Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование аффинной модификации хроматина реакционоспособными производными олигонуклеотидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование аффинной модификации хроматина реакционоспособными производными олигонуклеотидов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.113.7

Черноловская Елена Леонидовна

ИССЛЕДОВАНИЕ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА РЕАКЦИОНОСПОСОБНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск — 1993 г.

/

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель:

к.х.н. Кобец Н.Д.

Официальные оппоненты:

д.х.н. Г.А. Нэвинский д.х.н. С.Н. Кочетков

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

седании Специализированного советаК003.52.01 в Новосибирском институте биоорганическойхимииСОРАНпо адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8,

С диссертацией мож. ю ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химиг СО РАН.

Автореферат разослан _^¿-¿-г , ^дд г_

Ученый секретарь

Специализированного совета

кандидат химичесуих наук О.С. Федорова

Защита состоится"^*!.1

Актуальность про б леш . Олигонуклеотидные производные, способные связываться с определенными "мишенями" нуклеиновых кислот и влиять на их функции, становятся эффективным орудием молекулярных биологов. Они рассматриваются как перспективные лекарственные препараты (противораковые и противовирусные), действующие на уровне функционирования генома.

Возможность атаковать ДНК мишень может стать ключевым моментом метода повреждения "нежелательных" генов, таких, как онкогены, и инактивации интегрированных вирусных геномов. Возможность влиять на определенные гены дает принципиально новые возможности, в руки исследователей, изучающих функционирование генома или занимающихся направленным мутга^енезом.

Исследование организации определенных последовательностей ДНК в составе хроматина и её изменения в процессе функционирования клетки представляет существенный интерес для понимания процессор регуляции экспрессии генов. Специфическая химическая модификаций хроматина реакционоспособными производными олигонуклеотидов, комплементарными изучаемым последовательностям ДНК, могла бы позволить изучать изменения конформации ДНК и белкового окружения определенных её зон на разных стадиях клеточного цикла.

. Цель работы. Целью настоящей работы было исследование доступности выбранных мишеней ДНК- повторяющихся последовательностей, которые в большом количестве присутствуют в геноме эукариот, для комплементарно адресованной модификации, в зависимости от структурно-функционального состояния хроматина, а также исследование возможности применения этого подхода для изучения белкового окружения определенных последовательностей ДНК в составе интактных ядер I! хроматина и исследование зависимости этого окружения от с.труктурно-функцисна^ьных характеристик хроматина.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей диссертационной работе впервые изучена комплементарно-адресованная модификация ДНК и белков в составе хроматина производными олигонуклеотидов. Обнаружено, что наличие целостной ядерной мембраны не прнпятгтвует проникновению производных олигонуклеотидов в ядро и г/;'дифик'.ш'11 ндерных биополимеров. Показано, что взаимодействие ре-акшюноспособннх производных олигонуклеотидов с ДНК хроматина су-с&стийнно лависит от наличия высших уровней организации хроматина: доступность гюли-аА трактов ДНК в составе "растворимого" хроматина

на порядок ниже, чем в составе суспензионного хроматина и интакт-ннх ядер. Показано влияние белкового состава дезоксирибонуклео-протеидвдх комплексов на доступность поли-dA трактов для направленной химической модификации алкилирующими производными олигонук-леотидов. Обнаружена специфическая модификация белков хроматина при обработке ядер производными олигонуклеотидов, причем наборы белков, модифицирующихся в составе ядер из интактной и регенерирующей печени крыс, а также белков интерфазных ядер и метафазных хромосом клеток Hela существенно различаются. Проведен сравнительный анализ эффективности алкилирующих и фстоактивных реагентов для модификации хроматина.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзных совещаниях "Геном человека", 1990, 1991, 15 Международном конгрессе биохимии (Израиль, 1991), Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического применения" (Москва, 1991).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах, включающих 14 рисунков, 3 таблицы и список литературы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I Выбор мишени и условия -реакции.

Исследование организации определенных последовательностей ДНК в составе хроматина и её изменения в процессе функционирования клетки представляет существенный интерес для понимания процессов регуляции экспрессии генов. Специфическая химическая модификация хроматина реакционоспособными производными олигонуклеотидов, комплементарными изучаемым последовательностям ДНК, могла бы позволить изучать изменения конформации ДНК и белкового окружения 'определенных её зон на разных стадиях клеточного цикла.

