Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в клетках головного мозга и селезенки при стрессорных воздействиях

Барабанова, Светлана Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в клетках головного мозга и селезенки при стрессорных воздействиях
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в клетках головного мозга и селезенки при стрессорных воздействиях"

На правах рукописи

БАРАБАНОВА Светлана Владимировна

РГБ ОД

* о ¿ар ш

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ С-РОБ И ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА И СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ СТРЕССОРНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

03.00.04-биохимия

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000 С;

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патологической физиологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик РАМН Б.И. Ткаченко)

Научные руководители:

академик РАМН, профессор £.А. Корнева

доктор биологических наук Т.Б. Казакова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н.Н. Петрищев доктор биологических наук, Л.В. Пучкова

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Институт Цитологии РАН.

Защита диссертации состоится " с?О " д^Л/^С/ 2000 г. в

_часов на заседании Диссертационного Совета К001.23.01. по

защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, 197376, ул. акад. Павлова, 12)

Ученый секретарь

Диссертационного Совета К001.23.01. доктор биологических наук

О.Г. Куликова

ЕУМ. Я, 0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему моменту модулирующее влияние центральной нервной системы (ЦНС) на иммунную выявлено при всех известных формах иммунного реагирования организма (синтез антител, отторжение чужеродного трансплантата, противоопухолевая резистентность, аллергические реакции). Показано участие ЦНС в регуляции различных звеньев иммуногенеза (фагоцитоз, пролиферация и дифференцировка лимфовдных клеток, активность клеток-эффекторов иммунных реакций, миграция клеточных элементов иммунной системы) (Корнева и др., 1978; 1993; и др.). Тем не менее, механизмы нейрогуморального воздействия на иммунную систему и иммунной системы на нервную не только при действии различных стимулов, в частности стресса, но и в норме, изучены далеко не исчерпывающе.

Большое значение в такого рода исследованиях имеет совершенствование методических подходов. Появление

высокочувствительных специфических методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа и применение их в сочетании с гистохимическими и нммунохимическими методами исследования позволило подойти к изучению механизмов нейроиммуномодуляции на генном уровне. Мишенью для такого рода исследований могут служить гены немедленного и раннего ответа, экспрессирующиеся в нервных или иммунокомпетентных клетках. Изменение интенсивности их экспрессии при действии внешних стимулов позволяет оценивать изменение функциональной активности клеток в ходе развития реакции на определенные стимулы.

Фундаментальной основой такого рода исследований является доказанное ранее положение, согласно которому клетки, участвующие в формировании ответа на примененный внешний стимул, усиливают или уменьшают экспрессию соответствующих генов, что необходимо для компенсации возникающих изменений гомеостаза (Du Bow, 1998). Определение генетически запрограммированного ответа, поиск соответствующих маркеров, позволяющих регистрировать изменения метаболизма клетки на ранних стадиях реакции на стимуляцию и исследование экспрессии соответствующих генов создает основу для выяснения механизмов реализации влияния стресса на функции определенных клеток.

Признанным маркером активации нейрональных клеток является продукт гена немедленного ответа - протоонкогена c-fos, - c-Fos белок (Bullitt, 1990), выполняющий функцию ретулятора транскрипции ряда

индуцибельных генов и играющий существенную роль в процессах клеточного роста и дифференцирован (Heuer et al., 1996).

Примером индуцибельного гена раннего ответа, кодирующего структуру одного из ключевых медиаторов иммунной системы, может служить ген интерлейкина 2 (ИЛ-2). ИЛ-2 является одним из важнейших цитокинов, обеспечивающих контроль над процессами пролиферации и дифференцировки Т-зависнмых иммунокомпетентных клеток, и синтезируется Т лимфоцитами - хелперами под действием митогенов, интерлейкина-lß (ИЛ-lß) и некоторых других агентов. Существует большой объем литературы, посвященной проблеме регуляции активности гена ИЛ-2 специфическими белковыми транс-факгорами (Aiya et al., 1984; Novak et al., 1990; Granelli-Kpemo& McHugh, 1991; Tu & Anders, 1997). К числу трансфакторов гена ИЛ-2 относится и белок c-Fos. Так, известно, что белок c-Fos (вместе с другими представителями семейства Fos) в комплексе с продуктами других протоонкогенов семейства Jun входит в состав транскрипционных факторов АР-1 и NF-AT, которые регулируют активность ряда индуцибельных генов, в том числе и гена ИЛ-2 (Vacca et al., 1992; Garrity et al., 1994; Whisler et al., 1997).

