Анализ ядерных ДНК-эндонуклеаз и топоизомеразы нормальных и трансформированных клеток

Баснакьян, Алексей Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ ядерных ДНК-эндонуклеаз и топоизомеразы нормальных и трансформированных клеток
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ ядерных ДНК-эндонуклеаз и топоизомеразы нормальных и трансформированных клеток"

s 5 9 I

российская академия медицинских наух институт биологической я медицкнскоя зеиий

На пргзах рукописи УДК 577.155: 576. 312

БАСНАКЬЯН Алексей Георгиевич АНАЛИЗ

ядерных днк-эндонукдеаз и топоизоиеразы i нормальных и трансформированных клеток

Специальность: бнохяпия - 03.00.ОС

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва , 199 2 г .

)

Работа выполнена в.лаборатории ферментов обмена нухлэиновых кислот Института бнологнчясхой и медицинской хипии РАНН

Официальные оппоненты: академик РАНН ,

доктор биологических наук, профессор И. Б. ЗбарскиЯ

доктор биологических наук С.Р.Упансхий

. доктор биологических наук И. Е. Беряан

Ведущая организация - Московская Медицинская Академия

им. И. М. Сеченова

1992 г. в

/О

За сита состоите« « / Ь. » I^ 1992 г. в < ^ часов на заседании Специализированного совета Д. 001.10.01 при Институте биологической и медицинской химии РАМН по адресу: Москва, 119032, Погодинская ул., 10

С диссертацией можно ознакомиться в' библиотеке Института

Автореферат разослан « >_ 1992 г.

Ученый секретарь Специалиэировгшного совета кандидат Биологических наук

Паолихкк* Л. В.

0б21ая характеристика работы

Актуальность проблемы. Ядра клеток хивотиис к человека содержат ДНК—зндонуклеазу, активируеную ионапк Ca2* a Mg2*,- Ca/Mg--зависимую эндонуклеазу. Выявление феркента Hevtish и Burgoyne [1973] способствовали активные исследования хрокатлна. для которых Са/'Мс-зависиная зндонуклеаза представляла интерес как фактор, обусловливавший деградацию ДНК хрокатика з ходе вклеления клеточных ядер, ffyilie [1980] было установлено, что Ca/Hg-зависиная эн-докуклеаза катализирует расщепление ДНК хроматина при клеточкой гибели СапоптозеЭ тнноцятов in vitro. Впоследствив зндокуклеазо-—зависимый апоптоз был показан во яногих тканях. Он признан в настоягкее вреня наиболее частой причиной норнальасй клеточной гибели, и является на сегодняшний день единственной известной Функцией Са^Нз-зазисиной зндонуклеазы. .

Параллельно, в 70-90 годах исследованы 2 других типа ДНК— -разрезающих ферментов, так»? присутствующих в хлгточных ядрах: апуриновые/апиринидиновые зндонуклеазы САП-эндонуг_леазьО и ДНК— —топокзоиаразы. АП-эндонуклеазы катализируют in vitro реакцию гидролиза ДНК вблизи сайтов апуриннэации. что дает основание предполагать участие этих ферментов в репарация ?ДК. Топоизоме— разы катализирует сочетанную реакцию разрезания-отивания ДНК, в связи с чек участвуют о процессах деконденсацки я упаковки хроматина, устраняют возникающие зацепления нолекул ДК. катализируют рекокбкнацню ЯНК. Исследований, направленных на установление взаи-ноотнопакий топокзомераз ч АП-зндснуклзаз с Са/И~-завнсимой зндо— нуеляазой не проводилось. Информация об АП-эндонуклеазах ч топои-зонеразах по достоверности н полноте значительно превышает знания о Csstfg-зависимой зядонуклеазе, клсннрозаны гени этих ферментов из нескольких орг?.низяов.

lio аналогии с прокариотами СЕ.coli) нохно предполагать су-щестпозание у «¡зотнь'Х нескольких зндснуклеаз и '¿л изофорк, спо-собньк но только катялизирогать гидролиз ДНК в гибнущей клетке, но к уничтожать чуйкродкуж ДНК. участвовать о ресоябинадяи ка этапах ра-реоания рецкпкентпой и донорской ДНК иля рззреяения крестообразных структур, каГЕ.лизнроиать асе виды репарации ДНК. Ряд хосзениьгс данных указывает на су!тествовзн:»е зткх функций у

зидонуклесз ядра,' на :гх роль в инясртализачии и опухолевой тр" не-

формации клеток, вирусной инфекции и в других.процессах в клетке.

Многочисленные попытки выделить Са/И^-зависимую зндонуклеазу привели к накоплении ряда противоречивых данных о физико—химических и каталитических свойствах этого фермента. Дахе ферменты, выделенные из одного организма, по, данным разных авторов отличаются по молекулярной массе, изоэлектрическоЯ точке, оптимуму рН. кати— онозавис.шости, и субстратной специфичности. Имеются работы, свидетельствующие о существовании других катионозависимых эндонукле-аз наряду с Са/И^-зависимой эндонуклеазой, или об отсутствия последней. Дефицит данных, полученные на чистых белковых препаратах, приводит к недостатку базовых знаний об эндонуклеазах ядра, задерзсивает исследование механизмов их регуляции и клонирование их генов.

Цель и задачи исследования. Основной цодья настоя шей работы являлась разработка и экспериментальное обоснование концепции множественности ядерных ДНК-зндонуклеаз. В качестве глазного объекта исследования выбрана печень крыс как наиболее изученная в этом отношении ткань.

В соответствии с целыз исследования были поставлены следуютае задачи:

— иссследовать гетерогенность ядерных зндонуклеаз на основе анализа фрагментации ДНК хроматина в изолированных клеточных ядрах, пэчени крыс;

- разработать методы выделения ядерных зндонуклеаз и топоизочера-зы I из ядер печена хрыс;

- охарактеризовать полученные эндонуклеазы по физико—химическим и каталитическим свойствам, сравнить их с известными ДНКазаки;

— определить изменения актнзкости отдельных ядерных эндоьуклгаз

и топоизокеразы I при имнортаяизации и опухолевой трансформации клеток печени хрьзг. фибробластов крыс и человека, кератчноцитов человека."

Научная новизна. Основным результатом диссертационной работы явилось доказательство существования несхольхих ДНКаз в хлеточных ядрах печени крыс, различающихся по физико-химическим и каталитическим свойствам, а являющихся г.о-видииому изоформани Са/М£-зави-синой эндонуклеазы.

Впервые разработаны схены разделения ядерных эндонуклеаз, позволяющие параллельно получать несколько препаратов зндонуклеаэ и препарат топснзонеразы I близкие к электрофоретической гоиогеи— иостк. На основании данных о свойствах, субстратной специфичности, и нммунофермектного анализа показано подобие отдельных экдо— нуклеаз описанным ранее ДНКазан: Са/И^-зависяиой эндонуклелзе, АП-эндонуклеазе и нейтральной ДНКазе из печеня крыс. Некоторые феркекты выделены впервые. Определена принерная представленность ДНК-разреэающих ферментов в клеточных ядрах по белку к по актив-сти. Показана способность эндонуклеаз ядра нестохасткчески рас-плять реконбинационныа вставки в плазкиде рБН322» отдельные пос-довательности в составе ДНК парвовируса НУ)! и За1в1-Рги11 сегпек-та плазнкды рЧО.9, а также повторы Со^Ю-1 и кеждинухлеосокные линкеры в хроматине печени крыс. Янкортализацгя и опухолевая трансфорнация клеток в нескольких испытанных иоделях сопровождалась сниг^ниек активности топснзонеразы I и эндонуклеаз с высоки« Са/И^-синергиз«ок, и увеличением активности Мп-зависимой зкдонуклеазы. Выявлена способность одной из эндокуклеаз стимулировать внеплановый синтез ДНК при введении з гголугтрокицаеиые клетки китайского хояячка. Получены косвенные яэнкые, указывающие ка роль протеолитического процессинга в регуляции количества и активности ядерных эндонуклеаз.

Теоретическая и практическая значимость работы. Множественность эндонуклеаз является основой функциональной гетерогенности зтой группы фернентов ¡гивотной клетки, обеспечивающей процессы деградации ДНК при клеточной гибели, репарации, репликации, рекомбинации, ограничения проникновения чужеродной ДНК а клетку. Знание пехаиизнов разрезания ДНК и участия в этой процессе эндонуклеаз инеят значение для поникания мгханнзнов канцерогенеза, вирусной инфекции, лучевого поражения клеток, нарушений икнункой систены орггнизна.