Ранее в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот была показана принципиальная возможность комплементарно адресованной модификации хроматина и метафазных хромосом по поли (¿A)- участкам ДНК с помощью алкилирующих производных олигодеэоксирибонуклеотидов. Взаимодействие олигонуклеотидов может происходить через образование ком-

плементарного двойного комплекса с расплетенными участками ДНК-либо через образование тройного комплекса в участках с полнпурино-вой-полигшримидшювой последовательностью. Наиболее вероятным представляется взаимодействие олигонуклеотидов с оддощепсчечными участками д11к в составе хроматина, которые, как свидетельствуют литературные данные, постоянно присутствуют в ДНК сложнооргакизованных ядерных структур и могут появляться в процессе функционирования клетки, в ходе репликации, транскрипции, могут быть результатом взаимодействия со специфическими белхсами, способными расплетать двойную спираль, или результатом наличия в ДНК суперспирализован-ных доменов•

Мишенями для комплементарно адресованной модификации были выбраны полилезоксирибоаденилозне, поли-fTG) Alu- и альфоидные ионторякчциеся последовательности, которые широко представлены в геноме эукариит („.10^ копий на геном).

Для синтеза реагентов были выбраны олигонуклеотиды ptdT^g, pi'd," i р l dA j ' 1 . pd (tgcacacatcaca.aagaa ) (комплементарный - п0в-тор.у i и pdittcfi.yigcctcagcctctt) (комплементарный наиболее консервативному участку семейства Alu- повторов),

В качестве реакционоспособной группы использовали остатки

4-i (¡ч-2-хлорэтил-Ы-метил)амино] -бензилачина (RC1CH2HH2 ), 2-нитро-

5-азн,*> «?ензоиламина, п- азидобензоиламина и п- азидотетряфторбен-зоиламида, присоединенных к олигонуклеотиду по 5'-концевому фосфату фосфамиднпй связью.

Интактные ядра и хроматин выделяли, используя стандартные процедуры. "Суспензионную" фракцию хроматина получали механическим разрушением ядерной мембраны, "растворимый" хроматин представлял сооой супернатант после центрифугирования "суспензионного" хроматина в буфере с. низкой ионной силой.

Комилексообразование и реакцию алкилирования RC1- производными олигонуклеотидов с "суспензионной фракцией хроматива" и интакт-нчми ядрами проводили при 4 мМ CaClg, необходимом для поддержания высших уровней организации хроматина. Из концентрационной зависи-

—7 —R

мости видно, что при концентрации 5 10 ЮМ достигается максимальная степень модификации ДНК. Эта концентрация реагента и ис-, ло.мьуоьалась в дальнейших экспериментах.

Для определения степени модификации выделяли ДНК, отделяли еб от №'валентно несвязанного реагента гель-фильтрацией в ленатури-

рупцих условиях. Фракции, содержащие полимерный пик, собирали, измеряли оптическую плотность и радиоактивность. Степень модификации вычисляли, учитывая удельную активность реагента.

При сравнении степени модификации ДНК в составе ядер при 25 С и 37°С оказалось, что при 37 степень модификации ядер значительно ниже, чем при 25°С, тогда как степени модификации.ДНК в составе суспензионного хроматина одинаковы, что, возможно, свидетельствует о репаративном выщеплениимодифицированных оснований в ядрах в от-

Рис. I. Модификация ДНК в составе: "растворимого" хроматина (I), суспензионного хроматина (2), интактных ядер (3) и изолированной ДНК (4) реагентом RCICHgNHpCdT)J6 (О), реагентом KClCH2NHp(dT)I6 в присутствии Ю- кратного избытка p(dT)j6 (0), реагентом RClCH2i!Hp(dT)16 в присутствии IO-кратного избытка p(dN)j5 (0), реагентом RCiCH2NHp(dT)I6 после предварительной обработки SI-нуклеазой (g).

