Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ядерных белков клеток селезенки и ткани головного мозга иммунизированных крыс в регуляции экспрессии гена интерлейкина-2 в Т-лимфоцитах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ядерных белков клеток селезенки и ткани головного мозга иммунизированных крыс в регуляции экспрессии гена интерлейкина-2 в Т-лимфоцитах"

' ; ; , на правах рукописи

I 9 ДПР 1Ьз6

ГОЛОВКО

Ольга Ивановна

РОЛЬ ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ И ТКЛНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ИММУНИЗИРОВАННЫХ КРЫС В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 В Т-ЛИИФОЦИГАХ.

Специальность - 03.00.04 - биохимия

14.00.16 - патологическая фиэиоаогия .

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург ; 9 9 6

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патологической физиологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик РАМН Б.И. Ткаченко)

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор Е.А. Корнева доктор биологических наук Т.Б. Казакова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор H.H. Петрищев доктор биологических наук, вед. науч. сотр. Л.Б. Пучкова

Ведущая организация:

Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится "2.0" __ 1996 г.

,в _ часов На заседании Диссертационного Совета К.001.23.01

по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул акад. Пчвлова, 12.

С диссертацией можно, ознакомиться в библиотеке НИИЭМ

РАМН (Санкт-Петербург, ул акад. Павлова, 12).

автореферат разослан "/} " с

1996 Г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета К.001.23.oi доктор биологических наук

О.Г. Куликова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальноешь проблемы. Изучение взаимного влияния нервной и иммунной систем (НС и НС) является одной из актуальных проблем современного научного исследования. В последнее время большое внимание уделяется изучению роли цитохиноа в коммуникации между ЦНС и ИС. показана способность клеток ткани головного мозга реагировать на эндогенные ци-токины. Установлено также, что нейроны и глия продуцируют некоторое цитокины. Эти сведения позволяют сделать вывод о том, что цитокины могут являться недиаторами межклеточной коммуникации не только для имму-нокомпетентных клеток, но и для клеток ЦНС, осуществляя регуляцию при помощи аутокринного и паракринного механизмов (Sei et al., 1995).

В настоящей работе, для изучения механизма регуляции иммунного ответа белковыми факторами клеток нервной системы, была выбрана модель регуляции экспрессии индуцибельного гена интерлейкнна-2 (ИЛ-2) - белка играющего кардинальную роль в формировании имунного ответа клеточного типа {Smith, 1988). ЙЛ-2 регулирует пролиферацию Т-клеток tf продуцируется Т-лимфоЦитами в ответ на межклеточный сигнал, регистрирующий антигенное воздействие. При отсутствии повторяющихся внешних сигналов синтез ИЛ-2 Т-лиМфоцитами прекращается (Kroemer et al., 1991! Rubin, 1993).

Изучение свойств ИЛ-2 показало, что ИЛ-2, секретируемый Т-хелле-рами, оказывает действие на пролиферацию и созревание астроцитов и олигодендроцитов in vitro (Benvenista Ь Merrill, 1986). На поверхности олигодендроцитов и клеток микроглии обнаружен рецептор ИЛ-2 (Okamoto et al., 1990). Есть сведения о продукции ИЛ-2 нейронами и о наличии нл нейронах рецептора ИЛ-2 (Sei et al., 1995). Проводились также исследования влияния нервной системы на продукцию ИЛ-2 Т-лимфоцитами. В работе Глейзера (Glaser et al., 1990) было показано, что эмоциональный стресс у человека снижает продукцию ИЛ-2 и его рецептора лимфоцитами периферической крови. Другие исследователи (Sheridan et al., 1991) установили, что при иммобилизационном стрессе на фоне гриппозной инфек-цни у мышей снижается продукция ИЛ-2 в Т-клетках лимфатических узлов и селезенки.

К настоящему времени выделены и изучены транс-факторы - регуляторы экспрессии индуцибельного гена ИЛ-2, и для многих из них определены молекулярные массы и сайты связывания на специфических участках промо-горно-энхансерной области гена ИЛ-2 (Granelli-Piperno & Nolan, 1Э91, :hen t, Rothenberg, 1993). Известно, что все изученные до настоящего времени транс-факторы гена ИЛ-2 (АР-1, АР-2, АР-3, NF-AT, NF-кВ, 5ct-l, CD28RC) представляют собой высокомолекулярные сложные образованы, в состав которых входят белки, выполняющие функцию активаторов, эепрессоров или транспортеров (Angel et al., 1987; Mitchell et al., 1987; Imagawa et al., 1987; Granelli-Piperno fc McHugh, 1991; Baeuerle, 1991; Segil et al., 1991;' Verwej et al., 1991). Кроме того, существуют жределенные механизмы взаймодейсгвия между различными транс-фактора-

мм, обеспечивающие индукцию и развитие иммунологических реакций в лш фоидных клетках (crabtree & Clipstone, 1994). Установлено также, что состав белкового транскрипционного комплекса входят еще неидентифиц> рованныэ активаторы экспрессии гена ИЛ-2 (Garrity et al., 1994).

До сих пор изучалось влияние на продукцию ИЛ-2 транс-факторо! выделенных из Т-лимфоцитов. Не было показано наличие белковых фактор« - регуляторов экспрессии гена ИЛ-2 в клетках головного нозга, хотя с< общалось о продукции ИЛ-2 глиальныни клеткани определеннных структ; головного нозга (Merrill, 1989, 1990).

В связи с изложенным представлялось актуальным исследовать во: можность осуществления взаимодействия между ЦНС и ИС на молекулярн< уровне через регуляцию экспрессии гена ИЛ-2 белковыми факторами.

Цель длиной рабопш работы состоит в выявлении и изучении приро; и функции белковых транс-факторов, являющиеся общими для клеток нер| ной и иммунной систем и осуществляющих регуляцию экспрессии гена ИЛ-;

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Из ядер клеток селезенки и ткани головного мозга инмунизированш крыс выделить белки, способные активировать экспрессию гена ИЛ-2;

2. Исследовать действие выделенных белков на продукцию ИЛ-2 подобно! ростового фактора в культуре Т-лимфоцитов селезенки мыши:

3. Изучить способность выделенных белков к формированию комплексов промоторно-энхансерной областью гена ИЛ-2 in vitro;

.4. изучить роль ядерных белков селезенки и ткани головного мозга кр| в регуляции активности промотора гена ИЛ-2 с использованием различи! модельных систем;

6. Изучить влияние белковых факторов на синтез мРНК ИЛ-2 в Т-лимфощ так селезенки мыши;

6. Исследовать механизм действия выделенных белков при нммуНосупре! сии, вызванной иммобилизационным стрессом или иммунодепрессантом циклоспорином A (CsA).