В ходе решения поставленных задач разработаны новые методы определения активности и субстратной специфичности ДНКаз, создана катенатическая модель действия адно-дпуударных эндонуклеаз на кольцевые ДНК. С использование« полученного препарата топоизоне-разы X предложен способ определения количества кольцевых ДНК в бактериях и тест для диагностики системной склеродермии среди

других системных заболеваний соединительной ткани, который пробел испытания в клинической практике.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на IV а У Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград, 1979, Киев, 1936), Конференция* по програнне "Ген" АМН СССР (Москва.1981,1983), Всесоюзной конференции по применении ферментов б биохимических анализах (Паланга,1984 ), V Всесоюзной симпозиуме по медицинской знзимологии (Махачкала,1986 ). Всесоюзном симпозиуме по биохимии сельскохозяйственных животных (Ташкент,1986), Совещании по молекулярным механизмам канцерогенеза (Пущино.1987), IX Всесоюзном симпозиуме «Структура и Функция клеточного ядра» {Черноголовка, 1987), Симпозиуме "Репликация эукариотической ДНК" (Колд Сприкг Харбор.1989 ). 30-й конференции по клеточкой биологии (Сан Диего,1990), Нгкдуяародной конференции по склеродермии и склеродсргскя-яодобным заболеваниям (Варшава,1991 ).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исслэдованиЕ и их обсуждения, заключения и выводов. Работа излогэена на 160 страницах текста, содержит 53 рисунка и 29 таблиц. Список литературы включает 466 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовали: АП—эндонуклеазу из ядер печени крыс, полученную от H.Verly (Льежский унизерситет , Бельгия), нейтральную ДНКазу ядер печени крыс и коноклональиьге антитела к . ней, предоставленное В .Г .Винтером (Казанский университет) .

Клетки фибробяастов и кератиноцитов культкзирозала в ССЬ-инкубаторе на среде MEM с добавлением 5% фетальной сызоротки и 1 мкгД1Л гентаницика до стадии монослоя. С поверхности стекла клетки снимали шпателем без использования трипсина . СНО-клеткя еыракизг.чи с среде И.2 с 102 фетальной сыворотки "Gibco" при 1С>: СО*. Для синхронизации клеток использовали блок гидроксимочевины [Ausubel et al.,1988}. Анализ качества синхронизации проводили методом проточной флуороцитометрии.

Индукция гепатом у крыс дизтилиитрозамияон проводили по пе-

году Swert [1980]. Гистологический анализ препаратов был проведен Н .А .Поповой (НИИ канцерогенеза ВОКЦ АМН СССР). Гистологические диагнозы ставились в соответстзии с работой Гельштейн и соазт. [1984].

Все препаративные процедуры, кроне оговоренных особо проводили при 4°. Клеточные ядра печени крыс иолучали из белых нелинейных крыс-сакцов весом 180-200 г. Печень бистро извлекали и помещали в охлажденный на льду буфер, содержаний 50 иК трис-НС1, pH 7,9, 0,25 Ii сахарозу, 10 мМ СаС1г, 5 мМ 2-иеркалтоэтакола, 1 иМ PliSF (буфер А). Печень гомогенизировали в стеклянной гоноге-низаторе с тефлонозым пестиком. Гокогенат фильтровали через 4 слог марли и центрифугировали при 1500 g. Осадок ядер суспендировали в буфере А, добавляли при постоянном перемешивании 4 объе -ма буфера Б, отличающегося от буфера А тем, что концентрация са-харозы в нем составляла 2 М. При этом конечная концентрация сахарозы в суспензии ядер равнялась 1,65 Ч. Яа буфер Б наслаивали 3 объема полученной сусаенцни ядер к центрифугировали при 70000 g SO мии. Осадок клеточных ядер ресуспенднровали в буфере А и про-мызали центрифугированием при 1000 g в течение 5 мин. Выход кле-точных ядер из 100 г печени составлял по ДНК примерно 100 нг. При измерении ДНК слгточных ядер их суспендировали в веде, затек добавляли ЭДТА до 20 гаМ и SDS до l?i. и измеряли оптическое поглощение при 260 ик.

Клеточные ядра фибробластоз и кератиноцатоз получали тем жэ методом . В одно ьыделение брали от 2 до 200 или.клетоп . Выход ядер по ДНК составлял около 10 якг из löa клеток.

Зкдокуклеолиз хроматина проводили в свезевыяелгкиыз: препаратах клеточных ядер. Осадок ядер двагуцы прожывалк в инкубационном буфере, содерзадегс 0,25 М сахарозу, 50 мМтрис-ECl, pH 7,7, 2 мМ СаС]2. Перед инкубацией к препаратам ядер добавляли MgCl2 или KnCl2 до 5 нМ. Концентрация ДНК в пробе составляла 1 мг/пл. Инкубацию проводили при 37°, реакцию останавливали добавлением 1/5 объема буфера, содержащего 2,5% саркозкла, 125 мМ ЭДТА , 250 мМ тркс-HCl, pH 8,1. Для выделения позторяялцягся последовательностей ДНК использовали нетод Britten et al. [1974].

Электрофорез ДНК проводили в горизонтальных блоках O.SSSara-розного геля размерами 14 х 18 х 0,4 см в буфере, содержащем 40 иМ трис -ацетат, pH 7,8, 2 мМ ЭДТА, 0,5 «кг /мл бромида этидия при

напряжении 7 В /см .усгкь: геля в течение 1 ч. Обьен пробы состав -лял 25 мкл. По окончании электрофореза освещенные ультрафиолетом (254 нп) гели фотографировали через оранжевый светофильтр. Электрофорез кольцевой £ШС проводили по той =е схеие, но окрашивание

этидий бромидом осувсстзляли после окончания электрофореза. Нега -

тивы сканировали в денситометре. Количественное определение ДНК в геле проводили в ляоеКнои диапазоне зависимости количества ДНК в полосе о г ее оптической плотности на негатнзе .

Щелочную эндонухлеазну» активность определяли в иикубацион -ной пробе об1.эион 20 нкл, содержащей 2 нкг ДНК, 10 мМ трис-НСХ, рН 7,4 при 37°, 0,5 нМ ДТТ, 25 нкг/ил БСА, препарат фермента и соли дивалентиьсс металлов. При определении кислой ДНКазной активности инкубационная смесь того яе объема содеря£.ла 2 икг ДНК , Ю мН натрий-ацетатного буфера, рН 5,0, 0,5 кМ ДТГ, 25 нкг/Ъл БСА. 1 нН ЭДТА и препарат ¿зрнента . Инкубацию проводили в течение 1 ч при 37°. Реакцию останавливали добавлением 5 нкл буфера, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 0,1, 2,5Х саркозила , 250 нМ ЭДТд , БОЙ ' глицерина , 0,25Х брояфочолового синего . ДНК проб разделяли электрофорезом а 0, 85» агарознои геле как описано выяи .

За единицу актвзности экдонуклеазы принимали количество фермента, достаточное для вызедения 1 мкг линейной ДНК (50% ДНК пробы) или 1 мкг кольцевой сверхскрученной ДНК (50% ДНК пробы) из исходной полосы в геле 0,3% агарозы за 1 ч иккубааии при 37а. Кислоторастворимыо продукты определяли осаядениеч полимерной ДНК в пробах разным обьеоои 1 н ЕС10с. В этой случае за единицу активности принимали количество фермента способное образовывать 1 А2<5о кислоторастЕоркгой фракции за 1 ч при 37°. Активность АП-эндэнуклеазы определяем по методу ТЫЪо<Зеаи et а1. [19В0].

Измерение актигкости топоизомеразы I проводили с пробе обьокок 20 мкл, которая содержала 1 нкг плазмкдной ДНК рВГ.322, 10 иМ трис-НС1, рН ?,Э, 50 нМ КС1, 10 мМ , 0,1 нМ ЭДТА, 50 пкг/

мл БСА, ялернкй экстракт, разаеденмый в Х£-буфере: 10 мМ трис-КС1 рН 8,0, 0,1 кМ ЭДТА. Пробы инкубировали 1 ч при 37°. реакция останавливали добавлегжек 2,5 мкл снеси 0,1 К ЭДТА, IX Б1>3, и 2,5 нкл протеиназы К. йахубасию продолаалк еще 30 иин при 37°. Единицей активности считали количество ферлента , необходимое для релаксация 1 мкг ДНК за 1 ч при 37^. Расчет активности презодили из уровне 50%-ной релагс-ШЗ! плазмиды.