данные по определению относительной степени модификации ДНК RClCHgNHtpdT)16 в составе интактных ядер из клеток печени крысы и "суспензионного хроматина", полученного механическим разрушением ядерной мембраны. Видно, что наличие целостной ядерной мембраны не препятствует проникновении олигонукле-отидов, и спепень модификации ДНК в обоих препаратах примерно одинакова- (2±0,2)хЮ~6 молей ковалентно присоединенного олигонуклео-тида на моль нукдеотидов ДНК. Дополнительная обработка препарата ДНК РНКазой А в денатурирующих условиях (7М мочевина) не влияла на степень модификации, что подтверждает связывание реагента с ДНК.

Данные по модификации выбранных мишеней ДНК в составе ядер из клеток Hela производными соответствующих олигонуклеотидов приведены в таблице I. Из этих данных видно, что ДНК в составе интактных ядер клеток Hela существенно более доступна для модификации производным р(¿LAdC)g, чем производным pTjg, что возможно связано с большей долей расплетенных олиго-dCTG) участков.

личие от хроматина при 37 С. — 22" а-

ülili

На рис Л представлены

ТАБЛИЦА I.

Взаимодействие производных олигонуклеотидов с ДНК в составе ядер Hela.

Реагент Ковалентное присоединение ре агентЭрК ДНК (молей реа-гента/Ю молей нуклеотидоз ДНК)

p(dT)l6 ptdA^'g ptdAdC )б pdTGCACACATCACAAAGAA 1,2-0,2 3,1-0,3 20±0,45 3,6-0,25 в присутствии 10-кратного избытка

pdT16 Р®16

0,1-0,015 0,3-0,02 2,1-0,03 0,4-0,03 ■1.2-0,25 3,0Í0,31 20-^0, 37 3,5^0,3

2. Специфичность взаимодействия реагентов с ДНК хроматина.

Для доказательства специфичности алкилирования ДНК использо-вал1 опыты по снижению доли.ковалентно присоедгаенного реагента в присутствии нерадиактивного олигодезоксирибонуклеотида.

На рис. I представлены данные по специфической модификации ДНК в составе хроматина. В присутствии 10-кратного молярного избытка олигодезоксирибонуклеотида той же последовательности, что и реагент, относительная степень модификации ДНК примерно в 10 раз ниже, чем степень модификации .ДНК в отсутствии свободного олиго-нуклеотида, в то время как олигодезоксирибонуклеотид той же длины, но другой последовательности, не комплементарной. выбранной мишени-(рбЮ}-£, не ингибирует ковалентного присоединения реагента к ДНК. Эти результаты подтверждают специфичность алкилирования ДНК хроматина по соответствующим мишеням с помощью используемых реагентов (рис.1).

■ Мягкая предварительная обработка ядер 51-нуклеазой, разрушающей 'одноцепочечные участки хроматина при сохранении морфологии ядра, препятствует модификации ДНК хроматина алкилирующими производными олигонуклеотидов. Это свидетельствует в пользу.того, что реакция идет с одноцепочечной ДНК через образование комплементарного комплекса.

3 . Зависимость доступности ДНК в составе хроматина для комплементарно - адресованной модификации в зависимости от стадии клеточного цикла.

Одной из возможных причин появления доступных для атаки

олигонуклеотидным производным трактов ДНК в хроматине является расплетение двойной спирали ДНК в результате процессов транскрипции и репликации. Тогда можно было ожидать увеличения уровня алки-лирования ДНК по выбранной мишени соответствующим комплементарным производным олигонуклеотида при активации процессов транскрипции и репликации. Для проверки этой возможности была исследована доступность ДНК в составе хроматина из клеток-с различным уровнем репликации и ■ транскрипций.

Для изудения. клеточных процессов'в.условиях интенсивной репликации ' в .качестве' модели использовалась регенерирующая печень крыс. Ядра из интактной и регенирирующей•печени крысы обрабатывали алкилирующим производным.'олиго (с1Т). ■ Относительные степени модификации ДНК в обоих.случаях оказались одинаковыми. Данные•представлены в таблице 2.

ТАБЛИЦА2.

Взаимодействие _алкилирупцего производного гексадекадезоксирйботимидилата с ДНК хроматина.

