Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с хроматином

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с хроматином"

РГ 5 ОД

° ж:9 г^з

на правах рукописи

БОЖЕНОК ЛЮДМИЛА НИКОЛАЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ С ХРОМАТИНОМ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК -1999

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат химических наук Кобец Н.Д. кандидат химических наук Черноловская Е.Л.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор Карпова Г.Г. доктор биологических наук, профессор Загребельный С.Н.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Цитологии и Генетики СО РАН

Защита состоится _1999 года в _часов

на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

г

Автореферат разослан " ¿г " 1999 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук V г"¿г^Федорова О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальнейших задач современной биологии на сегодняшний день является изучение структурных перестроек хроматина и их связи с функциональным состоянием клетки. Решение этой задачи позволит разработать подходы к регуляции процессов, происходящих в клетке, в частности, к регуляции процесса транскрипции. Олигодезоксирибонуклеотиды и их производные являются уникальными инструментами для исследования структурно-функциональной организации хроматина.

Использование производных олигонуклеотидов для направленной модификации нуклеиновых кислот было предложено более 30 лет тому назад Н.И. Гриневой [ВеНкоуа е1 а\., 1967]. В 80-х - 90-х гг были проведены первые эксперименты по изучению взаимодействия производных олигонуклеотидов с хроматином. Было показано, что производные дезоксирибоолигонуклеотидов связываются с комплементарными расплетенными участками ДНК в хроматине и модифицируют как ДНК, так и близлежащие белки [Власов с соавт., 1985; КоЬе1з й а1., 1994]. Результаты аффинной модификации хроматина свидетельствовали о перспективности использования

реакционноспособных производных олигонуклеотидов для изучения структуры хроматина, в частности, для локализации одноцепочечных участков ДНК в клеточном ядре и выявления возможных причин их появления.

Одной из задач установления структуры хроматина в составе ядра является определение топографии расплетенных участков ДНК. Ранее в нашем институте был синтезирован ряд аффинных сорбентов, несущих иммобилизованные короткие олигонуклеотиды, и было показано, что белки, в частности, эндонуклеазы рестрикции, специфично связываются с иммобилизованными на полимерах короткими олигонуклеотидами, содержащими сайты связывания этих ферментов [Дегтярев с соавт., 1989]. Сочетание методов аффинной модификации хроматина с последующим анализом модифицированных белков гель-электрофорезом и аффинной сорбции ядерных белков на полимерах с иммобилизованными олигонуклеотидами позволило бы получить более полную информацию о ДНК-белковых взаимодействиях в хроматине в участках локального расплетения ДНК.

Цель и задачи работы. Целью данной работы является локализация одноцепочечных участков ДНК в хроматине и изучение белкового окружения расплетенных повторяющихся последовательностей ДНК с помощью производных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов, иммобилизованных на полимерах. В ходе работы решались следующие задачи:

1) разработка метода локализации расплетенных последовательностей ДНК в хроматине клеток млекопитающих, доступных для модификации производными олигонуклеотидов, направленными на эти последовательности, с помощью люминесцентной и электронной микроскопии;

2) изучение модификации хроматина клеток HeLa вблизи d(GT)n-повторов производными рё(АС)б, несущими на 5'-конце остаток 2-хлорэтилариламина или (нитро)арилазида, в условиях, индуцирующих переход ДНК из В- в Z-форму, анализ распределения в хроматине участков В->2-перехода ДНК и выявление вклада таких переходов в появление одноцепочечных участков ДНК в хроматине;

3) изучение фотомодификации белков хроматина, входящих в окружение d(GT)n-n0BT0p0B, пара-азидоанилидным производным рс!(АС)б; выявление белков хроматина, потенциально способных к связыванию с ё(СТ)п-блоками ДНК в хроматине, с помощью аффинной сорбции и сравнение белков, имеющих сродство к ё(ОТ)п-блокам, с белками, специфично модифицирующимися в окрестностях расплетенных участков с1(ОТ)п-блоков.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей диссертационной работе впервые предложен и разработан метод, позволяющий локализовать расплетенные последовательности ДНК в нативном хроматине, используя производные олигонуклеотидов. Проведено сравнение распределения расплетенных

полидезоксирибоадениловых последовательностей в составе интерфазных ядер и метафазных хромосом. Изучена аффинная модификация хроматина в условиях реализации перехода ДНК из В- в Z-форму. Показано, что B^Z-переходы ДНК являются одной из вероятных причин появления в хроматине одноцепочечных участков. Изучена аффинная модификация хроматина в области d(GT)n-noBTopoB ДНК. Показано, что набор белков, специфично модифицируемых вблизи этих последовательностей, определяется только олигонуклеотидным адресом (pd(AC)6) и не зависит от природы реакционноспособной группы (алкилирующая, фотореакционноспособные). С помощью метода аффинной сорбции получен набор белков хроматина, имеющих сродство к (СтТ)п-блокам ДНК. Обнаружено перекрывание наборов сорбируемых и специфично модифицируемых белков. Сделано предположение о топографии расплетенных участков (СТ)п-повторов ДНК в ядре.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы были доложены на 6 международных конференциях: 20-ом ежегодном симпозиуме ЕМВО "Genome and Chromosomes" (Гейдельберг, Германия, 1994), русско-французском симпозиуме "Regulation of Gene Expression" (Новосибирск, Россия, 1995), конгрессе "Congress on Therapeutic Oligonucleotides" (Рим, Италия, 1996), 13-м международном совещании "Nucleosides, Nucleotides,