В настоящее время присутствие ИЛ-2 было обнаружено не только в лимфоцитах, но и в клетках ЦНС - олигодендроглие, астроцитах и нейронах (Rabber & Blom, 1994; Ram et al.,1994, Sei et al., 1995 и др.). Следовательно, можно предположить, что ИЛ-2 может участвовать в механизмах активации не только иммунокомпетентных, но и нервных клеток (Goetz, 1998).

Существует значительное количество данных, свидетельствующих об изменении интенсивности экспрессии гена c-fos в ответ на неантигенные стимулы (Hunt et al., 1987; Bullitt et al., 1992, Honkaniemi, 1992, Lee & Beitz, 1993) и роли синалтической активности в синтезе иммунореактивного c-Fos белка (Morgan & Cuiran, 1986). Т.е. передача информационного сигнала может осуществляться через нервные пути и сигнал может поступать в мозг в очень короткие сроки (Gaykema et al., 1998) после определенного воздействия.

Однако, несмотря на интенсивные исследования физиологических и биохимических механизмов реализации реакций клеток ЦНС на неантигенные воздействия, в том числе, и стресс-ицдуцирующие, интенсивность экспрессии гена c-fos в иммунокомпетентных клетках и гена ИЛ-2 в клетках ЦНС при стрессорном воздействии практически не изучена. Решение данных вопросов представляется актуальным для фундаментальной науки и налрвлено на раскрытие молекулярно-генетических механизмов реализации реакций нервной и иммунной систем на стресс и механизмов нейроиммуного взаимодействия.

Цель данной работы заключалась в изучении молекулярных механизмов реализации реакции организма на стрессорное воздействие на генном уровне, а именно в сочетанном исследовании экспрессии генов немедленного и раннего ответа - гена с-йзб и гена ИЛ-2 - в клетках иммунной и нервной систем и выявлении структур головного мозга, реализующих реакцию на конкретные виды стресса.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1.Исследовать экспрессию генов с-Гоб и ИЛ- 2 в лимфоцитах селезенки мышей после ротационного стресса по синтезу с-К^ мРНК и ИЛ-2 мРНК

2.Исследовать экспрессию генов с-й^ и ИЛ-2 в клетках головного мозга крыс после ротационнго стресса по синтезу с-Гоб мРНК и ИЛ-2 мРНК

3.Изучить влияние болевого и комплексного стрессорного воздействия на синтез с-йэб мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга крыс.

4.Провести анализ синтеза с-РоБ-подобного белка в клетках головного мозга крыс после болевого и комплексного стрессорного воздействия.

5.Провести анализ синтеза ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей после болевого и комплексного стрессорного воздействия.

б.Охаракгеризовать влияние ИЛ-1(3 на синтез ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей.

Научная новизна работы. Впервые по экспрессии генов немедленного и раннего ответа: с-й« и ИЛ-2 выявлены структуры головного мозга крыс, активирующиеся после стресс-индуцирующих воздействий (ротационный стресс, болевые раздражители), и установлено время их активации. Показана одновременная индукция экспрессии исследуемых генов в лимфоцитах селезенки и ЦНС под воздействием стрессорных стимулов.

Функциональные изменения, протекающие в клетках НС и ИС на генном уровне, могут иметь значение в процессе реализации стресс индуцируемых воздействий на защитные функции организма.

Таким образом, впервые, по экспрессии генов немедленного и раннего ответа, под влиянием стимулов неантигенной (стрессорной) природы, инициирующих развитие стресса, проведено исследование молекулярно-биологических основ реализации взаимодействия нервной и иммунной систем.

Научно-практическое значение. Работа является

экспериментальным исследованием и важным этапом в развитии приоритетного направления по изучению механизмов реализации стресс-реакции на уровне экспрессии генов немедленного и раннего ответа в клетках ЦНС и иммунной системы, что дает возможность также анализировать механизмы взаимодействия НС и ИС на генном уровне. Результаты исследований могут найти применение в научно-исследовательских лабораториях, работающих в данном направлении, в педагогической практике, а также при разработке терапевтических методов, связанных с повышенным содержанием ИЛ-2 в мозге.