Научная новизна работы. В результате работы иэ ядер клеток сел! зенки и ткани головного мозга иммунизированных крыс были выделены бе. ки (ЯБС и ЯБМ), стимулирующие экспрессию гена ИЛ-2 в культуре Т-лимф< цитов in vitro на уровне синтеза мРНК ИЛ-2. В составе ЯБС и ЯБМ обн; ружены полипептиды с одинаковыми молекулярными массами, которые форм! руют специфический комплекс с регуляторной областью гена ИЛ-2. Резул таты определения N-концевой аминокислотной последовательности полипе] тидов 13,5, 18, 19 кДа и поиска гомологичных последовательностей компьютерном банке данных позволили сделать вывод о необходимое дальнейшей идентификации белков. Анализ способности изучаемых белк< образовывать комплекс с промоторно-энхансерной областью гена ИЛ-2 по волил установить, что белки 13.5, 18, и 19 КДа ЯБС специфически связ вастся с проксимальным участком от -141 п.н. до +39 п.н. и не рззим действуют с дистальным участком промоторно-энхансерной области re ИЛ-2 от -548 п.н. до -142 п.н. С использованием различных модедьн

ютем: (культуры Т-лимфоцитов селезенки мыши и Т-клеток линии JurVcat, ^сформированных плазмидой pIL-2LUC), продемонстрировано актнвирую-!в действие ЯБС и ЯБМ на промотор гена ИЛ-2 и синтез ИЛ-2 мРНК. Пришвине Двух моделей иммуносупрессни, вызванной имнобилизационним •рессон или действием цитостатика циклоспорина А, выявило различие шекулярных механизмов подавления синтеза мРНК ИЛ-2 в каждом случае. >и этом ЯБС и ЯБН ослабляли негативное действие циклоспорина А и под-¡рживали содержение ИЛ-2 мРНК в Т-лимфоцитах на достаточно высоком ювне. ЯБМ снижали падение уровня содержания мРНК ИЛ-2 в условиях гресса.

Научно-практическое значение. Полученные данные о ЯБС и ЯБМ, име-*их специфическое сродство к промоторно-энхансерной области гена ИЛ-2 регулирующих экспрессию гена ИЛ-2 на уровне транскрипции мРНК, после >льнейшего уточнении первичной структуры белков могут быть испольэо-шы при создании препаратов, коррегирующих экспрессию гена ИЛ-2 при 1нунодефицитах, вызванных различными патологическими факторами. Регу-. щия иммунного ответа при помощи белковых активаторов, близких к при-здным соединениям, может позволить избежать побочных эффектов, кото->ie наблюдаются при введении рекомбинантного ИЛ-2. Возможно, примене-*е аналогов белковых транс-факторов - участников нейро-нммунных вэаи-эдействий может обеспечить многонаправленную коррекцию процессов на эовне активации экспрессии гена при нарушении функций НС и ИС.

Основные положения, выносинив на защиту. L. В ядрах клеток селезенки и тканй головного мозга иммунизированных эыс присутствуют белки 13,5, 18 и 19 кДа, обладающие способностью тецифически взаимодействовать in vitro с регуляторной областью гена 1-2.

2. Ядерные белки селезенки и ткани головного мозга (ЯБС и ЯБМ) облазит транс-активирующими функциями в отношении гена ИЛ-2 и принимают частие в процессе активации Т-ликфоцитов.

3. ЯБС и ЯБМ оказывают защитный эффект при иммуносупрессни, вызванный ямунодепрессантом циклоспорином А. ЯБМ также обладают защитными войствами при стрессе.

Апробация диссертации. Результаты диссертации изложены в 11 пуб-нклциях и доложены на Конференции молодых физиологов и биохимиков оссии, С-Петербург, 19-21 сентября 1995 г.

Структура диссертации. Диссертация изложена на страницах,

остоит из разделов: Введение, Обзор литературы. Методы исследования, езультаты исследования. Обсуждение результатов. Выводы. Список цити-уемоЯ литературы включает источников. Диссертация содержит 3 таб-ицы и 23 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе использовали клетки E.coli (штамм НВ 101 , транс-ормированные рекомбинантными ДНК плаэмиды рАА1213, содержащей полно-'

размерную копию кДНК гена ИЛ-2 человека длиной 550 п.н. (любезно пре доставлена д.х.н. Э.Греном, Ин-т БиорганическоА химии, Рига, Латвия) или плазмиды pIL-2luc, включающей промоторно-эхансерную область ген ИЛ-2, длиной 587 п.н. (от -548 п.н. до +39 п.н.) (любезно предоставле на доктором Дж. Кантом, Пенсильванский университет, Филадельфия, США) Выделение плазмидной ДНК из E.coll и получение необходимых фрагменто! проводили стандартным способом.

Мечение ДНК-фрагментов проводили нерадиоативным методом при помощи дигоксигениновой метки. 1 мкг фрагмента ДНК, полученного посл< рестрикции эндонуклеазами и выделенного из легкоплавкой агароэы, растворяли в 5 мкл стерильной деиониэованной воды и денатурировали прогреванием при 95° С в течение 10 минут с последующим быстрым охлаждением, вызванным помещением пробирки в кювету со льдом на 5 минут. Затем к денатурированной ДНК добавляли 2 мкл 10-кратного гексаиуклеотидногс буфера, 2 мкл смеси дезоксинуклеотидов, содержащей короткий праймер с произвольной иуклеотидной последовательностью, 1 мН дАТФ, 1 ММ ДЦТФ, 1 иМ дГТФ, 0,65 ММ дТТФ, 0,35 мМ DIG-дУТФ рН 7,5; доводили объем смеси до 19 мкл стерильной деионизованной водой, после чего вносили 1 мкл (2 ед.) фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. описанную процедуру проводили на льду. Затем смесь цетрифугировали в течение короткого времени (1-2 минуты) при ю 000 х g и инкубировали около 20 часов при 37° с. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,2 М ЭДТА. ДНК преципитирова-ли внесением 2,5 мкл 4М МсХ и 75 мкл предварительно охлажденного этанола. Для эффективного осаждения ДНК пробирку оставляли на ночь при -20° С. Осадок меченой ДНК получали центрифугированием при 10 ООО х g в течение 1 часа при 4° С, промывали 704 этанолом и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ.

Эксперименты выполнены на мышах-самцах линии СБА, массой 18-24 г, крысах-самцах породы Вистар массой 170-220 г, полученных из питомника РАМН "Рапполово". Животных содержали в Виварии с искусственной вентиляцией и фиксированным режимом освещения (день - 8.00 - 20.00; ночь -20.00 - 8.00). Уход и все процедуры осуществляли в соответствии с нормами и правилами обращения с лабораторными животными. Крыс-самцов линии Вистар иммунизировали внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (1-5 х 109 клеток/мл стерильного фиэ.раствора) в течение 6 дней.

Выделение ядер из клеток селезенки и головного мозга осуществляли по методу Блобела и Поттера (Blobel 4 Potter, 1966) в модификации Хорза и Цахау (Horz 4 Zachau, 1980). Выделение белковых экстрактов из ядер клеток селезенки и ткани головного мозга осуществляли по Shapiro et al., 190В с некоторыми модификациями, осадок ядер ресуспендировали в ядерном буфере (20 MM HEPES рН 7,9; 0,75 мМ спермидин, 0,15 .мМ спермин, 2 MM EGTA, 0,2 ММ ЭДТА, 2 ММ ДТТ, 25 X глицерин. 0.1 MM PHSF) из расчета 120-150 мг ядер на 3 мл буфера. К суспензии приливали 1/10 насыщенного раствора (NH4)2S04, достигая конечной концентрации раствора 0,38 М. Суспензию встряхивали в течение 30 минут при 4" С, после чего

производили центифугирование при 150 ООО х g при 2° с 90 минут, супер-натант отбирали. К супэрнатанту добавляли сухой (NH4)2S04 из расчета 0,33 г на каждый мл раствора до конечной концентрации 2,98 М. Раствор встряхивали 20-40 минут при 4° С до полного растворения сульфата амна-ния. Осадок собирали при 85 ООО х g в течение 20 мин, при 2° С. Получанный осадок растворяли в 1-2 мл ядерного диализного буфера (20 ни HEPËS, pH 7,9; 20 % глицерина, 10 мМ KCl, 0,2 ММ ЭДТА, 0,2 мМ Е0ТЛ, 2 MM DTT, 0,1мМ PMSF) из расчета 1 мл буфера на 400-500 мг ядер, диа-лизовали дважды против 300 объемов того же буфера по 8-12 часов, концентрацию белка определяли по Шаффнеру (Schaffner et al., 1973). в результате выделения получали 7-10 мг/мл ЯБС и 100-200 мкг/мл ябм из 400-500 МГ ядер.