and their Biological Applications" (Монпелье, Франция, 1998), симпозиуме "Dynamic Organization of Nuclear Function" (Нью-Йорк, США, 1998), конференции "26th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies" (Ницца, Франция, 1999).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 112 страницах, содержит 20 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 177 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Локализация расплетенных поли(dА)-участков ДНК в составе интерфазных ядер и метафазпых хромосом с помощью метода аффинной модификации

Для локализации расплетенных поли^А)-трактов в клеточном ядре было использовано производное гексадекатимидилата, несущее на 5'-конце остаток 4-[Ы-(2-хлорэтил-Ы-метил)амино]бензиламина- (RC1-), а на З'-конце - остаток биотина (RC1 -pdTu-биот): CHj сн,сн.а

V о о NI1 N"

СП, NH Р О (1Т(1)<1Т\ О Р О (СШ Ml СО (СП,), ч , О" О"

В отдельных экспериментах было показано, что присутствие остатка биотина не влияет на степень модификации хроматина. Участки модификации в клетках предполагалось локализовать под микроскопом по флуоресценции, используя комплекс стрептавидина с флуоресцеинизотиоцианатом (Str«FITC), имеющий высокое сродство к биотину (Kd-Ю-15).

В экспериментах использовали клетки HeLa и клетки гибридной линии МН 4.1 (человек - китайский хомячок), выращенные на покровных стеклах. Сначала клетки инкубировали в течение 15 мин в буфере БЯ (15 мМ трис-HCl, рН 7.6, 0.34 М сахароза, 15 мМ NaCl, 60 мМ КС1, 4 мМ СаСЬ, 4 мМ NaaEDTA, 0.15 мМ спермин, 0.5 мМ спермидин), поддерживающем нативную структуру хроматина, в который были добавлены 0.1% Triton Х-100 для повышения проницаемости клеточных мембран и 0.4% формальдегид для сохранении морфологии клеток во время обработок. Затем проводили модификацию RCl-pdTi6-6HOT в буфере БЯ в течение часа. Концентрация RCl-pdTi6-6HOT составляла 10 6 М. По окончании инкубации клетки отмывали от несвязавшегося реагента, фиксировали 4% формальдегидом и обрабатывали комплексом

Str*FITC в присутствии 1% BSA. Препараты клеток просматривали под люминесцентным микроскопом.

Было обнаружено, что реагент практически не связывается с цитоплазматическими структурами, а модифицирует только ядерные компоненты. В ядрах клеток выявляются точечные участки свечения, дискретно распределенные в объеме ядра (рис. 1).

^ X ~ ~~.. Рис. 1. Локализация

л ; участков модификации

I хроматина гибридных

! клеток МН 4.1 КС1-рс1Т1б-

• "' | биот. Стрелки указывают на

1 участки модификации в интерфазном хроматине.

N

' t \

В присутствии 10-кратного избытка свободного рсШб наблюдается отчетливое ингибирование модификации, которое проявляется в снижении общего свечения ядра и исчезновении специфичных сигналов (рис. 2).

Рис. 2. Локализация участков модификации хроматина гибридных

клеток МН 4.1 11С1-р(Птб-биот в присутствии 10-кратиого избытка

свободного рс1Т1б.

Фотография клеток

представлена в двух вариантах

флуоресцентном (1) и фазово-контрастном (2).

Чтобы исключить модификацию РНК, клетки обрабатывали РНКазой А. В обработанных клетках были выявлены сигналы двух типов - ядрышковые и точечные. Последовательность проведения модификации и обработки РНКазой А влияла на интенсивность разных типов свечения. При обработке рибонуклеазой А после модификации отчетливо выявляются ядрышковые сигналы, а при такой же обработке клеток до инкубации с реагентом интенсивность сигнала от ядрышек меньше (рис. 3), что может быть связано с нарушением нативной структуры ядрышка во время обработки.

Известно, что ядра гибридных клонов человек-хомячок содержат блоки гетерохроматина - участки инактивированного генома одного из партнеров по гибридизации [Керкис с соавт., 1987]. Под световым

микроскопом они выглядят как "псевдоядрышки". Мы установили, что модификации подвергаются именно зоны активно-транскрибируемого хроматина - ядрышки, в то время как плотноупакованная ДНК в составе гетерохроматина псевдоядрышек мало доступна для модификации (рис. 4). Этот результат свидетельствует в пользу того, что именно в районах активного хроматина находятся локально расплетенные последовательности ДНК, доступные для модификации.

Рис. 3. Локализация участков модификации 11С1-рс1Т1б-бнот хроматина

гибридных клеток МН 4.1, предварительно обработанных

РНКазон А. ( ----------------

специфичные точечные

сигналы (А), ( —► ) - сигналы от ядрышек (Б). Фотографии клеток представлены в двух вариантах - флуоресцентном (1) и фазово-контрастном (2).