Основные положения, выносимые на защиту.

¡.Ротационный стресс вызывает индукцию синтеза с-йзв мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки мышей.

2.Ротационный стресс вызывает индукцию синтеза с^ов мРНК и ИЛ-2 мРНК в в определенных структурах головного мозга крыс.

3.Раздражигели, содержащие болевой компонент: укол в икроножную мышцу задней ноги крысы, внутримышечная инъекция растительного масла или 5%-ного маслянного экстракта горчицы, индуцируют (в различной степени) синтез с-Яэб мРНК и ИЛ-2 мРНК в одних и тех же структурах головного мозга крысы, однако, ИЛ-2 мРНК синтезируется в более поздние сроки, нежели с-Гов мРНК.

4.Примененные болевые раздражители стимулируют синтез с-Еов-подобного белка в различных структурах головного мозга крысы в более поздние по сравнению с с-й« мРНК сроки.

5.Примененные болевые раздражители стимулируют синтез ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей через 24 часа после воздействия.

6.Инъекция нативного ИЛ-1 {3 приводит к повышению содержания ИЛ-2-подобного белка в определенных структурах головного мозга мышей через 24 часа после воздействия.

Апробация диссертации. Результаты диссертации изложены в 11 публикациях.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах, состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Методы исследования, Результаты исследования, Обсуждение результатов, Выводы. Список цитируемой литературы включает 209 источников. Диссертация содержит 3 таблицы и 17 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы: мыши (50) - самцы СВА; крысы (30) -самцы Wistar. Все животные получены из питомника "Рапполово" РАМН, г. Санкт-Петербург.

В качестве источника молекулярных зондов использовали рекомбинантные ДНК: pUC-v-fos (получена из лаборатории д.б.н. В.Поспелова, ИНЦ РАН) и рРЬ32-ИЛ-2 (сконструирована д.б.н. А.П. Перевозчиковым, отдел биохимии НИИЭМ РАМН). Трансформацию бактериальных клеток Escherichia coli плазмидной ДНК осуществляли с применением СаСЬ или элекгропорацией. Большие количества плазмвдной ДНК получали амплификацией в богатой среде с последующей очисткой равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием (Маниатис, 1984).

Необходимые фрагменты ДНК получали рестрицированием плазмиды pUC-v-fos по сайгам Pstl и плазмиды pPL32 по сайтам BamHI и SalGI. Выделение фрагментов кДНК проводили из легкоплавкой агарозы (фирмы Sigma). Фрагменты кДНК метили нерадиоактивной меткой, используя дигоксигениновый кит фирмы "Boehringer Mannheim" (Boehringer Mannheim, 1996).

В качестве стрессорных стимулов были выбраны: ротационный стресс, болевое воздействие - укол инъекционной иглой; и комплексные воздйствия: внутримышечная инъекция растительного масла в икроножную мышцу задней конечности; инъекция 5% масляного экстракта горчицы.

При ротационном стрессе животные подвергались вращению на ротационной установке со скоростью 78 об/мин (4 раза по 10 мин с 5-минутными перерывами).

Лимфоциты селезенки мышей линии СВА получали стандартным способом (Гущин, 1992).

Инкубацию выделенных лимфоцитов проводили при 37°С, в условиях 100% влажности, 5% С02 в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки быка, 10 mM HEPES, 2 мМ глутамина, 50 мМ 2ß-меркаптоэтанола, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина.

Вьщеление тотальной мРНК осуществляли методом Шомзинского и Сахи (Chomczyncki & Sacchi, 1987).

Содержание c-fos и ИЛ-2 мРНК определяли с помощью spot-гибридизации с^*кДНК-мРНК (Boehringer Mannheim, 1996).

Для выявления клеток, содержащих c-fos и ИЛ-2 мРНК, в структурах головного мозга крыс, использовали метод in situ гибридизации dig*ic/IHK-мРНК (Boehringer Mannheim, 1996). Срезы головного мозга (25 мкм толщиной) приготавливали на замораживающем микротоме. Dig*K,5HK-MPHK

комплексы выявляли при помощи реакции иммунодетекции с антителами против дигоксигенина. Число меченных клеток подсчитывали на единицу площади среза, используя микроскопическую стандартную сетку.

