Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система циклического 3/1, 5/1 -аденозинмонофосфата у возбудителя чумы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Система циклического 3/1, 5/1 -аденозинмонофосфата у возбудителя чумы"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Шевченко Людмила Алексеевна

УДК 579.842.23:577.113.3

СИСТЕМА ЦИКЛИЧЕСКОГО 31,51-АДЕН03Ш1ЮН0$0СФАТА У ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУШ

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростон-на-Дону - 1988

Работа выполнена в Ростовскои-на-Дону ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательском противочумной институте.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук Б,Н. Мишанькии. .

Официальныз оппононты: доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РСФСР А.И, Коротяов, доктор . медяцинских наук, профессор А.П. Шепелев

Ведущая организация: Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб",

Защита состоится "19* 1988 г. в "/(?" часов

на заседании специализированного совета Д 074.20.02 при Ростовском ордена Друкбц народов медицинском институте (344718 г. Ростов-на-Дону, Нахичеьанский пер., 29).

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке института»

Автореферат разослан "/6 " ЛИ 1988 г.

Ученый секретарь специализированного совета доцент

Н.й, Корганов

\ ■'.;■■ ; - х -

; общая ирашристика работы

- А ктуальность работы. Изучение циклического 3*,5*-аденозинмонофосфата (цАШ), а такие выяснение его роли в биояогна клетки предопределило развитие принципиально новых путей исследования нейрогормональной регуляция клеточных систем организма» Циклический АШ является медиатором действия многих гордонов в животных клетках, но его присутствие в кишечной палочке, впервые продемонстрированное Сазерлендом и Макман в 1965 году» вызвало недоумение у экспериментаторов, так как бактерии лишены гормонального контроля,

Выясьено, что это небольшое соединение с молекулярной массой 347,2 дальтон играет немаловажную роль в решении одной из самых актуальных проблем биологии - проблемы контроля активации гена.

Наличие цАМФ установлено почти у всех изученных микроорганизмов. Его присутствие необходимо для прокариотов, так как выполняемые функции сложны и многообразны. В настоящее время известно более 60 белков, катаболитчувствителъных к цАМ5, Циклический нуклеотид влияет на различные функции бактериальной клетки, включая синтез структурных компонентов клеточных стенок и мембран, синтез нуклеиновых кислот, углеводный обмен, различные этапы клеточного деления, проницаемость мембран, репрессии биосинтетических энзимов и регуллторных белков, репликацию рада плазмид и лизогенизацив бактериофагов.

Регуляции циклическим нуклеотидом как у эукариотов, так и прокариотов подвержены такие важные процессы как транскрипция, трансляция, дифференцировка клеток, транспорт ионов и молекул (Нац$сШ Р. 91.аЬ, 1972, Воейков В., 1984).

Система цАЩ включает циклический аданозинмонофосфат, ферменты его метаболизма - аденилатцинлазу, катализирующую синтез

цАМ£ из ЛТФ, фосфодиэстеразу, деградирующую циклонуклеотид до а такие цАМФ-связываиций белок и протеинкиназы» Механизмы регуляторных процессов с участием цАМ5 у яивотни выяснены достаточно подробно» разработана трициклическая модель активации аденилатциклазы гормонами. Однако, в силу меньшей изученности понимание действия циклонуклеотида у прокариотов недостаточно. Вовлечённые механизмы и некоторые физиологические последствия изменения уровня цАШ не определены даже у хоропо изученной кишечной палочки, хотя информация о роли циклического нуклеотида в жизнедеятельности этой бактерии на сегодняшний ден значительна ( 1оаер1) Е. е1.а1., 1982, Мо*п К., 1985)«

Что касается возможной связи системы цА1й и вирулентности бактерий, то этот вопрос стал анализироваться только в последние шесть лет после обнаружения в составе токсина возбудителя сибирской язвы аденилатциклазы, способствующей развитии отёка у больных С1ерр1а Б», 1982). Сада ко относятся данные, касавцие ся выявления внеклеточной аденилатциклазы коклюшной бактерии, к торая подавляла ответ фагоцитов ыакроорганизма при развитии инфекции (Соп^еч Д., Еа1оп 1982).

Для того, чтобы понять, каким образом цАА»Ф участвует в рох^ ляции внутриклеточного метаболизма, нужно прежде всего 1шать представление о структуре и функции слокно организованной системы его действия.