Хроматографическое разделение ЯБС проводили на аппарате Hitachi на колонке с 12* суперозой (Pharmacia, 1KB) в 0,1 H фосфатном буфер« pH 6,5. Высота колонки 30 см, диаметр 10 см. Для калибровки молекулярных масс белков использовали стандартные белки.

Диск-электрофореэ ЯБС и ЯБМ в ПААГ в присутствии ДДС-Na проводили по Laemmly, 1970.

После электрофоретического разделения белки ядерного экстракта переносили На ни1роцеллюлозную мембрану методом электроблоттингэ (Tovbin et al., 1979). Мембрану затем преинкубироаали в течение 30 минут в 20-50 мл гибридизационного буфера (10 мМ HEPES pH 8,0, 50 нМ Nací, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ), содержащего IX блокирующий реагент. Затем этот раствор сменяли 1-2 мл гибридизационного буфера, содержащего 1 мкг меченой Дигоксигенином ДНК. Мембраны отмывали двумя сменами связующего буфера, содержащего 0,3 M Nací, в течение 1-2 часов при комнатной температуре и двумя сменами 100 мМ трис-HCl, pH 7,5 в течение двух часов. Фильтр высушивали и комплекс белок-ДНК визуализировали, применяя реакцию ИммунодетехциИ.

Для трансфекции ДНК pIL-2LUC были использованы человеческие лей-кемиЧеские Т-Клетки линии Ourkat (субклон 332). Трансфекцию осуществляли DEAE-декстрановым методом (Williams et al., 1989). В среду вносили белки ядерного экстракта или их хроматографические (после FPLC) фракции (0,6 нг/105 клеток) и инкубировали Т-клетки в течение 16-18 часов при 37° С, 100& влажности и 5% С02. Для индукции синтеза ИЛ-2 в среду добавляли КонА (2 мкг/мл, Sigma) и клетки дополнительно инкубировали 24 часа. Световую эмиссию измеряли при помощи люминометра 'SKB (Новосибирск).

Т-лимфоциты мышей линии СБА получали стандартным способом (Гущин, 199-2). Стимуляцию Т-лимфоцитов осуществляли КонА, КонА+рИЛ-2 или ФГА+ТРА. Белковые факторы добавляли в инкубационную среду в сочетании с указанными стимуляторами или без них. Тотальную мРНК выделяли, используя гуанидиноэый метод Шомэинского и Сахи (Chomczyncki S¡ Sacchi, 1987), адаптированный лля мышиных сплсноцитов. Полученный осадок то-."¿льной мРНК растворяли б 5 мкл стерильной деиончзованной поды и нано-

силн на фильтр (Шляхер и Шулль ВАв5). После закрепления РНК на мембра' не производили гибридизацию в буфере, содержащей меченый дигоксигени ной фрагмент, представляющий собой полноразмерную копию кДНК ген; ИЛ-2. Комплекс ДНК-мРНК выявляли при помощи реакции иммунодетекции Степень окрашивания пятен, пропорциональную количеству МРНК ИЛ-2, из меряли на денситометра LKB Ultrascan XL Law Dancytometer.

Применяемая модель стресса заключалась в обездвиживании мышей линии CDА, помещением их в специальные домики без фиксации конечносте! на 8 часов при комнатной температуре без еды и воды. Сеансы обездвижи вания проводили три дня подряд, после чего давали животным три дня от дохнуть. Через шесть дней после начала стрессорного цикла животных за бивали и из селезенки методом разделения центрифугированием в градиен те фиколл-верографин. получали Т-лймфоииты. Затем Т-Клетки Помещали i ростовую среду с добавлением ЯБС и ЯБМ и анализировали сПособност! белковых факторов стимулировать синтез мРНК ИЛ-2 в Т-лимфоцитах. ДЛ: выяснения физиологического действия ЯБС и ЯБМ на Т-лимфоциты животных подвергнутых стрессу, в качестве сравнительного контроля Т-клетки сти мулировали КонА+рИЛ-2. Параллельно анализировали способность к синтез; мРНК ИЛ-2 Т-лимфоцитов животных, не подвергавшихся стрессу.

Данные, представленные в разделе "Результаты Исследования", явля югся результатами 5-6 экспериментов, каждое определение Проводилось 3-4 повторах. Результаты Экспериментов обрабатывали с помощью методо вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-крите рию стьюдента или по непараметрическому критерию ВИлконсона для свя занных выборок. Во всех расчетах за достоверный Принимали 95% уровен значимости (Р<0,05) (Глотов И др., 1982). Графики и рисунки выполнен на IBM PC при помощи программы Harvard Graphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экстракты ядерных белков клеток селезенки и ткани головного мозг (ЯБС и ЯБМ) выделенные одинаковым способом, путем двукратного высали вания белков возрастающей концентрацией сульфата аммония содержали себе фракцию белков, растворимых В Воде и осадок, растворимый 0,1% ДДС-Na - 4 М мочевине. Электрофорез в 15% ПАЛГ - 0,1% ДДС-Na по казал присутствие ряда белков в ядерных экстрактах клеток селезенки мозговой ткани. Оказалось, что водная фракция И фракция, растворимая 0,IX ДДС-Na - 4М мочевине, содержат одинаковые по молекулярный масса белки, но водный экстракт содержал их В меньшем количестве.

FPLC селезеночного ядерного экстракта вели по трем параметрам наличию пептидной связи (УФ-аналиэ, длина Волны 214 нм) и по содержа нию триптофана и тирозина (измерение при 285/335НМ и при 223/240км соответственно). Измерение поглощения на длине волны 285/3.15 нм выяви ло в экстракте ЯБМ четыре группы белков, обладающих высоким содержаки ем триптофана. Наиболее выраженные пики по поглощению наблюдались н 21, 23, 25-27 и 30-32 минутах элюции, что соответствовало молекулярны

массам белков 66 кДа, 23-30 кДа 8-16 кДа и <5 кДэ (Рис. 1). Эти Фракции белков были лиофилиэированы и взяты для дальнейшего анализа. Их обозначения: Ф1, 92, 43 и Ф4 соответственно.

