроль за качеством рестрикции. С помощью этого модифицированного метода показано, что среди обследованных элитных спортсменов в целом увеличено присутствие лиц с генотипом RR и снижено - с генотипом XX1, причем различия оказались наиболее выражены в подгруппах пловцов и лыжников. Результаты такого генотипирования нашли практическое применение при предварительном отборе молодых спортсменов для профессиональной специализации по плаванью в СДЮШ Олимпийского резерва СКА (г. Санкт-Петербург), что зарегистрировано соответствующим свидетельством о внедрении.

Получены данные о распределении генотипов и частот аллелей для однот нуклеотидного полиморфизма rs3731746 (Т17556М) в гене 777V, которые свидетельствуют о том, что в группе профессиональных спортсменов повышено присутствие лиц с генотипом ММ и снижено число гетерозигот (особенно в подгруппах лыжников и пловцов), позволяют рекомендовать проведение соответствующего генотипирования для профилизации молодых спортсменов.

При изучении полиморфизмов в четырех участках генов MYH7 (экзоны 13 (или 14, по другой классификации), 9 и 20) и ТРМ1 (экзоны 5 и б с интроном между ними) получены данные, которые свидетельствуют, что для обеспечения целенаправленных поисков мутаций в соответствующих генах необходим специальный отбор лиц с потенциально высоким риском «синдрома внезапной смерти», например при диспансеризации спортсменов.

Результаты исследований полиморфизма в гене CANP3 и обнаружение ди-нуклеотидной делеции (АС) у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников представляют определенное значение для улучшения ДНК-диагностики при данной форме миодистрофии.

Основные положения, выносимые на защиту.

Проведены исследования биохимического полиморфизма пяти тканеспецифичных мышечных белков человека - тяжелая р-цепь миозина, а-тропомиозин, а-актинин-3, тайтин и кальпаин 3, которые представляют основные структурные компоненты саркомера - толстые и тонкие нити, Z-диски, а также тайтино-вые нити, соответственно.

Выявлены различия в распределении генотипов и частот аллелей для полиморфизма R577X гена ACTN3 в представительной выборке этнических русских и в группе профессиональных спортсменов РФ и показано, что среди профессиональных спортсменов в целом увеличено присутствие лиц с генотипом RR при снижении - с генотипом XX; обнаруженные различия оказались наиболее выражены в подгруппах пловцов и лыжников, что позволяет рекомендовать учитывать результаты генотипирования по данному полиморфизму при определении специализации молодых спортсменов.

По результатам изучения распределения генотипов и частот аллелей для однонуклеотидного полиморфизма rs3731746 в гене 777V показано, что по сравнению с контрольной выборкой (не занимающиеся спортом) среди профессиональных спортсменов увеличено присутствие лиц с генотипом ММ и снижено число гетерозигот; эти отличия особенно выражены в подгруппах лыжников и пловцов.

Обнаружена и зарегистрирована в международной базе данных "Nucleotide" NCBI новая мутация - динуклеотидная делеция (АС, номер - AY823489, gi56126469) в гене CANP3 у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на международных и отечественных научных и научно-практических конференциях, семинарах и школах, в том числе, на Всероссийской с международным участием школе-конференции «Физиология мышц и мышечной деятельности» (2005 г., г. Москва); на Межрегиональной научно-практической конференции «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» (2005 г., г. Самара); на Международной научной конференции «Актуальные проблемы спорта высших достижений и подготовки спортивного резерва к участию в XXIX Олимпийских играх 2008 г. в г. Пекине (КНР). (2006 г., Беларусь, г. Минск), а также на заседаниях Московского областного общества детских невропатологов, Ученого совета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и т.д.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 работ в отечественной и зарубежной печати, включая 2 статьи в профильных рецензируемых журналах и б статей в различных научных сборниках.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Плугов, Александр Геннадиевич

выводы

1. Показано, что определенные модификации методов электрофоретическо-го фракционирования белков из мышечных тканей человека в сочетании с масс-спектрометрической идентификацией позволяют выявлять полиморфизм некоторых саркомерных белков (тяжелые цепи миозина, актинин, тропомиозин) и, в частности, двумерным электрофорезом по О'Фарреллу обнаружены качественные и количественные изменения тропомиозиновых белков в скелетных мышцах.

2. Изучение трех участков гена MYH7 (SNP 1208 A-»G в экзоне 13, а также полиморфизмы в экзонах 9 и 20) и одного участка гена ТРМ1 (экзоны 5 и б с интроном между ними) не выявило гетерозиготности в группах спортсменов, но гетерозиготность в гене MYH7 была обнаружена у некоторых пациентов с кар-диомиопатиями.

5. Охарактеризованы распределение генотипов и частоты встречаемости аллелей для однонуклеотидного полиморфизма rs3731746 в гене ТТЛ/, приводящего к аминокислотной замене Т17556М, в выборке этнических русских и в группе спортсменов РФ; показано, что по сравнению с контрольной выборкой среди спортсменов увеличено присутствие лиц с генотипом ММ и снижено число гетерозигот; эти отличия особенно выражены в подгруппах лыжников и пловцов.

6. Обнаружена (зарегистрирована в международной базе данных "Nucleotide" NCBI, номер - AY823489, gi56126469) новая мутация - динуклео-тидная делеция (АС) в гене CANP3, присутствующая у некоторых пациентов с миодистрофией Эрба-Рота и их ближайших родственников.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время многочисленные работы, связанные с изучением различных белковых полиморфизмов, фактически сформировали особое и важное направление исследований в современной биохимии, которое охватывает несколько научных проблем, располагающихся на стыке с генетикой и молекулярной биологией [174, 96, 144, 167, 246].

С одной стороны, очевидно, что расширение и детализация представлений о полиморфизме белков, обеспечивающих клеточную подвижность (в частности, мышечное сокращение), вносят существенный вклад в фундаментальную науку и, соответственно, приобретают общебиологическое значение [44, 96]. С другой стороны, изучение белковых полиморфизмов важно для решения целого ряда прикладных задач, относящихся, например, к молекулярной медицине (особенно, для молекулярной диагностики), к фармакогенетике [162], к предикативной медицине [4], спортивной медицине и др.

Использование различных электрофоретических методов на протяжении нескольких десятилетий остается традиционным подходом к изучению полиморфизма мышечных белков высших позвоночных, включая человека [120,26]. В результате были получены убедительные данные о том, что, в частности сарко-мерные белки человека, представлены целыми наборами изоформ. При этом, по-видимому, наиболее подробно охарактеризованными оказались изоформы тяжелых цепей миозина, которые рассматривают, как своеобразное белковое семейство [44].

Вместе с тем, оказалось, что возможности электрофоретического анализа существенно ограничивают особенности строения наиболее крупных саркомерных белков - изоформ тяжелых цепей миозина, тайтина и других, для которых характерны экстремально высокие молекулярные массы, наличие протяженных фибриллярных участков и повторяющихся аминокислотных последовательностей, а также способность к образованию различных надмолекулярных комплексов [142]. В рамках проведенных исследований хорошо воспроизводимое разделение изоформ тяжелых цепей миозина удалось получить только при фракционировании мышечных белков электрофорезом в пластинах ПААГ с понижающимся градиентом концентрации, при изготовлении которых создавали градиент акриламида 8-4% (соотношением акриламид/бисакриламид -98,57/1,43).