Отсутствие в доступной литературе каких-либо данных о нали чии системы цАМФ у возбудителя чумы и очевидная важность её изу чения для понимания физиологических процессов, существенных для яиэнедеятельности микроба, а также решения вопросов, связанных его патогенностыо, определило необходимость и актуальность проведения детального исследования системы циклического нуклеотида у УечБ'та рез!¡3„

Исходя из сказанного выше была определена цель настоящей работы - показать наличие систем цА1!$ у возбудителя чумы и изучить по некоторым физико-химическим параметрам компоненты системы, оценить их возможную биологическую роль в реакциях взаимодействия возбудителя и клеток организма хозяина.

Для достижения поставленной цели представлялось необходима решить следующие з^а дачи :

I» Определить наличие цАМ$ у микроба чумы и найти его количественную зависимость от условий выращивания клеток, фазы развития культуры.

2. Выяснить возможность его выделения клеткой, во внешнюю среду.

3. Определить наличие аденилатциклазной активности у бактерий чумы, выделить и исследовать некоторые свойства фермента.

4. Охарактеризовать чумной микроб на наличие фосфодиэстеразноп активности, выделить фермент и изучить его по некоторым физико- химическим параметрам.

5. Определить наличие цйД-связыванцей способности у чумного микроба, выделить этот связывающий циклонуклеотид белок и охарактеризовать его некоторые физико-химические свойства.

6. Попытаться выяснить возможность биологической активности аденилатциклазы возбудителя чумы.

Научная новизна. Впервые у чумного микроба обнаружен циклический аденозинмонофосфат, ферменты его метаболизме (:•,;: -нилатцкклаза, фосфодизстераза) и цАН$-связываюций балок»

Разработан простой метод получения аденилатциклазы в чкс?о^ виде. Фермент выделен, очищен до гомогенного состояния и охарактеризован по ряду физико-химических параметров. Обнаружены три формы аденилатциклазы (мембраносвязаниая, растворимая цитопле-ака -тическая и внеклеточная), не отличающиеся друг от друга па изученным физико-химическим и иммунологическим свойствам, Пплучсна в

гомогенном состоянии и охарактеризована по некоторым свойствам фосфодиэстераза возбудителя чумы, а также цикло-АШ>-связывающий белок. Выявлено, что содержание цАЫФ в клетке модулируется температурой культивирования: его количество при 37° превышает уровень нуклеотида, синтезируемого клеткой при 28°; соответственно при 37° увеличиваются активности аденилатциклазы и цАМФ-связывагацего белка, снижается фосфодиэстеразная активность, что свидетельствует в пользу участия цАМФ в формировании вирулентного фенотипа клетки. На модели фагоцитов экспериментальных животных показана возможная биологическая роль внеклеточной аденилатциклазы микроба чумы в патогенетическом процессе, согласно которой её можно отнести к факторам, существенным для экспрессии вирулентности.

Практическая ценность. Получено положительное решение на заявку на предполагаемое изобретение "Способ очистки термостабильной внеклеточной аденилатциклазы чумного микроба", в которой приведена схема выделения и очистки внеклеточной термостабильной аденилатциклазы возбудителя чумы. Впервые предлагается гомогенный препарат аденилатциклазы для изучения физико-химических свойств, рминокислотной последовательности и структуры белка, а также для выяснения биологических функций фермента, включая его вклад в развитие патогенеза при чуме. По итогам выполненной работы составлены методические рекомендации "Обнаружение и количественное определение циклического 3^,5^-аденозинмонофосфата у возбудителя чумы." Метод позволяет тестировать наличие циклического А® у различных штаммов возбудителя чумы, что будет способствовать более углублённому изучению регулирующего влияния нуклеотида на физиологии чумного микроба.

Апробация работы. Материалы работы дояокени на 1У Всесоюзном симпозиуме по циклическим нуклеотидам (Минск, 1982), I!? Всесоюзной научной конференции по актуальным вопросам колекуляр-

кой биологии, генетики и южунслогии возбудителей особо опасных инфекций в г. Рсстове-ма-Дону б 1584 году, на У Всесоюзнои симпозиуме, посвпщённо:! циклический нуклеотидам'и системе регуляции ферментативных реакций (Рязань, 1985), на научной конференции-конкурсе молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института а 1585 году.

П у б л и к а ц и и. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура диссертации. Диссертация излояена из 169 страницах нсетнописи, иллюстрирована 17 таблицами и 36 рисунками и фотография:«!. Цитировано 45 отечественных и 261 иностранных автора.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела ^Собственные исследования", заключения, выводов и указателя литература.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования.