Электрофорез В 15* ПААГ с ОД* ДДС-Na экстрактов ядерных белков селезенки и ткани Головного мозга, при нанесении белков-маркеров с сопоставимыми молекулярными массами, позволил уточнить молекулярные массы белкой в составе ЯБС И ЯБМ (Рис. 2). Так в состав ЯБС входят поли-пепгиды с молекулярными массами 11, 13,5, 18, 19 и 43 кДа. ябм представлены более широким спектром белков До нескольких сот килодальтон. Наиболее выраженные Полосы соответствуют поЛипептидам с молекулярными массами 13,5, 18, 19, 37, 49 и 75 кДа. Нельзя не отметить тот факт, что в составе экстрактов ЯБС и ЯБМ имеются белки с одинаковыми молекулярными массами Í3.5, 1Й, 19 кДа и около 50 кДа. Не исключена возможность Tofo, Что эти белкй являются идентичными для ЯБС и ЯБМ. Некоторое несовпадение молекулярных масс полипептидов, выявляемых двумя методами: хроматографическим И электрофоретическим, можно объяснить различной разрешающей способностью этих методов И различной степенью погрешности определения молекулярных насс. Тем не Менее молекулярные массы полипептидов в обоих случаях достаточно близки (8-16 кДа фз и 11-19 кДа для ЯБС). близость значений молекулярных масс и способность проявлять транс-активирующие свойства, как было показано нами в дальнейших экспериментах, Позволяет полагать, Что белки фракции фз и белки 11-19 КДа являются одними И теми же белками.

В лаборатории Д.х.н. Т,В.Овчинниковой Института биопрганнческоп химий РАН (Москва) Проведен Н-коНцевой сиквеис белков, входящих в состав ЯБС. определена начальная последовательность аминокислот и проведен компьютерный поИсК В библиотеке белков известной структуры с целью выявления гомологичных аминокислотных последовательностей. У белков с молекулярной Массой 19 И 13,5 кДа N-концевая аминокислотная последовательность имеет следующий состав: Pro-Glu-Pra-Ala-Gln-Ser-Ala-Pro-AIa--Pro. На пятом шаге наряду с глутамином обнаружен лизин, при этом последовательность первых аминокислот белков 19 и 13,5 кДа выглядит как Pro-Clu-Pro-Ala-Lys-Ser-АJa-Pro-Ala-Pro. Приведенные аминокислотные последовательности имеют 70-90% гомологию с начальными последовательностями гистона Н2В, ■ принадлежащего различным видам млекопитающих (е том числе и человеку), а также птицам и низшим эуКариотам. В число белков с молекулярной массой 13,5 КДа,. как было установлено,, входит и минорный компонент - полипептид, N-концевая последовательность которого имеет вид: Leu-Asp-Ileu-Ileu-Lys. Для белка в 18 кДа N-концевая последовательность соответствует: Ala-Ala-Pro-Pro-X-Ala-Pro-Thr-Gly. Данная аминокислотная последовательность (70% Гомология) содержится в гистоне Н3 челобека и других.млекопитающих, а также дрожжей, однако ее Положение связано не с первой, как в случае ЯБС, а с 25-ой аминокислотой с N-конца белка. В составе белков с молекулярной насссй 18 кДа также имеется минорный полипептид. Для него N-концевая аминокислотная

Рис. 1. Разделение белков ядерных экстрактов клеток селезенки иммунизированных крыс методом РР1,С. Профиль изменения величины поглощения при длине волны 285/335 нм. Цифры над кривой обозначают время выхода пика.

4

Рис. 2. Диск-электрофорез препаратов ЯБМ и ЯБС иммунизированных крыс в 15% ПААГ с 0,1« ДДС-Ыа (ЬаептН, 1570).

1,4 - белки-маркеры: БСА - 67 кДа,

овальбумин - 4 5 кДа,

химотрипсиноген А - 25-кДа, миоглобин лошади - 17,в кДА, РНКаза - 13,5 кДа;

2 - ЯБМ;

3 - ЯБС.

оследовательность с трудом поддается расшифровке, установлено только етыра аминокислоты, входящие в его состав: Iiau-Arg-X-Ileu-Glu. Сле-ует отметить, что Наблюдаемый процент гомологии между N-концевынн ослвдовательностями выделанных белков и гистонов Н2В и НЗ не достаго-;еН для Того, чтобы сделать вывод об идентичности ЯБС и гистонов. К ому же при Выделении белков 0,38 М ионная сила способна извлечь из :роматина только гистон Н1. Для коровыя гистонов необходима ионная си-ia 1 М и более, кроме того, ЯЕС и ЯБМ в отличие от Н1, оказывают сти-|улнрующий эффект На экспрессию мРНК И/1-2. Возможно, сходные аминокис-ютные nocflefloBateflbHocTM белков ЯБС и гистонов, являются сигналами 1ЛЯ Проникновение В ядро И связывания с ДНК. Таким образом, выделенные >елкИ, По-видимому, являются еще не идентифйцирванными полипептидами, :трухтурУ которых Предстоит установить.

На Первом этапе исследований тестировали Наличие активирующих :войстй ЯБС и ЯБМ в отношении экспрессии гена ИЛ-2 в Т-лимфоцитах. Бы-ю установлено, что ЯБМ И ЯБС оказывают комитогенное действие в реакции бласт-траноформации Т-лИмфоцитов. Дальнейшие исследования проводи-тись в направлении изучения механизмов этого воздействия.

ДЛЯ ответа на вопрос, действительно ли Изучаемые белки влияют на продукцию И/1-2, регулируя экспрессию его гена, анализировали воэмож-■юсТь взаимодействия ЯБМ и ЯБС с ПромоторНо-эяхансерНой областью гена •)Л-2. Способность белкой ядерного экстракта клеток селезенки и ткани головного мозга иммунизированных хрыс к связыванию со специфическими последовательностями Нуклеотидов в регуляторНЫх участках гена ИЛ-2 эценййали По образованию комплекса между ДНК гена НЛ-2 и белками ядерного экстракта. Для этого проводили предварительный электофореэ белков ядерных экс+рактов й 132 ПААГ - 0,1% ДДс-Na с Последующим Переносом на гжтроцелЛюлоЭНую мембрану (Hybohdc-Extra) методом электроблоттинга и инкубацию фильтра с меЧеНЫй фрагментом ДНК ПроМоТорной области генл ИЛ-2 человека.

инкубация ЯЁС, подвергнутых электрофорезу в ПААГ-ДДС-Ма и последующему переносу на митроцеллюлоэную мембрану, с меченой днк ИЛ-2 показала Наличие домйНаНТНой области связывания ДНК с полиг1ептидами в районе 11-Í9 кДа. Что Касается ЯЗМ, То с Промоторной областью гена ИЛ-2 связывались полипептиды с молекулярными массами 13,5, 18 и 19 кДа, аИало^йЧНЫМи ЯБС. Кроме того, в составе ЯПМ обнаружены полипептиды С молекулярными массами 28-35 кДа, 37-42 кДа, 48 кДа и 75 кДа, которые образовывали комплекс белок-ДНк при оптимальных условиях связывания (Рис. 3).

. Специфичность формирования комплекса ДНК-белок для ЯБС и ЯЕМ подтверждалась при внесении в гибридизационную смесь гетерологичной или гомологичной ДНК и Повышением концентраций соли. При этом 500-кратный избыток ДНК фага X и 0.5 М Nací полностью не дестабилизировали образования комплекса ДНК-белок для полипептидов ЯБС и ЯБМ 13,5, 18 и 19 кДа, в то время как введение 5-кратного избытка гомоло-

п

. г.