Существенно более широкие возможности для изучения белковых полиморфизмов возникли с развитием технологий, позволяющих системно проводить поиск и изучение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP's) в генах, которые кодируют соответствующие белки. При этом особо следует отметить, что значительным стимулом для исследований различных полиморфизмов стали результаты, завершившегося в 2001 году международного проекта «Геном человека» [106,232].

Уже на протяжении нескольких десятилетий многие исследователи проявляют значительный интерес к изучению белкового полиморфизма, который обусловлен определенными изменениями в нуклеотидной последовательности генов, и ассоциациями между различными генотипами по данному полиморфизму с особенностями формирования фенотипов. Поскольку к настоящему времени установлено, что однонуклеотидные полиморфизмы в геноме человека встречаются с достаточно высокой частотой (частота их встречаемости приблизительно оценивается как один на 500-1000 пар нуклеотидов), изучение SNP's рассматривается как одна из наиболее актуальных задач постгеномного периода [147]. По мнению разных авторов, благодаря высокой частоте встречаемости SNP's в геноме, существует принципиальная вероятность выявления определенных полиморфизмов, которые будут служить хорошими маркерами для определения генотипов, связанных а) с развитием разнообразных заболеваний [147]; б) с различной реакцией на прием лекарственных препаратов [162]; в) с высокими физическими данными [246] и др.

Значимость проблем и экспоненциальный рост объема информации, касающейся однонуклеотидных полиморфизмов, нашли отражение в том, что Национальный Центр Биотехнологической Информации США (NCBI) в сотрудничестве с Национальным Институтом Исследований Генома Человека США (NHGRI) сформировали и поддерживают с 1998 г. специальную базу данных (dbSNP; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) [211].

Наряду со сведениями об истинных однонуклеотидных полиморфизмах, обусловленных заменами, делециями или вставками одного единственного нуклео-тида, в dbSNP содержится также информация, которая касается и других генетических вариаций (короткие вставки и делеции, микросателлитные маркеры, ретротранспазоны). Эти полиморфизмы, несмотря на неточность термина, создателями базы данных также предложено называть SNP [211].

В целом, к настоящему времени в геноме человека уже обнаружено просто огромное количество SNP's, и, как следствие, в базе данных NCBI число соответствующих прямых ссылок достигло 12 702 095. Однако большая часть SNP's, выявленных в геноме человека, естественно, располагается в некодирующих участках, и только сравнительно немногие SNP's локализуются в экзонах, обеспечивая изменения закодированной информации. Вместе с тем, именно такие SNP/s привлекают особый интерес при исследованиях проблем биохимического полиморфизма белков.

Соответственно, в данной работе один из основных разделов исследований был посвящен SNP rsl815739 (1747 С->Т) в гене ACTN3. Известно, что этот полиморфизм приводит к замене 577 кодона, определяющего включение в аминокислотную последовательность аргинина, на стоп-кодон (R577X) и, как следствие, у лиц с генотипом XX в скелетных мышцах отсутствует продукт гена ACTN3 - а-актинин 3, который является важным структурным компонентом Z-линий саркомера. Эти лица остаются клинически здоровыми, так как по имеющимся данным у них функцию а-актинин 3 выполняет другая изоформа мышечного и-актинина - а-актинин 2 [247].

По-видимому, а-актинин 3 оказался первым структурным саркомерным мышечным белком, для которого в 2003 г. была продемонстрирована связь со способностями к занятием профессиональным спортом [247]. В 2004-2006 гг. после этой пионерской публикации в зарубежной и отечественной прессе появилось еще несколько статей, которые были посвящены исследованиям ассоциаций полиморфизма R577X с особенностями функционирования мышечной системы [341; 218; 340; 342]. В указанный период независимо были опубликованы и статьи, содержащие материалы данной диссертации, Практически всем авторам удалось зарегистрировать ту или иную связь полиморфизма R577X в гене ACTN3 со способностью эффективно заниматься определенными видами спорта. Так, из результатов данной работы следует, что по всей вероятности среди профессиональных пловцов остается крайне мало или полностью отсутствуют лица, гомозиготные по стоп кодону. Этот вывод вполне соответствует материалам, опубликованным и некоторыми другими авторами [21,2]. Суммарно заключение о том, что для аллеля 577R имеется положительная корреляция с высокими спортивными достижениями в плавании, а носители генотипа XX при профессиональных занятиях плаваньем, очевидно, подвергаются своеобразному отбору, позволило рекомендовать соответствующее обследование к использованию для профилизации молодых пловцов. В итоге результаты генотипирования по полиморфизму R577X были внедрены в работу тренерской организации СДЮШ олимпийского резерва ЦСК для профилизации молодых спортсменов-пловцов, и это подчеркивает перспективность подобных исследований для решения практических задач спортивной подготовки.

Важно отметить также, что в обследованных группах лиц, профессионально занимающихся другими видами спорта, оказались существенно иные частоты распределения генотипов по полиморфизму R577X. В частности, выраженные отличия от контрольной группы были выявлены в группе лыжников: половина всех обследованных элитных лыжников имела генотип RR и только у одного из них - обнаружился генотип XX. Вместе с тем, соответствующие показатели в группе ватерполистов фактически совпали с контролем. Эти данные можно рассматривать как свидетельство определенной специфичности ассоциации полиморфизма R577X с особенностями спортивной деятельности.

Еще один важный раздел данной работы составили исследования SNP rs3731746 в гене тайтина, который приводит к аминокислотной замене Т17556М в первичной структуре этого важного структурного саркомерного белка. В результате, по-видимому, впервые удалось охарактеризовать распределение генотипов и частот встречаемости аллелей этого SNP в выборке этнических русских (п=44) и в нескольких группах спортсменов. При этом было показано, что в группе профессиональных гребцов (п=47) распределение генотипов не отличалось от контрольной группы. В тоже время в группе профессиональных пловцов и, особенно, в группе элитных лыжников выявилось значительное увеличение доли гомозигот по генотипу ММ и уменьшение доли гете-розигот по сравнению с контрольной группой. Таким образом, изучение SNP rs3731746 (Т17556М) гена TTN в выборке профессиональных спортсменов показало накопление генотипов ММ при резком уменьшении числа гетерозиготных генотипов в некоторых подгруппах - у пловцов и у лыжников, что делает, по-видимому, целесообразным использование этого теста при молекулярно-генетической профилизации спортсменов для указанных специализаций, но не у гребцов.

С проблемой профилизации молодых спортсменов тесно связана проблема так называемой внезапной смерти. В 490 году до нашей эры известный молодой атлет Фидиппид совершил забег от Марафона до Афин с целью поскорее известить греков о великой победе над врагом. Прибежав на рыночную площадь Афин он успел сообщить о поражении неприятеля и упал замертво. Символично, что первый забег на марафонскую дистанцию закончился возможно одним из первых зафиксированных случаев так называемой внезапной смерти спортсменов. Внезапная смерть до сих пор находится в центре внимания врачей, причем интерес к данной проблеме не ослабевает, а все более усиливается [72]. Известно, что современные условия большого спорта требуют от атлетов, нацеленных на достижение наивысших результатов, полной самоотдачи как на соревнованиях, так и во время тренировочного процесса. Длительные экстремальные нагрузки на мышечную и сердечно-сосудистую системы в сочетании с высоким эмоциональным напряжением, достигающим порой запредельных уровней при борьбе за высокие звания, рекорды или денежные призы фактически являются атрибутами спорта наивысших достижений. В итоге в последнее время все чаще регистрируются случаи так называемой внезапной смерти спортсменов во время тренировок и на соревнованиях.