Объекта?«! исследования явились восемь ггаммов чумного микроба различного происхождения из музая живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института. Для сравнительной характеристики нсполь-зомли 20 других бактерий родов Уегл^та, Во1Йе1е11а, ЕзсАеч?сй|а, V» О, М'|СЧОСОССи.З.

Для получения бактериальной массы клетки исследуемых штампов зырггцивали Яр'? 28°нли 37° на плотных и яидхих питательных средах -агаре и бульоне Хотткягора (рН 7,2), агаре 1В и ЫВ (Миллер Дя,, 1976). Однако, при определении экзогенного ц/Ш компоненты богатой питательной среды вызывали побочные эффекты и нешали выявлении нук-лзотида. В отоЛ связи была подобрана среда, которая удовлетворяла как питательном потребностям бактерий чумы, так и требования!! постановки экспериментов по определению цАЯЗ, За основу была взята срэяа М9 Шиллор Дзс., 1976), к которой добавляли необходимые для

- б -

роста аминокислоты (метиошш, фенилаяанин, треонин и цистеин солянокислый) или 0,5% казаминовых кислот, а также 0,5% одного из сахаро - глюкозы, рамнози, галактозы или глкжоната кальция. Клеточные экстракты получали после разрушения бактерий в Х-прессе или растиранием в ступке с кварцевым песком. Белок определяли метода).!« Лоури (1951) и Эрисмана (1973). Первый метод использовали преимущественна для определения белка в грубых экстрактах, а метод дифференциального спектрофотомбтрирования при 228,5 и 234,5 им по Эрисману - при исследованиях белка по фракциях по мере его очистки.

Определение цА!й осуществляли с использованием радиоизотопной техники по методу Товей (1974), основанному на конкуренции между

о

немеченым и неизменны:.! количеством Н-меченного нуклеотида за связывание белка-протеинкиназы из мьппц кролика. Об активности аденилатциклазы (Ш 4»6.1.1,) судили по количеству синтезировавшегося цАШ> и выражали в пикоыолях образовавсегося продукта за I мин» на I иг белка. Активность фосфодкэстерааы (КФ 3.1.4.17.) определяли двумя

методами. При использовании первого метода субстратом служил цик-т т

дический 3 ,5 -АМ5, меченный по тритию. О ферментативной активности судили по соотношению гидролизованного и негидролизованного продуктов реакции. Для этого инкубационную смесь хроматографировалн ¡;а пластине УЧ 254я. Пятна 3Н-51А?Й и 3Н цЗ^б^АЩ, отчёт-

ливо видимые в ультрафиолетовом свете, элюировали дистиллированной водой и элюаты просчитывали на сцинтилляционном счётчике "МачЛ II". За единицу фосфодиэстеразной активности принимали количество пЫ расщеплённого ^И-цАМФ на I иг белка в I мин. Второй метод, основанный на определении степени гидролиза хромогенных фосфодиэфиров (Капот В., 1968), более быстрый и менее трудоёмкий по сравнению с ра-диоизотопньш, использовали в процессе очистки фермента и получения его основных характеристик. В качестве хромогенного субстрата брали

- ?'-

натриевую соль бис(п-нирофенил) фосфата. За единицу активности фосфодиэстеразъмцядаинали количество мкМ паранитрофенола, образующегося за I час на I мг белка при 37°. Определение лшинол-опосре-дованной хемилшинесценции фагоцитов под влиянием аденилатциклазы проводили на жидкостном сцинтилляцконнон счётчика "МачА11", установленном на "режим непрерывного счёта". Результат выражали в импульсах в минуту. Вез манипуляции осуществляли при экранированном или красном свете.

Анализ белков во фракциях в процессе очистки ферментов, а танке определение молекулярной массы индивидуальных белков проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле согласно Мауреру (1971) В качества маркеров использовали коммерческие белки с известной иолзкулярной массой.

Выделение индивидуальных белков и белковых фракций проводили с использованием комплекта'приборов фирм "ШВ" (Швеция). При хро-ватографии на сефадексах объём наносимого белка составлял Зд> от общего объёма колонки. Обработку иоиообмвнииков проводили по Миллеру (1976), а сефадексов - по Детерману (1970). Скорость элюциа, поддерживаемая насосом, никогда не превышала свободного истечен.'я жидкости во избежание чрезмерного уплотнения наполнителя и наруг^ ния структуры колонки. Используемый носитель предварительно уравновешивали элшрущиц буфером, Франции элюата собирали в объэи; 2 - Ъ% от общего объёма колонки.