! » л

С

Л:

1

'I

67 КДа

4 5 КДа

ЗУ

¿я

1 2

* 17,8 КДа 13,5 КДа

«а»

й г

Г

Рис. з. Формирование комплексов ЯБС и ЯВИ с дигоксИГе-нин-дУТФ печеной ДНК промотора гена НЛ-2 человека.

1 - ЯБС,

2 - ЯБМ,

1,2 - перенос на мембрану, гибридизация с дигоксиге-нин-дУТФ меченой ДНК промотора гена ИЛ-2 человека, окрашивание методом иммунодетекции;

3 - белки-маркеры (перенос на мембрану, окраска амидочер-ным 10В).

Рис. 4. Формирование комплекса ЯБС с дистальным (1) и проксимальным (II) участками регуляторной области гена ИЛ-2 .

1.3 - ЯБС,

2.4 - гистон Н1.

гичной ДНК, содержащей промоторную область гена ИЛ-2, продемонстрировало конкурентоспособность намеченных фрагментов. Кроме этого, ЯБС содержат белки 11 кДа, а ЯБМ - белки 37 и 48 кДа, стабильно связывающиеся с ДНК при высокой ионной силе, и полипептид 75 кДа, способный образовывать прочные комплексы в присутствии избытка гетерологичной ЛНК фага X.

Дли уточнения локализации участков связывания ЯБС на промотор-но-знхансерной области Гена ИЛ-2 проводили расщепление Hindlll-фраг-мента ДНК ПлаэНиды pîL-2LUC, содержащего регуляторную область гена, pecTpHKtaaofl Hlnfl. В регуляторной области гена ИЛ-2 содержится только один сайт рестрикции Hlnfî (-141 п.н.). В результате рестрикции образуется Два фрагмента ДНК: проксимальный участок промотора (от +39 п.н. до -141 п.н.) и дистальный участок (от -142 п.н. до -548 п.н.). Сог-Ласйо литературным данным (Movak et al., 1990), оба эти участка способны формировать комплексы с регуляторными белками. Как видно из рис. 4, rMetoM III и ЯБС с молекулярной массой 13,5, 18 и 19 КДа образуют комплексы только с ДНК проксимального участка промотора, с дис-тальным участком связывается в крайне незначительной степени лишь гнс-тон Н1.

Представляло интерес посмотреть: сохраняется ли способность к формированию Комплекса ЯБС ri Ябм с проноторнымн последовательностями гана ИЛ-2 h условиях ih vivo, частично ответ на данный вопрос был получен В опытах с использованием модельной системы Т-клеток линии Jurkat, трансфецированных плазнидной ДНК pIL-2LUC.

Результаты этих опытов представлены на рис. 5. Оказалось, что добавление к Ourkat клеткам, трансфецированным плазмндой pIL-2LUC, тотальных ЯБН в количестве 0,6 нг/105 клеток весьма ощутимо сказывалось на экспрессии репортерНого гена. Зарегистрированные значения продукции тоциферазы в этом случае в 16 раз превышали таковые в контрольных опытах. Анализировалось tákwe действие фракций Я6С, Полученных в результате FPLc. При добавлении к Jurkat клеткам фракций Ф2 (23-30 кДа) и Ф4 (<5 кДа) транс-ак+ИВЙрувщего эффекта ЯБС не наблюдалось. Можно отметить даже некоторый негативный эффект оказываемый этими фракциями на продукцию люциферазы. В то же время при добавлении фракции чп (8-16 кДа) в количестве о,6 нг/lo5 клеток было отмечено значительное гранс-активирующее Действие белков данной фракции На экспрессию репор-герного ГеНа, превышающее контрольные значения более чеМ в 4 раза. Таким образом, как И в случае полученных ранее данных. Можно сделать вывод о том, что белки фракции Фз вносят максимальный вклад в транс-ак-гивирующее действие ЯБС, оказываемое на продукцию ИЛ-2 в Т-лИМфоцитах. 4зучалИ также влияние различных концентраций белков фракции ФЗ на про-цукцию репортерного гена LUC В трансфецированных плазМиДой pIL-2LUC Jurkat клетках. БЫло установлено', что фракция ФЗ в концентрации Э,003 нг/Ю5 клеток вызывала максимальную продукцию LUC, почти в 8 раз 1ревышающую контрольные значения.

Полученные данные могут свидетельствовать о том, что стимулирую-

С»»т. «д. хЮОО

Рис. 5. блияИйе ЯБС и ябМ на люциферазнуо активность Т-кЛеток пинии Эигка!, трансформированных ре-комбинантИой плаэмидой р1Ь-2^0с. По оси абсцисс: номер варианта Постановки опыта; По оси ординат: величина ЛюЦифераэНой активности, в световых единицах. 1 - НетраНсформИрованные клетки В отсутствие факторов ;

2-6 - клеткй, трансформированные рекомбинантной плаэмидой р'н,-2ШС:

2-е отсутствие факторов;

3-6 - в присутствии белковых факторов: 3-5 - ГРЬС-фракций ЯБС!

3 -

4 -

5 -

6 -

<Р2,

ф'з,

(0,6 НГ/10 (0,6 НГ/105

клеток), клеток),

Ч>4, (0,6 йг/Ю5 клеток), ЯБМ, (0,6 нг/Ю5 клеток).

щее воздействие анализируемых белков на транскрипцию гена LUC связано с активацией промоторного участка гена ИЛ-2. Возможно, этот процесс осуществляется за счет непосредственного взаимодействия белков с нук-леотидными последовательностями Гена, что предполагает наличие транс-факторных свойств ЯБЧ и ЯБС. Однако, не исключена и возможность белок-белкового опосредованного действия на экспрессию гена ИЛ-2.

Прямым доказательством влияния ЯБС и ЯБМ на экспрессию гена ИЛ-2 наряду с активацией промотора гена ИЛ-2 в модельной системе Jurkat клеток. Также служит стимулирующее действие белковых факторов на синтез мРНК ИЛ-2 в Т-лимфоцитах. Известно, что в покоящихся Т-лимфоцитах ген ИЛ-2 неактивен и только стимуляция клеток лектинами и/или форболо-выми эфирами In vitro приводит к продукции ИЛ-2 (Kroemer et al., 1991). При этом максимальный синтез мРНК ИЛ-2 наблюдается через 4-6 часов после начала Инкубации стимулированых клеток (Efrat it Kaempfer, 1984).

Полученные методом dot-гчбридиэации ИЛ-2 кДНК - ИЛ-2 мРНК результаты показывают, что при оптимальном сроке инкубации Т-лимфоцитоп (6 часов), белковые факторы из ядер клеток селезенки и ткани головного мозга оказывают существенное влияние на стимуляцию синтеза мРНК ил-2. При сравнении действия тотальных ЯБС и ЯБМ с индукцией синтеза ил-2 лектинами И форболозым эфиром следует отметить, что ЯБМ в концентрации 1 мкг/мл вызывали эффект того же порядка, а ЯБС в концентрации 1 мкг/Мл превышали эффект, производимый КонА. При стимуляции Т-лимфо-цитов КонА, содержание МРНК ИЛ-2 в 2,8 раза превышало контрольные значения. Эффект, Производимый ЯБС и ЯБМ был соответственно в 3,7 и 2,3 раза Выше, чем В контроле. Это ооставляло 13 2% (для ЯБС) и 82% (для ЯБМ) уровня содержания мРНК ИЛ-2, . стимулированной КонА. При стимуляции Т-лимфоцитоВ одновременно белковыми факторами и лектинами с ТРА наблюдался синергизм действия белковых факторов и киТогенов. По-видимому, мйтоГены и белковые факторы выполняют коактивирующую функцию по отношению к Т-клетке, при этом не исключена возможность, что их действие реализуется при участии различных сигнальных путей.