Сравнив выборку молодых атлетов с выборкой молодых людей, не занимающихся спортом, группа итальянских исследователей показала, что физическая активность в условиях спортивной конкуренции увеличивает риск возникновения внезапной смерти внезапной у людей в возрасте от 12 до 35 лет в 2,5 раза [по 72]. Этими авторами также было показано, что атлеты, перенесшие внезапную смерть, имели различные сердечно-сосудистые заболевания, носившие до момента смерти бессимптомный характер. Таким образом, сама по себе физическая активность не являлась у данных спортсменов причиной внезапной смерти. Скорее она исполняла роль своеобразного пускового механизма, приведшего к остановке сердца [по 72]. Установлено, что около 80 % случаев внезапной смерти, не связанных с травмами, имеют в своей основе различные врожденные сердечно-сосудистые заболевания. При этом от 40 до 50% всех случаев внезапной смерти связаны с гипертрофической кардиомиопатией [84].

Одним из наиболее часто затрагиваемых генов, вовлеченных в развитие семейной гипертрофической кардиомиопатии, является ген тяжелой цепи миозина - MYH7 [183]. Соответственно, исследования полиморфизмов в указанном гене стали еще одним разделом данной работы. Проведенный анализ трех участков гена MYH7 (экзоны 13, 9, 20) не выявил полиморфных участков ни у одного из обследованных профессиональных спортсменов. Однако в экзонах 9 и 20 у больных кардиомиопатиями и их ближайших родственников были найдены полиморфизмы, информация о которых, возможно, будет полезна для молекулярной диагностики и для определения среди спортсменов групп риска с повышенной вероятностью наступления внезапной смерти.

Таким образом, к настоящему времени наблюдается явная интенсификация исследований SNP's, которые ассоциированы с определенными физиологическими состояниями организма, в частности со способностью эффективно выполнять различные физические нагрузки. Отражением указанной тенденции стало появление своеобразного международного консорциума, который занялся отслеживанием и анализом публикаций, посвященных соответствующим SNP's. Одним из результатов его деятельности стало создание особой карты, показывающей локализацию выявленных генов, полиморфизмы которых определяют особые качества мышечной системы (human gene map for performance and health-related fitness phenotypes). Если в ранней версии 2000 года созданная карта содержала информацию всего о 29 генных локусах, то уже к 2004 году в нее была внесена информация уже о 140 аутосомных генах, 4 генах X хромосомы и 19 митохондриальных генах [246].

В заключение нельзя не отметить, что развернувшиеся масштабные исследования корреляций различных ДНК- полиморфизмов со спортивными достижениями, а также установление взаимного влияния различных ДНК-полиморфизмов в самом ближайшем будущем, вполне вероятно, смогут привести к установлению оптимального набора полиморфизмов, отвечающих генотипу «идеального» спортсмена в каком-либо виде спорта. Соответственно, знание начинающими спортсменами и тренерами генотипов, определяющих формирование тех или иных физиологических особенностей мышечной системы, позволит им более взвешенно принимать решение о том, какой вид спорта целесообразнее выбрать для профессиональной деятельности, чтобы прийти к высоким достижениям. В результате, данные фундаментальных исследований позволят решить практически важные задачи и обеспечат значительный экономический эффект.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плугов, Александр Геннадиевич, Москва

1. Арчаков А.И Что после геномики? Протеомика. // Вопр. Мед. химии. 2000. т.46(4). С.335-343.

2. Бадалян Л.О. Детская неврология. Из-во "Медицина", М., 1984, 571с.

3. Баранов B.C., Иващенко Т.Э., Баранова Е.В. Геномика и фармакогенетика в профилактике и лечении некоторых распространенных заболеваний у детей. // Вопросы современной педиатрии. 2004, т.З, N 6. С.57-61.

4. Белки и пептиды. Том 1. Под редакцией акад. В.Т. Иванова и проф. В.М. Липкина // М.: Наука, 1995. - 448 с.

5. Белозеров Ю.М. Никанорова Ю.М., Страхова О.С. Сердце при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера. // Из-во АО «Астра семь» М. 1999. 246с.

6. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А., Козловская И.Б. Новые изоформы тайти-на в скелетных мышцах млекопитающих. // Докл. Акад. Наук. 2004. Т.395. С.828-831.

7. Гланц С. Медико-биологическая статистика. // М. Практика. 1999. 459 с.

8. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. // Санкт-Петербург, 1997. 286с.

9. Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Часть 1. Заболевания нервно-мышечной системы. // Из-во "Интермедика". Санкт-Петербург. 2000. С.19-190.

10. Гусев Н.Б. Основы биохимии мышечных тканей. В кн.: "Мышечные ткани" под. ред. Ю.С. Ченцова. // Из-во "Медицина". М. 2001. 176-267.

11. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. // Из-во «Мир». М. 1982. т.1,2,3.

12. Крахмалева И.Н., Липатова Н.А., Шишкин С.С., Шаховская Н.И. Структура дистрофинового гена у больных миодистрофией Дюшенна. // Журнал неврологии и психиатрии. 1999. Т.99. - №3. С.41-43.

13. Крахмалева И.Н., Липатова Н.А., Шишкин С.С., Шаховская Н.И., Родни-кова Н.И., Лунга И.Н., Таркш М.А., Герасимова Н.Л. Полиморфизм экзона 4 в гене CANP-3 у больных первичными миопатиями. // Генетика. 1999, т.35, С.1713-1717.

14. Левицкий Д.И. Акиомиозиновые системы биологической подвижности. // Биохимия. 2004. т.69. С.1447-1462.

15. Лимборская С. А., Хуснутдинова Э. К., Балановская Е. К. Этногеномика и геногеография народов Восточной Европы. // Из-во Наука. 2002. 261с.

16. Льюин Б. Гены. // Из-во «Мир». М. 1987. 544с.

17. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. // М. Из-во "Мир". 1993, том 1 и 2.

18. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая активность. // Из-во «Наука». М. 1982.

19. Филатов В.Л., Катруха А.Г., Буларгина Т.В., Гусев Н.Б. Тропонин: структура, свойства и механизм функционирования. // Биохимия 1999 (сентябрь) 64 (9)1155-1174.

20. Шишкин С.С. Наследственные нервно-мышечные болезни. // Изд-во ВИНИТИ, Москва, 1997, 130с.

21. Шишкин С.С. От структурной геномики к функциональной: теоретические и прикладные аспекты. // Вест. РАМН. 2002, №4, С.11-16.

22. Шишкин С.С., Калинин В.Н. Медицинские аспекты биохимической и молекулярной генетики. // Из-во ВИНИТИ, М. 1992, 21бс.

23. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А. Протеомные исследования мышечных белков человека и некоторых других позвоночных. // Биохимия 2004, т.69, №11, С.1574-1589.