Рис. 4. Локализация участков модификации ИС1-рсПЧб-бнот хроматина

гибридных клеток МН 4.1, обработанных РНКазой А

после модификации. (_-

сигнал от ядрышек, (--------») -

сигнал от псевдоядрышек на уровне фона.

Фотография клеток

I 2 представлена в двух

вариантах - флуоресцентном (1) и фазово-контрастном (2).

Исследуя распределение участков модификации хроматина клеток НеЬа, мы обнаружили, что в этих клетках по сравнению с гибридными клетками общий сигнал от ядра существенно выше, кроме того выявляется третий тип специфичного свечения - свечение примембранной области ядра (рис. 5). Возможно, что это обусловлено более интенсивной пролиферацией клеток НеЬа по сравнению с гибридными клетками, а также с частичной инактивацией генома гибридной клетки.

ЧЧ

!

•¿л.' / *

I'

N

' N

„тгч-

Рис. 5. Локализация участков модификации КС1-рс1Т1б-биот хроматина клеток

НеЬа. ( -► ) - ядрышки,

(----------►") - районы дискретных

точечных сигналов, (_/'Ч ) -примембранная область. Фотография клеток

представлена в двух вариантах - флуоресцентном (1) и фазово-контрастном (2).

1 т

Ранее в нашей лаборатории было показано, что метафазные хромосомы также модифицируются производными олигонуклеотидов по расплетенным комплементарным участкам ДНК [Беляев с соавт., 1986]. В настоящей работе локализацию участков модификации метафазного хроматина изучали на выделенных метафазных хромосомах из синхронизованных колхицином клеток НеЬа. Хромосомы модифицировали ЫСЛ-рсППб-биот, затем осаждали на медные сеточки с угольным напылением, фиксировали и обрабатывали комплексом стрептавидингзолото.

Участки модификации локализовали под электронным микроскопом по скоплению частиц золота. Условия обработки хромосом были подобраны таким образом, чтобы фон на контрольной хромосоме, не подвергнутой модификации, был минимален (рис. 6 А).

На модифицированной и обработанной подобным образом хромосоме обнаруживаются области множественного мечения, которые располагаются преимущественно по периферии хромосомы (рис. 6 Б). По-видимому, расплетенные последовательности ДНК в составе метафазной хромосомы являются структурными особенностями упаковки ДНК на стадии метафазы. В присутствии 10-кратного избытка свободного рсГПб наблюдается отчетливое ингибирование модификации, которое выявляется в уменьшении количества частиц золота на теле хромосомы (рис. 6 В). Это дает возможность использовать разработанный нами метод для визуальной оценки относительной степени модификации хроматина.

Таким образом, реакционноспособные производные олигонуклеотидов могут быть успешно использованы для локализации расплетенных последовательностей ДНК в хроматине. Одним из интереснейших приложений разработанного метода могло бы быть изучение динамики структурных перестроек хроматина, сопровождающихся появлением расплетенных одноцепочечных участков

N

ДНК, например, изучение динамики активации транскрипции определенных генов.

«у?» 'Ч

Рис. 6. Локализация участков модификации Г(С1-рс!Т1б-биот хроматина

метафазных хромосом клеток

НеЬа. Стрелками указаны участки скопления частиц золота на теле хромосомы: А) препарат не

модифицированной хромосомы, Б) препарат модифицированной хромосомы, В) препарат хромосомы,

модификацированной в

присутствии 10-кратного

избытка рсГПб.

В

2. Изучение аффинной модификации хроматина в условиях перехода ДНК из В- в Z-кouфovмauuю.

Одной из причин, вызывающих появление одноцепочечных участков ДНК в хроматине, может быть переход ДНК из правоспиральной В-формы в левоспиральную Z-фopмy, который сопровождается появлением расплетенных областей ДНК на границах перехода. При физиологических ионных условиях такой переход способны инициировать природные полиамины (спермин, спермидин). Типичными последовательностями, способными к реализации перехода ДНК из В- в Z-кoнфopмaцию, являются с!(ОТ) п-повторы, широко представленные в геноме эукариот.

Ранее в нашей лаборатории было выявлено семь белков (групп белков) с молекулярными массами около 19.5; 21; 25.5; 31; 33; 38 и 43 кДа, специфично модифицирующихся вблизи расплетенных участков с1(ОТ)п-повторов алкилирующим производным рс!(АС)б [СЬегпо1оу$кауа е1 а1., 1992]. Представлялось интересным исследовать модификацию хроматина вблизи ¿(ОТ^-повторов в условиях реализации В->7-переходов, что

позволило бы оценить возможный вклад этих переходов в появление в ядре одноцепочечных участков ДНК.

Аффинную модификацию хроматина выделенных ядер клеток НеЬа проводили, используя алкилирующее производное рс!(АС)б, несущее остаток 4-[К-(2-хлорэтил-М-метил)амино]бензиламина- {11С1-рс1(АС)б} (1) и фотоактивируемое производное рс1(АС)б, несущее остаток 2-нитро-5-азидобензоиламида- {МАг-рс1(АС)б} (2):

сн, сн,а1,а

\ /

N

V V

СИ, N11 1»1(АС), СО МИ (СИц), N11 Р<1(АС).

