Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие уникального домена высокомолекулярной киназы легких цепей миозина с белками-мишенями и его регуляция фосфорилированием

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие уникального домена высокомолекулярной киназы легких цепей миозина с белками-мишенями и его регуляция фосфорилированием"

На правах рукописи

00347 13Б9

Вилиткевич Елена Леонидовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ УНИКАЛЬНОГО ДОМЕНА ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА С БЕЛКАМИ-МИШЕНЯМИ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003471369

Работа выполнена в лаборатории клеточной подвижности НИИ Экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ и СР РФ».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гусев Николай Борисович

доктор биологических наук, профессор Левицкий Дмитрий Иванович

Ведущая организация: ГУ Институт Теоретической

и Экспериментальной Биофизики РАН

Защита состоится 24 июня 2009 года в 13 часов 30 минут на заседании Диссертационного Совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (Д 208.073.01) в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ и СР РФ» по адресу: 121552, Москва, ул.З-я Черепковская. 15а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ и СР РФ.

Автореферат разослан 23 мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

д.м.н., профессор В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) является ключевым Са2+-кальмодулин зависимым регулятором клеточной подвижности. Единственный известный субстрат этого фермента у эукариот - основной молекулярный мотор клетки миозин II типа. Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина КЛЦМ приводит к активации моторного домена миозина, что необходимо для осуществления различных видов двигательных реакций клеток и тканей, например, сокращения гладких мышц сосудов и висцеральных органов, локомоции фибробластов, хемотаксиса лейкоцитов и гладкомышечных клеток интимы артерий, цитокинеза, секреции, эндоцитоза, повышения проницаемости эпителиальных и эндотелиальных монослоев и др. Большинство из этих реакций нарушается при сердечно-сосудистых заболеваниях, и, как показывают исследования последних лет, конечной мишенью многих фармакологических препаратов, применяемых для лечения этих заболеваниях, являются именно процессы клеточной подвижности (Ширинский и Воротников, 2005). Очевидно, что для создания новых эффективных лекарственных веществ, воздействующих на двигательный статус клеток, необходимо понимание молекулярных основ клеточной подвижности и сигнальных каскадов, которые ее регулируют в норме и патологии.

В результате выяснения организации генетического локуса немышечной / гладкомышечной КЛЦМ у высших позвоночных было установлено, что помимо широко распространенной 108-130 кДа КЛЦМ он кодирует 210 кДа изоформу этого фермента (КЛЦМ210; Watterson е1 а1., 1995; Вкикоу е! а!., 1998). КЛЦМ210 экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках, эпителии кишечника и эндотелиальных клетках сосудов, в лейкоцитах и других немышечных клетках. В нашей лаборатории было впервые показано, что КЛЦМ210 и КЛЦМ 108 обладают сравнимой каталитической активностью, что хорошо согласуется с наличием в их структуре одинакового каталитического и регуляторного доменов (КиёгуазЬоу е1 а1., 1999). В то же время КЛЦМ210 отличается от КЛЦМ 108 наличием уникального аминотерминального домена, состоящего из более, чем 900 аминокислот. Анализ первичной структуры этого домена показывает отсутствие в нем типичных последовательностей каталитических доменов протеинкиназ и других ферментов и позволяет выделить в его составе шесть иммуноглобулиновых доменов и несколько повторяющихся мотивов. Известно, что иммуноглобулиновые домены ряда белков вовлечены в процессы белок-белкового узнавания, однако к началу данного исследования белки-мишени уникального домена

КЛЦМ210 были не известны. В первичной структуре уникального домена КЛЦМ210 существует ряд потенциальных участков фосфорилирования различными протеинкиназами, и было экспериментально показано, что такое фосфорилирование действительно происходит в живой клетке (Dulyaninova and Bresnick, 2004). Поскольку фосфорилирование является распространенным способом изменения функциональной активности белков, эти данные дополнительно свидетельствовали в пользу наличия в области N-концевого домена КЛЦМ210 функционально активных участков. Вместе с тем точной идентификации участков фосфорилирования в ранних работах проведено не было, как не были выяснены и функциональные последствия этих посттрансляционных модификаций. В настоящем исследовании мы обратились к решению этих вопросов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы явилось исследование функциональных свойств высокомолекулярной киназы легких цепей миозина, ассоциированных с ее уникальным N-концевым доменом. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация и характеристика белок-белковых взаимодействий N-концевого домена КЛЦМ210 in vitro и в культивируемых клетках.

2. Определение участков фосфорилирования N-концевого домена КЛЦМ210 цАМФ-зависимой протеинкиназой.

3. Изучение эффектов фосфорилирования N-концевого домена КЛЦМ210 на его взаимодействие с белками-мишенями.

Научная новизна работы. Впервые показано, что уникальный домен КЛЦМ210 может связываться с филаментами актина и микротрубочками in vitro и в культивируемых клетках. Проведено картирование новых участков связывания КЛЦМ210 с основными компонентами цитоскелета. Идентифицированы аминокислотные остатки, фосфорилируемые цАМФ зависимой протеинкиназой (ПКА) в структуре N-концевого домена КЛЦМ210, и продемонстрировано, что эти модификации снижают его сродство к компонентам цитоскелета. На основании полученных результатов и данных литературы предложена схема функциональной организации КЛЦМ210. Результаты работы углубляют современные представления о структурно-функциональных свойствах высокомолекулярной киназы легких цепей миозина и ее роли, как интегратора цитоскелета и организатора подвижности немышечных клеток.

Практическая значимость работы. Обобщенные результаты работы могут применяться в обучающих программах для студентов

медико-биологических специальностей. Полученные в ходе работы молекулярно-генетические конструкции и рекомбинантные белки могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов регуляции подвижности немышечных клеток и разработки новых лекарственных веществ, воздействующих на клеточную подвижность.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены международных конференциях: «Biological Motility: New Trends in Research» (Pushchino, Russia, 2001), The XXXI European Muscle Conference (Lunteren, Netherlands, 2002), «Biological Motility» (Pushchino, Russia, 2004), HMM Meeting of International Research Scholars (Tallinn, Estonia, 2004), HHM Meeting of International Research Scholars (Merida, Mexico, 2005), «Biological Motility: Basic Research and Practice» (Pushchino, Russia, 2006), «Biological Motility: Achievements and Perspectives» (Pushchino, Russia, 2008).

Публикации. По данным работы опубликовано 2 статьи и 7 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста, включает 24 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Список литературы включает 137 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР проводили в приборе фирмы Hybaid Omnigene (Великобритания), используя Taq-полимеразу (СилексМ, Россия), Pfu-Turbo и Pfu-Ultra ДНК-полимеразу (Promega, США). Праймеры конструировали с помощью программы Vector NTI Suite 5.5 и синтезировали коммерчески.