24. Шишкин С.С., Шаховская Н.И., Крахмалева И.Н. Клинический полиморфизм, генетическая гетерогенность и проблемы патогенеза первичных миопа-тий. // Журнал неврологии и психиатрии. 2002, т.102, №2, С.54-60.

25. Шубникова Е.А. Строение, развитие, сравнительная и патологическая гистология мышечных тканей. // В кн.: "Мышечные ткани" под. ред. Ю.С. Чен-цова Из-во "Медицина". М. 2001. 7-108.

26. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. // М. Из-во "Мир". 1982. С.284-292.

27. Agarkova I., Perriard J.С. The M-band: an elastic web that crosslinks thick filaments in the center of the sarcomere. // Trends. Cell Biol. 2005. V.15. P.477-485.

28. Asano M. Quantitation of myosin light chain phosphorylation in intact smooth muscle. 11 Jpn J Pharmacol. 1990. V. 52. P.457-469.

29. Barton P.J.R.; Buckingham M.E.The myosin alkali light chain proteins and their genes. // Biochem. J. 1985. V.231. P.249-261.

30. Bashir R, Strachan T, Keers S, Stephenson A, Mahjneh I, Marconi G, Nashef L, Bushby KM. A gene for autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy maps to chromosome 2p. // Hum Mol Genet. 1994. V.3. P.455-457.

31. Baxevanis A., Ouellette B.F.F. Bioinformatics: A Practical Guide to analysis of genes and proteins. // Johon Wieley and Sons Inc. New York, NY, 1998, 370p.

32. Beggs A.H, Byers T.J., Knoll J.H.M., Boyce F.M., Bruns G.A.P., Kunkel L.M. Cloning and Characterization of Two Human Skeletal Muscle -Actinin Genes Located on Chromosomes 1 and 11. //J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.9281-9288.

33. Beggs A.H., Koenig M., Boyce F.M., Kunkel L.M. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction // Hum.Genet. 1990. V.86. P.45-48.

34. Berg J.S., Powell B.C., Cheney R.E. A millenial myosin census. // Mol. Biol. Cell. 2001. V.12. P.780-794.

35. Biral D., Betto R., Danieli-Betto D., Salviati G. Myosin heavy chain composition of single fibres from normal human muscle. // Biochem. J. 1988. V.250. P.307-308.

36. Blum H., Beir H., Cross H. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels // Electrophoresis. 1987. V.8. P. 126 129.

37. Brakebusch C., Fassler R. The integrin-actin connection, an eternal love affair. // EMBO J. 2003. V.22. P.2324-2333.

38. Breitbart R.E., Andreadis A., Nadal Ginard B. Alternative splicing: a ubiquitous mechanism for the generation of multiple protein isoforms from single genes. // Ann. Rev. Biochem. 1987. V.56. P.467-495.

39. Brown J.H.; Kim K.-H.; Jun G.; Greenfield N.J.; Dominguez R.; Volkmann N.; Hitchcock-DeGregori S.E.; Cohen C. Deciphering the design of the tropomyosin molecule. // Proc. Nat. Acad. Sci. 2001. V.98. P.8496-8501.

40. Brown R.H. Dystrophin-associated proteins and the muscular dystrophies. // Ann. Rev. Med. 1997. V.48. P.457-466.

41. Carlier M.F. Actin: protein structure and filament dynamics. // J Biol Chem. 1991. V.266. P.1-4.

42. Carrillo В., Lekpor K., Yanofsky C., Bell A.W., Boismenu D., Kearney R.E. Increasing peptide identification in tandem mass spectrometry through automatic function switching optimization. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005. V.16. P.1818-1826.

43. Chamberlain J.S., Farwell N .J., Chamberlain J.R., Cox G.A., Caskey C.T. PCR analysis of dystrophin gene mutation and expression. J Cell Biochem. 1991 V.46. P.255-259.

44. Cheung V.G.; Conlin L.K.; Weber T.M.; Arcaro M.; Jen K.-Y.; Morley M.; Spielman R.S. Natural variation in human gene expression assessed in lymphoblas-toid cells. // Nature Genet. 2003. V.33. P.422-425.

45. Clarkson E., Costa C.F., Machesky L.M. Congenital myopathies: diseases of the actin cytoskeleton. // J. Pathol. 2004. P.204. P.407-417.

46. Clarkson P.M., Hoffman E.P., Zambraski E., Gordish-Dressman H., Kearns A., Hubal M., Harmon В., Devaney J.M. ACTN3 and MLCK genotype associations with exertional muscle damage. // J. Appl. Physiol. 2005. V.99. P.564-569.

47. Cohen N, Muntoni F. Multiple pathogenetic mechanisms in X linked dilated cardiomyopathy. // Heart. 2004. V.90. P.835-841.

48. Collins C.; Schappert K.; Hayden M.R. The genomic organization of a novel regulatory myosin light chain gene (MYL5) that maps to chromosome 4pl6.3 and shows different patterns of expression between primates. // Hum. Molec. Genet. 1992. V.l. P.727-733.

49. Cooke R. The Sliding Filament Model: 1972-2004. // J. Gen. Physiol. 2004. V.123. P. 643-656.

50. Corrado D., Pelliccia A., Bjornstad H.H., Vanhees L., Biffi A., Borjesson M., Panhuyzen-Goedkoop N., Deligiannis A., Solberg E., Dugmore D., Mellwig K.P., As-sanelli D., Delise P., van-Buuren F., Anastasakis A., Heidbuchel H., Hoffmann E.,

51. Cummins P., Perry V. Chemical and Immunochemical Characteristics of Tropomyosins from Striated and Smooth Muscle // Biochem. J. 1974 V. 141. P. 43-49.

52. Daehmlow S.; Erdmann J.; Knueppel Т.; Gille C.; Froemmel C.; Hummel M.; Hetzer R.; Regitz-Zagrosek V. Novel mutations in sarcomeric protein genes in dilated cardiomyopathy. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V.298. P.116-120.

53. Domenico Corrado, Antonio Pelliccia, at all Cardiovascular pre-participation screening of young competitive athletes for prevention of sudden death: proposal for a common European protocol. // European Heart Journal. 2005. V.26. P.516-524.

54. Donner K, Ollikainen M, Ridanpaa M. Mutations in the beta-tropomyosin (TPM2) gene-a rare cause of nemaline myopathy. // Neuromuscul Disord. 2002. V.12. P. 151-158.

55. Doolan A., Langlois N., Semsarian C. Causes of sudden cardiac death in young Australians.// Med. J. Aust. 2004. V.180. P.110-112.

56. Dos Remedios C. G., Chhabra D., Kekic M., Dedova I.V., Tsubakihara M., Berry D.A., Nosworthy N.J. Actin Binding Proteins: Regulation of Cytoskeletal Microfilaments. // Physiol. Rev. 2003. V.83. P.433-473.

57. Edwards Y.H.; Parkar M.; Povey S.; West L.F.; Parrington J M.; Solomon, E. Human myosin heavy chain genes assigned to chromosome 17 using a human cDNA clone as probe. // Ann. Hum. Genet. 1985. V.49. P.101-109.

58. Emery A.E.H. Diagnostic Criteria for Neuromuscular Disorders. // European Neuromuscular Centre, The Netherlands, 1994. 72p.