I 1

Для индукции перехода ДНК хроматина из В- в 2-форму использовали К-буфер (1 мМ (СНз^ОгМа, рН 7.4,50 мМ ЫаС1, 0.15 мМ ИагЕВТА), содержащий 0.5 мМ спермин или 2.8 мМ спермидин, согласно условиям, описанным в литературе. Модификацию проводили, инкубируя ядра в соответствующем буфере (БЯ или К с полиаминами) с алкилирующим производным в течение 16 ч или с фотоактивирумым производным в течение 30 мин с последующим облучением УФ-светом с длиной волны 303-365 нм. Для определения степени модификации ДНК и белки хроматина разделяли ультрацентрифугированием. Модифицированные образцы отделяли от ковалентно не связавшегося олигонуклеотида гель-фильтрацией в денатурирующих условиях. Относительную степень модификации ДНК и белков определяли, измеряя оптическую плотность и радиоактивность полимерных фракций, учитывая при этом удельную активность реагента.

На рис. 7 представлены данные по относительной степени модификации белков (А) и ДНК (Б) в составе хроматина реагентом 11С1-рс!(АС)б в нативных условиях и условиях реализации В->7-перехода ДНК. В присутствии 10-кратного избытка рс1(АС)б, как и после обработки хроматина нуклеазой (расщепляющей односпиральные участки ДНК), степень модификации ДНК и белков снижается, а присутствие олигонуклеотида произвольной последовательности рс!№б (рс1(САТССААААССТТССС)) не влияет на относительную степень модификации белков и ДНК, что свидетельствует о специфичности модификации хроматина по выбранной с1(СГ)б -мишени как в нативных условиях, так и в условиях В->2-перехода. В присутствии 0.5 мМ спермина и 2.8 мМ спермидина увеличивается относительная степень модификации белков и ДНК по сравнению с нативными условиями. Этот факт является подтверждением того, что реализация В->7-переходов действительно приводит к появлению в хроматине новых расплетенных участков ДНК, доступных для модификации.

А

5

ш

ШБЯ-буфер

□ К-буфер

ОК-буфер+О.БмМ спермин

□ К^буфер+2,8мМ сперыидин

+ 10-кратный предварительная + 10-кратный избыток р(*(АС)6 обработка 31 избытокр<аМ*1Б

нуклеазой

*10-крагн>|й предварительная +10-кратный

избыток рс!(АС)6 обработка избытокр<1М1б

нуклеазой

Рис. 7. Относительная степень модификации суммарного белка (А) и ДНК (Б) в составе хроматина выделенных ядер клеток НеЬа КС1-рс1(АС)б в нативных условиях (БЯ-буфер) и условиях реализации В->Х-перехода ДНК (К-буфер с полиамицами).

На рис. 8 представлены результаты анализа белков хроматина, модифицируемых 11С1-р(1(АС)б и МАг-рс1(АС)б в составе выделенных ядер клеток НеЬа. Среди белков хроматина, специфично модифицируемых как 11С1-р(1(АС)б, так и ЫАг-рсЦАС^, обнаруживаются семь белков, выявленных ранее для алкилирующего производного [СКегпо1оузкауа е1 а1., 1992]. Это белки с молекулярными массами около 19.5; 21; 25.5; 31; 33; 43 и 67 кДа. Присутствие 10-кратного избытка рс!(АС)б, как и предварительная обработка хроматина нуклеазой Б1, приводит к резкому снижению относительной степени модификации белков обоими реагентами и в нативных условиях, и условиях реализации В-^-перехода ДНК (рис. 8 А, Б, дорожки 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12), что свидетельствует о взаимодействии 11С1-рс1(АС)б и МАг-рс1(АС)б с односпиральными

комплементарными участками ДНК в хроматине и модификации белков, расположенных вблизи этих последовательностей.

Обращает на себя внимание тог факт, что в отсутствие полиаминов (рис. 8 А, Б, дорожка 4) набор модифицируемых белков сильно обеднен по сравнению с наборами белков, модифицируемых в нативных условиях (рис. 8 А, Б, дорожка 1), или при высоких концентрациях полиаминов (рис. 8 А, Б, дорожки 7, 10). В частности, в последнем случае среди специфично модифицируемых белков обнаруживаются белки с молекулярными массами около 19.5; 21; 25.5; 31; 33; 43 и 67 кДа, причем наиболее заметно влияние полиаминов на модификацию белков с молекулярными массами около 19.5, 21 и 25.5 кДа (рис. 8 А, Б, дорожки 7, 10). Следует отметить, что белки хроматина модифицируются более эффективно в присутствии 0.5 мМ спермина по сравнению с модификацией в присутствии 2.8 мМ спермидина (рис. 7 А; 8 А, Б дорожки 7, 10). Возможно, это отражает описанный в литературе факт, что спермин, который имеет в своем составе четыре аминогруппы, оказывает более сильное влияние на стабилизацию определенного ряда ДНК-белковых взаимодействий, чем спермидин, несущий три аминогруппы.