В следующей серии опытов мы попытались установить величины концентраций ЯБС й ЯБМ, при которых изучаемые белки оказывают максимальный эффект. Т-лимфоцигы инкубировали с ЯБС или ЯБМ, без дополнительной стимуляции их КонА или ФГА+ТРА. Было отмечено, что ЯБС способны оказывать более сильный активирующий эффект на Т-клетки по сравнению с таковым ЯБМ, причем их действие стабильно наблюдалось при более низких концентрациях белков В ростовой среде Т-лимфоцитов (до 1 пг/мл/Ю6 клеток), оптимальная концентрация белка, стимулирующая максимальный синтез мРНК ИЛ-2 составляла 0,1 нг/мл/106 кЛеток для ЯБС и 10 нг/мл/106 клеток для ЯБМ. То, что концентрация ЯБМ, вызывающая аналогичный действию ЯБС физиологический эффект, на два Порядка превышает концентрацию ЯБС можно объяснить содержанием в препарате ЯБМ более широкого спектра белков. При этом равновероятны две ситуации: а) каждый

из белков ЯБМ способен оказывать активирующее действие и может конкурировать с остальными; б) ощутимое стимулирующее действие оказывае1 только один или ограниченное число белков, но при этой его (их) относительная концентрация В белковом экстракте не достаточно велика.

Сравнивая результаты, полученные в предыдущих экспериментах, с данными представленной серии опытов, нельзя не отметить, что стимулирующий эффект ЯБС и ЯБМ на синтез мРНК оказывается обращенным по сравнению с их активирующим воздействием на промотор гена ИЛ-2 в экспериментах на модельной системе Т-клеток линии Ourkat. Тотальные ЯБС оказываются более нощныНИ активаторами синтеза мРНК ИЛ-2 в Т-лимфоцитах, чем тотальные ЯБМ. Возможно, это является следствием внесения большие количеств белковых экстрактов, г.к. было показано, что ЯБС действуют с Меньших концентрациях, чем ЯБМ.

Таким образом, оптимальные значения концентраций ЯБС и ЯБМ, вызывающие максимальную активацию синтеза ИЛ-2 мРНК лежат в пределах 01 10 нг/мл до 0,1 нг/мл. В дальнейших опытах использовали именно эти величины концентраций ЯБС и ЯБМ.

Для уточнения Путей передачи сигнала от белковых факторов, содержащихся в экстрактах ЯБС и ЯБМ в ядро, мы провели серию опытов по анализу продукции МРНК ИЛ-2 Т-лиМфоЦитамН в случае, когда наряду с белковыми факторами В инкубационную среду вносился циклоспорин A (CsA). CsA, являясь цитостатИком, относится к чйслу иммунодепрессантов, используемых в клинике, как было установлено в опытах in vitro, CsA подавляет продукцию ИЛ-2 На этапе регуляции экспрессии гена и синтезе мРНК ИЛ-2 (Nordmann et al., 1989; Elliot et al. , 1984). Из литературь известно, что CsA оказывает Мощное Не(-атиВНое действие на траНс-факто]: NF-AT, препятствуя его перемещению В ядро (Flanagan et al., 1991). Также было показано, что этот иммунодепрессант подавляет транскрипцик МРНК ИЛ-2, ослабляя активность некоторых других факторов (например, АР-1 и его компонентов с-Эуп и c-Fos) (Ullman et al., 1993; Garrity et al., 1994).

В контрольных экспериментах при активации Т-лимфоцито1 КонА+рИЛ-2, было усГановЛено, что CsA практически полностью (на 94,б%] подавлял синтез мРНк ИЛ-2. В то же время стимулирующее действие ЯБС i ЯБМ лишь частично блокировалось циклоспорином А (РИс. 6).

При введении CsA одновременно с ЯБС наблюдалось снижение содержания мРНК примерно в 2 рйэа, а именно: на 54,5% (при.коНц. 10 нг/мл) ^ на 56,15$ (при конц. 0,1 нг/мл). На действие ЯБМ CsA влиял в несколькс большей степени, уровень содержания мРНК ИЛ-2 снижался на 78,5% (npi конц. 10 нг/мл) и на 6.4, 3SJ (при конц. 0,1 нг/мл). Если сравнить полученные Данные с результатом действия CsA в присутствии КонА+рИЛ-2, тс видно, что белковые транс-факторы, особенно ЯБС, обладают иимунопро-тективными свойствами. Так результат действия ЯБС в присутствии Cs/ был в 5 раз (при конц. 10 нг/мл) и в 12,5 раз (при конц. 0,1 нг/мл) выше, чем В случае добавления в.инкубационную среду KonAlplUI-2+CsA.

мРНК

ил-2 Отп. опт. «д.

8Ш Норна СИ] С/А ЕШ Стресс

Рис. 6. Влияние ЯБс и ЯБМ на содержание мРНК ИЛ-2 в 1-лИнфоцитах селезенки ниши при ИММуносупрессии, вызванной Инмобилиэационным стрессом или действиен циклоспорина А (СаА). По оси абсцисс: номер варианта постановки опыта; по оси ординат: содержание мРНК ИЛ-2 в Т-лимфоцитах.

1 - инкубация клеток В среде без добавок;

2-6 - инкубация клеток в присутствии:

2 - КонА+рИЛ-2:

3 - ЯБС, (10 нг/мл);

4 - Ябс, (0,1 нг/мл);

5 - ЯБМ, (10 нг/мл);

6 - Я6М, (0,1 нг/мл).

Факторы ЯБМ также в присутствии CsA поддерживали синтез мРНК ИЛ-2. Уровень содержания кРНК ИЛ-2 был в 3 раза (при коиц. 10 нг/мл) и в 2,5 раза (при конц. 0,1 нг/нл) выше по сравнению с таковым в случае КонА+рИЛ-2+СвА. Следует отметить, что наиболее сильный эффект проявляли ЯБС в концентрации 0,1 нг/мл. Содержание МРНК ИЛ-2 в присутствии CsA и ЯБС в концентрации 0,1 нг/мл превышало таковое при стимуляции Т-лимфоцитов ЯБС в концентрации 10 нг/мл в отсутствие CsA.

Таким образом, результаты данных опытов позволили установить, что ЯБМ и ЯБС способны ослаблять иммуносупрессирующее действие CsA в культуре т-лимфоцитой in vitro.

Так как иммуносупрессирующее действие CsA связано с Саг+-зависимым путем передачи информационного сигнала в лимфоидной клетке, то представляло интерес проследить роль иных механизмов трансдукции сигнала в реализации трайс-факторных функций ЯБС и ЯБМ.