59. Epp T.A.; Dixon I.M.C.; Wang H.-Y.; Sole M.J.; Liew C.-C. Structural organization of the human cardiac alpha-myosin heavy chain gene (MYH6). // Genomics 1993. V.18. P.505-509.

60. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. Electrophoretic analysis of the major peptides of the erytrocyte membrane. // Biochemistry. 1971. V.10. P.2607 -2617.

61. Faulkner G., Lanfranchi G., Valle G. Telethonin and other new proteins of the Z-disc of skeletal muscle. // IUBMB Life. 2001. V.51. P.275-282.

62. Finsterer J. Limb girdle muscular dystrophies. // Nervenarzt. 2004. V.75. P,1153-1166.

63. Firoozi S., Sharma S., McKenna W.J. Risk of competitive sport in young athletes with heart disease. // Heart. 2003. V.89. P.710-714.

64. Fodor W.L.; Darras В.; Seharaseyon J.; Falkenthal S.; Francke U.; Vanin E.F. Human ventricular/slow twitch myosin alkali light chain gene characterization, sequence, and chromosomal location. // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.2143-2149.

65. Foth B.J., Goedecke M.C., Soldati D. New insights into myosin evolution and classification. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V.103. P.3681-3686.

66. Golomb E, Ma X, Jana SS et al. Identification and characterization of non-muscle myosin II-C, a new member of the myosin II family. // J Biol Chem. 2004. V.279. P. 2800-2808.

67. Gordon A.M., Homsher E., Regnier M. Regulation of contraction in striated muscle. // Physiol Rev. 2000. V.80. P.853-924.

68. Grant J.W.; Zhong R.Q.; McEwen P.M.; Church S.L. Human nonsarcomeric 20,000 Da myosin regulatory light chain cDNA. // Nucleic Acids Res. 1990. V.18. P.5892.

69. Granzier H., Labeit S. Cardiac titin: an adjustable multi-functional spring. // J. Physiol. 2002. V.541. P.335-342.

70. Granzier H., Labeit S. The Giant Protein Titin: A Major Player in Myocardial Mechanics, Signaling, and Disease. // Circ. Res. 2004. V.94. P.284-295.

71. Gunning P.P. Ponte H., Blau H., Kedes L. a-Skeletal and a-cardiac actin genes are coexpressed in adult human skeletal muscle and heart. // Mol, Cell. Biol. 1983. V.3. P.1985-1995.

72. Hackman J.P.V.; Vihola A.K.; Udd A. B. The role of titin in muscular disorders. // Ann. Med. 2003. V.35. P.434-441.

73. Hailstones DL, Gunning PW. Characterization of human myosin light chains lsa and 3nm: implications for isoform evolution and function. // Mol Cell Biol. 1990. V.10. P.1095-1104.

74. Harata M.; Nishimori K.; Hatta S. Identification of two cDNAs for human actin-related proteins (Arps) that have remarkable similarity to conventional actin. // Biochim. Biophys. Acta 2001. V.1522. V.130-133.

75. Hart G. Exercise-induced cardiac hypertrophy: a substrate for sudden death in athletes? // Experimental Physiology. 2003. V.88.5. P.639-644.

76. Hirota Т., Kitaoka H., Kubo Т., Okawa M., Furuno Т., Doi Y.L. Morphologic characteristics of hypertrophic cardiomyopathy of the elderly with cardiac myosin-binding protein С gene mutations. // Circ. J. 2006. V.70. P.875-879.

77. Huff Т., Muller C.S., Otto A.M., Netzker R., Hannappel E. beta-Thymosins, small acidic peptides with multiple functions. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2001. V.33. P.205-220.

78. Huxley H.E., Hanson J. Changes in the cross-striated of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation. // Nature. 1954. V.173. P.973.

79. International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. // Nature, 409, 860-921.

80. Iwasaki Т.; Murata-Hori M.; Ishitobi S.; Hosoya H. Diphosphorylated MRLC is required for organization of stress fibers in interphase cells and the contractile ring in dividing cells. // Cell. Struct. Func. 2001. V.26. P.677-683.

81. Jaenicke Т.; Diederich K.W.; Haas W.; Schleich J.; Lichter P.; Pfordt M.; Bach A.; Vosberg H.-P. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. // Genomics. 1990. V.8. P.194-206.

82. Kapetanopoulos A., Kluger J., Maron B.J., Thompson P.D. The congenital long QT syndrome and implications for young athletes. // Med. Sci. Sports Exerc. 2006. V.38. P.816-825.

83. Kaplan J.C., Fontaine B. Neuromuscular disorders: gene location. // Neu-romusc. Disord. 1999. V.9. P.I-VIII.

84. Kawamoto S. Neuron-specific Alternative Splicing of Nonmuscle Myosin II-Heavy Chain-B Pre-mRNA Requires a Cis-acting Intron Sequence. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P.17613-17616.

85. Kelley C.A., Adelstein R.S. Characterization of isoform diversity in smooth muscle myosin heavy chains. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1994. V.72. P. 13511360.

86. Kim K.-Y.; Kovacs M.; Kawamoto S.; Sellers J.R.; Adelstein R.S. Disease-associated mutations and alternative splicing alter the enzymatic and motile activity of nonmuscle myosins II-B and II-C. // J. Biol. Chem. 2005. V.280. P.22769-22775.

87. Kimura A, Harada H, Park JE, Nishi H, Satoh M, Takahashi M, Hiroi S, Sa-saoka T, Ohbuchi N, Nakamura T, Koyanagi T, Hwang TH, Choo JA, Chung KS, Ha-segawa A, Nagai R, Okazaki O, Nakamura H, Matsuzaki M, Sakamoto T, Toshima H,

88. Кода Y, Imaizumi T, Sasazuki Т. Mutations in the cardiac troponin I gene associated with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 1997. V.16. P.379-382.

89. Klocke В., Klingenhoff A., Seifert M. und Werner Т. Genom-Informationen effizient und differenziert nutzen. // BlOspektrum • 1/05 ■ 11. Jahrgang. St.113-114.

90. Klose J. Systematic analysis of the total proteins of a mammalian organism: principles, problems and implications for sequencing the human genome. // Electrophoresis. 1989. V.10. P.140-152.

91. Kumar C.C.; Mohan S.R.; Zavodny P.J.; Narula S.K.; Leibowitz P.J. Characterization and differential expression of human vascular smooth muscle myosin light chain 2 isoform in nonmuscle cells. // Biochemistry. 1989. V.28. P.4027-4035.

92. Labeit S.; Kolmerer B. Titins: giant proteins in charge of muscle ultrastruc-ture and elasticity. // Science. 1995. V.270. P.293-296.

93. Laval S.H., Bushby K.M. Limb-girdle muscular dystrophies-from genetics to molecular pathology. // Neuropathol Appl Neurobiol. 2004. V.30. P.91-105.

94. Leinwand L.A.; Saez L.; McNally E.; Bernardo N.-G. Isolation and characterization of human myosin heavy chain genes. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1983. V.80. P.3716-3720.

95. Lenz S.; Lohse P.; Seidel U.; Arnold, H.-H. The alkali light chains of human smooth and nonmuscle myosins are encoded by a single gene: tissue-specific expression by alternative splicing pathways. // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.9009-9015.