А Б

1234567 89 10 И 12

Рис. 8. Анализ электрофорезом в ПААГ в присутствии 0.1% вОЭ белков, модифицированных ЯС1-р(](АС)б (А) п NAz-pd(AC)б (Б) в составе хроматина выделенных ядер клеток НеЬа: в нативных условиях (буфер БЯ) - дорожки 13; в буфере К - дорожки 4-6; в условиях реализации В->7-персхода ДНК -

(буфер К + 0.5 мМ спермин) - дорожки 7-9, (буфер К + 2.8 мМ спермидин) -дорожки 10-12; дорожки 1,4,7, 10 - опыт; дорожки 2, 5, 8, 11 - в присутствии 10-кратного избытка свободного рс!(АС)б; дорожки 3, 6, 9, 12 - после предварительной обработки ядер нуклеазойБ!. Звездочками отмечены белки, специфично модифицирующиеся в хроматине производными рс1(АС)б. Черточки указывают положения маркерных белков на электрофореграмме, числа над черточками - их молекулярную массу (в Да). |

Следует отметить, что как для алкилирующего, так и для фотореагента набор белков, доступных для модификации в буфере с высокими концентрациями полиаминов, сходен с набором белков, модифицируемых в нативных условиях (рис. 8 А, Б, дорожки 1,7, 10), а не с белками, модифицируемыми в буфере без полиаминов (рис. 8 А, Б, дорожка 4). Этот результат свидетельствует о важной роли полиаминов в инициации и поддержании расплетенных участков ДНК в хроматине в нативных условиях, и является еще одним аргументом в пользу того, что В->г-переходы вызывают появление одноцепочечных участков ДНК в хроматине.

Представлялось интересным локализовать расплетенные участки ДНК в хроматине в нативных условиях и в условиях, индуцирующих В->2-переход, используя алкилирующее производное додекануклеотида рс!(АС)б, несущее остаток 4-[(1\т-2-хлорэтил-]\Г-метил)амино]бензиламина на 5'-конце и остаток биотина на 3'- конце {11С1-рс1(АС)б-биот}. Клетки обрабатывали по методу, описанному в п. 1 для локализации расплетенных поли(ёА)-последовательностей в хроматине интерфазных клеток. Сначала проводили модификацию нативного хроматина по расплетенным (1(ОТ)п-последовательностям, а затем участки модификации локализовали с помощью комплекса Б^РГГС под люминесцентным микроскопом. Результаты представлены на рис. 9.

Видно, что в присутствии 10-кратного избытка р<1(АС)б, как и после обработки хроматина нуклеазой 81 (расщепляющей односпиральные участки ДНК), наблюдается снижение интенсивности специфичного сигнала от клеток, что свидетельствует о специфичности протекания реакции как в нативных условиях, так и в условиях реализации В->2-перехода ДНК, по комплементарным одноцепочечным участкам в хроматине клетки.

В нативных условиях с1(ОТ)п-последовательности, доступные для модификации, локализуются по всему объему ядра клетки, за исключением некоторых слабомодифицирующихся областей (рис. 9 А). Кроме того, в интерфазном ядре можно выделить область наиболее сильной модификации (рис. 9 А). В присутствии высоких концентраций полиаминов, индуцирующих переход ДНК из В- в 2-форму, наблюдается резкое изменение интенсивности сигнала, а общая картина локализации сходна с ситуацией, отражающей модификацию в нативных условиях (рис. 9 В, Г). Приведенные данные наглядно демонстрируют, что B->Z-переход ДНК может быть одной из причин появления в нативном хроматине расплетенных участков, доступных для модификации реакционноспособными производными олигонуклеотидов, и природные полиамины играют важную роль в этом процессе.

в

г

Рис. 9. Локализация участков модификации КС1-рс1(ЛС)б-биот хроматина клеток НеЬа в БЯ-буферс

(A), К-буфере (Б), К-буферс, содержащем 0.5 мМ спермин

(B) или 2.8 мМ спермидии (Г). Модификация В.С1-рс!(АС)б-биот (1), в присутствии 10-кратного избытка рс!(АС)б(2), после предварительной обработки ядер нуклеазой Б! (3).

3. Изучение белкового окружения (ИСТ)^повторов в хроматине с помощью методов аффинной фотомодификаиии и аффинной сорбции.

Можно полагать, что каждая последовательность ДНК в хроматине характеризуется специфическим белковым окружением. Семь белков с молекулярными массами 19.5; 21; 25.5; 31; 33; 43 и 67 кДа, входящих в белковое окружение расплетенных (1(ОТ)п-последовательностей, были выявлены в результате аффинной модификации хроматина клеток НеЬа 11С1-рс1(АС)б [СЬегпо1о\'5кауа е1 а1., 1992] и НАг-рё(АС)б [наст.работа, п. 2]. Чтобы выяснить, имеют ли эти белки сродство к ё(ОТ)п-последовательностям ДНК, проводили аффинную сорбцию суммарного ядерного белка клеток НеЬа на полимерах с иммобилизованными олигонуклеотидами рс!(АС)б, рё(ОТ)б и дуплексом рс1(АС)б • рс1(ОТ)б. Белки, полученные в результате аффинной сорбции, анализировали БОБ-электрофорезом и сравнивали по молекулярным массам с белками, специфично модифицируемыми в составе хроматина п-азидоанилидными производными р<1(АС)б, несущими на 5'-конце группу «-Ыз-СбН4-ЫН-:

N.. (СН,). р<«лс\ АгАп(п)-рс1(АС)б (где п= 2,4 и.