Трансформацию бактериальных клеток Е. coli штаммов BL(DE3)pLys или DH5a (100 цл) осуществляли 10 нг плазмидной ДНК, подвергая клетки тепловому шоку (42°С) в течение 45 секунд. Клетки инкубировали 1 час при 37°С при постоянном перемешивании, осаждали (4000g, 5 мин) и растирали на чашках с агаром с соответствующими антибиотиками. Репликацию плазмидной ДНК проводили в клетках Е. coli штамм DH5a. Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью наборов фирмы Qiagen (Германия) по протоколу производителя.

Конструирование фрагментов уникального домена КЛЦМ210 N1-452, N1-201, N27-157. Конструкции для бактериальной экспрессии. ДНК фрагментов получали полимеразной цепной реакцией

(ПЦР), используя в качестве матрицы кДНК полноразмерного уникального домена цыпленка N934 (Kudryashov et al., 1999). Для синтеза кДНК фрагментов КЛЦМ210, кодирующих 452 и 201 аминокислоту с N-конца молекулы были использованы пары праймеров: 5' праймер общий для обоих продуктов - 5'- CCCAGAT CATATGGGGGATGTTAAACT и 3' праймер - 5'- ATCGTCGACTGGTT TCCCTGAAACTTTG для N1-452, или 3' праймер - 5'- TTGTCGACCTC ATTTTGCTGCAGATGA для N1-201. ПЦР-продукт клонировали в вектор pET-30b(+) (Novagen, США) по участкам рестрикции эндонуклеазами Ndel и Sali соответственно (подчеркнуты). Для получения кДНК фрагмента уникального домена КЛЦМ210, кодирующего с 27 по 157 аминокислоты с N-конца молекулы были использованы следующие праймеры ПЦР для клонирования в Ask-IBA3 (IBA GmbH, Германия) вектор: 5' праймер - 5'- CAGAATTCGCACCAG САТТТАСТСТТС и 3' праймер - 5'- AATGCCATGGTACTTTGGTGGA СТСТ. ПЦР-продукт клонировали в промежуточный вектор pAsk-IBA3 (IBA, Германия) по участкам рестрикции EcoRI и Ncol (подчеркнуты). Далее, провели ПЦР промежуточного вектора: 5' праймер - 5'- АСС GAATTCCAGCACCAGCATTTACTCTT и 3' праймер - 5'- AAGCTTCA CAGGTGTATTTACCACTA, и клонировали в вектор pET21(d+) (Novagen, США) вместе со Лге/?-последовательностью. Таким образом, полученные конструкции уникального домена КЛЦМ210 включали Strep-последовательность (из вектора pAsk-IBA3) и/или HIS6 последовательность (из векторов рЕТ) для аффинного выделения и идентификации белка при иммуноблоттинге.

Получение векторов эукариотической экспрессии. Для N1-452 были использованы праймеры: 5' праймер - 5'- CCAAAGCTTTCATGG GGGATGTTAAACT и 3' праймер - 5'- ATCGGATCCTGGTTTCCCTTA AACTTTG. Провели клонирование ПЦР-продукта в вектор pEGFP-Cl (Clontech, США) по участкам рестрикции Hindlll и BamHI (подчеркнуты). Более короткие конструкции уникального домена КЛЦМ210 вместо GFP кодировали короткие идентификаторные последовательности FLAG и Strep. Для синтеза кДНК конструкции N1-201 и дальнейшего его клонирования в pFLAG CMV2 (Sigma, США) вектор по сайтам рестрикции Hindlll и BamHI (подчеркнуты) использовали праймеры: 5' праймер - 5'- CCAAAGCTTATGGGGGATG ТТАААСТ и 3' праймер - 5'- AAAGGATCCTTAACGCTCATTTTGCTG. Для синтеза кДНК конструкции N27-157 со Лгер-последовательностью были использованы следующие праймеры ПЦР: 5' праймер - 5'- CGAAT TCAGCACCAGCATTTACTCTTC и 3' праймер - 5'- AAGGATCCTTAT

TTTTCGAACTGCGG; провели клонирование в pFLAG CMV2 вектор по участкам рестрикции EcoRI и BamHI (подчеркнуты).

Точечные аминокислотные замены вводили согласно протоколу QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit фирмы Stratagen (США). Получение мутантного N27-157 с заменами Seri40 и Seri49 на остатки Asp (N27-157(S140D;S149D)), проводили в две стадии на основе кДНК pCMV-FLAG-N27-157-Strep-tag. На первой стадии с помощью праймеров 5'- CCTGGGGGAAGACTAGATGTTCCACCTGTGGAG для кодирующей цепи и 5'- GCTCCACAGGTGGAACATCTAGTCTTCCCCC AG для комплементарной цепи (измененный кодон выделен жирным шрифтом) был получен мутант N27-157(S140D). На второй стадии использовали праймеры 5' - GCATAGGCCAGATATCTGGGGAGAGAG ТССАСС для кодирующей цепи и 5'- GGTGGACTCTCTCCCCAGATAT CTGGCCTATGC.

Все полученные векторы были проверены коммерческим сиквенированием.

Очистка рекомбинантных белков. Бактериальную экспрессию белков проводили в клетках E.coli штамм BL(DE3)pLys. Экспрессию индуцировали изопропил-Р-О-тиогалактопиранозидом. Химерные белки очищали согласно протоколам производителей на носителях Ni-NTA-агароза (Qiagen, Германия) или TALON (Clontech, США) для His6-последовательности, и для Strep-Tag на StrepTactin агарозе (IBA GmbH, Германия). Рекомбинантные белки диализовали против буфера МРВ (10 мМ MOPS, pH 7.4, 100 мМ NaCI,l мМ MgCI2, 0,1 мМ ЭГТА, 1 мМ

дитиотреитол (ДТТ)) и хранили при -70°С.

Выделение белков. Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц (Sprudich and Watt., 1971); тубулин из мозга быка был любезно предоставлен д-ром Шаниной H.A. (Кафедра молекулярной биологии, Биологический факультет, МГУ им. М.В. Ломоносова).

Определение концентрации белков. Концентрацию белков определяли спектрофотометрически, используя известные коэффициенты экстинции, или по методу Лоури (Lowry et al., 1951), используя бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве стандарта.

Электрофорез и денситометрия. Препараты белков и экстракты клеток подвергали электрофорезу в пластинах полиакриламидного геля 6-12% в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН) по методу (Laemmmi, 1970). Гель окрашивали Кумасси-Я-250, отмывали, высушивали, сканировали с помощью сканера Hewlett-Packard HP и проводили денситометрический анализ с помощью программы NIH Image версия 2,0.

Иммуноблоттинг проводили по методу (Towbin et а., 1970) с модификациями. Электроперенос проводили на фильтры PVDF или нитроцеллюлозы (Amersham, Великобритания). Использовали моноклональные антитела к КЛЦМ (клон К36, Sigma, США), к последовательности Strep-tag (IBA, Германия), вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham, Великобритания). Белковые полосы выявляли хемилюминесцентной детекцией (Amersham, Великобритания) или З'-диаминобензидином (Sigma, США).