Концевое нечэние ДНК парвовируса MVH н SalGl-FVuII сегмента плазниды рОС19 для определение специфичности з.чдокуклеаз выполняли с помощью я.нк -гтолинеразной реакции фрагментом ^ленова с единственным предшественником - [32Р]дГТФ. Автор.чдгографн» проводили как описано в кетодчческон руководстве Manie-bis et. al. [i960].

Реакции ELISA выполняли г.о общепринятой методике [Ausubal et а!.. 1988] в планшетах «Flow-, з соотношении 0.1 якг препарата моноклональкых антител 0,3 икг белка препарата йеркента. Реакция ингкбнревания ДНКазной активности проводили как описано ньеез. с доблзлекиек 0.2 нгг иококлокальиых антител s пробы. При определении :::!Гибироьания топоизомер^зы I сыворотсоЗ крови последнюю добавляли з стандартную инкубационную смесь s каличостая 0,55-0,4 ккл .

Электрофорез бэлко^ проводили по Laesaali [1970 ]. Для определения активности эвдонуклеаз в ПААГ по опокчэаии электрофореза дороязеу геля , в готэруя» наносили образец, отяызал.'с or SDS. разре -за ли на кусочки длиной 2 кк и каждый кусочек геля помещали s буфер для спре.аэлгниг. ДИКазной активности , содержаний ионы Кп2+ к i Hier ДНК яяазии.зк PBR322. Пробы ияг.убирояали при постоянном встряхивании в тзченкэ lö ч при 37°, :>атем определяли поднкер-ность ДЧК электрофорезом в 0,8%-нсн агарозноя голе. Часть дорог-кк полиакр1глаш!Д:Юго гзля окрэыязали купасс-н R-250 для определения положьиня белковых ст^пдартов молекулярной массы.

Протеиказную активность определили по нгтоду Lin ö"fc "1 -[i9S9j, используя !-?, ЬЬдаметклказеин в качестве субстрата. Концентрации белка определяли по Sedœsrk [13773-

результатм ^сояедованкя к нх сэда'ДЕние

i. Дакки? о мисяяеетвеш-юсти кэо^орст ;гдер12гх ДШС-эадснуклегз на основе аяалгеа Apancf кхггтка хроматина

Как видна рис. 1, основным произлгкяеп экдогтуклеа^ной ак-ткзно.-тн s изолирован«-:**« клеточные ядрах ns-гени ^рыс ячлялгеь нежну,-лсг0с0мнзя Орагкед ,-ггция ::ри1:гт»ка с образование;: дискргтни* про^уктос кратких 2?0 п.к.. Наибольшая активация достигалась з присутствии сочетай:«; ионов Сг~* и и инкубационной среге

ССа^'М^г-здвнснмая зкдонуклеэзО. Высокие концентрации Сг2* бгзз Из"* блокировали Арэгнентаиик. Ограничении! аачальныД зкдокук-

леолиз хроматина характеризовался линейным накоплением солюбили-зируемой и кислоторастворимой фракции хроматина. Эндонуклеаэная активность выявлялась в диапазоне от рН 4 до рН .10, что позволяло предполагать множественность ядерных зндонуклеаз Срис. 2Х

При начальном эндоыуклеолизе в присутствии 5 иМ HgCl2 t 2 нН СаС1г Срис.3D подвижности версии/пиков олигонуклеосом описывались не одной, а двумя аепересрещивающимися кривыми, соответствующими олигомерам с четным и нечетный числом нуклеосои . Наблюдаемая ди-нуклеосомная фрагментация обычно связана действием зндонуклгаз с молекулярной массой более 60 кД [Burgoyne &. Skinner.1981. Басна-кьян и соавт. ,19813- При этой пики четных олигонуклеосом на ден-ситограиме были вьпве и гомогеннее нечетных по молекулярной массе. Длина ДНК нуклеосок в составе четных олигомеров была больша, чек нечетных. После 5 НИ» эндонукл<?олиза разница составляла 24+5 п .н . , после 20 мин разница в подвижности нивелировалась.

Анализ скорости расцепления повторяющейся ДНК Со-Ь<10-1 в ядрах печени крыс Срис.45 показал, что в присутствии ионов Мп2* гидролиз фракции повторов при равной степени расщепления ДНК происходил быстрее, чем в присутствии Са2+ + Мд2*. В присутствии • Мп2* средний размер повторов практически оставался неизменны« в ходе эндоиуклеолиза на уровне 150 п .н . , хотя общее количество повторов снижалось. Следовательно, расоепление повтороз C=>t<10~1 в составе хроматика в присутствии Мп2+ происходит по процессяв-нону механизму: начавшись в области одного повтора , гидролиз его идет до конца. Как ендно из графика молекулярно-яассового распределения повторов , представленного на рнс.4 , в ходе зьдонуклеолиза хроматина в присутствии иоков Кп2* происходило распэаление повторов иенее 145 и более 160 п .н ., а средняя фракция (150 п ,н. ) была более устойчивой к ядерны:: ДНКазам . Устойчивость к гидролизу части повторов ножрт быть связана со специфичной для данных локуссв структурой хроматина и свойствами ядерных ДНКаз .

Совокупность представленных данных позволяла предполагать наличие нескольких эндонуклеаз в ядрах печени крч-с, различающихся по хатнонозависимости, олтииуку рг. и молекулярной массе. Дальнейшие исследования подтвердили правомерность данного предположения.

2. Фраклиоклрозанае ДЕК.-»ндопуклеаз клеточных ядер печели крыс

Для уменьшения инактивации эндонуклеаз клеточные ядра выде-

Рнс.1. Электрофорез продуктов расиепле-ния хроматика в изолированных ядрах печени крыс в зави-синости от ионного состава инкубационных сред: 1 тМ СаС1г (а), 5 тМ СаСк (б), 10 юМ СаСЬг <в ) , 5 тМ МнС12 (г), 10 тМ ИзСЬ (д), 5 пМ МзСЬ + 5 тМ СаС1г (е), 10 кМ МяС12 + 1 тМ СаСЬг (х).

А260 1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

4 5 6 7 8 9 10 рН

г^пс. 2. Зависимость интенсивности расщепления хроматина печени крыс от рН инкубационных сред. .

2 3 4 5 ноаер олигоиерг.

1.0

Ряс. 4.- Зависимость средневзвешенной длины ДНЕ фракции повторен Со-Ь-СЮ"1 от средневзвешенной длины тотальной ДНК в ходе эндонуклеслиза хроматина клеточных ядер в присутствии 2 шМ СаС1г + 5 вМ Н«С12 (1) и 5 тМ НаС1г (2). или расщепления очищенной ДНК панкреатической ДНКазой СЗЭ.

р. о е* а о с

о) р.

ч:

к ч С£

Рис.3. Подвижность ДНК четных и нечетных олигонуклео-сом в агароз-

ном геле после 5 мин аутогидролиза хроматина печени крыс. По оси абсцисс - номер оли-гомера нуклеосомы, по оси ординат -расстояние в нн от начала геля.

0.1

50 10 2 0.8 0.4 0.2 0.1 длина тотальной ДНК, т.г..к.

ляли з присутстзки 10 иМ CaClz - ингибитора эндонуклеолиза Сен. рис.1>. Экстракцию ядер проводили 1 М NaCl, которая по данный Hibíno [1906] позволяет наиболее полно экстрагировать ядерные ДНКазы. 3 ходе выделения икгибнровалн протеолиэ зндонуклеаз введением во все буферы 1 K(í PMSF к 10 нМ бисульфита калия. В предварительна экспериментах было показано, что экстракты ядер печени крыс обладают протеиназной активностью. При выделении ядер 8 отсутствие ингибиторов протеиназ. протеиназная активность свежеприготовленных экстрактов составляла 0,1 ДНС-ед. /яг белка. Наивысшее ингибирование протеазной активности, ко не более чем на 70S от контрольного, вызывалось PKSF С1 нЮ. KHSO. СЮ мМЗ, или их комбинацией. Пепстатин (0,5 ккг/»л), леупептин (0.5 мкг/мл) и ЭДТА С1кМ5 не злкяли на протеиназ ну su активность экстракта.