Модификацию хроматина проводили следующим образом: выделенные ядра клеток НеЬа инкубировали с АгЛп(п)-рс1(АС)б в буфере БЯ в темноте в течение 30 мин во льду, а затем облучали УФ-светом с длиной волны 303-365 нм. После образования ковалентных сшивок реагента с компонентами хроматина ядра лизировали, модифицированные белки анализировали БОЗ-электрофорезом. На рис. 10 (дорожки 1, 2) представлены результаты модификации белков в составе ядер клеток НеЬа производным АгАп(4)-рс1(АС)б. Видно, что среди модифицируемых белков обнаруживаются те же семь специфично модифицируемых белков, что и в случае модификации хроматина алкилирующим и нитроарилазидным производными [СЬегпо1оу$кауа е1

Рис. 10. Анализ электрофорезом в ПААГ в присутствии 0.1% SDS белков хроматина, модифицированных фотоактивными производными рс1(АС)б (дорожки 1, 2) и pd(ATACTTATATAGCGTT) (дорожки 3, 4), несущими на 5'-концевом фосфате остаток /I-NJ-C«H4-NH-(CH2)4 -NH-.

Дорожки 2, 4 - модификация в присутствии 10-кратного избытка pd(AC)6 и

pd(ATACTTATATAGCGTT), соответственно. Звездочками

отмечены _ специфично

модифицируемые белки. Черточки указывают на расположение маркерных белков на

электрофореграмме, числа над черточками - молекулярную массу маркера (в Да).

В качестве контроля проводили модификацию хроматина клеток HeLa аналогичным и-азидоанилидным производным олигонуклеотида pd(ATACTTATATAGCGTT), комплементарного миниэкзону РНК Leishmania amanosensis {AzAn(4)-pd(ATACTTATATAGCGTT)}. Видно, что происходит лишь неспецифичная модификация нескольких белков, причем интенсивность модификации существенно ниже и положение полос не совпадает с полосами белков, специфично модифицируемых аналогичным производным pd(AC)6 (рис. 10, дорожки 3,4).

Для установления влияния размера линкера на модификацию белков была проведена модификация хроматина производными pd(AC)6, несущими остаток «-азидоанилина, связанный с 5'-концевым фосфатом

al., 1992; наст.работа, п.2].

12 3 4

i

№I

66000.

45000

* щ

36000

29000 * 24000 *

20100

1 2 3

олигонуклеотида аминоолигометиленовым линкером разной длины -(СНг)п^Н- (с п=2, 4, 6) (Рис. 11). Для всех трех случаев наблюдали специфичную модификацию одних и тех же групп белков. Однако интенсивность полос на радиоавтографе, а следовательно, и эффективность модификации, существенно зависела от длины линкера. Наиболее эффективно модификация проходила при п=4.

Рис. 11. Анализ электрофорезом в ПААГ в присутствии 0.1% БЬв белков хроматина, модифицированных

фотоактивными производными рс!(АС)б, несущими на 5'-концевом фосфате остаток л-№-СбН4-1ЧН-(СН2)п-1ЧН-, где п=2 (дорожка 1), 11=4 (дорожка 2), п-6 (дорожка 3). Звездочками отмечены белки, специфично модифицирующиеся в хроматине производными р(1(АС)б. Черточки указывают на расположение маркерных белков на

электрофореграмме, числа над

черточками - молекулярную массу маркера (в Да).

66000

45000_

36000_

29000_ 24000_

20100

Для выявления белков хроматина, имеющих сродство к участкам ДНК, содержащим с1(ОТ)п-блоки, проводили аффинную сорбцию ядерных белков клеток НеЬа на полимерах с иммобилизованными одноцепочечными олигонуклеотидами рс1(АС)б, р<1(ОТ)б и дуплексом рс1(АС)б'рс1(ОТ)б. Комплексообразование белков с олигонуклеотидами осуществляли при 4°С в БЯ-буфере. Белки, связавшиеся с олигонуклеотидами, элюировали с сорбента раствором 2.8 М ИаС1 в 7 М мочевине. Смесь белков диализовали против 0.001 М трис-НС1 (рН 7.5), концентрировали бутанолом и анализировали электрофорезом в градиентном ПААГ в присутствии 0.1% ЗОБ. Полученные результаты представлены на рис. 12 и суммированы в таблице.