Электронная микроскопия. Исследуемые белковые смеси инкубировали при 20°С в течение 20-30 минут, после чего разбавляли соответствующим буфером до конечной концентрации белков в растворе 50-100 мкг/мл. Разведенные образцы быстро наносили на покрытые Формваром и напыленные углеродом сетки, которые были гидрофилизированы путем облучения ультрафиолетом. На сетки наносили 1% уранил ацетат, инкубировали 2 минуты и промывали 5 раз раствором 1% уранил ацетата. Электронную микроскопию проводили на микроскопе JEM 100СХ при ускоряющем напряжении 100k V. Увеличение калибровали по периоду кристалла каталазы.

Дифференциальное центрифугирование. При исследовании связывания уникального домена КЛЦМ210 с Ф-актином (6-25 цМ) использовали буфер МРВ при температуре 25°С. Димеры тубулина (13 цМ) полимеризовали в микротрубочки в присутствии 10 цМ таксола в буфере ПЕМ (100 мМ Pipes, рН 6,8, 1 мМ MgC^ 1 мМ ЭГТА, 1мМ ГТФ) при +37°С в течение 20 минут.

Перед экспериментом все не полимерные белки центрифугировали при 100 000 х g 30 мин в роторе LP42Ti (Beckman, США) при 20°С, чтобы осадить возможные агрегаты. Все конструкции уникального домена КЛЦМ210 вносились в пробу (50 цл) последними. Образцы инкубировали 30 мин при 25°С. Образцы подвергали ультрацентрифугированию при указанном выше режиме и отбирали надосадочную жидкость и осадок для анализа с помощью электрофореза. При исследовании связывания с микротрубочками пробу наносили на «глицериновую подушку» (буфер ПЕМ, 30% глицерина, 70 мМ NaCI, 70 цМ таксола, 20 цМ РМЕ, 1 цМ ГТФ).

Определение участков фосфорилирования в уникальном домене КЛЦМ210 методом масс-спектрометрии. Определение выполняли совместно с д-ром Т.Дж. Лукасом (Северо-Западный Университет, Чикаго, США). Конструкцию N1-201 фосфорилировали ПКА, подвергали ДСН-ПААГ электрофорезу, вырезали полосу белка после окрашивания Кумасси-Я-250, затем проводили трипсинолиз белка в фрагментах геля и экстрагировали пептиды. Смесь пептидов

фракционировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии сначала на катионообменной колонке, а затем на стандартной колонке С18 с обращенной фазой. Элюат с помощью нанонасоса подавался на вход тандемного (MS/MS) масс-спектрометра Agilent 1100 ХСТ, оснащенного нановпрыском и ионной ловушкой. Масс-спектры анализировали с помощью программного обеспечения Agilent Spectrum Mill (Agilent, США).

Фосфорилирование белков in vitro. Очищенные фрагменты уникального домена КЛЦМ210 фосфорилировали каталитической субъединицей цАМФ-зависимой протеинкиназы, ПКА (NEB, США). Степень фосфорилирования определяли по включению радиактивности, используя у-[32Р]АТФ в качестве субстрата. Все реакции фосфорилирования проводили при 30°С в ФБ (10 мМ MOPS, pH 7.0, 50 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 5 мМ MgCL, 0,2 мМ ЭГТА в присутствии 1мМ АТФ.

Культура эукариотических клеток. Фибробласты линии CV-1 из почки африканской зеленой мартышки или клетки линии HeLa культивировали на покровных стеклах в среде ДМЕМ с добавлением 10% ЭТС. Клетки, достигшие 50-70% конфлуентности, трансфицировали pN 1-201 FLAG, pN27-157FLAG, pNl-452GFP или pOIJM210GFP используя трансфекционный реагент Максифектин-21 (Пеплайн, Россия) и протокол производителя. Через 24-72 часа клетки либо обрабатывали ингибитором 10 цМ ML-7 в течение 1 часа при 37°С и затем фиксировали, либо сразу фиксировали 3.7% формалином в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) 5 мин при комнатной температуре и обрабатывали 1% Тритоном Х-100 в ФСБ в течение 1 мин. Клетки обрабатывали антителами к FLAG последовательности и вторыми флуоресцентно мечеными антителами, а также ТРИТЦ-фаллоидином (для визуализации актиновых филаментов). Для визуализации микротрубочек, клетки через 24-72 часа после трансфекции промывали троекратно ФСБ, и фиксировали в метаноле 10 мин при -20°С. Далее последовательно промывали буфером на основе ФБС, содержащим 75%, 50% и 25 % метанола, по 3 мин каждым, и чистым ФСБ. Проводили окрашивание антителами против ß-тубулина (Sigma, США). После заключения стекол в среду AquaPolymount (США) иммунофлуоресцентные изображения получали с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200М (Германия) и снимали на цифровую камеру высокого разрешения AxioCam, управляемую программой Axiovision v.3.1. Окончательно изображения монтировали в программах Adobe Photoshop v.6.0 и PowerPoint 2000.

Экстракционный анализ. Клетки линии HeLa культивировали на пластиковых чашках в среде ДМЕМ с добавлением 10% ЭТС. Клетки, достигшие 50-70% конфлуентности, трансфицировали pN27-157FLAG и его мутантами, как было описано выше. Через 24 часа клетки либо обрабатывали 0,5 мкМ окадаиковой кислоты и 100 мкМ 8-Вг-сАМР в течении 30 мин при 37°С и затем проводили экстракцию тритон-содержащим буфером, либо сразу проводили экстракцию буфером на основе ФСБ рН 7,4, содержащим 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭГТА, 0,5% Triton Х-100, 1 мМ DFP. Клетки на чашках Петри промывали фосфатно-солевым буфером, вносили 50 мкл буфера экстракции, инкубировали 10 мин на льду при покачивании, собирали растворимую часть экстракта и добавляли Зх буфер образца. На чашки с детергент-нерастворимой клеточной фракцией наносили 75 мкл 1хбуфера образца и собирали (фракция осадка). Образцы анализировали с помощью ДСН-электрофореза в 10% полиакриламидном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

К моменту начала выполнения этой работы было известно, что помимо актин-связывающего участка на С-конце уникального домена КЛЦМ210, состоящего из двух повторов типа DXRXXL, существует дополнительный участок связывания с актином, но не было установлено его расположение. Помимо этого было установлено, что уникальный домен КЛЦМ210 может фосфорилироваться в клетках HeLa (Dulyaninova and Bresnick, 2004), но не были выявлены участки фосфорилирования и не было показано его функциональное значение. Предварительные исследования, проведенные в лаборатории клеточной подвижности д-ром Д.С. Кудряшовым, показали, что уникальный домен КЛЦМ210 без DXRXXL повторов является также субстратом ПКА in vitro. В развитие этих исследований мы поставили задачу более точно локализовать потенциальный актин-связывающий участок в уникальным домене КЛЦМ210 и выявить возможные взаимодействия ее аминотерминального домена с другими компонентами цитоскелета. Одновременно была поставлена задача идентифицировать участки, фосфорилируемые ПКА в уникальном домене КЛЦМ210, и попытаться выяснить функциональное значение этих модификаций.