Статистическая обработка полученных данных по непараметр;пзс~ коку критерии знаков показала достоверность проведенных исслздсча-ний с вероятностью 0,95.

Характеристика системы цМ$ м и и р о ? а чумы. Циклический нуклеотид удалось обнаружить у всех ;-,-зученнчя втаммов чутшего микроба. При вырвзивении в течение дзух суток на плотной питательной среде уровень внутриклеточного цА® у различных зггаммов, находящихся в стац'!0нарн0Я фазе своего развития, колебался.

от 0,2 до 1,5 гйЗ/мг белка. Внутриклеточная концентрация циклонук-леотида оказалась непостоянной и изменялась в процессе роста: максимум её приходился на середину логарифмической фазы, тогда как в стационарной фазе количество цАМ£ уменьшалось в два раза. Повышенная температура культивирования Í370) чумного микроба способствовала увеличению внутриклеточного содержания цАМФ у различных штаммов на 10-60$ по сравнению с культивированием при 28°,

Небезынтересно, что микроб чумы обладал способностью выделять нуклеотид в окружапдую среду, причём в количествах, превьшаяцих его внутриклеточное содержание в 100 и более раз. Такая возможность описана и для других бактерий, например, кишечной палочки, корда интактнае клетки выделяли в среду роста до 99,синтезированного циклонуклеотида. И хотя биологическая целесообразность этого явления остаётся пока мало понятной, её объяснение может приблизить нас к пониманию поведения бактерий на уровне популяций.

В процессе выршцивания чумного микроба на агарз LB с градиентом (0~0,005Ш концентрации цА).!£ наблюдали торможение росте клеток по мере возрастания концентрации нуклеотида. Увеличение теиперахури культивирования с 28° до 37° способствоимо ещё болыиеыу угнохена» роста возбудителя чууы» а пороговая концентрация икгкбирооанип циклический нуклеохидоы снижалась с 2,5 мМ до 0,5 i¿2. На рост кг.~ шзчной палочки в тех же условиях экзогенный цА1;£ влияния на ока?-и-вал.

Полученные данные позволяет утверядать существование тесной взаимосвязи циклического оденозкншнофосфата с клеточные мзгаболно-мон возбудителя.

Из данных литературы известно, что определённая концентрация цАЙ$ б «летка поддерживается функционированием ряда ферментов, со-ствяяящих СИС9&4У цАМ$. У чук;юго г.икробй игм удалось с5!шр/и:пч> с^е белковые коцпоконты, обычно входяцче в сист««у циклкчес:-л^о нуквеотцда» Выя.ага:ное по&аг.°ние уровня циклонуклеотида сопровел-

далось увеличением активности аденилатциклазы, осуществляющей синтез цАМФ из АТФ3 и снияением фосфодиэстеразной активности, деградирующей цАМФ до 5*-АЫ§. Одновременно повышалась цАШ-связывавщая способность клетки. Количественные колебания уровня циклического АМ&, а также активностей аденилатциклазы и фосфоднэстеразы можно рассматривать как результат индивидуальных особенностей исследованных штаммов чумного микроба.

Температура культивирования 37°, близкая температуре внутренней среды чувствительных к чуме животных, по сравнению с общепринятой в лабораторной практике температурой культивирования (28°), является мощным фактором становления фенотипа чумного, микроба (ЗМау-1оч. Н. е1.а1., 1961). Не исключено, что сигнал повышенной температуры, воспринятый клеточкой мембраной, трансформировался в повышенное содержание количества цийлонуклеотида, который, являясь эффектором цАЫФ-связывающего белка, участвующего в инициации транскрипции, корректировал, в свою очередь, способность РНК-палимеразы считывать катаболктчувствительные гены.

Проведенные исследования показали наличие системы цАМФ у возбудителя чумы и её чувствительность к колебаниям температуры окружающей среды (Табл. I, табл. 2). Благодаря пластичности этой системы при каждой определённой температуре роста формируется своя стационарная концентрация циклического нуклеотида, которая, по-видимому, играет немаловажную роль в формировании фенотипа возбудителя.

Все белковые компоненты системы цАМЗ? были выделены в гомогенном состоянии и охарактеризованы по ряда- физико-химических параметров. Гомогенность белков подтверждена электрофорезом в 7,5$ по-лиакриламидном геле и реакцией преципитации по Оухтерлони о 1% ага-розном геле с коммерческой чумной агглютинирующей сывороткой» В обоих случаях наблюдали одну окрашенную белковую зону и одну линию преципитацж.