Ковалентное - присоединение реагентавк ДНК (молей реагента/10 молей нуклеотидов' ДНК) с составе: б присутствии Ю- . кратного избытка

Р«1Т)16 - Р(ЙМ)16

растворимого хроматина из клеток печени крыс суспензионного хроматина . из клеток печени крыс ■ интактных ядер печени крыс ядер регенерирующей печени крыс ядер эритроцитов цыплят ядер несинхронизованных мышинных фибробластов ядер мышинных фибробластов,. синхронизированных в Б-фазе изолированной ДНК . 0.2-0.02 2.0^0.1 • г.о^ю.г 2.3^0.2 2.2-0.2 4.2-01 4.4-0.2 ' 0.014).005 0.18-0.02 0.2-0.02 0.19±0.02 1.9±0.2 2.1^0.15

Возможно, этот результат свидетельтвует. о том, что появление репликационных вилок не - увеличивает .'в значительной степени - доли доступных поли (йА)- трактов для комплементарно адресованного реагента. Аналогичный результат был получен при сравнении степени-модификации ДНК по полк(с1А.)-трактам ядер -из несинхронизированных и синхронизированшх в'э-фазе с помощью двойного тимидинового блока клеток мышинных'фибробластов.'

• ' Содержащие ядра эритроциты птиц часто используются для изуче-

ния инертного, неактивного хроматина. Полностью репрессированный как в транскрипции, так и в репликации хроматин из эритроцитов цыпленка модифицируется по поли(1А)-трактач ДНК с такой же эффективностью, что и хроматин, из регенерирующей печени крысы. Это свидетельствует, по нашему мнению, о том, что активация процессов репликации и транскрипции не увеличивает доступности гюли(с1А ¡-участков ДНК для комплементарно адресованной модификации. 4. Влияние структурной организации хроматина на его доступность

модификация.

Логично предположить,• что- существование расплетенных участков ДНК, содержащих выбранные >.йшени, скорее всего. определяется уровнем суперспирализации ДНК,'взаимодействием со специфическими белками и зависит от структурно-функциональных характеристик хроматина. Следовательно, можно было' предположить, что доступность ДНК комплементарно адресованной модификации может зависеть от наличия высших уровней организации ДНК в хроматине.

Известно, что "растворимая", фракция хроматина в буфере, не содержащем двухвалентных ионов, представлена, в основном, развернутыми куклеосомными цепями в отличие от "суспензионного" хроматина шттактных ядер. Степень модификации ДНК в составе "растворимой" фракции /роматина на'порядок ниже ..чем степень модификации ДНК в соотане "■•успензионного" хроматина, и иктактных ядер. (рис. I) Это, скорее всеги. связано с наличием в: составе "суспензионного" хроматина и ядер петлеобразных структур, ■образованных ДНП-фибриллами, закрепленными на ядерном матриксе, что приводит к повышению уровня суперспирализации ДНК,, а-также с присутствием различных негистоно-г*ых белков. Изолированная . ДНК -практически не модифицируется ЕС1-производными олиго |'<ЗТ)', -что,- еще' раз убеждает нас в протекании специфический модификации по о'дноцёпочечным участкам ДНК.

Для исследования -влияния -изменения структуры хроматина за счет удаления из него определенных групп белков на степень доступности ДНК для комплементарно 'адресованной модификации были проведены эксперименты с дезоксирибонуклеопротеидами ДНП-0,35; ДНП-0,6; ДНП-2,0, полученными из хроматина обработкой соответственно 0,35; 0,6; 2,0 М ЫаС1.

Изяестно, что при обработке хроматина 0,35 М ЫаС1 удается отделить из него фракцию негистоновых белков, содержащую НМС-белки, наиболее изученные из негистоновых белков хроматина. Удаление этой

группы белков из хроматина клеток Hela степень модификации поли(ОА)- и поли(ТО-ными реагента.™ (рис. 2).

уменьшает относительную участков ДНК адресован-

Рис. 2. Модификация■ДНК в составе ядер (I) из клеток Hela и дезоксирибонуклеопротеидов, полученных экстракцией ядер 0,35М (2), 0,6М (3) и 2,ОМ (4) NaCl производными pdTjg (D) и pd(AC)g

(Ш).

Обработка хроматина 0,6 М ЫаС1 приводит к удалению наряду с рядом негистоновых белков гистона Н1. При этом степень модификации несколько увеличивается, возможно, за счет того, что удаление гистона Н1, связывающегося с линкерными участками ДНК хроматина, освобождает их как потенциально более доступные для комплементарно адресованной модификации НС1-производным.