Создание генетических конструкций уникального домена КЛЦМ210. Для изучения свойств уникальной N-концевой области КЛЦМ210 мы сконструировали ее фрагменты, соответствующие Ig С2 подобным доменам и фланкирующим их последовательностям в различных форматах. Были созданы конструкции для бактериальной экспрессии в клетках E.coli и для эукариотической экспрессии: N452-

875, N1-452, N1-201, N1-116, N27-157 (конструкции N1-116 и N452-875 оказались не растворимы в физиологическом буфере и в дальнейшей работе не использовались). Дополнительно были созданы конструкции мутантных форм N27-157, имитирующие фосфорилирование по серинам 140 и 149, были произведены замены остатков серинов на аспарагиновую кислоту. Все конструкции были клонированы с кДНК курицы, нумерация аминокислотных остатков соответствует таковой у последовательности КЛЦМ210, опубликованной Watterson et al. (1995) (Рис.1).

КЛЦМ210 > ________КЛЦМ108 >_KRP

"Г

lgG-C2 домены D(V/F)RXXL

повторы

N1-452 — GFP-HTI -хбГис

N1-201 — FLAG-ЯГ"!]-ХбГис

N27-157 — FLAG-] Щ -StrepTag

N452-875 —

N116— И I I I ■

> нерастворимы

Рисунок 1. Схематическое представление используемых в работе конструкций. Белыми квадратами обозначены ^ С С2-подобные домены, черными - части полипептидной цепи с неизвестной структурой

Фрагмент N1-452 колокализуется с актином и микротрубочками в немышечных клетках. Для изучения внутриклеточного распределения N1-452 был использован метод световой флуоресцентной микроскопии. В культивируемые фибробласты С\М был трансфицирован химерный конструкт N1-452-вРР методом липофекции. вРР обладает собственной флуоресценцией, благодаря этому химерный белок, экспрессирующийся в клетках, также имеет способность к флуоресценции.

Рисунок 2. Фрагмент N1-452-GFP колокализуется с микрофиламентами в культивируемых клетках CV-1. Клетки CV-1 трансфицировали вектором N1-452-GFP, через 24ч. фиксировали, пермеабилизовали и окрашивали ТРИТЦ-фаллоидином для визуализации актиновых филаментов (Б), или антителами к ß-тубулину(Е). N1-452-GFP колокализовался с актиновыми волокнами напряжения (В) и с единичными микротрубочками (Ж, стрелки). В и Ж наложение картин А, Б и Д Е, соответственно. Г и 3 - изображения В и Ж обработанные программой Adobe Photoshop для контрастирования колоколизующихся структур (функция multiply) (масштабный отрезок, 25 /ш).

Через 24 часа после трансфекции конструктом Ы1-452-СРР зафиксированные и пермеабилизованные клетки были окрашены ТРИТЦ-фаллоидином для выявления пучков актина и антителами к Р-тубулину (вторые антитела коньюгированы с красным флуорохромом Алекса 594). Рис. 2 А и Д отражает флуоресценцию 1Ч1-452-ОРР в двух клетках СУ-1. На панелях Б и Е эти же клетки окрашены антителами для визуализации актиновых пучков и микротрубочек. Как видно на рис 2 В и Ж фрагмент М1-452-СРР колокализовался с пучками микрофиламентов и микротрубочками.

Для уточнения возможности взаимодействия конструкции N1-452-ОРР с тубулином мы провели дополнительный эксперимент (Рис. 3).

¿Г А 1 ^ 4Г Б * те ш ,, | К ж ^^

Г г * г д г Е * -

Рисунок 3. Фрагмент Ш-452-СРР колокализуется с микротрубочками и растворенным тубулином в цитоплазме культивируемых клеток СУ-1.

Клетки СУ-1 трансфицировали вектором Ь'1-452-СГР, через 24ч. обрабатывали в течение 2,5 часов 7/.¿М нокодазола (А, Б), или через 1 час после отмывки (Г, Д) фиксировали и окрашивали антителами к (З-тубулину. N1-452-ОРР колокализовался с растворенными дилерами тубулина и с единичными микротрубочками (показано стрелками). В и Е наложение картин А, Б и Г, Д соответственно. Двойные стрелки указывают на места колокализации с кортикальными актиновыми филаментами (масштабный отрезок, 25 /лм).

Клетки СУ-1, экспрессирующие 1Ч1-452-СРР, были обработаны в течение 2,5 часов 7цМ нокодазолом, веществом, приводящим к разборке микротрубочек. Проведенное совмещение окрасок Ж-452-СРР (А) и антител к (3-тубулину (Б) выявило колокализацию с димерами тубулина в цитоплазме клеток СУ-1, а также с микротрубочками, которые не подверглись разборке под действием нокодазола (В).

В клетках СУ-1 экспрессирующих "1Ч1-452-СРР и отмытых от нокодазола в течение 1 часа происходило восстановление микротрубочек, и полипептид Ы1-452-ОРР также колокализовался с ними (Рис. 3 Е). Наиболее ярко колокализация отмечалась с периферическими кольцевыми пучками микротрубочек, но не с типичными интерфазными микротрубочками, берущими начало от центросомы. Одновременно на панелях А, В, Г и Е наблюдается колокализация Н1-452-СРР с кортикальными актиновыми филаментами (показано двойными стрелками).

Фрагменты N1-201 и N27-157 колокализуются с актином в немышечных клетках. Более короткий фрагмент уникального домена КЛЦМ210 N1-201 трансфицированный в фибробластах СУ-1, также как Ш-452-ОРР, колокализуется с актиновыми волокнами напряжения. На

Рисунок 4. Фрагмент 1Ч1-201-Р^ колокализуется с филаментами актина в культивируемых клетках СУ-1.

Клетки СУ-1 трансфицировали вектором N1-201-РЬАС, через 24ч. фиксировали, пермеабилизовали и окрашивали антителами к Р1а^-последовательности (А) и ТРИТЦ-фаллоидином для визуализации актиновых филаментов (Б).

рис. 4 на панели А показана клетка, окрашенная антителами к РЬАО-последовательности, произошедшей из экспрессионного вектора. На панели Б показана та же клетка, окрашенная ТРИТЦ-фаллоидином для выявления пучков актина. При сравнении панелей А и Б обнаруживается колокализация актиновых филаментов и конструкции N1 -201.

Аналогично, конструкция №7-157-Р1а§ была экспрессирована в культивируемых клетках НеЬа (Рис.5, панель А). Показана группа клеток окрашенных антителами к РЬАО-последовательности (вторые антитела коньюгированы с зеленым флуорохромом Алекса 488). На панели Б та же группа клеток окрашена ТРИТЦ-фаллоидином.

Совмещение окрасок приводит к появлению желтого окрашивания, что говорит о колокализации конструкции N27-157 и пучков актиновых филаментов (Рис.5 В). Однако ни для N1-201, ни для N27-157 экспрессированных в культивируемых клетках не было обнаружено колокализации с микротрубочками.