Таблица I ,

Влияние температуры культивирования на содержание цАШ и активность ферментов его метаболизма у шташюв возбудителя чуш

Темпера- • Количество

Штамм тура цАЩ, .....

УечхЫа культи- пУ/мг белка циклазы,

рез1|3 вирова- пМ/мин/мг

ния, град белка

Активность Активность аденилат- фосфодиэс-

теразы, мкМ/мг белка

556/106

ЕУ 1290

ЗлВР

17/ЮЭЗ

1/1092

773/101

28 0,18 4,21 0,18

37 0,34 16,43 0,13

28 1,21 2,34 0,24

37 1,52 31, 37 0,11

26 • 0,40 1,90 0,03

37 1,02 8,50 0,02

28 0,27 2,70 0,45

37 0,54 2,90 0,42

28 0,59 20,10 0,29

37 0,99 33,40 0,22

28 0,55 6,00 0,48

37 0,61 9,50 0,27

Дценилатциклазу ввделяли по схеме представленной в таблице 3» Аденилатциклаза оказалась термостабильны:.!, ввдераивакцим прогрэвг-кко в точении 30 пин. на водяной бане при 100° белкой с молекулярной массой £0000 дальтон. Температурный оптимум очищенного ферзкш-та составлял 37а~40°, оптю.?уы рН действия - 7,0-7,2. Использование в нсехх экспериментах по выделению энзима ионообменников всегда приводило к полной утрате ферментативной активности. ЭДТА и ЭГТА также ингибировали активность аденилатциклазы. Эти наблюдения позволили над заключить о наличии в активном центре аденилатциклазы какого-то иона металла, хелатная структура которого могла нарушаться сильными нснитами, что сопровождалось инактивацией энзима. Тем

Таблица 2

Влияние температуры культивирования на цАМФ-свяэывапцую активность шташов микроба чумы

Штамм Уечя п|а резШ

Теыпература культивирования, град

Количество цАЫФ связываемое I мг белка за 2 часа, пМ/иг белка

556/106 28 0,224

37 0,381

ЕУ 1290 28 0,473

37 0,548

2356 28 0,795

37 0,915

235? 28 0,678

37 0,750

17/1093 .28 0,460

27 0,832

1/1092 28 0,118

37 0,153

не 1.:сиее, з противоположность всем известным в литературе адеиияат-

цннлазам как животноготак и бактериального происхождения, требу-

юг!!«.! для проявления активности ионов Са~+или Г аде-

нилатциклаза микроба чу?.щ, хотя и повышала своп активность при до-о. о,

бавлении 10 иМ На**г или Са , 'не проявляла абсолютной потребности в каких-либо ионах для течения реакции синтеза цАШ.

Лденилатцпклаза чумного никроба представлена тремь формами: мэыбраносвязанной, растворимой цитоплазыатической и внеклеточной» При сравнении внутри- и внеклеточной аденилатциклаз по таким параметрам» как оптюдо рН действия, температурный оптимум, термостабильность, иммунологическое сходство отличий обнаружить не удалось. Это дало нагл основание сделать вывод о том, что все три формы фермента представлены одним и тем же белком, предположительно

Таблица 3

Очистка внеклеточной аденилатциклазы возбудителя чумы

Этап Всего белка, мг Удельная активность, пМ/мин/мг Выход активности. Очистка

Надосадочная жидкость 500 2,4 100 I

Жидкость после прогревания при 100 и удаления денатурировавшихся белков 200 5,8 97 2,4

Фракция 60-705? насыщения сульфатом аммония 30 25 63 10,4

Гель-фильтрация на ссфадексе 6-100 0,09 1700 13 708

наделённым различными биологическими функциями, связанными» по-видимому, как с внутриклеточным метаболизмом, так и с межклеточными взаимодействиями возбудителя чумы.

К гомогенному препарату аденилатциклазы чумного микроба была получена моноспецифическая кроличья сыворотка, с помощью которой удалось установить антигенное сходство аденилатциклаз таких видов рода Уечз!та, как У. еп!ечосо1(1!са и У. р2еиаЬ1авечси1о5^5. Дальнейшее применение монолинейной сыворотки поможет разработать более простой серологический метод тестирования аденилатциклазы, а также ускорить её выделение методом специфической сорбции на антительной аффинной матрице.