В следующей серии экспериментов изучали изменение уровня содержания мРНК ЙЛ-2 в Т-лИмфоцитах животных, подвергнутых иммобилизационнону стрессу и эффективность действия ЯБС и ЯБМ на этот процесс.

Из литературы иэвестйо, что стресс оказывает негативное действие на иммунный ответ клеточного типа (Sheridan et al., 1991) в целом, ^ на продукцию ИЛ-2, В частности (Glaser et al., 1990). Было показано, что стресс влияет в большей степени на функцию 1hl, производящих ИЛ-; (Mosmann et al., 1989). Одной из причин угнетения функций иммунно( системы при стрессе считают повышенный уровень глюкокортикоидных гормонов (Корнева и Шхйнек, 1988). В ряде работ было установлено,, чтс глюкокортикоиды Ингибируют продукцию ИЛ-2 в лимфоцитах селезенки и периферической крови (Gill is et al., 1979, Crabtree et al., 1980, Ary; et al., 1984, Grabstein et al., 1986) а также клеточных линий Ourkai (Vacca et al., 1990) и LBRM-33 клон 4A2 (Sorg et al., 1989). В даль иейшем выяснилось, что Глюкокортикоиды блокируют синтез мРНК ИЛ-2 влияя на активность белковых транс-факторов, которые регулируют экс прессию гена, связываясь с промоторно-энхансерной областью (Vacca е al. , 1992). В модельной системе Т клеток линии Ourkat было показано что глюкокортикоиды препятствуют связыванию транс-факторов АР-1 NF-AT с соответствующими специфическими сайтами промотора гена ИЛ-2 При этом основная мишень для глюкокортикоидов - фактор АР-(Paliogianni et al., 1993).

В ответ на стимуляцию КонА+рИЛ-2 происходило заметное снижени содержания мРНК ИЛ-2 при стрессе по сравнению с нормой (на 29,7%). По добная же ситуация наблюдалась и при активации экспрессии гена ИЛ-белкоЕЫМи факторами клеток селезенки и ткани головного мозга (Рис. б) Однако, следует отметить, что снижение содержания мРНК в случае ЯБ было более значительным, чем в случае стимуляции КонА+рИЛ-2. Стрес снижал активирующее действие ЯБС на 40,9% (при конц. 10 нг/мл) и н 49,1% (при конц. 0,1 нг/мл). В то же время, уровень содержания мРН ИЛ-2 при действии ЯБМ снижался на 21,4%, (при конц. Юнг/мл) и всего и

4.2SS (при конц. 0,1 нг/мл). Сравнивая эти значения с величинами содержания мРНК ИЛ-2 при стинуляции КонА+рИЛ-2 в условиях стресса, нельзя не отнетить, что ЯБМ способны оказывать определенный положительный эффект, снижая падение уровня содержания нРНК ИЛ-2 в условиях стресса.

В следующей серии опытов было показано, что стресс усугубляет действие циклоспорина А. Если в норме, как при стимуляции Т-линфоцитов КонА+рИЛ-2, так и при добавлении ЯБС или ЯБМ в присутствии CsA в ростовой среде, наблюдалось снижение уровня содержания мРНК ИЛ-2 в Т-лим-фоцитах, то после иммобилизационного стресса в присутствии CsA синтез мРНК в Т-лимфоцитах in vitro подавлйлся практически полностью. Таким образом, комбинация иммуносупресии, вызванной стрессом с таковой, обусловленной CSA, приводит к суммированию эффектов подавления экспре-сии гена ИЛ-2.

Полученные результаты свидетельствуют о различии молекулярных механизмов действия цитостатика и стрессорного воздействия на лимфоидную клетку и, соответственно, о различии путей реализации сигналов от ЯБС и ЯБМ на генном уровне.

В экспериментах по распределению лимфоидных клеток различного происхождения в двухфазовой водной полимерной системе нами было показано, что ядерные белки, добавленные к инкубационной среде, меняют конформацию белков клеточной поверхности линфоцитов (в зависимости от происхождения последних) и их распределение в той или иной фазе среды. Данный факт свидетельствует в пользу того, что Т-лимфоциты имеют на поверхности нембраны рецепторные структуры, способные взаимодействовать с ядерными белками.

Полученные данные позволяют предложить несколько гипотез о механизме действия факторов в составе ЯБС и ЯБМ.

Способность изучаемых белков связываться с нуклеотидными последовательностями промоторно-энхансерной области гена ИЛ-2 и продукция лю-диферазы в 3urkat клетках наряду- со свойствами ЯБМ и ЯБС изменять конформацию белков клеточной мембраны Т-лимфоцитов побуждает нас сделать эывод о проникновении белковых факторов в ядро и непосредственной участии их в сборке инициирующего белкового транскрипционного комплек-:а на ДНК. В подтверждение этой гипотезы можно привести литературные занные о том, что ростовые факторы (FGF-1, FGF-2, SDGF) и некоторые фугие транс-факторы интернализуются в ядро, в результате чего они мо--ут участвовать в регуляции транскрипции гена (Roux et al., 1993; )erossi et al., 1994; Prochiantz !< Theodore, 1995).

На наш взгляд иная ситуация, когда факторы ЯБС и ЯБМ оказывают (ктивирующее действие, связываясь со специфическими рецепторами кле-■очной поверхности, но не проникают внутрь, а лишь, как антиген, затекают в клетке каскад биохимических реакций, приводящих к экспрессии ена ИЛ-2, менее обоснована.

Скорее всего, исследованные факторы влияют на регуляцию транс-рипции ИЛ-2 после интернализации лиганд-рецепторного комплекса в ци-

топлазму, вступая во взаимодействие с цитоплаэматическими компонентами белковых транс-активирующих комплексов, Аргументом в пользу данного предположения могут служить опыты по активации экспрессии гена ИЛ-2 в Т-лимфоцитах белковыми факторами на фоне внесения В ростовую среду СвА.

Известно, что активация Т-клеточного рецептора ведет к повышению содержания ионов Са2 + в цитоплазме, что в свою очередь вызывает активацию Са2*-зависимой фосфатазы - кальцийнейрина и транспорт ЫГ-АТр/с из цитоплазмы в ядро. СвА блокирует активность кальцийнейрина и препятствует перемещении НГ-АТр/О в ядро и образованию белкового транскрипционного комплекса. Если бы ЯБС и ЯБМ действовали на ТКР как антигены, они бы вызывали выброс Са2* из внутриклеточных хранилищ, но не могли бы стимулировать активность ИГ-АТр/с. Способность ЯБС и ЯБМ поддерживать синтез мРНК ИЛ-2 в присутствии СвА может служить косвенным доказательством проникновения ЯБС и ЯБМ через плазматическую мембрану.

Из литературы известно, что в активации Т-лимфоцитов и стимуляции синтеза ИЛ-2 участвуют два основных пути: протеинкиназный и Саг*-зависимый. результаты экспериментов по изучению иммуносупрессии, вызванной иммобилизационным стрессом и действием СзА, позволили предпложить, что подавление иммунного ответа в каждом случае происходит с участием различных механизмов передачи трансмембранного сигнала при активации Т-лимфоцитов, в каждом из которых активируются специфические транс-факторы - регуляторы экспресии гена ИЛ-2. Подтверждением этого может служить тот факт, что при комбинированной иммуносупресии, вызванной иммобилизационным стрессом и действием СбА, происходит полное подавление синтеза мРНК ИЛ-2 как в случае актИЕации КонА+рИЛ-2, так и в ответ на стимуляцию ЯБС или ЯБМ.