Рисунок 5. Фрагмент N27-157^^ колокализуется с микрофиламентами в культивируемых клетках НеЬа. Клетки Не1а трансфицировали вектором Ы27-!57-РЬАС, через 24ч. фиксировали, пермеабилизовали и окрашивали антителами к Ркщ-последователыюсти (А) и ТРИТЦ-фаллоидином для визуализации актиновых филаментов (Б). N27-I57-FLAG колокализовался с актиновыми волокнами (В) (масштабный отрезок, 100 //м).

Таким образом, мы заключили, что участки взаимодействия с микрофиламентами и микротрубочками расположены в первой половине уникального домена КЛЦМ210, но не выяснили, взаимодействует ли уникальный домен непосредственно с актином и тубулином.

Сравнение защитного действия КЛЦМ210 и N1-452 на микрофиламенты в культивируемых клетках. Изложенный ниже эксперимент был поставлен с целью оценить относительное сродство связывания полноразмерной КЛЦМ210 ее ^концевого фрагмента с микрофиламентами в клетках (Рис. 6).

Под воздействием ингибитора каталитической активности КЛЦМ МЬ-7 миозин дефосфорилируется и его филаменты распадаются. Поскольку активированный миозин является основным стабилизатором волокон напряжения в клетке, его инактивация влечет за собой разборку пучков актиновых филаментов. Именно такой ожидаемый эффект наблюдался в клетках С\М, гиперэкспрессирующих N1-452. В то же время в клетках, гиперэкспрессирующих КЛЦМ210, разборки пучков актиновых филаментов не происходило (Рис. 6В, Г), при этом форма филаментов из «натянутой» превратилась в волнообразную (Рис. 6Г), что может отражать ослабление натяжения микрофиламентов в отсутствие моторной активности миозина. Однако присутствие

КЛЦМ210 защищает пучки микрофиламентов от разборки

ЕЯ Б

S • ' -V

\ • i /.'; ' Ч-ЧУ [ j -

Рисунок 6. КЛЦМ210 в трансфицированных клетках защищает актиновые стресс-фибриллы от деградации, вызванной действием ингибитора каталитической активности КЛЦМ МЬ-7. Приведены клетки СУ-1 с гиперэкспрессией конструкций фрагмента N1-452 уникального домена КЛЦМ210 (верхняя панель) и полноразмерной КЛЦМ (нижняя панель) конъюгированных с С/7/> (А и В, соответственно) после инкубации с ингибитором КЛЦМ - МЬ-7 (10рМ). На панели Б и Г актиновые филаменты окрашены ТРИТЦ-фаллоидином. Гиперэкспрессия конструкции КЛЦМ2 ЮСРР предотвращала разборку стресс-фибрилл, вызванную ингибитором каталитической активности КЛЦМ (Г). Конструкция М1-452СГР не оказывает подобного защитного действия на актиновый цитоскелет, который оказался деструктурированным после обработки ингибитором КЛЦМ МЬ-7 (Б) (масштабный отрезок, 25 рм).

Связывание фрагмента N452 с актином и тубулином. Для

подтверждения взаимодействия конструкций уникального домена КЛЦМ210 с микрофиламентами и микротрубочками, которое выявилось в экспериментах на трансфицированных клетках, мы изучили связывание этих белков с актином и тубулином in vitro методом дифференциальной седиментации. Принцип метода состоит в том, что при ультрацентрифугировании филаментарные белки переходят в осадок, а мономерные/олигомерные белки остаются растворенными в надосадочной фракции. Если филаментарные белки и белки интереса

взаимодействуют, то после совместной инкубации и последующего центрифугирования белки интереса окажутся в осадочной фракции.

Рисунок 7. Связывание конструкции N452 с актином и микротрубочками in vitro. Связывание фрагмента N1-452 с Ф-актином (А) и микротрубочками (МТ) (Б) исследовали методом дифференциапьного ультрацентрифугирования. Фрагмент инкубировали в присутствии и отсутствии филаментарных белков, затем смеси подвергали центрифугированию lOOOOOxg. Надосадочные жидкости (и) и осадки (о) анализивали электрофорезом в ПААГ и окрашивали Кумасси R-250. БСА - бычий сывороточный альбумин. Представлены типичные электрофореграмм ы.

Экспрессированный в E.coli фрагмент уникального домена КЛЦМ210 N1-452 подвергали центрифугированию в присутствии Ф-актина или микротрубочек. Повышение концентрации фрагмента при постоянной концентрации Ф-актина или микротрубочек в инкубационной смеси приводит к дозозависимому увеличению

Рисунок 8. Дифференциальное центрифугирование Ф-актина (А) и микротрубочек (Б) в присутствии N1-452. Актин (13 цМ) или

полимеризованный тубулин (3,5 цМ) инкубировали в течение 30 минут в присутствии повышающихся концентраций N1-452. Образцы центрифугировали в ультрацентрифуге как указано в Материалах и методах. Содержание белков в осадке и надосадочной фракциях оценивали методом электрофореза в ПААГ. Гель окрашивали Кумасси Я-250, соотношение плотностей белковых полос в осадках и надосадочных фракциях оценивали с помощью программы NIH-Image. На основании полученных данных были построены кривые связывания и вычислены Кс1 с использованием метода нелинейной регрессии в программе СгарИРас/ Рг 'ит.

А

N1-452 _

- 12мМ

bCi

N "1-452 тубупин

+ МТ

12 рМ

12рМ

содержания фрагмента в осадочной фракции (Рис.7). Кривые связывания, построенные на основании распределения белка в осадке и надосадочной фракциях, позволили рассчитать кажущуюся константу диссоциации (Kj). Для взаимодействия N1-452 с ф-актином Kd составила

7.4 цМ, а для взаимодействия с микротрубочками - 5,6 цМ. Стехиометрия связывания N452 с актином в соотношении 2,1:1 (моль/моль), с тубулином 1,8:1 (моль/моль) (Рис.8).

Взаимодействие фрагментов N1-201 и N27-157 с Ф-актином in vitro. Аналогичные эксперименты по связыванию с актином провели с конструкциями N1-201 и N27-157 и определили кажущуюся константу диссоциации (Kd) и молярное соотношение при насыщении: для N1-201 -

5.5 цМ и 1:1.4=Ш-201:актин; и для N27-157 - 5.6 цМ и 1:1,85=N27-157:актин.

Значения К^ к актину использованных нами конструкций уникального домена КЛЦМ210 оказались примерно одинаковыми, поэтому можно предположить, что все конструкции имеют единый сайт связывания с актином. Из литературы известно, что короткая конструкция, включающая 128 аа. с N-конца КЛЦМ210 не связывается с микрофиламентами (Chen et al., 2006). Исходя из этого можно полагать, что область связывания с актином расположена между остатками 128 и 157. Интересно отметить, что в этой области расположен участок 145EHRPSI150 гомологичный DXRXXL мотиву центрального сайта связывания с актином КЛЦМ210.

Мы не обнаружили взаимодействия конструкций N1-201 и N27-157 с микротрубочками in vitro, что согласовывается с результатами флуоресцентного окрашивания немышечных клеток, экспрессирующих эти конструкции.