Очищенная фосфодиэстераза микроба чумы (табл. 4) представлена белком с молекулярной массой 70000 дальтон, имеющим температурный оптимум своего действия в диапазоне 37°-40°, а оптимум рН действия

Таблица 4 Очистка фосфодиэстеразы чумного микроба

Этап Всего белка, МГ Удельная активность, мкМ/мг Выход активности, % Очистка

Экстракт 5400 0,20 100 I

Фракция 40-60% насыщения сульфатом йммония 3850 0,26 93 1,3

Хроматография на ДЭАЭ-цел-лшозе 150 2,0 28 ю ■

Ультрафильтрами я с мембраной РМ 30 140 2,2 28 II

Гель-фильтрация на сефа-дексе (3-100 1,0 130 12 650

Диск-электрофорез в ПАлГ 0,5 200 9 1000

7,0-7,4. Общеизвестные ингибиторы фосфодиэстераз животного происхождения - теофиллин и кофеин - оказывали ингибирупцее действие на фосфодиэстеразу микроба чумы только в очень высоких концентрациях (10~3- 10~%). Активаторами фермента являлись ионы Са2+ и Со^+.

Белок, связывающий циклический АШ у бактерии чумы выделяли как представлено в таблице 5. Очищенный белок сохранял свою активность очень короткий срок (в течение двух суток), что не позволило выявить некоторые его характеристики. Такое явление, скорее всего, можно объяснить нарушением информационной структуры при длительном нахождении в условиях, не соответствущих его окружению Ы vivo , тем более, что белок высоко молекулярен. ЦиклоАМФ-связыващий белок

Таблица 5

Очистка цАМФ-связываоцего белка из клеток чумного микроба

.Всего Удельная Выход Этап белка, ' активность, бедка, Очистка

иг пМ цАМФ/ыг %

Экстракт 760 0,4 100 .1 Фильтрат

ХМ 300 740 . 0,4 97 I

Хроматография

на ДЕ-52. 200 0,3 26 0,75

Хроматография на гидроксил-

апатите 20 9,1 2,6 22

с молекулярной массой 180000 дельтой состоял из двух одинаковых субъединкц по 900Q0 дальтса поедая. В свои очередь, эти субъедц-кацы могли распадаться на мономеры с ш, массой около 18000 дальтон» К гоглогашоиу препарату белка получена коноспецнфичеецая кроличья сыворотка, исследование которой в реакции преципитации позволило обнаружить антигенное сходство с белком У. pseudbluBO'i-cuîosis, но не У. егйечосоК 1 (ca. В клеточных окстрактех Esc fis и'-chia coli, Mictococcus IysodeiclicuS, \'1вч(о еЙоч, Vionio NAß и Dotdeiella penlussis белка, близкого в антигенном отношении к цАШ>-связыващеыу белку микроба чумы, не обнаружено.

Проведенными исследованиями компонентов системы цА&Ф чумного микроба установлено, что изученные ферменты по некоторым своим физико-химическим свойствам и структурной организации отличается от известных в литературе белков, составляющих систему цАМФ у других бактерий, в частности, у хорошо изученной кишечной палочки<

Биологическая активность к о м п о -н о н т о в системы цАМ5 возбудителя чумы. Посла характеристики систезш цАМЗ возбудителя чумы мы предприняли попытку ответить на вопрос о возможном участии цАМ5 или ферментов ого метаболизма в реализации патогенетических функций микроба. Побудительным мотивом здесь явился тот факт, что аденилатциклаза В, Гэ уяе отнесена к факторам патогенности (СЫе Р., 1963).

Взгляд на патогенность как на сформропавкупся в процессе длительной эволюции способность микробов опрэдзлённого вида вызывать инфекционные заболевания в наибольшей степени отражает объективность существования этого генетически дэторяпшрованного свой-с?5а у болознетворних бактерий, независимо от того, встречаются ля они с иаяроорганизмоц или нет, Полояениа о том, что патогенность п знрулентмссть, как мэра её количественного выражения, является пэлкгаяка (пэяздзтор&тздтнкз) свойством в настоящее врепя но

ССПСр:1Е2С-ТСЯ.