При обработке хроматина 2 М ЫаС1, когда вместе с основной массой негистоновых белков удаляются и все гистокы, относительные степени модификации поли(аА)- и (ТС)П- участков ДНК снижаются, но остаются существенно выше, по сравнению с изолированной ДНК. ДНП-2,0, полученные при такой обработке хроматина, представляют собой структуру, выявляемую на электронно-микроскопических препаратах как фибриллы ДНК, закрепленные в виде петель на ядерном матриксе. Результаты, полученные нами, по всей видимости, свидетельствуют об определенном вкладе специфических хроматиновых белков, сохраняющихся в структуре хроматина при его обработке 0,6 М МаС1, но полностью исчезающих при обработке 2 М ШС1, в существование доступных для модификации трактов ДНК, обогащенных поли(с1А)- и (Т0)п~ повторами.

Таким образом видно, что степень модификации ДНК в составе хроматина существенно зависит от структурных особенностей и скорее всего определяется уровнем суперспирализации ДНК в хроматине. 5. Модификация белков производными олигонуклеотидов в составе • хроматина.

При образовании специфических комплексов с ДНК в составе хрс матина алкилирупцие производные олигонуклеотидов взаимодействуют не только с ДНК, но и с белками, расположенными в зоне контакта с рассматриваемой мишенью ДНК, а также с пространственно сближенными с ней.

Нами были исследованы белки, подвергающиеся алкилированию производными гексадекадезоксириботимидилата, р(АС)д и 20- членного олигонуклеотида , комплементарного наиболее консервативному участку А1и-поптор>а в составе ядер. Модифицированные белки анализировали с помощью градиентного воз-электрофореза. Белковые пробы предварительно обрабатывали микрококковой нуклеазой с целью разрушения коваленгно присоединенного к белку олигонуклеотидного фрагмента, который мог бы изменить подвижность модифицированного белка при электрофорезе.

В составе ядер из интактной печени крыс модификации подвергаются, по крайней мере, два мажорных бежа со средними молекулярными весами „19-20 и 27-28 кДа, алкилируемые 5'-НС1-рТ16. При добавлении 10-кратного по отношению к реагенту избытка немеченного рТ^ в реакционную смесь наблюдается ингибирование алкилирования этих белков, тогда как избыток олигонуклеотида рМ^д с произвольной последовательностью РСАТССААААССГТССС не влияет на алкилирование данных белков. Это указывает на специфичность взаимодействия реагента с белками. Такое взаимодействие может происходить как в составе комплекса олигонуклеотида с мишенью ДНК, так и с белками, имеющими сродство к олиготимидилату.

Интересно, что белок с молекулярной массой „19-20 кДа модифицируется реагентом как в составе интактного хроматина, так и в составе дезоксирибонуклеопротеидного комплекса, полученного обработкой хроматина 2М НаС1 (ДНП-2.0). Таким образом, этот белок может быть представителем группы белков ядерного матрикса.

При сравнении наборов алкилировэнных белков из ядер интактной и регенерирующей печени крысы наряду с белками „19-20 кДа и 28-29 кДа, появляются два новых модифицированных белка с молекулярными массами „22-23 и 29-30 к Да (рис. 3, дорожка 2). Наблюдаемые различия в наборах модифицированных белков могут быть связаны с изменением доступности белков для алкилирования при структурных перестройках, сопровождающих процесс активации хроматина при репликации и изменением белкового окружения ро1у(А)-трактов ДНК.

Рис. 3. Анализ белков хроматина, модифицирующихся pdl'jg- производным: I- в составе ядер из регенерирующей печени- крыс; 2- ь составе ядер из интактной печгни крыс.

Алкилирование ядер производным p(AC)g дает совершенно иной набор модифицированных белков. Шесть белков (или групп белков) специфически модифицируются 5ClCH2tiHp(dAdC )g. Набор модифицированных белков в хроматине и дезоксирибонуклеопротеидах различного состава существенно отличается.

Таким образом, полученные результаты указывают на возможность использования метода комплементарно-адресованной модификации для изучения белкового окружения определенных последовательностей ДНК, расположенных в локально расплетенных зонах хроматина и его чувт-вительность к структурно-функциональным перестройкам хроматина.