Влияние N1-452 на сборку и взаимодействие микротрубочек. Ввиду внутриклеточной колокализации конструкции N1-452 с тубулином, мы предположили, что N1-452 может служить «затравкой» для сборки микротрубочек. Эту гипотезу проверяли с помощью метода светорассеяния, которое возрастает при повышении содержания микротрубочек в инкубационной смеси. Анализ светорассеяния смеси димеров тубулина и N1-452 показал, что при соотношении в растворе фрагмента и тубулина 1:1,5 (моль/моль) происходит быстрое возрастание поглощения при длине волны 330 нм с выходом на плато через 8 минут от внесения фрагмента N1-452 в раствор тубулина (Рис. 9, А). Увеличение концентрации фрагмента N1-452 в растворе до молярного соотношения 1:0,8 вызывает еще небольшое увеличение поглощения раствора тубулина на протяжении последующих 8 минут эксперимента. Внесение затем 5цМ таксола, агента, вызывающего

сборку микротрубочек, увеличению поглощении.

приводило к

о с с

15

Время, мин

резкому и значительному

Рисунок 9. N1-452 связывается и вызывает агрегацию димеров тубулина in vitro.

Измерят светорассеяние смеси димеров тубулина (2/.iM) при добавлении N1-452 (по 1,ЗрМ) и затем таксола (5/.iM). Панели справа - пробы до начала ^ эксперимента (А) и перед Щ добавлением таксола (Б) были проанализированы методом электронной микроскопии (масштабный отрезок. 240 нм).

Электронномикроскопический анализ смеси белков в начале эксперимента и перед внесением таксола показал, что образуются агрегаты тубулина, но сборки микротрубочек не происходит (Рис. 9 Б).

На рисунке 10 представлены электронные микрофотографии

контроль

В

Рисунок 10. В присутствии конструкции N1-452 происходит образование пучков микротрубочек, а также их ветвление. Внесение таксола (2/.1М) в смесь димеров тубулина вызвало сборку микротрубочек (контроль), а внесение к уже собранным микротрубочкам конструкции N1-452 приводило к образованию пучков микротрубочек (Б) и возникновению ветвящихся структур (В, Г). (масштабный отрезок: 100 нм (А, Б иВ), на вставке В - 20 нм. 240 нм (Г).

контрольных микротрубочек, образованных при добавлении к тубулину 5 цМ таксола, и пучков микротрубочек индуцированных таксолом в присутствии N1-452. Видна латеральная агрегация микротрубочек и образование ветвящихся структур, состоящих из микротрубочек. Дополнительных контрастированных структур в местах отхождения микротрубочек от боковой поверхности других микротрубочек обычно не наблюдалось. Образование ветвящихся микротрубочек в присутствии домена внутриклеточного белка показано нами впервые. Возможно, КЛЦМ210 играет в отношении микротрубочек в клетке такую же роль, какую играет комплекс белков Агр 2/3, WASP/кортактин в ветвлении актиновых филаментов в кортикальной цитоплазме (Weaver et al., 2003).

Вышеизложенные результаты показали, что N-концевом домене КЛЦМ210 функционирует как минимум еще один актин-связывающий участок, вероятно, представленный последовательностью 145EHRPSI150 гомологичной DXRXXL мотиву из центрального актин-связывающего участка КЛЦМ210. Также было показано, что помимо микрофиламентов N1-452 может взаимодействовать с тубулином и микротрубочками 5п vitro и в клетках. Аффинность уникального домена к микротрубочкам сравнима с его сродством к микрофиламентам, что позволяет предположить сходную динамику взаимодействия с обоими цитоскелетными компонентами и возможность менять адресацию, что еще больше расширяет спектр взаимодействий КЛЦМ210 в клетке и позволяет рассматривать ее, как связующее звено между двумя основными филаментарными системами цитоскелета. Пока остается неясным, может ли уникальный домен КЛЦМ210 одновременно связываться с микрофиламентами и микротрубочками или эти процессы взаимоисключающие.

Описанные находки побудили нас исследовать возможные способы регуляции взаимодействия уникального домена КЛЦМ210 с белками цитоскета. Одним из возможных способов регуляции белок-белковых взаимодействий является фосфорилирование и было установлено, что уникальный домен КЛЦМ210 фосфорилирован в клетках HeLa (Dulyaninova and Bresnick, 2004).

Влияние фосфорилирования уникального домена КЛЦМ210 протеинкиназой А на его связывание с микротрубочками in vitro.

Фосфорилирование фрагмента N1-452 протеинкиназой А.

Анализ первичной структуры уникальной последовательности КЛЦМ210 выявил несколько потенциальных участков фосфорилирования протеинкиназой А. Фосфорилирование in vitro показало, что в присутствии каталитической субъединицы

протеинкиназы А происходит включение 1,2 моль неорганического фосфата на моль N1-452 (рис 11).

Рисунок 11. Фосфорилирование фрагмента N1-452 протеинкиназой А (ПКА) in vitro. Представлена кинетика фосфорилирования фрагмента N1-452 после добавления протеинкиназы А (ПКА). Время инкубации по оси абцисс. По оси ординат - количество неорганического фосфата включенного на моль фрагмента N1-452.

1.4 f ,2 см' 1

Щ 0.8 5 Об

©* 0 4 0.2 0

50 „ 100 150 200 Время, мин

Фосфорилирование N1-452 протеинкиназой А практически не влияет на его связывание с микротрубочками. Было исследовано связывание фосфорилированного и контрольного фрагментов N1-452 с тубулином методом соосаждения. Мы обнаружили, что практически одинаковое количество фосфорилированного и нефосфорилированного фрагмента обнаруживается в осадке с микротрубочками по сравнению с контрольным N1-452 (Рис. 12).

Смесь О О Смесь О О

60 А ВС А

P-N1-452 N452

ту бу.п и н ШЯ^ттт ту буя и н

+ МТ - МТ + МТ ' - мт

Рисунок 12. Влияние фосфорилирования протеинкиназой А конструкции N1-452 на связывание с микротрубочками in vitro.

Метод коседиментации показывает, что в осадке с микротрубочками обнаруживается сравнимое количество фосфорилированного фрагмента КЛЦМ210 и нефосфорилированного белка. Самоосаждение фрагментов КЛЦМ210 не превышает 10% и не зависит от фосфорилирования. о - осадок, смесь- образец до центрифугирования, БСА - бычий сывороточный альбумин, МТ - микротрубочки

Фосфорилирование фрагмента N27-157 протеинкиназой А.

Мы оценили способность к фосфорилированию in vitro фрагмента N N27-157. Оказалось, что ПКА введенная в инкубационную смесь приводила к включению 0,7 моль неорганического фосфата на моль N27-157.