96. Li H., Fernandez J.M. Mechanical design of the first proximal Ig domain of human cardiac titin revealed by single molecule force spectroscopy. // J Mol Biol. 2003. V.334. P.75-86.

97. Lim LE, Duclos F, Broux 0, Bourg N, Sunada Y, Allamand V, Meyer J, Richard I, Moomaw C, Slaughter C, et al. Beta-sarcoglycan: characterization and role in limb-girdle muscular dystrophy linked to 4ql2. // Nat Genet. 1995. V.ll. P.257-265.

98. Lindblom В., Holmlung G. Rapid DNA purification for restriction fragment length polymorphism analysis. // Gene Anal.Techn. 1988. V.5. P.97-101.

99. Linke W.A., Fernandez J.M. Cardiac titin: molecular basis of elasticity and cellular contribution to elastic and viscous stiffness components in myocardium. // J. Muscle Res. Cell. Motil. 2002. V.23. P.483-497.

100. Linke WA. Stretching molecular springs: elasticity of titin filaments in vertebrate striated muscle. // Histol. Histopathol. 2000. V.15. P.799-811.

101. Linke WA., Kulke M., Li H., Fujita-Becker S., Neagoe C., Manstein D.J., Gautel M., Fernandez J.M. PEVK domain of titin: an entropic spring with actin-binding properties. // J Struct Biol. 2002. V.137. P.194-205.

102. Lucas C.A., Rughani A., Hoh J.F. Expression of extraocular myosin heavy chain in rabbit laryngeal muscle. // J. Muscle Res. Cell Motil. 1995. V.16. P.368-378.

103. Lucia A., Gomez-Gallego F., Santiago C., Bandres F., Earnest C., Rabadan M., Alonso J.M., Hoyos J., Cordova A., Villa G., Foster C. ACTN3 Genotype in Professional Endurance Cyclists. // Int. J. Sports Med. 2006. V.27. P.880-884.

104. Luther P.K. Three-dimensional structure of a vertebrate muscle Z-band: implications for titin and alpha-actinin binding. // J. Struct. Biol. 2000. V.129. P.l-16.

105. Luther P.K., Padron R., Ritter S., Craig R., Squire J.M. Heterogeneity of Z-band structure within a single muscle sarcomere: implications for sarcomere assembly. // J. Mol. Biol. 2003. V.332. P.161-169.

106. Luther P.K., Squire J.M. Muscle Z-band ultrastructure: titin Z-repeats and Z-band periodicities do not match. // J. Mol. Biol. 2002. V.319. P.1157-1164.

107. LocKer R.H., Wild D.J.C. Comparative Study of High Molecular Weight Proteins in Various Types of Muscle Across the Animal Kingdom. // J. Biochem. 1986. V.99. P.1473-1484.

108. Macera M.J.; Szabo P.; Wadgaonkar R.; Siddiqui M.A.Q.; Verma R.S. Localization of the gene coding for ventricular myosin regulatory light chain (MYL2) to human chromosome 12q23-q24.3. // Genomics. 1992. V.13. P.829-831.

109. Marian AJ, Mares A Jr, Kelly DP, et all. Sudden cardiac death in hypertrophic cardiomyopathy. Variability in phenotypic expression of beta-myosin heavy chain mutations.// Eur Heart J. 1995. V.16. P. 368-376.

110. Marian AJ. On genetics of dilated cardiomyopathy and transgenic models: all is not crystal clear in myopathic hearts.// Circ Res. 2001 V.89. P. 3-5.

111. Marnellos,G. High-throughput SNP analysis for genetic association studies. // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2003. V.6 P.317-321.

112. Maron B.J., Shirani J., Poliac L.C., et al. Sudden death in young competitive athletes clinical, demographic and pathological profiles. // JAMA. 1996. V.276. P.199-204.

113. Marston S.B., Redwood C.S. Modulation of thin filament activation by breakdown or isoform switching of thin filament proteins: physiological and pathological implications. Circ Res. 2003. V.93. P.1170-1178.

114. Martinsson Т.; Oldfors A.; Darin N.; Berg K.; Tajsharghi H.; Kyllerman M.; Wahlstrom J. Autosomal dominant myopathy: missense mutation (glu706-to-lys) in the myosin heavy chain Ila gene. // Proc. Nat. Acad. Sci. 2000. V.97. P.14614-14619.

115. Maruyama K. Connectin/titin, giant elastic protein of muscle. // FASEB J. 1997. V.ll. P.341-345.

116. Maruyama K., Kimura S., Yoshidomi H., Sawada H., Kikuchi M. Molecular size and shape of beta-connectin, an elastic protein of striated muscle. // J. Bio-chem. 1984. V.95(5). P.1423-1433.

117. Matsuoka R.; Yoshida M. C.; Kanda N.; Kimura M.; Ozasa H.; Takao A. Human cardiac myosin heavy chain gene mapped within chromosome region 14qll.2-ql3. // Am. J. Med. Genet. 1989. V.32. P.279-284.

118. Mohammad MA, Sparrow MP. The distribution of heavy-chain isoforms of myosin in airways smooth muscle from adult and neonate humans.// Biochem J. -1989. V.260. P.421-426.

119. Monaco Т., Kunkel M.L. Cloning of Duchenne/Becker muscular dystrophy locus. // Adv. Hum. Genet. 1988. V.17. P.61-98.

120. Moore, K. J.; Testa, J. R.; Francke, U.; Milatovich, A.; Copeland, N. G.; Jenkins, N. A. Cloning and regional assignment of the human myosin heavy chain 12 (MYH12) gene to chromosome band 15q21. // Cytogenet. Cell Genet. 1995. V.69. P.53-58.

121. Mooser,V., Waterworth,D.M., Isenhour,T. and Middleton,L. Cardiovascular pharmacogenetics in the SNP era. // J. Thromb. Haemost. 2003. V.l. P.1398-1402.

122. Morano I., Koehlen S., Haase H., Erb G., Baltas L.G., Rimbach S., Wallwie-ner D., Bastert G. Alternative splicing and cycling kinetics of myosin change during hypertrophy of human smooth muscle cells. // J. Cell. Biochem. 1997. V.64. P.171-181.

123. Moreira ES, Vainzof M, Marie SK, Sertie AL, Zatz M, Passos-Bueno MR. The seventh form of autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy is mapped to 17qll-12. // Am J Hum Genet. 1997. V.61. P.151-159.

124. Mori Y., Folco E., Koren G. GH3 Cell-specific Expression of Kvl.5 Gene. Regluation by a silencer containing a dinucleotide repetotive element. // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.27788-27796.

125. Muntoni F., Wilson L., Marrosu G., Marrosu M.G., Cianchetti C., Mestroni L., Ganau A., Dubowitz V., Sewry C. A mutation in the dystrophin gene selectively affecting dystrophin expression in the heart. // J. Clin. Invest. 1995. V.96. P.693-699.

126. Murali D. Bashyam, Gorinabele R. Savithri Murugapiran S. Kumar, Calam-bur Narasimhan Pratibha Nallari. Molecular genetics of familial hypertrophic cardiomyopathy (FHC) // J Hum Genet. 2003. V.43. P.55-64.