При обработке -ядер из клеток Hela производным pfdAriO)- получен более сложный набор модифицированных белков. Наряду с белками, предположительно аналогичными модифицированным белкам из печени крыс (мол.- вес 19000, 21000, 25500, SIOOO, 33000, 38000 и >60000) модифицируется ряд - белков алкилирование которых не ингибируется избытком олигонуклеотида. Поскольку ингибироьнние модификации иг>--бытком олигонуклеотида той же последовательности не исключает возможности алкилирования белков, не расположенных в участках локального расплетения, а имеющих сродство к олигонуклеотиду-адресу, для доказательства специфичности модификации белков .в комплементарном комплексе -использовалась предварительная обработка ядер SI-нуклеазой, расщепляющей одноцепоч«-чные участки ДНК хроматина. Данные ингибирования приведены на pi:o. 4 (порожка ñ), они позволяют сделать вывод о специфичности модификации, :ю крайней мере, семи белков (указаны стрелкат!* ).

Набор белков, полученный при по/.лфнгацпи ядер Hela производным pdTjg-содержит 4 белка (мол. вес 1Г600. 47ООО. 6150Г- л >66000', модификация которых ингибируется как hm---jtk<ai м'игонугл^-шлп, так

и предварительной обработкой sl-нуклеазой (рис. .4, указаны стре. -ками).

. Рис. 4. Анализ .белков ядер

123456

клеток Hela: I- .модифицированных RClCH2NHp'(dT)IG; 2-модифицированных' FClCHgNH-p(dT)I6 в- присутствии 10-кратного избытка-p(dT)j6; 3-модифицироваяных RCICH^NH-p(dT)j6 после предваритель-*- ной обработки. SI-нуклеазой; 4-модифицированных- RC1CH2NH-pd(AC)-; 5- модифицированных RCiCH^ifflpd(АС )g' 'в' присутствии Ю- кратного избытка pd(AC)g; 6- модифицированных RCiCH2NHpd(AC)g после предварительной обработки SI-нуклеазой.

Другой интересной мишенью для модификации является ^Aiu- повтор, широко распространенный в геноме человека. При обработке ядер алкилирующим производным pd(TTCTCCTGCCTCAGCCTCTT), комплементарным наиболее консервативному участку Alu- повтора, выявлен ряд белков, модификация которых, как мы полагаем, протекает : при образовании комплементарного комплекса олигонуклеотидного адреса с расплетен-ннми участками ДНК хроматина. Данные по модификации и ее ингибиро-ванию избытком свободного олигонуклеогида и предварительной обработкой si-нуклеазой приведенына рис. 5. Из приведенных данных видно, что, на основании-используемых нами тестов на специфичность, можно говорить о специфической модификации белков или групп белков с мол. массами I8I00, 22500, 26000, 28000, 43000, 68000, 93000 и двух белков с мол. массами >94000.

При переходе хроматина из интерфазного состояния в метафазные хромосомы происходят существенные структурные перестройки, приводящие к структуре с максимально еысоким уровнем компактизации ДНК. Использование- реакционоспособных производных олигонуклеотидов для модификации интерфазных ядер и метафазных хромосом отчетливо свидетельствуют о том, что наборы специфически модифицируемых

£ р» ¿X

f и

ей <3

О ** О

66000_ 45000_

34700

о -

2ÍOOO _ °

° О-

14300

;псов хроматина существенно отличаются. Так в составе хромосом не происходит модификации бежа с мол. массой 28000, однако наблюдается модификация белков с мол. весами 27000, 31000 и 40000 (СНЭ-г?, СНЭ-ЗЬ СНЗ-40), не подвергающихся модификации в составе интерфазных ядер (_рис. 5(Б) >.

Б

SäCCO_

етссо_ sasoa

1ТЕ00

12500

¿нагмз белков |§ модифицированных КС1-СН2№Нрс1 (ТТСТССТСССТСА ПССТСТТ): ^ А- в составе

94000_

670С0_ 43000_

36000

Сга! клеток Heia присутствии кратного

(I

ядер ! в 10-избытка

CHS-.40 CHS-31-CKS-ET

Ш рсКТТСТССТСССТСАСССТС тг) (2); после предварительной обработки 81- ьуклеазой (3); Б- в составе хромосом

17S00

12500

Эти данные указывают на возможность.использования производных оли-гонуклеотидов для исследования изменения белкового окружения в ;>и-нах расплетенных последовательностей ДНК и их доступности н,а разных стадиях клеточного цикла.