Лредгаестзувзщая инкубация ядерного экстракта сопровождалась примерно двукратным увеличением активности ДККаэ, в то зрекя как обработка трипсином приводила к снигеению активности ДНКаз. Данные, приведенные на рис.5, показывают, что экстракт, полученный в присутствии PMSF. содергсит 4 активных пептида (рис. 5,.л). Получение ядер и экстракта в отсутствии PMSF (ркс.5,С) приводило к снижению молекулярной кассы полипептидов. Хранение обоих экстрактов при -20° вызызало увеличение числа активных полипептидоз (рис. 5, В н Д ), указывая на присутствие PMSF-устойчивых протеиназ.

Пр.» гель-фильтрации ядерного экстракта эядонуклеазная активность была эыявлена в интервале 25-60 кД Српс. 65. Широкий интервал молекулярных масс тахпе как и по дакнып SDS-ПААГ электрофореза. свидетельствовал о гетерогенности этой группы феркйктоз. Пики активности s 2 ой СаС1г + 5 вИ MgClz и 3 d fínClz не совпадали . Активность в присутствии ионов Са2* и Mg2* была выше. чем в присутствии Ка* в высокомолекулярной области С55-80 кДЗ. но была меньше последней s низкомолекулярной области (25-55 кД).

При разработке схемы фракционирования бьиш использованы иокообменники: ДЕГА£ -целлюлоза , фосфоцгллилоза , колонки Мско-S и Моно-Q з системе FPLC-хроматографии; молекулярные сита - сефаде-ксы и тогперлк; оксиапгтит, аффииные сорбенты - голубая сегфароза , гепарин-сефароза, ДНК-целлюлоза и ДНК-ягароза. Иа этапах фракционирования субстратом для определения активности эндокуклеаз служила линейная ДНК печени крыс, ДНК фага \ или ДКй тимуса теленка, а такгя? кольцевьге плазппдные ДНК . Последние использовались для

1.3

определения активности топоизомераз и доказательства эндонуклео— литического способа расщепления ДНК . В качестве основного нетода определения степени расщепления ДНК использовали электрофорез в агарозном геле . Во всех анализируемых фракциях активность эндо-нуклеаз определяли в 4-х буферах, содержащих: 2 мМ СйСiz + 5 нМ HfiCb (рН 7.4), 5 иИ МзС1г + 2 мМ ЭГТА СрН 7.45. ,5-иМ M11CI2 СрН 7,4Э ии 2 мМ ЭДХА СрН 5.03. При необходимости точного определения Са/М£-синергизма кроне того использовали буфер с 2 мМ СгС СрН 7,43. Признаком, использованным для идентификации CasHg-завнсиной эндонуклеазы. считали активацию в присутствии ионов Са2+ + Mg2*, превышающую актизацн» другими ионами.

Если судить по катионозависиности, выявленное нами отношение активностей эндонуклеаз в ядерном экстракте соответствовало существующему в клеточных ядрах . Для получения сысскосчн^знкых препаратов эндонуклеаз бшса использована схема, включающая от четырех до шести этапов хроматографии. и которая позволяла разделить 5 фракции эндонуклеаз и топоизоиеразу I Срис.7,В}.

Клеточные ядра, выделенные из 1 кг печени крыс, суспендировали в буфере А до концентрации 0,5 кг ДНК/мл, и лизировали при постоянном перенешыаиии добавлением по каплям равного объема буфера С, содержащего 10 ИМ трис-HCl, рН 7,9, 50 нМ ЭДТА, 2 М NaCl, 5 нМ 2-керкаптоэтанола , 20 мМ KHSOa, 1 ИМ PHSF. Дизат перемешивали еще 30 юн. ДНК осаждали добавлением 1/30 объема 10% полиэтиленимина с последующим центрифугированием при 20000 g 20 мин . Для концентрирования белок из иадосадочноЯ жидкости высаливали добавление;! сухого сульфата аммония до. 80S масьЕсенкя и перемешивали на магнитной меоалке 30 нин после полного растворения соли . Осадок белка собирали центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин, растворяли з 50 мл буфера Г: 20 мН На-фосфат. рН 6,0, 5 иМ 2-меркалтаэтано.ча, 0,1 нМ ЭДТА, 1 м.М PHSF, 10* глицерина и диализовади в течение ночи против того же буфера .

Колонку фосфоцг.члюлозы "Signa" 5 х 6 см уравновеаашали буфером Г. Экстракт в объеме 50 ил наносили на колонку со скоростью 1 мл/Нин. Проаьеаяие и элвирование вели со скоростью 8 мл /мин . При хроматографии использовали ступенчатый градиент кон -центрации НаС1 0-1,5 М. Активность эндонуклеаз во фракциях первоначально измеряли в присутствии 2 мМ СеСХз + 5 мН MgClz. Максимальная Са'И^-эавасияая активность была сосредоточена во фрак-

Мол.масса, кД 94 67 43 30< 20 14

Мол.масса, кД 94 67 43 30 20 14

...А/У LÀ.

100 45

!7 I

27 18

100

120

34 35

.25 .5 .75

Относительная подвижность

.25 .5 .75 Относительная подвижность

Рис.5. Зимограмиа в 12.5У. SDS-ПААГ эндонуклэазной активности экстрактов ядер печени крыс, свежевыделенных в присутствии PMSF, до СА? и после 3 месяцев хранения при -20° СВЭ, или без PMSF. ДО ССЭ и после 3 месяцев хранения в тех же условиях CED.

л ь и о

X «

к ti

100 80 60 40 20 молекулярная иасса, кД

100 60 60 40 20 молекулярная касса, хД

Рис. 6. Гель-фильтрация ядерных экстрактов через Тоуоре^гХ Ш60Г. ДНКазные активности измерены в присутствии 2 шМ СаС1г + 6 о!| МяС1», рН 7,4 (1) или Б вН МпСЬ. рН 7,4 (2). Клеточные ядра выделены с Р^ет САЭ У. без ПСУ СБЭ.

Рис.7. Электрофорез конечных препаратов эндонук.-левэ в пэлиакрила-мидном геле с SDS. 2 - Ма31, 3 -СМ26, 4 - СМ41/54, 5 - CK3S.6 - Hg36, 7 - Tono I, 1,8 -стандарты молекулярной массы: фос-форилаза Б 94 кД, альбумин 67 кД, овальбуник 43 кД, карбоангидраза 30 кД, ингибитор трипсина 20,1 кД, альфа—лактальбумин 14.4 кД. 1-7 -окраска кунасси, 8,9 - окраска серебрением.

1 2 3 4 5 6 7

8 5

_- 94 :

. 37

■— 20.1

■—

-— 14.4

Ядеркьй экстракт i

4»

МпЗХ СМ36 СМ26 Hg36 СМ41/54 Topol

Рис.В. Схеиа разделения ДНК-зидонуклеаз клэточикх ядер печени

крыс СЙЭФ - изозлектрофокусирование, Тоуо - тойоперл, ГолС - голубая сефароза. ГепС - гепарин-сефароза, ДНК-аг - ДНК-эгарозаЭ

tiíjSl - Kn-завнсикая эндонуклеаза 31 кД, CM2S - Сг/Нз-зависикэя эндонуклеаза 26 кД, CM3S - Са/Нйг-зависнкая эндонуклеаза 36 кД, M®3S - Мг-завнскиая эндонуклеаза 36 кД. СМ41/54 - Ca/Hg-зависиная эндонуклеаза 41/5& кД, Tono I - топокзонераза I.