Фосфорилирование N27-157 протеинкиназой А ослабляет его связывание с актином. При сравнении результатов соосаждения с Ф-актином аминотерминального фрагмента N27-157 и N27-157, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой, обнаружилось,

что фосфорилирование значительно ослабляет взаимодействие N27-157 с Ф-актином. Если фрагмент N27-157 связывался с Ф-актином с молярным соотношением при насыщении 1:1,85=актин: N27-157, то в случае фосфорилированного N27-157 не удалось достичь насыщения им Ф-актина и определить и стехиометрию взаимодействия (Рис.13).

2.5-

5 10 15 20 25

N27-157CBo6. цМ

Актин 5 jiM

2.5 рМ 5 рМ 7.5 рМ lOpM

10 р М

Z 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.017.5 20.022.5

P-N27-157CBo6 . цМ

Рисунок 13. Анализ связывания N27-157 и P-N27-157 с Ф-актином. Кривые связывания (А, Б), построенные на основании данных денситометрии полиакриламидных гелей (В, Г), соответственно.

Идентификация участков фосфорилирования

протеинкиназой А в уникальном домене КЛЦМ210. Для выявления участков фосфорилирования аминотерминального домена КЛЦМ210 мы провели фосфорилирование ПКА конструкции N1-201 и подвергли её масс-спектрометрическому исследованию. Анализ спектров позволил идентифицировать пептид: ^TPGGRLsVPPVEHRPsIWGESPPKuy, в котором серины 140 и 149 были фосфорилированы.

На основании полученных данных были сконструированы фосфоимитирующие мутанты N27-157(S149D) и N27-157(S140D;S149D) для определения влияния фосфорилирования ПКА уникального домена КЛЦМ210 на его взаимодействие с белками цитоскелета.

Взаимодействие фосфоимитирующих мутантов N27-157 с цитоскелетом. Мы изучили относительную прочность связывания фосфоимитирующих конструкций N27-157 с цитоскелетом клеток HeLa,

применив метод дифференциальной экстракции (КиёгуазЬоу е! а1., 1999). Клетки были трансфицированы контрольным вектором, кодирующим N27-157 и векторами, несущими N27-157(81490) и N27-157(814(Ю;81490), в которых была произведена замена серинов 140 и 149 на остатки аспарагиновой кислоты.

Клетки на чашках Петри обрабатывали буфером экстракции, содержащим Тритон Х-100. Затем методом иммуноблоттинга определяли распределение N27-157 и его фосфомутантов между растворимой и нерастворимой (цитоскелетной) фракциями.

Было установлено, что N27-157 примерно поровну содержится в растворимой и цитоскелетной фракциях клеток НеЬа, в то время как содержание фосфоимитирующих мутантов N27-157 в цитоскелетной фракции было в 2 раза ниже (Рис.14). Достоверных различий в экстрагируемости между одиночным и двойным фосфомутантами обнаружено не было.

го

ш н 90

о

ф ао

У

Ц 70

О 5С 60

О и 50

Ф

3 40

ю

о 30

1-

о 20

10

ю 0

Г"

Г~-

см

г

п=12, р<0.05

I-1

экстр, цито. N27-157

экстр, цито.

N27-157 (81490)

экстр, цито.

N27-157 (Б14(Ш;81490)

Рисунок 14. Взаимодействие фосфомутантов N27-157 с цитоскелетом клеток НеЬа. Проводили экстракциию тритон-содержащим буфером фрагмента N27-157 и его фосфомутантов с компонентов цитоскелета клеток НеЬа (см. Материалы и методы). Распределение связанной и растворимой форм фрагмента N27-157 и его мутантных форм, имитирующих фосфорилирование по серину 149 (N27-157(81490)) и серинам 140 и 149 (N27-157(51400:81490)), выражено в процентах от общего количества изоформы N27-157. Экстр. - экстрагированный белок, Цито.-белок, связанный с компонентами цитоскелета. (*р<0.05)

Активация протеинкиназы А в клетках HeLa сопровождается уменьшением связывания N27-157 с цитоскелетом.

Метод дифференциальной экстракции был применен для изучения связывания N27-157 с цитоскелетом клеток HeLa, в которых искусственно повышали активность протеинкиназы А. Для этого клетки, экспрессирующие N27-157, инкубировали в присутствии 100 мкМ 8-Вг-сАМР в течении 30 мин и одновременно обрабатывали 0,5 мкМ окадаиковой кислотой для ингибирования фосфатаз. Такая обработка клеток приводила к тому, что снижалось содержание N27-157 в цитоскелетной фракции, и повышалось его содержание в растворимой фракции (Рис. 15).

ф

э

ю о

70 60 50 40 30 20 10 0

п=9, р<0.05

I-1

* É

экстр. цито. экстр. цито.

контроль эксперимент

Рисунок 15. Экстракция фрагмента N27-157 с компонентов цитоскелета клеток Hela, обработанных 0,5 мкМ окадаиковой кислоты и 100 мкМ 8-Вг-сАМР , выше, чем у не обработанных. Клетки HeLa трансфицировали конструкцией N27-157-Flag. Обрабатывали тритон-содержащим буфером, собирали образцы: экстр. -экстрагированный белок, цито,- белок, связанный с компонентами цитоскелета. Анализировали относительное содержание N27-157 методом иммуноблоттинга с помощью антител против последовательности Flag. (*р<0.05)

Таким образом, мы впервые продемонстрировали, что фосфорилирование уникального домена КЛЦМ210 по участкам ПКА является негативным регулятором его взаимодействия с цитоскелетом. Интересно, что один из идентифицированных фосфосеринов (фосфосерин 149) входит в состав потенциального актин-связывающего мотива 145EHRPSI150, а фосфосерин 140 находится в непосредственной близости от этого мотива. На основании этих данных мы предполагаем, что реализуется простой механизм ингибирования взаимодействия уникального домена с микрофиламентами - путем модификации его контактного участка и снижения сродства к актину.

* * *

На основании полученных нами результатов и литературных данных, можно предложить следующую схему функциональных свойств КЛЦМ210 (Рис.16).

Рисунок 16. Схема функциональных свойств КЛЦМ210 (объяснения в тексте).

Согласно этой схеме, КЛЦМ210 прочно связана своим центральным актин-связывающим участком с пучками актиновых филаментов клетки, а N-конец и С-конец молекулы могут обратимо взаимодействовать с другими компонентами цитоскелета и регуляторными белками. С-концевой KRP домен выполняет функцию захвата мономеров немышечного миозина и представления их каталитическому центру киназы. В результате их фосфорилирования локально в области расположения КЛЦМ210 будут формироваться филаменты миозина, которые наиболее вероятно будут взаимодействовать с ближайшими к ним микрофиламентами и развивать усилие. Таким образом, в ответ на вход Са2+ в немышечную клетку домены сократительной активности будут возникать в тех областях клетки, где локализуется КЛЦМ210. N-концевая часть КЛЦМ210 сшивает сокращающиеся микрофиламенты с другими микрофиламентами и микротрубочками и за счет локального изменения механических свойств цитоплазмы способствует распространению тянущего усилия. Дополнительно, аминотерминальный домен КЛЦМ210 может влиять на архитектуру микротрубочек в клетке, что важно для направленного движения, прикрепления к субстрату и некоторых специальных видов клеточной подвижности, например, барьерной функции эндотелиального монослоя. Известно, что повышение активности ПКА в эндотелии усиливает его барьерную функцию (Carson et al., 1989). Одним из возможных механизмов этого явления может быть снижение каталитической активности эндотелиальной КЛЦМ210, а также, согласно нашим данным, ее цитоскелет-связывающей активности.