6. Использование фотоактиннмх реагентов лл." модификации хроматина.

Ранее в НМБХ были синтезированы и использованы для модификации ДНК-мишени фотоактивные производные олигонуклеотидов, содержащие в качестве реакционоспособных • групп остатки 2-нитро-5-" азидобензоиламида (I), п- азидпбензоиламида (II) и п- азидотетра-фторбензоиламида. Использование таких высоко реакционоспособных производных, позволяющих в мягких условиях проводить модификацию при инкубации в течении лишь нескольких минут и|№ДС'гмкпял->ль пер-

спективным для исследования тонкой структуры хроматина и динамики процессов, происходящих при функционировании клеточного ядра. В настоящей работе приведены результаты сравнительного анализа ДНК и белков хроматина, подвергающихся модификации алкилирующим и фотоактивными производными олиготимидилата.

Степени модификации ДНК по олиго-(йА) последовательностям фотоактивными производными (1-111) оказались несколько ниже, чем степени модификации алкилирующим производным олиготимидилата (IV). Это согласуется с литературными данными, в которых показано, что эффективная модификация ДНК-мишени наблюдается только по остаткам гуанина и цитог-ина, а остатки аденина модифицируются слабее.

/•VI

0.5-

3 I и

Рис. Г.. Денспт-граммы радиоавтографа ББЗ-ПААГ с хромати-новыми белками, модифицированными фотоактивными реагентами 1,2,3 и алкилирующим реагентом 4 в присутствии(нижние кривые) и в отсутствии (верхние кривые) 10-кратного избытка свободного олигонуклеотида. (А- поглощение; ь- подвижность )

Модифицированные в составе хроматина белки анализировали

с

1. мощью БРИ-электрофореза. Наборы модифицированных белков в случае алкилирующего и фотоактивных производных аналогичны, за некоторым исключением. Из данных сканирования радиоавтографа в области молекулярных масс. 10-25 КДа (рис..7) видно, что при модификации хроматина фотореагентами (1-1ГЛ появляется новый компонент (1) с мол. массой 24,6 кДа, не выявляемый при модификации алкилирущим реагентом (IV). Это свидетельствует о большей чувствительности метода при использовании фотореагентов для выявления белков хроматина вблизи определенных зон ДНК. Для доказательства специфичности модификации использовали добавление в реакционную смесь десятикратного по отношению к реагентам избытка свободного гексадекадезокси-тимидилата. (нижние кривые на денситограмме). Относительная степень модификации индивидуальных белков определялась по площадям пиков на денситограмме. Все три фотоактивных реагента модифицируют белки хроматина приблизительно одинаково, но существенно эффективнее, чем ашсилирукчций реагент.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что фотоактивные реагенты (1-Ш) обладают рядом преимуществ перед алки-лирующим реагентом (IV), такими, как большая эффективность, специфичность и высокая реакционная способность, позволяющая избежать длительных времен инкубации высоколабильных препаратов, которые делают их перспективными для комплементарно адресованной модификации белков хроматина.

ВЫВОДЫ.

I. Продемонстрирована возможность специфической химической модификации ДНК в составе нативного хроматина эукариотических клеток с помощью реакционоспособных производных олигонуклеотидов и зависимость этой модификации от.структурно-функциональных характеристик хроматина:

1.1. Показано, что наличие целостной ядерной мембрани не пре-.пятствует проникновению производных олигонуклеотидов в ядро и модификации ядерных биополимеров.

1.2. Показано, что избыток свободного олигонуклеотида той же последовательности, что и в реагенте, существенно ингн5ирует модификацию ДНК, тогда как о.пигокук.чеотид л) онзьчльной последовательности не влияет на модификаци*' ДНК, чт" свидетельству;"!' :> специфичности проводимой модификации.