Было обнаружено пять белков с молекулярными массами — 100 кДа, 67 кДа, 56 кДа, 31 кДа и 30 кДа (рис. 20, дорожка 1), связывающихся с одноцепочечным рс1(АС)б, и шесть белков с молекулярными массами — 100 кДа, 67 кДа, 56 кДа, 49 кДа, 31 кДа и 30 кДа (рис. 20, дорожка 2), связывающихся с одноцепочечным рё(СГ)б. Таким образом, только один белок, имеющий молекулярную массу около 49 кДа, связывается с рс!(ОТ)б и не связывается с рё(АС)б (рис. 20, дорожка 2). Присутствие свободного рс!А|б в количестве, эквивалентном количеству олигонуклеотида, иммобилизованного на сорбенте, подавляет

связывание белков, имеющих молекулярные массы ~ 100 кДа, 31 кДа и 30 кДа, с рс!(АС)б и белков, имеющих молекулярные массы -100 кДа, 49 кДа, 31 кДа и 30 кДа, - с рс1(СГ)б. Поскольку присутствие рс!А|б не подавляло связывания одноцепочечных олигонуклеотидов с белками, имеющими молекулярные массы 67 кДа и 56 кДа, мы полагаем, что эти белки (группы белков) имеют сродство к обеим цепям расплетенных участков ¿(СГ)п-блоков ДНК в хроматине.

Рис. 12. Сравнение ядерных белков, модифицируемых

производным Л/.Ап(п)-рс1(ЛС)б (А, радиоавтограф), и белков, имеющих сродство к

последовательностям ДНК,

содержащим (](СТ)п-йлоки (Б, окраска Кумасси)- Суммарный ядерный белок клеток НеЬа (дорожка 1); белки, полученные в результате аффинной сорбции суммарного ядерного белка на сорбенте с иммобилизованным рё(АС)б*рс1(ТС)б (дорожка 2), р(1(ОТ)(, (дорожки 3, 4), рс!(АС)б (дорожки 5, 6). Дорожки 3, 5 - в присутствии эквивалентного количества рс1А1б. Звездочками отмечены белки, специфично модифицирующиеся в хроматине производными рс1(АС)б.

Черточки указывают положения маркерных белков на электрофореграмме, числа над черточками - молекулярную массу маркера (в Да)

При анализе ядерных белков, связывающихся с аффинным сорбентом, несущим иммобилизованный дуплекс, было обнаружено, что их набор включает в себя белки, способные к связыванию с одноцепочечными олигонуклеотидами, в частности, белки с молекулярными массами около 67 кДа, 56 кДа, 49 кДа, 31 кДа, 30 кДа, а также белки, связывающиеся только с двуцепочечным олигонуклеотидом, к которым относятся белки с молекулярными массами 27 кДа, 23 кДа, 21 кДа, 19.5 кДа. Таким образом, единственным белком (группой белков), связывающимся только с одноцепочечными олигонуклеотидами, является высокомолекулярный белок, имеющий молекулярную массу около 100 кДа.

1 2 3 4 5 6

66000_* 45000

36000

29000 24000_*

20100

Таблица. Сравнение данных по ядерным белкам, специфично модифицируемым производными рс1(АС)б в составе хроматина, и белкам, имеющим сродство к одноцепочечным олигонуклеотидам рс!(АС)б и рс1(СТ)б н дуплексу р(1(АС)б*рс1(СТ)б.

молекуляр- белки,

пая масса специфично белки, имеющие сродство к ё(СТ)в - блокам ДНК модифицируемые

реакционно- рс](АС)г.'рс1(ОТ> рс1(АС)б рё(АС)б рс1(СТ)б рс1(ОТ)б

способными в прису- в прису-

производны- тствии тствии

ми рс1(АС)д рс!А1б рс!А|б

100 кДа + +

67 кДа + + + + + +

56 кДа + + + + +

49 кДа + +

43 кДа +

33 кДа +

31 кДа + + ' +' . +

30 кДа + + +

27 кДа +

25.5 кДа +

23 кДа +

21 кДа + +

19.5 кДа + +

При сравнении набора ядерных белков, полученных . с помощью

аффинной сорбции, и белков хроматина, специфично модифицируемых в нативных условиях в окрестностях с1(ОТ)п-повторов фотоактивируемым производным рс!(АС)б, несущим остаток /г-№-СбН4-МН-(СН2)4-ГЧН-, было обнаружено, что эти наборы частично перекрываются (рис. 20). На основе полученных данных по связыванию ядерных белков с иммобилизованными на сорбенте одноцепочечными рс!(АС)б и рс1(ОТ)б и дуплексом рс!(АС)б*рс1(ОТ)б можно разделить семь белков, специфично модифицируемых производными рс1(АС)б, на следующие группы:

Первая группа (белок или группа белков с молекулярной массой 67 кДа) - белки, имеющие сродство к одноцепочечным рс!(АС)б и рс1(СГ)б, а также их дуплексу. Мы полагаем, что в хроматине эти белки связаны либо с расплетенными последовательностями-"мишенями" ДНК, либо с двуцепочечными участками ё(ОТ)п-блоков, находящимися вблизи этих последовательностей.

Вторая группа (белки с молекулярными массами 43 кДа, 33 кДа, 25.5 кДа) - белки, не обладающие заметным сродством к рс!(АС)б, рс1(ОТ)б и дуплексу рс1(АС)б*рс!(ОТ)б. Специфичная модификация этих белков может объясняться их топографической близостью к расплетенным участкам

ДНК, с которыми связывается производное рс!(АС)б, но непосредственно с с!(ОТ)п-блоками ДНК в хроматине эти белки не взаимодействуют.