127. Nagy A., Cacciafesta P., Grama L., Kengyel A., Malnasi-Csizmadia A., Kel-lermayer M.S. Differential actin binding along the PEVK domain of skeletal muscle titin. // J. Cell Sci. 2004. V.117. P.5781-5789.

128. Neagoe C., Kulke M., del Monte F., Gwathmey JK., de Tombe PP., Hajjar RJ., Linke WA. Titin isoform switch in ischemic human heart disease. // Circulation. 2002 V.106. P.1333-1341.

129. Neagoe С., Opitz C.A., Makarenko I., Linke W.A. Gigantic variety: expression patterns of titin isoforms in striated muscles and consequences for myofibrillar passive stiffness. //J. Muscle Res. Cell Motil. 2003. V.24. P.175-189.

130. Niemi AK., Majamaa K. Mitochondrial DNA and ACTN3 genotypes in Finnish elite endurance and sprint athletes. // Eur J Hum Genet. 2005. V.13. P.965-969.

131. North K.N., Yangl N., Wattanasirichaigoon D., Mills M., Easteal S., Beggs A.H. A common nonsense mutation results in a-actinin-3 deficiency in the general population. // Nature Genet. 1999. V.21. P.353-354.

132. Ojima K., Ono Y., Hata S., Koyama S., Doi N., Sorimachi H. Possible functions of p94 in connectin-mediated signaling pathways in skeletal muscle cells. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2005. V.26. P.409-417.

133. Olson T.M., Karst M.L., Whitby F.G., Driscoll D.J. Myosin light chain mutation causes autosomal recessive cardiomyopathy with mid-cavitary hypertrophy and restrictive physiology. // Circulation. 2002. V.105. P.2337-2340.

134. Olson T.M.; Michels V.V.; Thibodeau S.N.; Tai Y.-S.; Keating M.T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. // Science. 1998. V.280. P.750-752.

135. Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V.86. P.2766-2770.

136. Otey C.A., Carpen O. Alpha-actinin revisited: a fresh look at an old player. // Cell. Motil. Cytoskeleton. 2004. V.58. P.104-111.

137. Otey C.A., Rachlin A., Moza M., Arneman D., Carpen O. The pal-ladin/myotilin/myopalladin family of actin-associated scaffolds. // Int. Rev. Cytol. 2005. V.246. P.31-58.

138. Ott P., Marcus F.I., Arthur J. Moss A.J. Ventricular Fibrillation During Swimming in a Patient With Long-QT Syndrome. // Circulation 2002. V.106. P.521-522.

139. Payne J., Montgomery H. The renin-angiotensin system and physical performance. // Biochem. Soc. Trans. 2003. V.31. P.1286-1289.

140. Perry S.V. Troponin T: genetics, properties and function. // J. Muscle Res. Cell Motil. 1998. V.19. P.575-602.

141. Perry S.V. Vertebrate tropomyosin: distribution, properties and function. // J. Muscle Res. Cell Motil 2001 V.22. P.5-49.

142. Perusse L., Rankinen Т., Rauramaa R., Rivera M.A., Wolfarth В., Bouchard C. The Human Gene Map for Performance and Health-Related Fitness Phenotypes: The 2002 Update. // Med. Sci. Sports Exerc. 2003. V.35. P.1248-1264.

143. Peterman S.M., Dufresne C.P., Horning S. The use of a hybrid linear trap/FT-ICR mass spectrometer for on-line high resolution/high mass accuracy bottom-up sequencing.//J. Biomol. Tech. 2005. V.16. P.112-124.

144. Pollard T.D. Korn E.D. Acanthamoeba Myosin I. Isolation from Acan-thamoeba castellanii an enzyme similar to muscle myosin // J. Biol. Chem. 1973. V.248. P.4682-4690.

145. Porzio M.A., Pearson A.M. Improved resolution of myofibrillar proteins with sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. // Biochim Biophys Acta. 1977. V.490. P.27-34.

146. Prado L.G., Makarenko I., Andresen C., Kruger M., Opitz C.A., Linke W.A. Isoform diversity of giant proteins in relation to passive and active contractile properties of rabbit skeletal muscles. // J. Gen. Physiol. 2005. V.126. P.461-480.

147. Pyle W.G., Solaro R.J. At the crossroads of myocardial signaling: the role of Z-discs in intracellular signaling and cardiac function. // Circ. Res. 2004. V.94. P.296-305.

148. Rankinen Т., Rice Т., Boudreau A., et al. Titin is a candidate gene for stroke volume response to endurance training: the HERITAGE Family Study. // Physiol. Genomics. 2003. V.15. P.27-33.

149. Rappold, G.A.; Vosberg H.-P. Chromosomal localization of a human myosin heavy-chain gene by in situ hybridization. // Hum. Genet. 1983. V.65. P.195-197.

150. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. Three-dimensional structure of myosin. // Science. 1993. V.261. P.50-58.

151. Redowicz M.J. Myosins and pathology: genetics and biology. // Acta Bio-chim. Polonica 2002 V.49. P.789-804.

152. Roberds SL, Leturcq F, Allamand V, Piccolo F, Jeanpierre M, Anderson RD, Lim LE, Lee JC, Tome FM, Romero NB, et al. Missense mutations in the adhalin gene linked to autosomal recessive muscular dystrophy. // Cell. 1994. V.78. P.625-633.

153. Salviaty G. Betto R., Danielli-Betto D., Zeviani M. Myofibrillar-protein iso-forms and sarcoplasmic-reticulum Ca+2 transport activity of single muscle fibres. // Biochem. J. 1983. V.224. P.215-225.

154. Sartore S, De Marzo N, Borrione AC et al. Myosin heavy-chain isoforms in human smooth muscle.// Eur J Biochem. 1989. V.179. P.79-85.

155. Schiaffino S., Reggiani C. Molecular Diversity of myofibrillar proteins: gene regulation and functional significance // Physiol. Reviews. 1996. V.76. P.371-423.

156. Scholten Ch., Maurer G. Hypertrophe Kardiomyopathie. Journal fur Kardi-ologie 2000. V.7. P.150-155.

157. Seharaseyon J.; Bober E.; Hsieh C.-L.; Fodor W.L.; Francke U.; Arnold H.-H.; Vanin E.F. Human embryonic/atrial myosin alkali light chain gene: characterization, sequence and chromosomal location. // Genomics. 1990. V.7. P.289-293.

158. Sherry ST, Ward M, and Sirotkin K. dbSNP-Database for Single Nucleotide Polymorphisms and Other Classes of Minor Genetic Variation Genome Res. 1999. V.9. P.677-679.

159. Shlesinger H., Ovil Y., Levy M.J., Kessler-Icekson G. Separation and quantitation of ventricular myosin heavy-chain from human atrial myocardium. // Bio-chem Int. 1985. V.ll. P.747-753.

160. Smith D.A., Geeves M.A. Cooperative regulation of myosin-actin interactions by a continuous flexible chain II: actin-tropomyosin-troponin and regulation by calcium. // Biophys. J. 2003. V.84. P.3168-3180.

161. Soussi-Yanicostas N.; Whalen R. G.; Petit C. Five skeletal myosin heavy chain genes are organized as a multigene complex in the human genome. // Hum. Molec. Genet. 1993. V.2. P.563-569.