1.3. Показано, что в отличие от ДНК в составе хроматина, изс лированная из этих же клеток ДНК практически не взаимодействует с алкилируюцим производным олигонуклеотида; при этом предварительная обработка хроматина SI-нуклеазой, расщепляющей одноцепочечные участки ДНК, ингибирует специфическую модификацию ДНК в составе хроматина, что свидетельствует в пользу протекания специфической модификации ДНК в хроматине через образование комплементарного комплекса с расплетенными участками ДНК, содержащими "мишень".

1.4. Относительная степень модификации ДНК хроматина в составе интактных ядер, содержащих высшие уровни организации хроматина, существенно выше, чем в составе развернутой нуклеосомной цепи, что может быть результатом более высокого уровня суперспирализации в ядре.

II.Показана специфическая химическая модификация белков хроматина реакционоспособными производными олигонуклеотидов, позволяпцая выявить белковое окружение локально расплетенных зон ДНК в натив-ном хроматине, содержащих выбранную мишень.

2.1. Наборы модифицированных белков существенно различаются для разных RCl-прсизводных олигонуклеотидов.

а) ciRCHgNHpfT)алкилирует специфически белки с мол. весами Л9-20 и 27-28 кДа в ядрах из печени крыс и белки с мол. весами 16500, 47000, 61500 и >66000 в ядрах Hela.

б) ciPCHgNHp(AC)g алкилирует специфически белки с мол. весами 19000, 21000, 25500, 3IOOO, 33000, 38000 и >66000.

в) RCiCH^NHpdíTTCTCCTGCCTCAGCCTCTT) алкилирует белки с мол. весами I8I00, 22500, 26000, 28000, 43000, 68000, 93000 и два белка с мол. массами >94000 в составе ядер.

2.2 Обнаружены существенные отличия в наборах белков модифицирующихся в составе ядер из интактной и регенерирукщей печени крыс, а также белков интерфазных ядер и метафазных хромосом клеток Hela.

2.3. Показано, что фотореакционсспособные производные олигонуклеотидов, реагирующие с белками хроматина более эффективно, по сравнению в алкилирующими производными, являются перспективными для развития работ по исследованию белковой топографии хроматина и динамики его структурных перестроек.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Власов, В.В., Кобец, Н.Д., Черноловская, Е.Л., Иванова, Е .М., Субботин, В.М., Якубов, Л.А. Аффинная модификация хроматина алкилирующим производным гексалекадевоксириботимидила-та. Биополимеры и клетка, 1989, т.5, с. 49-53.

2. Vlassov, V.V., Kobe ta, N.D., Chernolovskaya, Е.Ь. , Demido-va, S.G., Borissov, R.G., Ivanova, E.M. Sequence-specific chemical modification of chromatin DMA with reactive derivatives of oligonucleotides. Mol. Mol. Reports, 1990, v. 14, p. 1115.

3. Кобец, Н.Д., Черноловская, Е.Л, Иванова, Е.М., Власов, В.В. Бе.пки хроматина клеток печени крысы, взаимодействующие с реак-ционоспособными производными олиготимидилата. Биоорг. химия, 1991, т. 17, с. 933-936.

4. Chernolovskaya, E.L. , Kobets, N.D., Borissov, R.C.. , Abramo-va, T.V., Vlassov, V.V. Affinity modification of human with reactive derivatives of oligonucleotides. FEE>S Lett., 1992, v. 303, p. 269-271.

5. Chernolovskaya E.L., Borissov P.G. , Gorodjankin A.V., Ivanova E.M., Kobets N.D. and Massov V.V. Affinity modification .of chromatin proteins located near open oligo(dA), oligo(dTG) and Alu- PNA .'sequences. Synthetic; oligonucleotides: problems and frontures of practical application. Nucleic acids symposium series, 1991, № 2A. p. 312

6. Kobets N.D.', Chernolovskaya E.L., Borisrov E.G., Gore-zhankin А.В., Ivanova E.M. and Vlassov V.V. DNA in chromatin is available for sequence-specific chemical modification with oligonucleitide derivatives. Synthetic oligonucleotides: problems and frontures of practical application. Nucleic acids symposium series, 1991, № 24, p. 302.

7. Черноловская Е.Л., Черепанов П.П., Горожанкин А.В., Добри-кив М.И., Власов В.В., Кобец Н.Л. Взаимодействие фотоактившх производных олиготимидилата с .пм^чтпном человека. Биоорг. химия, 1993, № 7, с.