Таблица 1. Очистка ДНК -эндонуклеаз и топсизомеразы I из клеточных ядер печени крыс

Стадия выделения Белок , Удельная актив - Очистка Выход,

иг кость , 10* ед. /пг1 X

Са/Мя-зависимая зндонуклеаза 41/54 кД (СМ41/54):

экстракт 2200 0,2 - 100

фосфоцеллюлоза 96 1.0 5 22

ИЭФ 4 4,0 20 18

голубая сефароза 0,4 29,7 150 2,7

гепарин-сефароза 0,032 310 1500 2,3

Тоуорваг1-50 0,016 500 2500 1.6

Са/Мз-зависиная зндонуклеаза 36 кД (СМ36):

экстракт 2200 0,2 - 100

фссфсцеллилоза 205 1.4 7 65

ИЭФ 3,5 7,3 36 5,7

голубая сефароза 0,2 60,2 310 2,7

гепарин-сефароза 0,05 95 480 2,5

ДНК-агароза 0,024 167 640 0,9

Са/Мя-зависивая зндонуклеаза 26 кД (СМ26): /

экстракт 2200 0,2 - 100

фосфоцеллюлоза 205 1.4 7 65

ИЭФ 3,5 7,3 36 5,7

голубая сефароза "0,8 20 20 4.1

гепарин-сефароза 0,185 54 270 1.8

Из-зависимая зндонуклеаза 36 кД <Мв36):

экстракт 2200 0,06 - 100

фосфоцеллюлоза 205 0,37 6 57

ИЗО 16,6 2,7 45 34

Тоуореаг1-50 3,1 6,5 109 15

голубая сефароза 0,2 12 ' 200 1,6 '

гепарин-сефароза 0,013 10 170 0,1

Мл-зависиная зндонуклеаза 31 кД (Мп31):

экстракт 2200 0, 1 - 100

фосфоцеллюлоза 450 0, 2 2 41

ИЭО 55 0, 5 5 12, 5

Тоуореаг1-60 7 3, С 30 9, 5

голубая сефароза 1.2 13, 6 138 7, 5

гепарин-сефароза 0,1 48 480 2, 2

ДНК-агароза 0,005 200 2000 0, 4

циях 0,5-0,7 М. В зоне менее 0,5 М NaCl определена Мп-зависимая эндонуклеаза. Во фракциях 0,8-1,0 М NaCl выявлялась топоизомераза I. Белок объединенные фракций 0,2-0,4 М. 0,4-0.7 М и 0,7-1,0 М концентрировали высаливанием 0-80% сульфатом аммония, и диализо-вали в течение ночи против буфера Д: 10 кМ трис-HCl, рН 7,7, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-неркаптоэтанола, 10% глицерина.

Колонки для изоэлектрофокусирования объемом 100 мл с 1% ам-фолинани рН 7-11 и градаеитом глицерина 0-60% преформировали в течение 8 часов при напряжении 1200 V. В пробу добавляли глицерин до 30% и препарат фермента в объеме 7 мл вносили в зону рН 8,5. Изоэлектрофокусирование вели в течение 18 часов при 1200 V 10 мА на холоду. Фракции объемом 2 мл собирали, определяли рН и активность эндонуклеазы.

Хроматографию через тойоперл проводили в колонках размером 2,5 х 35 с«, уравновешивали буфером, содержащим 10 тМ трис-НС1, рН 7,7, 0,2 М NaCl, 5 мМ 2-иеркаптозтанола, 10 мМ KHSOs, 0,1 кМ ЭДТА, 10% глицерина . Объем препарата , наносимого на колонку составлял 3 мл, скорость элюции - 1 мл/пнн, объем фракций после 10-кратного концентрирования на мембране «Anicon» YM-10 - 0,4 мл.

Колонки голубой сефарозы "Pharmacia" 1,4 х 4 см уравновешивали буфером Д. Препарат в объеме 8 мл наносили со скоростью 0,5 нл/Ъии. Нанесение повторяли пятикратно. Колонку промывали 15 мл исходного буфера и элянрозали ступенчатым градиентом NaCl: 0,1, 0,2, 0,3, 0,6 и 1,5 И. Объем каждой ступени составлял 7 мл. Для последующей очистки фракцию диализовали против буфера Д.

Колонки гепарин-сефарозы "Pharmacia" 0,4 х 1 см уравновешивали буфером Д. Диализовакньй препарат ДНКазы зносили в объеме 7 мл с скоростью 0,2 мл/ihh . Колонки промывали 10 мл исходного буфера . Белок элюировали тремя ступенями - 0,2, 0,8и 1,5М НаС1 в буфере Д объемом no 1,5 ял.

ДНК-агарозу готовили из расплава 4У. ггарозы Н «Pharmacia» и нативной ДНК тимуса теленка с последующим дроблением ч отнучива-нием сорбента. Колонки размером 0,4 х 1 см уравновешивали буфером Д. Препарат фермента троекратно вносили з объеме 5 мл со скоростью 0.2 ма/т*ин. Белок элюировали одной ступенью 1.5 М NaCl s буфере Д С1 млЭ.

Конечные препараты ферментов диализовали троекратно против буфера Е: 10 мМ трис-HCl, р& 7,7, 0,1 иМ ЭДТА, 0,5 кМ ДТТ, 50%

глицерина и хранили до 6 месяцев при -20 без потери активности. Результаты очистки приведены в табл.1. Дополнительно, с использованием другой схены очистки, была очищена Са/М^-зависикая эн-докуклэаза 15 кД Сен. табл. 15. Как видно из таблицы, очистка ДНК-зкдонуклеазы 15 кД составила 2000 раз. Суммарная активность фракции. полученной после хроматографии на оксиапатите. была на 2 порядка выше, чем в грубом экстракте, что можно объяснить отделением неизвестного ингибитора ДНКазы. Суммарный выход ферментов составил около 12Х.

По данный электрофореза в вЙЗ-ПААГ ферменты были близки к гомогенности, а один из препаратов (СМ41.'54 ) имел две белковые полосы в геле Сем. рис. 73. Гель-фильтрация этого препарата через тойоперл НИЬО показала присутствие одного пика ДНКазной активности, соответствующей 46 кД.

Таким образом, несколькими методами подтверждена множественность зндснуклеаз в ядерном экстракте из печени крыс. По данный очистки основными формами зндокуклеаз ядра являются Са/Мз-зависк-мые эндокуклеазы 41/54, 36, 26 и 15 кД. Пе-зазисимая эндонуклеа-

за 36 кД, Мп-зависииая эндонуклеаза 31 кД. Итоговая схема очистки

позволяет одновременно получать препарат топоизонеразы I типа, свободный от зндонуклеазной активности.

3. Исследование свойств ияднзндуальпых ферментов

В табл. 2 представлены данные характеристики выделенных ДНКаз. Каждый из шести ферментоз содержал одну полипептидную цепь, характеризовался эндокуклеазнын типом гидролиза ДНК, действовал как на кольцевую, так и на линейную ДНК, не обладал РНКаз-ной, топоизомеразной. АТФазной кли ДНК-связызающей активностью. -Кроме молекулярной: кассы. ДНКазы различались по изоэлектрической точке, удельной активности, катконозависикости, расщепляемой последовательности ДНК. а в тех случаях, где было измерено - по оптимуму рН, механизму гидролиза ДНК (проценту одноударности в начале гидролиза ). действию на одно- и двуцепочечную ДНК.

Две из выделенных ДНКаз, С1141/54 и СИ26. имели высокий Са/Мй-скнергизк - от 20 до 100, и составляли в сумме по данным выделения около 2/3 по белку и по активности среди эндонуклеаз ядерного экстракта. ДНКаза СК26, являющаяся из них основной по белку и по активности, давала положительную иммунную реакцию с

Таблица 1. Очистка ДНК -ондонуклеаз и топоизомеразы I из клеточных ядер печени крыс С продолжение}.

Стадия выделения Белок, Удельная актив - Очистка Выход, нг ность, 10э ед.^г %

Са/Мд-зависимая эндонухлеаза 15 кД (СМ.5 ):

экстракт 1200 1.6 - 100

оксиапатит 27 89 19 43, S

ИЗ® 5 80 17 7.2

голубая сефароза . 0,45 8С0 174 6,5

гепарин-сефароза 0,04 9600 2090 6.9

Топоизомераза I типа СTono D:

экстракт 2200 0,7 - 100

фосфоцеллюлоза 98 7 10 44, ,5

ИЭ® 4 33 47 8, ,6

голубая сефароза 0,4 210 300 5, ,5

гепарин-сефароза 0,032 400 570 0, ,9

Toyopearl-50 0.010 650 1000 0, 5

Очистка проведена из 1 кг печени крыс. При выделении СМ15 ядра получали тритоновьи нетодои из 500 г ткани, определение активности вели с использованием ДНК плазмиды рВК322.

Активность эндонуклеазы, ед./Ю^кл.

Рис.9. Включение ^НЗтнмидина в полупроницаемые СНО-хлетки после введения эндонуклеазы СИ15 в зависимости от количества фермента. Пунктиром показан уровень хонтроля.

Таблица 2 . Сравнение свойств ДНК-эндонуклеаз из ядер печени крыс

Параметр СМ41/"54 СМ36 СМ26 cm 5 Mri31 МеЗб

Молекулярная масса

электрофорез 41/S4 36 26 15 31 36

гель-фильтрация 46 30 30 НУД 30 30

Субъединицы 1 1 1 1 ■ 1 1

Изоэл.точка. рН 9,7 10,4 10.4 8.0 10,4 8.3

Тип гидролиза эндо эндо эндо эндо эндо эндо

Оптинун катионов. У. от наксимуиа

2нМ СаСЬ+ЗнМ MgClz 100 100 100 100 50 100

5мМ М^Ь+2мМ ЗГТА 1 25 5 7 50 100

5нМ MrClz 8 50 100 33 100 100

Im« ЭДТА pH 5 1 2 0 3 12 50

Са^М ^синергизм высокий высокий

низкий низкий низкий низкий

Оптимум pH

2мМ СаС 12+ЗмМ MgClz 6.5 ПУД Н/'Д 8,5 5.5 н УД

5иМ MiClz 6.5 Н/'Д НУД 6,5 5.5 НУД

Субстратная специфичность

РНК - - - - - -

ДНК + + ч- +

кольцевая ДНК + + + +

вставки Н/'Д н/д ++ Н/'Д НУД

палиндромы НУД НУД н Уд ' + н уд

аз/сЗэДНК 35>>ds ss>d3

АП—ДНК - + - нуд - " -

сайт -селективность Г* АЛ

3'...5' Н/'Д гит. | /lyWÄ TT1 Т GG С/» ЛЛ T'TG н Уд KA | Н выроэц

Принерная представленность : в ядерном

экстракте, У. среди эидонуклеаз

по белку 6 9 65 14 2 5

по активности

2мК CaClz+ЗнМ MgCla 30 15 зе 12 4 .1

5нМ ПгС1г 4 13 63 7 13 .1

Реакции с AT к нейтральной , ДНКазе

ELISA - - н Уд + -

ингибирование — - + НУД - -

Прочие активности :

ДКК -зав .АТОаза - - - - - -

ДСА - - - - - -

Tono I - — - - - -

Tono II - - - - - -

моноклональными антителами г; нейтральной Mrr-зависииой ДНКазе, и подобно последней характеризовалась высокой Ми-зависимой активностью. Фермент с аналогичными свойствами был впервые описан в ядрах печени крыс (но не очивен) Ishida [1976]. и выделен недавно их ядер тимуса теленка Никоковой и соавт. [1989]. Так как выход фермента по белку наиболее велик среди описываемых ДНКаз, сн может являться первым претендентом для клонирования гена ядерной Ca/tlff-завясимой эндонуклеазы. Вторая из эндояуклеаз с высоким Ca/Mg-сянергизмон. СП11/54. наиболее близка описанной ранее Ходаревым и соавт. [1987] эндонуклеазе из спленоцитов человека.

На эндонуклеазы с низким (2-4 ) СМ-синергнзмои: СМ36. СМ15, Мп31 н МфЬ, — приходится около 1/3 белка и активности ДНКаз ядерного экстракта. В препарате СМ36 показана АП-эндонуклеазная активность, так что есть основания предполагать сродство этих ферментов. Кроме того, по свойствам фермент близок к Mg-зависямой ДНКазе ядер печени крыс, описанной Machrajr [1981]. Три остальные эндонуклеазы - СМ15, Ме31 и МдЗб - описаны впервые. Они являются минорными белками среди эндонуклеаз ядра, и возможно - продуктами частичной протеолитнческой деградации высокомолекулярных зндонуклеаз.

Роль протеоялза в регуляции активности и количества ядерных эндонуклеаз ранее не изучалась, но по-видимому долэета стать предметом дальнейших исследований. На необходимость таких исследований указывают полученные нами косвенные данные,, в частности: сходство свойств, наличие различий в молекулярных массах ферментов, их относительно низкой удельной активности по сравнения с ДНКазой I, роли протеолиза в регуляции количества изоформ ядерной ДНКазы in vitro, и присутствие некоего высокомолекулярного пред-¡Еествешшка эндонуклеаз, активируемого трипсином. Образующиеся изоформы. обладая индивидуальной специфичность» а отношении последовательности и вторичной структуры ДНК. могут выполнять в ядре различные функции.

В экспериментах с одной из выделенных ДНКаз, СШ5, было показано. что фермент способен стимулировать синтез ДНК при введении в полупроницаемые клетки китайского хомячка (рис. 9).

Описанное соотнесение эндонуклеаз характерно для нормальных клеток и изменяется при кммортализации и опухолевой трансформации

клеток.

4. Активность ядерных ДНКаз и ДНК.-топоиэомеразы I в нормальных н трансформированных клетках

В экстрактах ядер гепатом. индуцированных диэтилнитрсзами-

и 2+

нон. активность в присутствии Мп превышала зктиаиость в присутствии Са + Мд , причем это превышение увеличивалось пропорционально снижению степени дифференцироеки гепатом. Судя по соотношению активностей в различных ионах Стабл. ЗЭ снижение активности эидонуклеаз с высоким Са/М^-синергиэмом происходило на этапе трансформации Сконтроль-высоксдифференцированные гепатомыЭ. а дедифферекцирозка гепатом сопровождалась увеличеииен Мк-зависнкой эндонуклеазы. Сходство эндонуклеазкого профиля печени плодов и гепатом позволяет утверждать, что превышение марганцевой над кальций-магниевой зкдонуклегзной активностью является признаком Фенотипа низкодифференцированных клеток. Изменение активностей зндокуклеаз не связано с пролиферирующим состояние!! ткани, поскольку в регенерирующей печени не отмечено подобного изменения соотношения активности ферментов. Активность топоизомеразы I в опухолях снижалась параллельно Са/И^-завнсикой эндокуклеазе, ко б окружающей опухоль ткани печени ее активность была резко повышена и коррелировала с массой опухолевой ткани в печени.

Аналогичные изменения были выявлены в клетках находящихся на последовательных стадиях трансфорнации. В работе использовали модельную систему клеток крысиных знбркокальных фибробластоз, полученную ранее Тополь и соавт. [1986 ], которая вклнчала з себя первичные фибробласты крыс, иммортализозанкые ранней областью аденовируса обезьян БА.7 (11ЕК-1), те же клетки, протерпевшие дополнительные морфологические изменения после однократной трансфекции онкогеном Е,1газ (ЕЕР^Е«!), и, наконец, после пслной трансформации при позторной трансфекции этик жг онкогеном <КЕЕ-2ЕЛ). Для транслекции использовали плазмиду р2»Хга5. Особенностью модельной сис— тепы. используемой для этих экспериментов являлась то, что ока включала дополнительную стадию покино иинортглизацки на пути к трансформации. Эксперименты показали, что активность топоизомеразы I и Са/"Мг-скнсргизп монотонно снижались б ряду КЭС-£1ЕГ1--Н£Ь"1Е<1, а Мс—зависимая активность увеличивалась от КЗ© с ИУГ-2ЕЛ. Иккортал;1зация альтернативными способами - онкогеном туе, большим

Таблица 3. Удельная активность топоизонеразы X и зндонуклеаз в экстрактах ядер гепатои, окружающей ткани печени, регенерирующей и фетальной печени крыс. Условия определения активности: А - пМ СаСЬ + 5 оМ МяСЬ, рН 7,4; Б - 5 иН НяСЬ + 2 вМ ЭГТА, рВ 7,4; В - 5 шМ МпСЬ, рН 7,4;

Г - 1 шМ ЭДТА, рН 5,0. Субстрат - ДНК печени крыс. Все числа приведены в значении Н ± н.

Тка.чи п Акт. топо I 1 Огед. / УНГ Активности ДНКаз Се. отношения я. /пг) и их

А Б В Г А/Б В /А

Контроль 10 100±11 201+5 32+3 123±3 16+4 6. .3 0.6

Гепатоны

ВДГ 4 10+1 56±1 20±2 84±4 40+2 2. .8 1.5

УДГ 18 27±1 5Э±1 18+3 106+7 23+4 2. .9 2.0

НДГ ч 7±2 48±3 10+2 152±10 26+5 4. .8 3.2

Окружающая печень

18 650±350 114+10 41+3 113+3 22+6 2. ,7 1.0

Регенерирующая печень

12 ч 4 46+3 174±6 33+3 96±2 12+8 4. .6 0.6

16 ч 4 10±1 164+14 27±5 84+3 24+5 6. ,3 0.5

24 ч 4 14± 1 100±9 20+4 40+3 12+3 5. ,0 0.4

30 ч 4 25±1 86+7 26+5 58+2 47+2 3, ,3 0.7

Печень новорожденных

4 85+5 166+11 84+2 166+5 26+2 2. ,0 1.0

Фетальная печэкь

28 7Э±3 •11+1 26+3 86+1 26+1 1. .5 2.1

Таблица 4. Изменение удельной активности топоизомеразы I.

Мгг-активируемых эндонуклеаз и Са/Ме-синергизн^ в экстрактах клеточных ядер фибробластов крысы на стадиях канцерогенеза, в % от КЭФ

Клетки Удельная активность Ca/Mg- Мп-активируеная

топоизомеразы I синергизм эндонуклеазная

активность

КЭФ 1С0

REF-1 41,8

REF-1EJ 25,5

REF-2EJ 7,3

100 100

35.5 131 28,3 144

51.6 244

Таблица 5. Удельная активность эндонуклеаз и топоизомеразы I в

ядерных экстрактах трансформированных клеток человека, различающихся по чувствительности к парвовирусу Н1 , 102 ед./мг белка

С А - 2 шМ СаС12 + 5 вМ МаС1г, рН 7,4; Б - 5 шМ МдС12 + 2 тМ ЭГТА , рН 7,4; В - 5 вМ МпС12, рН 7,4; Г - 5 вМ МзС12, рН 7,4 Д - топоизомеразная реакция I типа)

Субстрат ДНК фага \ АП -ДНК рОС 19 Восприии-

- чивость

Условия к

реакции А Б В Г Д вирусу Н1

ФИБРОБЛАСТЫ:

MRC5 1,22 0,46 1,15 36 4,00 +

MRC5V1 0,49 0,25 0,46 34 6,00

KMST6 0,18 0,21 0,14 26 5,44 ++++ -

NBK 0,09 0,06 0,30 24 4,00 ++++

КЕРАТИНОЦИТЫ:

С17 3,20 2,50 3,00 н/д 6,50

С110 0,63 0,70 0,95 н/д 5,00

Т-антигеном вируса полиомы также сопровождалось уменьшением синергизма и активности топоизомеразы I (данные не приведены). Такап образом, мы предполагаем, что топоизоиераза I и Са/М£-зависимая зндонуклеаза, вернее снижение их активности, могут являться маркерами иммортализации. а На-зависимая зндонуклеаза - маркером полной СзлокачествениойЭ трансформации клеток.

В клеточной системе, состоящей из нормальных и трансформированных фибробластов человека, а также з 2-х линиях кератиноцитов человека, различающихся по способности заражаться парвовирусами и амплифицирозать парвовирус Н1. активность ядерных эндонуклеаз в Са2* + М^" и Са/М^-синергизм обратно коррелировали с чувствительностью клеток к парвовирусу. Выявленная закономерность нояет являться иллюстрацией защитной функции ядерных эндонуклеаз.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что Са/М^-зависиная ДНК-эндонуклеазная активность в клеточных ядрах печени крыс обеспечивается несколькими ДНКазами. различающимися по молекулярной массе, изоэлэктрической точке и катионозависямости. Аналогичная гетерогенность эндонуклеаз выявлена в ядрах других клеток: фибробластов крыс, фибробластов человека, кератиноцитов человека.

2. Разработаны методы выделения основных ДНКаз и топоизомеразы X из клеточных ядер печени крыс до состояния близкого к электрофоретической гомогенности. Определена представленность основных ДНК-эндснуклеаз з клеточных ядрах по белку и по активности .

3. Бее ядерные ДНКазы печени крыс представляют собой моно-мерныэ лолипептиды, расщепляют ДНК по эндонуклеолитическому типу. Среди эндонуклеаз ядер печени крыс выявлены:

- СМ41/54. зндонуклеаза 41/54 кД С 46 кД по гель-фнльтрацииЭ,

р! 9,7, актнвируемап прзимуиестэенно сочетанием ионов Са2* и Нд'*, характеризующаяся высоким Са/Мд-синергизиом, оптимумом рН 6,5;

- СМ36. зндонуклеаза 36 кД, р! 9,7, активируемая преимущественно ионами С а2* н с низким Са/М^-синергизмом;

- М^Зб, зндонуклеаза 36 кД, р! 8.3. активируемая ионами М32*;

- Мг>31. эядонуклгаза 31 кД, р! 10.4, активируемая преимущественно ионами Мп2+, с оптимумом рК 5,5;

- СМ26, зндснуклеаза 26 кД, р1 10,4, активнруеная сочетанием ионов Са~* и Мз** или ионами Мп2+. с высоким Са^'М^-синергизиом;

- СМ15, эндонуклэаза 15 кД, рХ 8,С, активируемая преинукествекно ионами Са2+ и Нд2*. с низким Са/'Ма-синергизкои к оптимуноп рК 8,5 ССа2" и ИягЪ или 6.5 СИп2Ъ.

i. Из описанных ранее ДНК-эндонуклеаз■ядер печени крьзг: Са^М^-зависимой зядонуклсазэ близка СН26 Спо молекулярной кассе- и катионозависимост:0; нейтральной ДНКгзе - таказз СМ26 Спо реакции с мококлональныки антителами}; апуркновой эндонуклзазе - СМ35 Спо катионозависикэстк}. Остальные ДНКазы описаны впервые.

5. Разработана компьютерная программа для расчета соотноеэ-кия активностей основных эндонуклааз ядс-рного экстракта. Предложена иатенатнческая модель стохастического сиег^аггнсгс одно-д-у-ударного разрезания кольцевых ДНК зкдолутлзз-эдкн. С понощыо недели определена способность зкдонуклеаз СИ26, Мп31 !• панкреатической ДНКазы I нестохастичес:;и растсп^ять вставки г плаз.чидс рВЕ32£ СВ1-, В2-, и Л1и-яовторы, палиндромы парсовирусоз. онкоген ЕОгв.О.

6. Показано, что выделенные зндоиуклеази проявляет сходную специфичность гидролиза ДНК парвззкруса К\'Н, гредпочктакт АТ-бо-

пооледэсательности. хотя основные сайты разрезания для от— дельных ферментов различаются.

7. Определена способность экдсггуклеаз ядра [.-^стохастически расщеплять позтеры Со-ЬОО"1 к иездинуклеосовнък ликкеры и процессе ограниченного гидролиза хроматина.

8. В гепатомах крыс, кндуцнровакя^сс дпэтплнктрезаккном, показано снижение актнехгости ядерных ^цдо.чуклеаз с высоким Сах'Мз-синергизно::, и активности топо;;зомеразы I. Н;:зкодифференцирован-_ ныв гепгтоиы характеризовались позыпгок»':оЛ активностью Мп-зависи-кой зндонуклэгзы. Диалогичные изменения р.г.тквности ферчь-г.тов наблюдались в эмбриональной печени крыс. ко отсутствовали в реггке--рирую^-й пучени.

. 9. В эмбриональных Оибробллстах кри; снижение активности то-по!:зокеразк I :< зндонуклгаз с высокий СаЛ^з-синсргизнои совпадало со стадией хпшорталкзацик клеток и продолжало енк—атьел при пергой т^аксфехцки онкогене;-: гМгаз. На зткх стадиях канцерогенеза, а таг.»; после старой трансакции онкогеном активность Кгг-завискмеч зндо::уклеэзы повышалась.

10. Активность эндонуклеаз с высоким Ca/Mg-сикергнзмом снизана 3 трансформированных фибробластах и кератикоцитах человека. Способность этих клеток заражаться опухслетропным автономным пар-возирусом Н1 увеличивалась пропорционально снижения активности эндонуклеазы о линии клеток.

11. В экспериментах на полупроницаемых клетках яичников китайского хомячка выявлена способность эндонуклеазы СН15 усиливать внеплановый синтез ДНК. Предложены способы определения кольцевых ДНК в бактериях, и диагностики системной склеродермии среди системных заболеваний соединительной ткани, основанные на использовании полученного препарата топоизомеразы I.

12. С учетом сходстза свойств и отсутствия пряных указаний на генетическую гетерогенность ядерных эндонуклеаз данные ДНКазы признаны кзоформами ядерной Са/М^~зависимой эндонуклеазы. На основании косвенных данных: различий в молекулярных массах ферментов, относительно низкой удельной активности, роли протеолиза в регуляции количества изоформ ядерной ДНХазы in vitro, наличию высокомолекулярного предшественника эндонуклеаз, активируемого тркггсиггоя, - зыдзинуто предположений о протеолязе как одном из механизмов регуляции активности и количества изоформ ядерной ДНК-зндокуклеазы.

Осказние результаты проведенных ясследозаяа^й олуБляхозани в следуЕвчазс работах:

1. Вотрнн И. И. . Ходарев H.H. , Баскакьяц А. Г. , Соколов H.H. , Фяцмер А.Б. Характеристика действия различных эндонуклеаз на хро-катня « получение трзнсхрнпционко-ахтивянх фракций /ХГезисы IV Бсесопзчого биохимического съезда.Ленинград.-197?.-т. 2. -с.313.

2. Хсдарев H.H. , Вотрик !!. ¡1. . Баснакьян А. Г. , Яе».5оз С. С. Обнаружение эндонуклзазной активности и некоторь^е особенности аутолиэа хроматика з клеточных ядрах мезга крыс//Биохичня. -1979. -т. 44.-с. 622-627.

3. Вотрин И.И. , Ходарев H.H., Баснакьян А. Г. , Сохолоз К.К.. Фицнер A.S. , Александрова С. С. Ксследзваихо направленной фрагке-атацли ДНК хроматина некоторым;.' эндснуклеазакн, их выделение и свойства //Вестник АМН СССР.-1981.-JE.-с.59-64.

4. Еотрин И.И.. Ходарев Н.Я.. Баснакьян А.Г. Эндонуклеазы

как инструмент исследования структурно-функциональной организации хроматика /.-'Вестник АНН СССР.-1983.-КЗ.-с. 88-95.

5. Баснакьян А.Г.. Вотрик И.И. Рестриктазы как возможный фактор эволюции нуклеотидного состава ДНК //Ж. эвол. биохим. фнзи-ол. .-1983. -Ы1. -с. 20-24.

6. Воробьев С. Н. i Баснакьян/А. Г. . Вотрин И. К. Обнаружение и характеристика стафиллококковых плазмид с использованием иуклеазы S1 //Тезисы Всес.конф. по применению ферпентов в биохимических анализах. Паланга.-1984. -т. 1. -с. 54.

7. Баснакьян А.Г., Блинкова Л.П., Бутова Д.Г.. Кирсанова И. Д. , Вотрин И.И. Способ выделения хромосомной и плгзкидной ДНК из гранположнтельных кокков //Авт. свидетельство N 1192367 от 15. 07.1985.

8. Бубнов Н.В.. Баснакьян А. Г. . Вотрик И.К. Условия начального зндонуклеолиза хроматика и характеристика его продуктов // Бюлл. зксп. биол. мед. -1985. -с. 154-156.

9. Баснакьян А. Г.. Бубнов Н.В. , Кирсанова И. Д.. Вотрин И. И. Топоизомераза I хроматика печени крыс: применение дли изучения бактериальных плазмид //Тезисы V Всес. биох. съезда. Киев.-1986. -т. 2. -с. 25-26.

10. Баснакьян А. Г.. Бубнов Н. В. . Вотрин 1!. К. Динуклеосока как продукт начального расагпления хроматина эндогенными нуклеа-зами //Бюлл. эксп. биол. мед. -1986. -Ьй. -с. 463-466.

11. Бубнов Н.В. . Баснакьян А.Г. . Вотрик й.И. Расиэяление повторов ДНК печени кркс з ходе начального зндонуклеолиза хроматика //Молекул, генетика .кикробкол. вкрусол. -1936. — №>. -с. 25-30.

12. Баснакьян А.Г., Бубнов Н.В. ДНК-эмдонуплеазы клеточных ядер печени крыс а норке и при химическое канцерогенезе //Тезисы УВсес.спмп.по мед. эь'зимологии. Махачкала.-1986.-с. 169-170.

13. Вотрин И.И., Ходарез Н.Н., Баснакьян А.Г. Топокзомеразо -зндокуклеазкый комплекс клеточных ядер а стратегии исследования ДНК-ферментов //Гаи же, с.9-10.

14. Бубнов К.В., Баснакьян А.Г., Вотрин К.К. Маргакец-завнскнал эндонуклеазиая активность хрокатнна //Биохимия. -1986. -т. 51. -с. 1194-1202.

15. Баснакьян А. Г. , Кирсанова И. Д. . Чупырина К. В., Газдаров А. К., Вотрин К.К. ДНК—топоизонераза лимфоцитов крози телят в норме и при лейг.озе //Тезисы Всэс.силп.по биохимии сельскохсз.

животных, Ташкент. -1S86. -с. 74.

16. Votrin I I, Basnakian A G, Khodarev К N Endodeoxyribcr-nucleases: role in "the cell and application in biology and medicine // Soviet Medical Reviews, Section B, Physicocheraical Aspects, Lopuchin CJ.M. (ed.), Harwood Academic Publishers. -1987. -VI. -p. 331-42S.

17. Баснакьян А.Г., Вотрин И.И. Ядерные ферменты, разрезавшие ДНК //Тезисы Всес.симп.«Структура и функция клеточного ядра». Черноголовка. -1987. — с. 50.

18. Basnakian A. G. , Antoni F. , Boubnov Ы. V. , Votrin I. I. . Banfalvi G. Bivalent cation and ATP requirements of endonuc-leases from rat liver nuclei // Acta Biochisx. Biophys. Hung- -1987. -.У22, H4. -c. 409-424.

19. Баснакьян А. Г., Бубнов Н.Э., Кирсанова И. Д. . Вотрин И. И. Активность ядерных эндонуклеаз и топоизомераз в печени крыс и опухолях, индуцированных диэтилнитрозамином //Эксперим. онкология. -1989.-11, N2.-с. 15-19.

20. Баснакьян А. Г. . Тополь З.Л. , Кирсанова И. Д. , Вотрин И. И. , Киселев Ф. J1. Активность топоизокеразы I и эндонуклеаз з клетках, трансфицированных онкогеном ras //Молех. биология. -1989. -?3, N3.-с. 750-7S7.

21. Баснакьян А.Г. , Бубнов Н.В. , Вотрин И.И. ДНКазы клеточных ядер: множественность и гетерогенность //Биохимия.-19S9.-54, iE. -с. 273-283.

22. Basnakian А., Banfalvi G., Sarbar Н. Contribution of DNA polymerase delta to DKA replication in permeable CHO cells synchronized in S phase //Nucleic Acids P.asearch.-1939.-У17.-

p. 4757-4767.

23. Sarkar M-, Basnakian A., Banfalvi G., Taljanidisz J., Popowski J. Temporal order of gano replication in marajnalian chromosomes usins a novel approach using HgdCTP //Symposium «Eucariotic DSA replication, Cold Spring Harbor Lab.-1989. -p. 142.

24. Бубнов H.B. , Баснакьян А. Г. , Вотрин И. К. ДНКазы клеточных ядер : Мгг-эависияая эндояуклеаза //Б»лл. экслерим. биол. мед. -1990, MIO. -с. 370-372.

25. Basnakian A. G. , Tcherepanova I. Y. , Rashkovetsky L- G. , Votrin I. I. Endonuclease from rat liver nuclei enhances the DNA synthesis in permeable Chinese Harastar Ovary cells //J. Cell Biol.

-1590.-V. 111. К5-г -p. 379a.

26. Soherbaoov А.В., Eeaerison E.I., Kirsanova I.I., Basna-kian A.G., Gusseva N.G. Inhibition of activity of topoisomerase I by sera of patients with systemic sclerodermia: new method of determination and clinical correlations //The Int.Conf.on sclerodermia and 3cIerodermia-like diseases, Poland, Swieradow-Zdroj. -1991.-p.70.

27. Basnakian A. G. , Boubnov N. V. , Kirsanova I. D. , Votrin

I. I. Nuclear topoi3oraerase and DNase activities in rat diethyl-nitrosamine-induced hepatoma, in regenerating and fetal liver //Biochemistry International. -1991. -V. 24. - p. 429-437.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ссДНК - суперспирализованкая форма ДНК плазниды, форма I

ок.ДНК - открытая кольцевая форма ДНК плазниды, форма II

лДНК - линейная форма ДНК ллазмиды, форма III

зеДНК - одноцепочечная ДНК

dsÄHK - двуцепочечкая ДНК

ДНКаза - дезокскрибонуклеаза

РККаза - рибонуклеаза

н. - нуклеотид

п .н . - пара куклеотидов

т .п .к . (кб ) - тысяча пар нуклеотидов (килобаза )

SDS - додецнлсульфат натрия