Третья группа белков (белок или группа белков с молекулярной массой 31 кДа) - белки, связывающиеся с иммобилизованными рс!(АС)б, рс1(СГ)б и дуплексом рс1(АС)б*рс1(ОТ)й. Однако, связывание этих белков с одноцепочечными олигонуклеотидами подавляется в присутствии рс!А|б. По-видимому, эти белки имеют повышенное сродство к нуклеиновым кислотам вообще, по крайне мере, к одноцепочечным, а в хроматине взаимодействуют как с сЗ(ОТ)п-блоками, так и с любыми другими последовательностями.

Четвертая группа (белки с молекулярными массами 21 кДа и 19.5 кДа) - белки, имеющие сродство к дуплексу рё(АС)б*рс1(ОТ)б. Можно предположить, что эти белки связаны с двуцепочечными с!(ОТ)п-блоками ДНК, расположенными вблизи одноцепочечной последовательности-"мишени". Тем не менее, нельзя исключить возможность связывания белков этой группы и с дуплексом, который образуется при взаимодействии реакционноспособного производного рс!(АС)б с одноцепочечным участком ДНК.

Таким образом, сопоставление результатов, полученных с помощью аффинной сорбции и аффинной модификации, позволило получить более детальную информацию о ДНК-белковых взаимодействиях в районах расплетенных ¿(СГГ)п-блоков. Представляется перспективным дальнейшее приложение аффинной сорбции для выделения и наработки конкретных белков хроматина, а также определения их первичной структуры.

ВЫВОДЫ

I. Впервые в нативном хроматине интерфазных клеток и выделенных метафазных хромосом локализованы расплетенные полидезоксирибоадениловые последовательности, доступные для модификации алкилирующим биотинилированным производным гексадекатимидилата, несущим остаток 2-хлорэтилариламина на 5'-конце и остаток биотина на З'-конце, с помощью методов люминесцентной и электронной микроскопии с использованием комплексов стрептавидин-флуоресцеинизотиоцианат и стрептавидин'коллоидное золото, соответственно.

II. Изучена аффинная модификация хроматина клеток НеЬа в области с)(СТ)п-повторов производным рс1(АС)б, несущим на 5'-конце остаток 2-хлорэтилариламина, в условиях реализации перехода ДНК из В- в Z-фopмy и фотоаффинная модификация хроматина производным рс1(АС)б, несущим на 5'-конце остаток 2-нитро-5-азидобензоиламида, как в нативных условиях, так и в условиях реализации В-^-перехода. Показано, что спектр белков, специфично модифицируемых в составе нативного хроматина производным рс1(АС)б, несущим остаток 2-нитро-5-азидобензоиламида, совпадает по

молекулярным массам с набором белков, выявленных ранее для алкилирующего производного pd(AC)6. С помощью производного pd(AC)6, несущего остаток 2-хлорэтилариламина на 5'-конце и остаток биотина на З'-конце, и метода люминесцентной микроскопии локализованы участки модификации хроматина в клетках как в нативных условиях, так и в условиях B->Z-nepexofla. Показано, что переход ДНК из В- в Z-форму является одной из вероятных причин существования в хроматине расплетенных доступных для модификации участков.

III. Изучена фотоаффинная модификация белков, расположенных в области d(GT)n-noBTopoB хроматина клеток HeLa с помощью производных pd(AC)6, несущих остаток я-азидоанилина, связанный с 5'-концевым фосфатом олигонуклеотида аминоолигометиленовым линкером -(CH2)n-NH-, где п=2, 4, 6. Обнаружено влияние длины линкера на эффективность модификации белков. Осуществлена аффинная сорбция белков хроматина на сорбентах с иммобилизованными олигонуклеотидами pd(AC)«, pd(GT)6 и дуплексом pd(AC)6*pd(GT)e. Проведено сравнение спектра специфично модифицируемых белков хроматина с наборами белков, полученных с помощью аффинной сорбции. В результате проведенного анализа выявлено четыре группы специфично модифицирующихся белков, различающихся по их сродству к d(GT)n-6noKaM ДНК.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Боженок JI.H., Черноловская E.JL, Горожанкин A.B., Байбородин С.И., Болоболова Е.У., Киселева Е.В., Керкис А.Ю., Кобец Н.Д. Визуализация участков ДНК, взаимодействующих с реакционноспособными производными олигонуклеотидов, в составе интерфазных ядер и метафазных хромосом // Молек. биология. 1995. Т.29. № 4. С.862-870.

2. Боженок Л.Н., Власов В.В., Черноловская Е.Л., Иванова Е.М., Кобец Н.Д. Направленная по d(GT) ^повторяющимся участкам ДНК химическая модификация хроматина клеток эукариот // Биоорган, химия. 1998. Т.24. № 12. С.916-919.

3. Bozhenok L.N., Khazina Е.В., Chemolovskaya E.L., Kobets N.D. Chromatin proteins surrounding the d(G-T)n repeats and polyamine influence as revealed by photoaffinity labeling with reactive pd(A-C)g derivatives // FEBS Lett. 1998. Y.440. N 1-2. P.38-40.