162. Starling A, Kok F, Passos-Bueno MR, Vainzof M, Zatz M. A new form of autosomal dominant limb-girdle muscular dystrophy (LGMD1G) with progressive fingers and toes flexion limitation maps to chromosome 4p21. // Eur J Hum Genet. 2004. V.12. P.1033-1040.

163. Stedman HH, Kelly AM, Rubinstein NA. Isoform-specific cDNAs for human embryonic, neonatal, and slow skeletal myosin heavy chains. // Ann N Y Acad Sci. 1990. V.599. P.119-126.

164. Stewart M. Structural basis for bending tropomyosin around actin in muscle thin filaments. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V.98. P.8165-8166.

165. Szantai E., Ronai Z., Szilagyi A., Sasvari-Szekely M., Guttman A. Haplotyp-ing by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr A. 2005. V.1079. P.41-49.

166. Tanigawa G., Jarcho J.A., Kass S., Solomon S.D., Vosberg H.P., Seidman J.G., Seidman C.E. A molecular basis for familial hypertrophic cardiomyopathy: an alpha/beta cardiac myosin heavy chain hybrid gene. // Cell. 1990. V.62. P.991-998.

167. Tardiff J.C. Sarcomeric proteins and familial hypertrophic cardiomyopathy: linking mutations in structural proteins to complex cardiovascular phenotypes. // Heart Fail. Rev. 2005. V.10. P.237-248.

168. Thiene G., Basso C., Calabrese F., Angelini A., Valente M. Twenty years of progress and beckoning frontiers in cardiovascular pathology: cardiomyopathies. // Cardiovasc. Pathol. 2005. V.14. P.165-169.

169. Thierfeld L., Watkins H., MacRae C. Lamas R, McKenna W, Vosberg HP, Seidman JG, Seidman CE. Alpha-tropomyosin and cardiac troponin T mutations cause familial hypertrophic cardiomyopathy: a disease of the sarcomere. // Cell. 1994. V.77. P.701-712.

170. Toydemir R.M.; Rutherford A.; Whitby F.G.; Jorde L.B.; Carey J.C.; Bam-shad M.J. Mutations in embryonic myosin heavy chain (MYH3) cause Freeman-Sheldon syndrome and Sheldon-Hall syndrome. // Nature Genet. 2006. V.38. P.561-565.

171. Tskhovrebova L., Trinick J. Properties of titin immunoglobulin and fi-bronectin-3 domains. //J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P.46351-46354.

172. Udd В., Vihola A., Sarparanta J., Richard I., Hackman P. Tenopathies and extension of the M-line mutation phenotype beyond distal myopathy and LGMD2J. // Neurology. 2005. V.64. P.636-642.

173. Ueyama H.; Bruns G.; Kanda N. Assignment of the vascular smooth muscle actin gene ACTSA to human chromosome 10. // Jpn. J. Hum. Genet. 1990. V.35. P.145-150.

174. Vandekerckhove J., Weber K. At least six different actins are expressed in a higher mammal: an analysis based on the amino acid sequence of the amino-terminal tryptic peptide. // J. Mol. Biol. 1978. V.126. P.783-803.

175. Vaughan K.T.; Weber F.E.; Ried Т.; Ward D.C.; Reinach F.C.; Fischman D.A. Human myosin-binding protein H (MyBP-H): complete primary sequence, genomic organization, and chromosomal localization. // Genomics. 1993. V.16. P.34-40.

176. Vincent G.M. Role of DNA testing for diagnosis, management, and genetic screening in long QT syndrome, hypertrophic cardiomyopathy, and Marfan syndrome. // Heart. 2001. V.86. P.12-14.

177. Virel A., Backman L. Molecular evolution and structure of alpha-actinin. // Mol. Biol Evol. 2004. V.21. P.1024-1031.

178. Wang K., Wright J. Architecture of the Sarcomere Matrix of Skeletal Muscle: Immunoelectron Microscopic Evidence that Suggests a Set of Parallel Inexten-sible Nebulin Filaments Anchored at the Z Line. // J. Cell Biol. 1988. V.107. P.2199-2212.

179. Watkins H, MacRae C, Thierfelder L, Chou YH, Frenneaux M, McKenna W, Seidman JG, Seidman CE. A disease locus for familial hypertrophic cardiomyopathy maps to chromosome lq3. // Nat Genet. 1993. V.3. P.333-337.

180. Weiss A., Schiaffino S., Leinwand L.A. Comparative sequence analysis of the complete human sarcomeric myosin heavy chain family: implications for functional diversity. //J. Mol. Biol. 1999. V.290. P.61-75.

181. Wernyj R.P., Ewing C.M., Isaacs W.B. Multiple antibodies to titin immuno-react with AHNAK and localize to the mitotic spindle machinery. // Cell Motil. Cy-toskeleton. 2001. V.50. P.101-113.

182. Whalen R.G.; Schwartz K.; Bouveret P.; Sell S.M.; Gros F. Contractile protein isozymes in muscle development: identification of an embryonic form of myosin heavy chain. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1979. V.76. P.5197-5201.

183. Wilkins M.R., Williams K.L., Appel R.D., Hochstrasser D.F. Proteomic research: new frontiers in functional genomics (principle and practice). // Springer Verlag. Berlin. 1997. 464p.

184. Wolfarth B, Bray MS, Hagberg JM, Perusse L, Rauramaa R, Rivera MA, Roth SM, Rankinen T, Bouchard C. // The Human Gene Map for Performance and Health-Related Fitness Phenotypes: The 2004 Update. // Med. Sci. Sports Exerc. 2005. V.37. P.881-903.

185. Yang N., MacArthur D.G., Gulbin J.P., Hahn A.G., Beggs A.H., Easteal S., Northl K. ACTN3 Genotype Is Associated with Human Elite Athletic Performance. // Am. J. Hum. Genet. 2003. У.13. P.627-631.

186. Yang, Т.; Pfister, M.; Blin, N.; Zenner, H. P.; Pusch, С. M.; Smith, R. J. H. Genetic heterogeneity of deafness phenotypes linked to DFNA4. // Am. J. Med. Genet. 2005. V.139. P.9-12.

187. Young P., Ferguson C., Banuelos S., Gautel M. Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin interactions lead to an asymmetrical sorting of alpha-actinin. // EMBO J. 1998. V.17. P.1614-1624.

188. Zastrow M.S., Flaherty D.B., Benian G.M., Wilson K.L. Nuclear titin interacts with A- and B-type lamins in vitro and in vivo. // J Cell Sci. 2006. V.119. P.239-249.

189. Zatz M, Vainzof M, Passos-Bueno MR. Limb-girdle muscular dystrophy: one gene with different phenotypes, one phenotype with different genes. Curr Opin Neurol. 2000. V.13. P.511-517.

190. Zou P., Pinotsis N., Lange S., Song Y.H., Popov A., Mavridis I., Mayans O.M., Gautel M., Wilmanns M. Palindromic assembly of the giant muscle protein titin in the sarcomeric Z-disk. // Nature. 2006. V.439. P.229-233.

Информация о работе

Плугов, Александр Геннадиевич
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение полиморфизмов некоторых саркомерных белков человека и их значения для функционирования мышечных тканей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы