Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфотирозинпротеинфосфатаза ядер клеток: Локализация и взаимодействие с хроматином

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфотирозинпротеинфосфатаза ядер клеток: Локализация и взаимодействие с хроматином"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГ6 Од

Ч На правах рукописи

ЛЕОНОВА Лариса Евгеньевна

ФОСФОТИРОЗИНПРОТЕИНФОСФАТАЗА ЯДЕР КЛЕТОК: ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ХРОМАТИНОМ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в лаборатории химии белка Физиологического научно-исследовательского института им A.A. Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель - кандидат биологических наук, доцент А.И.Комкова

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор А.В.Арутюнян,

доктор биологических наук, В.М.Крутиков

Ведущее учреждение - Институт Цитологии Российской Академии наук

Защита состоится " Q " 1994 г. в /у^ час, на

заседании Специализированного совета К 063.57.09 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургскогом государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. № 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета. Автореферат разослан " Ч " /СкЙ-^Д?_1994 г.

Учений секретарь Специализированного совета

А.Г.Марков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обратимое фосфорилирование белков, катализируемое фосфопротеинкиназами (К.Ф.2.7.1.37) и фосфопротеинфосфатазами (PPPs, К.Ф.3.1.3.16) является одним из главных механизмов контроля внутриклеточных процессов (Krebs, 1986; Cohen, 1989).

Реакциями фосфорилирования-дефосфорилирования белков регулируются различные биологические процессы, а именно: метаболизм нуклеиновых кислот, аминокислот, углеводов, липидов, функции синаптических мембран, сократительного аппарата, передача нервного импульса, образование и разрушение цитоскелета и др. (Krebs, Beavo 1979; Krebs, 1985).

Достигнут существенный успех в изучении влияния фосфорилирования гистонов и негистоновых белков на функциональную активность клеточного ядра (Кучеренко и др., 1983).

PPPs в настоящее время изучены менее подробно, чем протеинкиназы. Интенсивное исследование PPPs началось в последние 10-15 лет. К настоящему моменту накоплено достаточно много сведений о специфичности, структуре, регуляции цитоплазматических PPPs (Ballon, Fischer, 1986), что касается PPPs из клеточных ядер, то эти ферменты изучены в значительно меньшей степени, чем цитоплазматические.

В настоящее время известны два класса PPPs: фосфосерин/ фосфотреонинпротеинфосфатазы (PSPPs) и фосфотирозинпротеин-фосфатазы (PTPPs), которые отщепляют фосфорильный остаток от фосфосериновых/треониновых или фосфотирозиновых остатков фосфопротеинов, соответственно. Наиболее широко представлен и изучен класс PSPPs (Cohen, 1989).

В последнее время особое внимание уделяется фосфорилированию клеточных белков по тирозиновым остаткам, которое непосредственно связано с регуляцией клеточной

активности включая пролиферацию, дифференцировку и трансформацию (Lau et а!., 1989). К настоящему моменту изучены трансмембранные и цитоплазматические PTPPs (Fisher et а)., 1991). Сведений о ядерных PTPPs в литературе практически нет, хотя накоплено достаточно данных о существовании различных ядерных белков, фосфорилированных по тирозиновым остаткам (Meek et al., 1992), поэтому изучение ядерных ферментов сейчас является наиболее актуальным.

исследования: определение типа РРР из клеточных ядер селезенки быка, изучение локализации фермента и взаимодействие с хроматином. При выполнении работы стояли следующие задачи:

1. Выделение и характеристика РРР из клеточных ядер селезенки быка и нерпы.

2. Изучение субстратной специфичности и ингибиторный анализ фермента.

3. Получение, очистка и характеристика антител к РРР из клеточных ядер селезенки быка.

4. Изучение тканевой и видовой иммуноспецифичности РРР.

5. Изучение локализации фермента.

6. Изучение взаимодействия РРР с хроматином.

Научная новизна. В данной работе впервые определен тип РРР из клеточных ядер селезенки быка. Исследование субстратной специфичности показало, что фермент катализирует дефосфорилирование фосфотирозинозых остатков казеина, а также фосфотирозин и паранитрофенилфосфат (pNPP, аналог фосфотирозина). РРР ингибируется ионами цинка и ортовзнадата в микромолярных концентрациях (специфическими ингибиторами PTPPs). Ингибирование активности фермента ортованадатом натрия является бесконкурентным, а сульфатом цинка - смешанным.

Получены, очищены и охарактеризованы антитела к РТРР из клеточных ядер селезенки быка.

Определено, что низкомолекулярная форма РТРР не является ткане- и видоспецифичной.

Изучена локализация РТРР в ядре. Методом солевых экстракций показано, что значительная доля фермента связана с хроматином. Основная часть РТРР связана с трудмофрагмеитируемой нуклеазами фракцией хроматина.

Методом иммунной электронной микроскопии при спрединге ядер изучена локализация РТРР с использованием моноспецифических поликлональных антител, коньюгированных с частицами золота. Показано, что фермент распределяется по хроматину неравномерно, в основном, выявляется в наднуклеосомных структурах.

Изучено связывание ,251-меченного препарата РТРР с фракцией легкофрагментируемого микрококковой нуклеазой хроматина печени крыс в условиях низкой ионной силы. Показана специфичность взаимодействия, наличие одного типа мест связывания и максимальная связывающая способность, представлены результаты по связыванию. Определено, что основная доля фермента связывается с высокополимерными ДНП-фрагментами хроматина после электрофореза (ЭФ) в ПААГ.

Научно-практическое_значение. Разработан

высокочувствительный специфический метод определения РТРР (220 нг), сочетающий ЭФ в ПААГ с иммунопреципитацией, которйй может быть использован при изучении тартрат-нечувствительных кислых фосфатаз.

Разработан высокочувствительный быстрый метод определения тирозина (1-10 нмоль) с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения фосфотирозинфосфатазной активности, который может быть использован для изучения фосфотирозинпротеинфосфатаз.

Апробация работы, Основные материалы диссертации были доложены на VIII Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции

клеточного ядра" (Пущино, 1984), на IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1984), на X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990), на XI Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на^страницах, включает 35 рисунков и 15 таблиц. Список литературы содержит 168 авторских ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали ткани лабораторных животных сразу после их декапитации, а также ткани крупного рогатого скота и селезенка нерпы после замораживания и хранения при -20°С. Для получения антител использовали морских свинок и кроликов.

Для изучения локализации РРР, ядра выделяли по методу Шово и сотр. (Cauveau et al., 1956), по методу Блобелла и Поттера в модификации Херца и Цахау (Herz, Zahau, 1980), по методу Даунса и Ицковича (Dounse, Ickowicz, 1969), и для получения препаративных количеств фермента ядра выделяли с использованием солевых растворов (Реэяпкин, и др., 1985). Все процедуры проводили при 4°С. РРР выделяли по ранее описанному методу (Резяпкин, и др., 1985).

Активность РРР определяли при 37°С в среде, содержащей насыщающие концентрации субстратов: фосфоказеина (1,25 мМ Р,), pNPP или фосфотирозина (6 мМ), 10 мМ ДТТ, 0,1% БСА, 0,3 М Na-Ac буфера, pH 5,8, 0,2-20,0 ед. фермента. За ед. фермента принимали количество РРР, отщепляющей 1 мкмоль Р| от субстрата за 1 мин. Количество тирозина определяли методом обращенно- фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с

нуклеосил 5-CiB. Количество гидролизованного pNPP определяли по интенсивности окраски нитрофенола (коэффициент молярной экстинкции равен 17,9 *103 при длине волны 410 нм). Количество Р| определяли по методу Амеса и Дюбина (Ames, Dubin, 1960).

ЭФ проводили в нативных условиях (Lam el al., 1978) и в присутствии додецилсульфата Na (Thomas, Kornberg, 1975).

Определение величин Km и построение кинетических кривых проводили на компьютере по программам "ENZFITTER" и "GRAPHER".

Концентрацию белка определяли методами Лоури (Lowry, 1951), Итзаки и Гилла (Itzaki, Gill, 1961) и микрометодом (Shaffner, Weissmann, 1973). Для количественного определения РТРР разработан метод (2-20 нг), сочетающий иммунопреципитацию с ЭФ в ПААГ в нативных условиях.

Для получения антисыворотки использовали схему иммунизации малыми количествами антигена (Verma et al., 1982). Антитела выявляли методом двойной радиальной иммунодиффузии (Ouchterlony, 1967). Антитела из сыворотки были очищены двумя способами: на колонке с протеин-А-ультрагелем и высаливанием 33% сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией (Остерман, 1984). ЭФ анализ фракции IgG проводили в системе la (Маурер, 1971).

Для изучения локализации РТРР в ядерных структурах клеточные ядра фракционировали с использованием солевых растворов (Збарский, 1967) и нуклеазного переваривания хроматина. Растворимый хроматин выделяли из ядер методом, основанным на частичной фрагментации ДНК Са.Мд-эндонуклеазой (Чихиржина и др., 1976) или микрококковой нуклеазой (Arceci, Gross, 1980) с последующей экстракцией его растворами низкой ионной силы (Noie et al., 1975). РТРР в клеточных ядрах и ядерных фракциях выявляли методом двойной непрямой иммунофлуоресценции (Gerace et al., 1978). Для идентификации РТРР в ДНП-фрагментах хроматина после ЭФ в ПААГ (Albanes, Weintraub, 1980) использовали метод

иммуноблотинга (Bonven et al., 1980). Выявление РТРР проводили также дот-иммуноферментным методом (Hawkos et al., 1982).

Изучение локализации РТРР при спрединге ядер проводили методом иммунной электронной микроскопии. (Работа проводилась совместно с сотрудником кафедры биохимии Казанского государственного университета З.И. Абрамовой). Препараты хроматина получали по методу Миллера в модификации Лабхарта и Коллера (Labchart, Koller, 1981), ядра печени крыс выделяли по методу Даунса и Ицковича. Коллоидное золото с диаметром частиц 20 нм получали по методу Френса (Frens, 1973) для получения коньюгатов Аиго-lgG и Аиго-БСА. Локализацию РТРР в структурах хроматина выявляли по методу Пейнтера и сотр. (Painter et al., 1973) с некоторыми модификациями. Препараты просматривали под электронным микроскопом Testa BS-500.

Изучение связывания РТРР с хроматином проводили в условиях низкой ионной силы. 1251-меченный препарат РТРР получали с использованием иодогена 1,3,4,6,-тетрахлор-3,6-дифенилгликолурил (Paus et al., 1982), Был получен ,251-меченный препарат РТРР (390000 имп/мин на 1 мкг ,25I-PTPP).

Растворимый хроматин печени крыс, полученный в результате переваривания микрококковой нуклеазой (40 мкг ДНК) инкубировали с 1251-РТРР (1170000 имп/мин на 3 мкг ,25I-PTPP) в присутствии или без немеченного фермента. Инкубацию проводили в течение 15 мин при 25°С в среде 1 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, содержащего I мМ ЭДТА и 2,5 мг/мл БСА. Хроматин переводили в нерастворимое состояние добавлением NaCI до конечной концентрации 0,15 M и осаждали центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин. В осадках определяли радиоактивность на у-счетчике. Для изучения конкурентного связывания использовали возрастающие концентрации немеченной РТРР (0-800 мкг/мл).

Связывание РТРР с хроматином печени крыс, ■ фрагментированным микрококковой нуклеазой, и распределение

фермента в ДНП-фрагментах хроматина после ЭФ в ПААГ также изучали с использованием 1г51-меченного препарата РТРР в присутствии немеченного фермента и больших количеств другого кислого белка - БСА. ЭФ пробы содержали растворимый хроматин (200 мкг ДНК), 10 мкг ,251-РТРР (3,9*10® имп/мин), 20 мкг РТРР, 1 мг БСА. После проведения ЭФ гели фотометрировапи при длине волны 260 нм, ДНК окрашивали раствором бромистого этидия, затем гель разрезали на части и измеряли радиоактивность на у-счетчике.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ядер клетак

Высокоочищенный активный препарат низкомолекулярной формы РРР из клеточных ядер селезенки быка был получен быстрым и простым методом, который заключается в удачном сочетании специфической экстракции фермента из ядер клеток, ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе, гель-хроматографии на сефадексе С-75 и аффинной хроматографии на конканавалин-А-сефарозе. Этим же методом был получен фермент из клеточных ядер селезенки нерпы. Ферменты из клеточных ядер селезенки быка и нерпы очищены в 624 и 274000 раз с выходом конечного продукта 22,55 и 0,30 мг, т.е. 17 и 4%, соответственно. Гомогенность полученных препаратов РРР показана ЭФ в ПААГ в нативных условиях. В этих условиях выявляется одна белковая полоса, которая обладает фосфатазной активностью. Препараты из ядер селезенки быка и нерпы обладали одинаковой электрофоретической подвижностью. Мг РРР в нативных условиях около 33000 Д. При ЭФ препарата РРР из ядер селезенки быка в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата Ыа выявляются две белковые полосы с Мг 12000 и 18000 Д, что соответствует ранее полученным характеристикам (Резяпкин и др., 1985). Сходные характеристики имеют железо- и

углеводсодержащие тартрат-нечувтвительные кислые фосфатазы типа 5 (Robinson, Glew, 1981; Нага et al„ 1984).

Определение типа РРР из клеточных ядер селезенки быка проводили с помощью изучения субстратной специфичности и ингибиторного анализа. В качестве субстратов были использованы фосфотирозин, pNPP, а также изучали содержание тирозиновых остатков в гидролизатах фосфоказеина до и после действия фермента. Величины удельных активностей препарата РРР из клеточных ядер селезенки быка при использовании в качестве субстратов фосфотирозина и pNPP примерно одинаковы и равны 1,26 ± 0,20 и 0,91 ± 0,11 ммоль Р, • мин"' ♦ мг"' белка, соответственно. Величина удельной активности фермента на фосфоказеине была 0,18 ± 0,03 ммоль Р( - мин"1 * мг'1 белка. Значения К,,, для РРР при использовании в качестве субстрата фосфотирозина были 6,45 ± 1,0 мМ, а в случае использования pNPP -1,20 ± 0,15 мМ, что соответствует ранее полученным данным для РРР (субстрат pNPP) (Резяпкин и др., 1985) и для углеводсодержащих кислых фосфатаз (Tung et al., 1987, Tonks et at., 1988). Содержание фосфотирозиновых остатков казеина изучали в условиях полного ферментативного гидролиза с последующим кислотным гидролизом, который не разрушает фосфотирозиновых щелочелабильных связей. Количество фосфотирозиновых остатков фосфоказеина определяли разработанным нами методом количественного определения тирозина с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии по нарастанию гидролизованного тирозина. Эта величина оказалась примерно равной количеству второго продукта реакции - Р, и составляла около 10% всех фосфорилированных остатков казеина.

рМРРазная активность фермента ингибируется в эквимолярных концентрациях фосфотирозином и тирозином более чем на 50% и практически не ингибируется серином, фосфосерином, треонином и фосфотреонином. На основании полученных результатов можно

сделать заключение, что фермент разрывает только фосфотирозиноеые связи, а не фосфосериновые и фосфотреониновые и относится к тирозиновым PPPs.

Изучение влияния ионов цинка и ортованадата (специфических ингибиторов тирозиновых PPPs (Brautigan et al., 1981)) на активность РРР из клеточных ядер селезенки быка показало, что сульфат цинка и ортованадат натрия в микромолярных концентрациях ингибируют активность изучаемого фермента. Ортованадат натрия в микромолярных концентрациях ингибирует активность РРР из ядер клеток примерно на 50% , что характерно для многих описанных в литературе PTPPs (Nelson, Branton, 1984; Rotenberg, Brautigan, 1987), и является бесконкурентным ингибитором фермента с К| = 9,5 ± 0.6 мкМ. Сульфат цинка в микромолярных концентрациях ингибирует активность препаратов РРР почти полностью (до 94%). Аналогичные результаты по ингибированию активности РТРР ионами цинка описаны в литературе (Brautigan, Shriner, 1988). Ингибирование активности РРР из клеточных ядер сульфатом цинка является смешанным с К| = 33,7 ± 3,0 мкМ. Результаты по ингибированию РРР из клеточных ядер селезенки быка ионами цинка и ортованадата позволяют также отнести изучаемый фермент к PTPPs.

Для изучения локализации, тканевой и видовой специфичности фермента были получены антисыворотки, содержащие антитела к РТРР из клеточных ядер селезенки быка по схеме, требующей малые количества антигена (Verma et al., 1982). При взаимодействии антигена с антисывороткой выявлена одна полоса преципитации методом Оухтерлони, что свидетельствует о гомогенности антигена. Комплекс фермент-антитело сохраняет ферментативную активность, что позволило выявить линии преципитации по ферментативной активности при большем разведении антисыворотки.

Для изучения тканевой и видовой иммуноспецифичности был разработан метод, который сочетает иммунопреципитацию с ЭФ в нативных условиях. При взаимодействии фермента с антителами образуется высокомолекулярный комплекс, который обладает меньшей ЭФ подвижностью. Предложенный нами метод, включающий иммунопреципитацию, ЭФ и затем выявление фосфатазной активности в ПААГ, является как более быстрым, так и более чувствительным по сравнению с классическим методом двойной иммунодиффузии 8 геле.

Для изучения тканевой специфичности были использованы экстракты из ядер селезенки, печени, почек быка и тимуса теленка. Для изучения видовой специфичности использовали гомогенаты селезенки быка, мышей, экстракт из клеточных ядер селезенки крыс и РТРР из клеточных ядер селезенки нерпы. Во всех случаях наблюдалось взаимодействие фосфатаз с антителами, выработанными против РТРР из клеточных ядер селезенки быка, что указывает на наличие общих антигенных детерминант и свидетельствует об отсутствии тканевой и видовой иммуноспецифичности РТРР.

Антитела из сывороток (фракция IgG), очищенные стандартными методами на колонке с протеин-А-ультрагелем и в препаративных количествах на ДЕАЕ-целлюлозе, не содержали других белков сыворотки крови с более низкими молекулярными массами. Специфичность антител была показана по выявлению фосфатазной активности комплекса антиген-антитело и методом дот-иммуноанализа. Методом дот-иммуноанапиза не выявлено общих антигенных детерминант с рядом ядерных белков и кислой фосфатазой из пшеницы. Лэм и сотр. (Lam et al., 1982) показали, что тартрат-нечувствительная кислая фосфатаза не взаимодействует с антителами на другие кислые фосфатазы (тартрат-чувствительные).

В предварительных опытах было показано, что ядерная фракция обогащена РТРР. Изучение распределения РТРР в субъядерных фракциях методом солевых экстракций по И.Б. Збарскому и нуклеазной обработки ядер показало, что основная доля (около 80%) РТРР в ядре связана с хроматином, в составе которого около 95% ДНК. В составе ядерного сока обнаружено около 10% активности РТРР. В ядерном остатке, в который входит около 3% ДНК, выявлено около 5% активности (табл. 1).

Наличие РТРР в ядрах, хроматине и ядерном остатке подтверждено методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноспецифических поликлональных антител к РТРР из клеточных ядер селезенки быка.

Основная ча^ть РТРР связана с труднофрагментируемой Са, Мд - эндонуклеазой или микрококковой нуклеазой фракцией хроматина ("неактивный хроматин"). Наличие РТРР в ДНП - фрагментах подтверждено методом иммуноблотинга.

В настоящей работе были предприняты попытки изучения локализации РТРР методом иммуной электронной микроскопии.

Таблица 1

Распределение РТРР в субъядерных структурах

Субъядерные структуры ДНК, % РТРР*, %

Ядерный сок - 10,5±1,3

Тотальный хроматин 95,0±4,0 83,9±4,4

"Активный" хроматин с элементами ядерного сока 12,2±5,1 7,9±2,3

"Неактивный" хроматин 83,0±7,9 7в,0±3,3

Ядерный остаток 3,1±1,5 6,2±1,5

'Субстрат фосфотирозим

Метод иммунной электронной микроскопии благодаря высокой разрешающей способности электронного микроскопа, строгой специфичности и высокой чувствительности антител является одним из наиболее перспективных подходов для изучения структурно-функциональных взаимодействий компонентов клеточного ядра и получения информации, которую трудно или невозможно получить другими методами.

Спрединг ядер позволяет деконденсировать хроматин при низкой ионной силе (Labchart, Koller, 1981). При изучении локализации РТРР при спрединге ядер показано, что коньюгат IgG -золото распределяется по фибриллам неравномерно, группами. Количество связанных частиц увеличивается в более толстых хроматиновых фибриллах или в местах слабодиспергированных участков хроматина, т.е. в основном, в наднуклеосомных структурах.

Таким образом, на основании данных, полученных различными способами: солевой экстракции, фрагментации хроматина нуклеазами, иммунофлуоресценции и иммунной электронной микроскопии можно сделать заключение, что РТРР присутствует во всех субъядерных фракциях, и основная часть фермента связана с компактным хроматином.

Результаты по связыванию РТРР с хроматином показали, что

125

при постоянной концентрации I - РТРР (6 мкг/мл) и возрастающих концентрациях немеченной РТРР (0 - 800 мкг/мл) наблюдается увеличение связанной РТРР с фракцией хроматина, легкофрагментируемого микрококковой нуклеазой в условиях низкой ионной силы. Специфичность взаимодействия подтверждается тем, что хроматин связывает микрограммы РТРР в присутствии высоких концентраций другого кислого белка - БСА (2,5 мг/мл). Полученные данные как в координатах Хилла, так и в координатах Скэтчардз имеют сходные величины по связыванию фермента с хроматином

(табл.2) и указывают на наличие ограниченного числа высокоаффинных мест связывания РТРР с хроматином. Максимальная связывающая способность - 3,95 ±0,18 нмоль РТРР на 80 мкг ДНК или 49,5 ± 2,2 нмоль фермента на 1 мг ДНК, т.е. на 10 нуклеосом приходится около 50 молекул фермента.

Таблица 2

Параметры связывания РТРР с хроматином

График Хилла Коэффициент Хилла (И) Ка'- 10"7 (М-1) 0,92 ± 0,06 0,33 ± 0,06

График Скэтчарда Вшах" (нмоль связанной РТРР/мг ДНК) Ка • 10"7(МИ) 49,5 ± 2,20 0,39 ± 0,03

"Ка - константа ассоциации

**В тах - максимальная связывающая способность

Анализ взаимодействия РТРР с различными ДНП-фрагментами хроматина показал, что фермент связывается преимущественно (до 90%) с высокополимерными фрагментами хроматина.

Исходя из полученных результатов можно предположить, что РТРР может участвовать не только в дефосфорилировании белков, но и, возможно, участвует в структурной организации компактного хроматина.

ВЫВОДЫ

1. Получены препараты низкомолекулярной формы РРР из ядер селезенки быка и нерпы ранее разработанным методом ионообменной, аффинной хроматографии и гель-хроматографии со степенью очистки 624 и 274000 раз, соответственно. Характеристики препаратов не отличались от ранее описанных.

-142. Определен тип РРР из ядер клеток. Фермент расщепляет фосфотирозиновые связи казеина, а также фосфотирозин с Кт = 6,45 ± 1,0 мМ, ингибируется ионами цинка и ортованадата. Ортованадат натрия является бесконкурентным ингибитором с = 9,5 ± 0,5 мкМ, а сульфат цинка - смешанным ингибитором с К| = 33,7 ± 3,0 мкМ. По субстратной специфичности и ингибируемости ионами цинка и ортованадата в микромолярных концентрациях фермент относится к тирозиновым фосфопротеинфосфатазам (РТРР, К.Ф.3.1.3.48).

3. Получены и очищены моноспецифические поликлональные антитела к РТРР из клеточных ядер селезенки быка. Антитела при взаимодействии с РТРР не ингибировали активности фермента.

Методом дот-иммуноанапиза показано, что антитела к РТРР не взаимодействуют с рядом ядерных белков( гистоны Н1, Н2А, Н2В, НЗ, фосфокреатинкиназа, сАМР-зависимая протеинкиназа, РНКаза).

Определено, что низкомолекулярная форма РТРР не является ткане- и видоспецифичной. По электрофоретической подвижности и иммунохимическим свойствам РТРР из ядер селезенки быка и нерпы идентичны.

4. Изучена локализация РТРР в ядре. Методом солевых экстракций по И.Б. Збарскому показано, что значительная доля фермента в ядре ("80%) связана с хроматином. В составе ядерного сока обнаружено около 10% РТРРазной активности и "5% выявлено в ядерном соке.

Основная часть РТРР связана с труднофрагментируемой Са, Мд-эндонуклеазой или микрококковой нуклеазой фракцией хроматина.

Методом иммунной электронной микроскопии при спрединге ядер печени крыс изучена локализация РТРР с использованием моноспецифических поликлональных антител, коньюгированных с частицами золота. Найдено, что фермент распределяется по

хроматину неравномерно и, в основном, выявляется в наднуклеосомных структурах.

125

5. Изучено связывание I - меченного препарата РТРР с фракцией легкофрэгментируемого микрококковой нуклеазой хроматина печени крыс в условиях низкой ионной силы in vitro. Анализ кривых связывания РТРР с хроматином по Скэтчарду выявил специфичность взаимодействия, наличие одного типа мест связывания с Ка = (0,39 ± 0,03) * 10 7 М'\ Максимальная связывающая способность 3,95 ± 0,18 нмоль РТРР на 80 мкг ДНК или 49,5 ± 2,2 нмоль фермента на 1 мг ДНК, т.е. на 10 нуклеосом приходится около 50 молекул фермента. Коэффициент Хилла равен 0,92 ± 0,06, константа ассоциации в координатах Хилла равна (0,33 ± 0,06) * 10 7 М'\

Анализ ПА. ,Г-электрофоретических фрагментов хроматина

125

после взаимодействия с 1-РТРР показал, что основная доля фермента (до 90%) связывается с высокополимерными ДНП-фрагментами хроматина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комкова А.И., Леонова Л.Е., Резяпкин В.И. Характеристика ядерной фосфопротеинфосфатазы, иммобилизованной на альбумине глютаровым альдегидом// VI Конф. биохимиков Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда.:Тез. докл. -Рига, 1981,-С.259-260.

2. Комкова А.И., Карандашоо Э.А., Красовская И.Е., Кулева Н.В., Леонова Л.Е., Резяпкин В.И. Применение метода 'вО-обменных реакций для изучения фосфатазного центра фосфопротеинфосфатазы// I Всесоюз. биофиз. съезд.:Тез. докл. -М., 1982.-Т. I.-С. 137-138.

-163. Комкова А.И., Леонова Л.Е., Морозов В.И., Резяпкин В.И. Фосфопротеинфосфатаза ядер// VIII Всесоюз. симп."Структура и функции клеточного ядра".:Тез. докл.- Пущино, 1984.-С.129-130.

4. Резяпкин В.И., Леонова Л.Е., Комкова А.И. Сравнительная характеристика растворимой и иммобилизованной форм фосфопротеинфосфатазы ядер клеток селезенки быка//Вестн. Ленингр. ун-та.-1984,- №9.-С.112-115.

5. Комкова А.И., Леонова Л.Е., Резяпкин В.И. Способ получения фосфопротеинфосфатазы: А. с. 1182078 СССР.- 4 с.:ил.

6. Резяпкин В.И., Леонова Л.Е., Комкова А.И. Фосфопротеинфосфатаза клеточных ядер селезенки быка: физико-химические свойства//Биохимия.-1985.-Т.50.-Вып.7.-С.1067-1075.

7. Комкова А.И., Леонова Л.Е., Резяпкин В.И. Фосфопротеинфосфатаза ядер клеток: изучение механизма действия//5 Всесоюз. биохим. съезд.:Тез. докл.-Киев, 1986.-Т.2.-С.45-46.

8. Леонова Л.Е., Комкова А.И. Фосфопротеинфосфатаза ядер клеток: изучение локализации//1Х Всесоюз. симп. "Структура и функции клеточного ядра".:Тез. докл.-Черноголовка, 1937.-С.168.

9. Резяпкин В.И., Лисицкий С.И., Леонова Л.Е., Комкова А.И. Выделение термостабильного активатора фосфопротеинфосфатаз клеточных ядер селезенки быка//X Всесоюз. симп. "Структура и функции клеточного ядра".:Тез. докл.-Гродно, 1990.-С.150.

10. Леонова Л.Е., Абрамова З.И., Комкова А.И. Фосфопротеинфосфатаза ядер клеток: локализация и взаимодействие с хрсматином//Х1 Всесоюз. симп. "Структура и функции клеточного яд>а".-СПб./Цитология.-1993.-Т.35.- N°10.-C.80-81.