Вышеизложенные результаты позволяют заключить, что в экстрактах ЯБС и ЯБМ содержатся белки, регулирующие активность тканеспецифическо-го транс-фактора ИГ-АТ, состоящего из полипептидов, активация которых индуцируется как Са2+-зависимым (для НР-АТр/с), так и протеинкиназнын (для с-Зип и с-Коб) путем. При этом действие оказывается как на транслокацию тканеспецифической субъединицы ЫГ-АТс в ядро, так и на ядерные полипептиды с-Оип И с-Го5, которые являются также компонентами универсального транс-фактора АР-1. Являются ли полипептиды ЯБС и ЯБМ фрагментами белков семейства Зип и Гоэ или другими белками-активаторами транс-факторов ЫГ-АТ и АР-1, может быть установлено при определении полной аминокислотной последовательности выделенных полипептидов.

Полученные в результате исследований данные подтверждают высказанное нами предположение о существовании общих для нервной и иммунной систем механизмов регуляции экспрессии гена интерлейкина-2 на уровне ядерных белковых трансактивирующих факторов. В настоящей работе показано влияние не только ЯБС, но и ЯБМ на экспрессию гена ИЛ-2 в Т-лимфоцитах. В дальнейшем несомненный интерес будет представлять изучение регуляции экспрессии гена ИЛ-2 в клетках ЦНС.

ВЫВОДЫ:

1. Из ядер клеток селезенки и ткани голоаного мозга имнунизнро-ванных крыс выделены белки (ЯБС и ЯБМ) и показано присутствие общих для иммунокомпетентных и нервных клеток белковых факторов с молекулярными массами 13.5, 18 и 19 кДа, взаимодействующих с промоторно-знхан-серной областью гена ИЛ-2. С регуляторной областью гена ИЛ-2 связываются Также белки 11' кДа ЯБС И 37, 48, 75 КДа ЯБМ.

2. Установлено специфическое связывание белков 13,5, 1В и 19 кДа ЯБС с проксимальным фрагментом промоторно-энхансерной области от -141 п.Н. до +39 п.и. гена ИЛ-2 человека.

3. Показано активирующее Действие ЯБС и ЯБМ на промотор гена ИЛ-2 в модельной системе Т-лИмфоцитов (линия ЗигкаЬ), трансформированных рекомбинантной ДЙК р!Ь-2ШС.

4. Методом ¿оЪ-гибридиэации выявлено стимулирующее влияние ЯБС и ЯБМ на экспрессию гена ИЛ-2 в культуре Т-лимфоЦитов селезёнки ныши. Показана зависимость синтеза нРНК ИЛ-2, инициируемого белковыми факторами от концентрации белка и времени инкубации (максимальный уровень содержания мРНК ИЛ-2 при 10"® - Ю~10 г/106 клеток через б часов после начала инкубации).

5. В условиях иммуНосунрессии, вызванной циклоспорином А, добавление ЯБС и ЯБМ к культуре т-лнмфоцитов селезенки мыши почти на 40Х и более чем на 20Х, соответственно, снижает ингибирующий эффект цитоста-тика.

6. Применение модели иммобилизационн'ого стресса позволило установить., что в Т-лимфоцитах стрессированных животных снижается уровень содержания мРНК ИЛ-2 при стимуляции КонА+рИЛ-2 почти на ЗОХ. При этом ЯБМ в концентрации 0,1 нг/мл задерживают падение уровня содержания мРНК ИЛ-2 более чем На 25Х.

7. Комбинированная имнуносупрессия, вызванная иммобилизационным стрессом и воздействием СзА, приводит к полному подавлению синтеза мРНК ИЛ-2, в том числе и при внесении в инкубационную среду ЯБС или ЯБМ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Головко О.И. Роль ядерных белковых факторов в регуляции экспрессии гена интерлейкина-2 Т-лимфоцитами.// Тез. докл. конф. "Механизмы регуляции, физиологических функций", С-Петербург, '1992.- С.38,

2. Kazakova Т., Golovko О., Mulberg A. Molecular mechanisms of neuroimmune interactions.// In abstr. of Baltic Sea Conference on Psychosomatics and Psychotherapy, Kiel, Germany, 1992.- 1-151,- FI.-P.118.

3. Kazakova T.B., Golovko O.I., Gushchin G.V., Lebedeva L.V., Dolgi O.D., Karandaschev E.A., Mulberg A.A. Transactivation of

interleukin-2 gene via* the nuclear proteins from spleen and bra cells.// Biotechnology Therapeutics.- 1993.- V.4.- N.1J<2.- P.63-76.

4. Kazakova Т., Burov S., Golovko O., Gushchin G., Lebedeva L Rungger D.( Mulbarg A.A. Neuro-immune interactions on the level i 1L-2 gene.// In abstr. of 2nd Int. Congr. ISNIM, Paestum, Ital; 1993.- P.107.

5. Казакова Т.Е., Мюльберг Л.А., Буров С.в., Головко о.и., Гриш на Т.В., Карандашев Э.А., Шацкая Г.С. Нейроиммуные взаимодействия уровне гена ИЛ-2.// XX Всерос. Симп. по структуре и функциям клеточн» го ядра, С-Летербург, 1993.- Цитология.- 1993.- Т.35, N.10, с.75.

6. Kazakova Т.В., Golovko 0.1., Mulberg А.А.: Splenic and brail nuclear proteins as a signal carriers, acting on the gene level ai regulating the inmune functions.// Intensive Care Medicine.- 1994 V.20.- Si.- P.342.

7. Казакова Т.Б., Гришина Т.В., Головко о.И., Гущин Г.В., Мюль-берг А.А. Активация транскрипции гена интерлейкина-2 ядерными факторг ми селезенки и мозга иммунизированных крыс.// Вюлл. эксп. биол. мед.- 1994.- Т.117.- N.5.- С.523-526.

8. Korneva Е., Kazakova Т., Bichkov Е., Goldvko о. Neurochemical processes in the brain after immunization., Pathophysiology.- 1994.- V.I.- S.November.- P.101..

9. Kazakova Т., Burov S., Golovko O., Grishina Т., Lebedeva L. Mulberg A., Novikova N., Perevozchicov A. Role of protein and peptit immunomodulators in the regulation of interleukin-2 gene activity.; In abstr. of 6-th INWIN, Geneva, Switzerland, 1995.- P.29.

10. Golovko O.X., Lebedeva L.V., Novikova N.S., Grishina T.V Mulberg A.A., Kazakova T.B. Trans-activation functions of nuclei proteins from spleen and brain cells of immunized rats.// In abstr. с Environmental Pollution (ICEP'95) and Neuroimmuno Interactions ai Enviroment (ICONE'95), St.Peterburg, Russia, 1995.- P.112.

11. Гришина T.B., Головко О.И. Активация транскрипции гена инте) лейкина-2 белковыми факторами из ядер клеток головного мозга иммуниз! рованных крыс.// Тез. докл. конф. молодых физиологов и биохимиков Pot сии "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функцш С-Г1етербурГ, 1995.- С.54.

Тип-tbHWfay № }$ - ¡Г,.