Гцделснио ряда ггоррзяирутгрх с вирулентностью признаков гез-буДТ5Т'2ЛЯ ЧуШ сыграло полоштольную роль в познании сущности зто-го в.^гнейпего свойства иякроба. Бсрроуз (1962) предложи формулу в'/руяентвости чукного кахробз, благодаря которой последний считается яанбозео изученный в плане вирулентности объектов. Однако, су^сствосятя "ухчонгщихся'' птглмов, из укладывавшихся з формулу, позволяет предположить существование дополнительных факторов, уча-ствусзих в экспрессии вирулентности»

Для испытания мы выбрала зденилатциклазу чумного кикроба, сс-новывзясь на сходстве её свойств с аденилатциклазой В. ря"«1 иззТз . Из литературы известно, что последняя обладает способностью инги-бировать продукцию супероксида, явяятацегося основным фактором токсического действия кислорода на бактерипльнкэ клетки при их контакте с фагоцитами. При оценке модулирущего действия гомогенного

препарата аденилатциклазы чумного микроба на модели фагоцитирующих клеток с помощью приёма хемилшинесценции в пробу, содержащую лейкоциты или макрофаги морской свинки, вносили 0,075 ыкг/ыл фермента и через 10 мин. наблюдали литичгское падение интенсивности люминесценции до 70-78$ от исходного уровня. При увеличении дозы вносимого энзима в 2 и 4 раза, хемилвминесценция соответственно снижалась до 60-66%, 50-55$ от первоначального уровня (рис. I). Использование Са^+ионофора Е качес'Ее стимулятора продукции супероксидного радикала клетками животных инициировало хеыилвыинее-ценцию на 300$, однако последующее добавление аденилатциклазы микроба чумы даже в конечной концентрации 0,03 ыкг/ыл вызывало резкое снижение интенсивности хемилшинесценции фагоцитов морской сбшпш уже в первые 15-30 сек» до 27,5-24$, а через 10 шш. - до 3$ (рис.2).

Рис» I. Зависимость интенсивности хемилшинесценции лейкоцитов морской свинки от времени контакта с различными концентрациями аденилатциклазы чумного микроба: I - 7,5-Ю^г/мл, 2 - 15-10"® г/ил, 3 - ЗО-Ю^г/мл.

1 гз«б&7вега вкгз, вам

Ряс. 2, Изменения во времени интенсивности сталированной кальций-ионсфорсм ^2137 хемилгминасценцин лейкоцитов морской свинки после добавления аденилатциклазы чуггного микроба: I - 3.10-9г/ил» 2 - З-Ю^г/ил.

Поскольку аденилатциклаза является ферментом синтеза цАШ-, влияние которого определяется концентрацией и выражается либо в стимуляции, либо в угнетении контролируем« реакций, било проведено количественное изучение содержания циклического нуялеотидз в фагоцитирующих клетках. Оказалось, что оря увеличении концентрации вносимой в рсакционнув смесь аденилатциклазы, количество тдЛЧХ» увеличивалось с 7,8 до 57,6 г", Более того, при определении влияния экзогенных добавок коммерческого препарата цЛКФ в внеохкх дозах (10~°- наблюдали снижение уровня хекилгминесцешми

до 25-75%, а в низки- дозах ПО"8» Ю-11'**) - усиление х^илечи-

несценции до 149$.

Аденилатциклаза бактерии чумы обладала и цитотоксическшл действием по отношению к макрофагам белой мыши» Количество разрушенных клеток при внесении I мкг/мл фермента по истечении первого часа воздействия составляло 34%, а через б часов приближалось к 50%,

Приведенные данные показывают, что аденилатциклаза чуыного шкроба в физиологических концентрациях оказывает негативное действие на лейкоциты и макрофаги зкеперимзнтальных яивотньгх. Действие это имеет зависимый от дозы характер и выражается в подавлении хецилюминесценции клеток макроорганизка, которое сопровождается резкий подъёмов внутри них уровня цАЫ£, что, по-видимому, ыокет явиться одной из причин нарушения основных функций фагоци- . тов, а такие вести их к гибели»

Таким образом, помимо функций, связанных с активацией генов и участием в белковой синтезе, продукт аденилатциклазы - циклический аденозинионофосфат - монет обладать и разрушительным дейс-гвксiu Непосредственный участника'.: этого действия является едзнилатцпила-за чушого микроба, что с учётом данных по влиятш аденилатциклазу на хемилюминесценцив животных клеток позволяет отнести ее к факторам, существенным для проявления вирулентности возбудителя цуми» Наряду с другими факторами патоганности аденилатциклаза, по-видк-ыому, принимает участие в развитии чумной инфекции.