Мономеры миозина

Выводы

1. Обнаружены новые участки связывания КЛЦМ210 с актином и тубулином, расположенные в аминотерминальной половине уникальной последовательности этого белка.

2. цАМФ-зависимая протеинкиназа фосфорилирует Сер 140 и Сер 149 в уникальном домене КЛЦМ210 курицы.

3. Фосфорилирование уникального домена КЛЦМ210 цАМФ-зависимой протеинкиназой ингибирует его взаимодействие с актиновыми филаментами in vitro, а фосфоимитирующие мутанты этого белка слабее связываются с цитоскелетом в клетках HeLa.

4. Согласно предложенной модели, уникальный домен КЛЦМ210 осуществляет регулируемое взаимодействие с цитоскелетными структурами и, таким образом, участвует в организации подвижности немышечных клеток.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Vilitkevich, E.L., Dudnakova, T.V., Krymsky, М.А., Khapchaev,

A.Yu., Sidorova, M.V., Bespalova, Zh.D., Shirinsky, V.P., Vorotnikov, A.V. Phosphorylation-dependent intracellular interactions of myosin light chain kinase and kinase related protein. Abstracts of International Simposium «Biological Motility: New Trends in Research» - Pushchino, Russia, 2001, 169-171.

2. Khapchaev, A.Yu., Krymsky, M.A., Vilitkevich, E.L., Sidorova, M.V., Bespalova, Zh.D., Wang, C.-L.A., Shirinsky, V.P. Phosphorylation affects intracellular interactions of myosin light chain kinase and kinase related protein (telokin). J. Muscle Res. Cell Motil., 2002,23(1):40.

3. Shirinsky, V.P., Dudnakova, T.V., Dergilev, K.V., Stepanova, O.V., Vilitkevich, E.L., Van Eldik, L.J., Watterson, D.M. Cellular models with altered expression of genetic products of the myosin light chain kinase. HHM Meeting of International Research Scholars, June 23-26, 2004, Tallinn, Estonia,70.

4. Вилиткевич E.JI., Кудряшов Д.С., Степанова O.B., Ширинский

B.П. Новый актин-связывающий участок 210 кДа молекулярной киназы легких цепей миозина. Физиологический журнал им.И.М. Сеченова, 2004, 90:577-85.

5. Stepanova, O.V., Vilitkevich, E.L., Kudryashov, D.S., Nikonenko, T.A.,Lukas, T.J.,Watterson, D.M., Shirinsky V.P. Characterization of the novel actin-binding region of 210 kDa myosin light chain kinase. Abstracts of International Symposium "Biological Motility", May 23 - June 1, 2004, Pushchino, Russia, 104-105.

6. Kudryashov, D.S., Stepanova, O.V., Vilitkevich, E.L., Nikonenko, T.A., Nadezhdina, E.S., Shanina, N.A., Lukas, T.J., Van Eldik, L.J., Watterson, D.M., Shirinsky, V.P. Myosin light chain kinase (210 kDa) is a potential cytoskeleton integrator through its unique N-terminal domain. Exp Cell Res. 2004, 298(2): 407-417.

7. Chadin, A.V., Dudnakova, T.V., Dergilev, K.V., Stepanova, O.V., Vilitkevich, E.L., Tiruppathi, C., Van Eldik, L.J., Watterson, D.M., Shirinsky, V.P. Products of the myosin light chain kinase locus in the vertebrate genome regulate structure and function of the cellular motile system. HHM Meeting of International Research Scholars, June 22-25, 2005, Merida, Mexico, 33.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вилиткевич, Елена Леонидовна

Список используемых сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Подвижность немышечных клеток.

Миозины II типа.

Киназы легких цепей миозина.

Гены КЛЦМ.

Экспрессия КЛЦМ210 в тканях организма.

Строение и функциональные свойства КЛЦМ210.

Аминотерминальный домен.

Каталитический домен.

Регуляторный сегмент.

КНР домен и связывание с миозином.

Связывание с актином.

Фосфорилирование КЛЦМ210.

Участие КЛЦМ210 в регуляции клеточной подвижности.

Обоснование задачи.

Материалы и методы.

Материалы.

Методы.

Молекулярно-биологические методы.

Генетическое конструирование фрагментов уникального домена

КЛЦМ210 для бактериальной экспрессии.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Введение точечных аминокислотных замен.

Получение мутантов N27-15 7(8140Б;8149Б).

Трансформация клеток Е. coli.

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

Биохимические и физико-химические методы.

Очистка рекомбинантных белков.

Выделение белков из тканей.

Определение концентрации белков.

Электрофорез и денситометрия.

Иммуноблоттинг.

Дифференциальное ультрацентрифугирование.

Измерение светорассеяния суспензии микротрубочек и агрегатов тубулина.

Электронная микроскопия белков. Исследование влияния уникального домена КЛЦМ210 на микротрубочки.

Фосфорилирование фрагментов КЛЦМ.

Определение участков фосфорилирования в уникальном домене

КЛЦМ210 методом масс-спектрометрии.

Клеточно-биологические методы.

Экстракции.

Результаты.

Создание генетических конструкций уникального домена КЛЦМ

Фрагмент N1-452 колокализуется с актином и микротрубочками в немышечных клетках.

Фрагменты N1-201 и N27-157 колокализуются с актином в немышечных клетках.

Сравнение защитного действия КЛЦМ210 и N1-452 на микрофиламенты в культивируемых клетках.

Связывание фрагмента N1-452 с актином и тубулином.

Взаимодействие фрагментов N1-201 и N27-157 с Ф-актином in vitro

Влияние N1-452 на сборку и взаимодействие микротрубочек.

Влияние фосфорилирования уникального домена КЛЦМ210 протеинкиназой А на его связывание с актином и микротрубочками in vitro.

Фосфорилирование фрагмента N1-452 протеинкиназой А.

Фосфорилирование N1-452 протеинкиназой А практически не влияет на его связывание с микротрубочками.

Фосфорилирование фрагмента N27-157 протеинкиназой А.

Фосфорилирование N27-157 протеинкиназой А ослабляет его связывание с актином.

Идентификация участков фосфорилирования протеинкиназой А в уникальном домене КЛЦМ210.

Взаимодействие фосфоимитирующих мутантов N27-157 с цитоскелетом.

Активация протеинкиназы А в клетках HeLa сопровождается уменьшением связывания N27-157 с цитоскелетом.

Обсуждение.

Новые участки связывания с компонентами цитоскелета в структуре уникального домена КЛЦМ210.

Функциональное значение фосфорилирования уникального домена

КЛЦМ210.

КЛЦМ210 как интегратор цитоскелета и организатор клеточной подвижности.

Выводы.

Благодарности.