вывода

т т

1. У возбудителя чу;-:ы обнаружена система циклического 3 ,5 ~ аденозиныонофосфата, включающая в себя ц№Ф, ферменты его мзтабо-лизма - аденилатциклаэу и фос£одиэстераву, а также цАШ-евязнва?,!-щкй белок.

2. Аденилатциклаза чудного микроба, вчделзнная в гемотмли

состоянии, представляет собой белок с молекулярной массой 30000 дальтон, температурным оптимумом 37°-40°, оптимумом pH действия 7,0-7,2; она устойчива к прогревания при 100°, активируется ионами Mg. и Ca , проявляет антигенное сродство с ферментами из У. pseudbiuBe-tCHlosis и У. enietocolf lica и а противоположность энзиму из Е» coli не требует для проявления своей активности ионов

3. Фосфодиэстераза чумного микроба очинена до гоггогснного состояния, Она представляет собой белок с молекулярной массой 70000 дальтон, температурным оптимумом 37°-40°, оптимумом pH действия 7,0-7,4, который активируется ионаки Са^+ и Со^+ и в противоположность фосфодиэстеразам животного происхождения ингибирует-

_р

ся теофшшшек и кофеином только в высоких концентрациях (10 -Ю"3М).

4. ЦиклоМЙ-связываоций белок, полученный в гомогенном co-i стоянии, имеет молекулярную массу 180000 дальтон, состоит из двух идентичных субъединиц по 90000 дальтон, которые могут распадаться на мокоиеры с мол. кассой около 18000 дальтон; проявляет антигениев сродство с цА!0-связцвапцнм белхоц У» pseudbiuBe4cuIosfs , ко но У. enteiocoliifca.

5. Разработан простой и воспроизводимый способ получения внеклеточной аденилатциклаоы чукного микроба в чистом виде, что будет способствовать ускорению изучения её биологических свойств.

6. Обнаружено влияние повышенной температуры культивирования (37°) чумного микроба на активность компонентов системы иЛШ, п результате чего з клетке достоверно увеличивается синтез циклического нукдеотида.

7. На модели лейкоцитов и макрофагов экспериментальных животных показана возможная биологическая роль тергастабильной внеклеточной формы адекнлатциклаэы в патогенетическом процессе, согласно

которой её моено отнести к факторам» существенным для зкспрзсскк вирулентности возбудителя чумы.

СПИСОК

научных трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Шевченко Л.А., Гончаров Е.К., Мишанькин Б.Н. 3*,5*-цккло-нуклеотид-фосфодиэстераэа Уечгт! а peslis ЕУ//Микробиол. нурн,-1982.-Т.44,№3.-С.3-8.

2. Шевченко Л.А., Мишанькин Б.Н.//Циклические нуклеотиды.-Минск, I982.-C.I68.

3. Мишанькин Б.Н., Шевченко Л,А., Коробейник Н.В., Диханов Г.Г, Возиозшый путь реализации сигнала повышенной температуры культивирования у чумного мифоба//Микробиол. курн.-1984.-Т.46, }f6,~

С.42-47.

4. Шевченко Л.А,, Мишанькин Б.Н.//Актуальные вопросы лабораторной диагностики и биохимии возбудителей чумы и холеры.-Саратов, 1984.-С.34-40.

. 5. Шевченко Л.А.//Молекулярная биология, генетика и иммунология особо опасных инфекций.-Ро'ст)ов-на~Дону, I984.-C.80-82.

6. Шевченко Л.А., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н.//Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций,-Рязань, I985.-C.127-128.

7. Шевченко Л.А., Мишанькин Б.Н.//Иврсинисзы,-Владивосток,

1986.-0.82-83.

8. Асеева Л.Е., Шевченко Л.А., Шиманюк Н.Я., Рублёв Б.Д., Мишанькин Б,Н. Оценка модулирующего действия аденияатцяклазн чумного микроба на лейкоциты морской свинки с помощью хемилши-несценции/Дурн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-

1987.-№7.-С.59-63.

9. Шевченко Л.А,, Мишанышн Б.Н. Аденилатциклаза возбудителя чумы: счистка и некоторые свойства/Дурн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1987.-J,»12,-С. I5-2Q.

10» Шзвчонко Л,Л», Мизанькин Б»Н, Способ очистки тошоатп-бильной внеклеточной адонияатциклази цушюго шшроба/УПоломиге-льноо реашие па -заязку }; 4065977/13 от 30.01.87.

ПК Подписано в печать о-/. £&.

Тирах 100. Заказ - Печатных листов I.

Ротапринт РОДОИ