Клетки головного мозга крыс, продуцирующие c-Fos-подобные белки, выявляли стандартным гистохимическим методом (Bourne, 1983) с применением поликлональных антител к белкам семейства c-Fos (Santa-Cruz Biotech.Inc.).

Содержание ИЛ-2-подобного белка в тканях головного мозга мышей определяли с помощью InterTest Mouse IL-2 ELISA Kit (Genzyme).

Данные, представленные в разделе "Результаты исследования", являются результатами 4-5 экспериментов, каждое определение проводилось в 3-4 повторах. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-кригерию Стьюдента. Во всех расчетах за достоверный принимали 95% уровень значимости (Р<0,05).

Графики выполнены на IBM PC при помощи программы Origin, схемы головного мозга с помощью программы CorelDrow8 с использованием компьютерных карт Brain Maps (Swanson, 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в лимфоцитах селезенки мышей и клетках головного мозга крыс.

В данной серии экспериментов ставилась задача выявить на генном уровне реакцию лимфоцитов селезенки на неантигенный стимул, в частности, изучить влияние ротационного стресса на экспрессию двух генов немедленного (c-fos) и раннего (ИЛ-2) ответа. Известно, что продукт гена c-fos - c-Fos белок является признанным маркером активации нейрональных клеток и, одновременно, - транс-фактором, регулирующим экспрессию ряда индуцибельных генов, в том числе, и гена ИЛ-2 (Grabstein, 1986; OrlandM, 1996; Heuer, 1996). Вместе с тем, ИЛ-2 может, соответственно, служить функциональным маркером активации иммунной системы.

С целью изучения экспрессии протоонкогена c-fos и гена ИЛ-2 в условиях стимулирования функций иммунной системы, лимфоциты, выделенные в градиенте плотности фиколла, из селезенки мышей, подвергнутых ротационному стрессу, инкубировали 4 часа в отсутствии или присутствии митогена (Кон А+ рИЛ-2). Экспрессию генов оценивали по содержанию c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах с использованием соответствующих зондов методом spot-гибридизации мРНК-кДНК.

Проведенные нами эксперименты показали, что даже в отсутствии митогена КонА+рИЛ-2 количественное содержание с-Гоб мРНК в лимфоцитах достаточно для определения его методом БроЬгибридизации. В то же время, через 2 часа после ротационного стресса в лимфоцитах происходит повышение уровня с-Сэб мРНК по сравнению с контролем на 54% (Рис. 1).

При анализе экспрессии гена ИЛ-2 в лимфоцитах селезенки при стрессе, было показано, что в противоположность гену с-Гоэ, индукции синтеза ИЛ-2 мРНК не происходит без внесения в среду митогена КонА+рИЛ-2. Вместе с тем, на фоне стимулирования активности гена ИЛ-2 (КонА+рИЛ-2), ротационный стресс приводит к усилению индукции синтеза ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах. При этом, повышение содержания ИЛ-2 мРНК по сравнению с контролем, у мышей, подвергшихся ротационному стрессу, составляет 40% (Рис. 2).

Более высокие величины уровня синтеза ИЛ-2 мРНК в присутствии Кон А + рИЛ-2 при ротационном стрессе могли быть обусловлены костимулирующим действием ИЛ-1, синтез которого в лимфоцитах под влиянием ротационного стресса показан другими авторами (Когпеуа е1 а1., 1992).

Следующей задачей являлось проследить, какие изменения происходят под влиянием неантигенного стимула (ротационного стресса) не только в клетках иммунной системы, но и в клетках нервной системы. В частности, происходит ли экспрессия гена ИЛ-2 под действием стресса в головном мозгу, имеет ли место при этом корреляция процессов активации генов с-Аоб и ИЛ-2, какие структуры головного мозга реагируют на стресс изменением экспрессии этих генов. Для выяснения этих вопросов были проведены эксперименты по оценке экспрессии с-Гоэ мРНК и ИЛ-2 мРНК в различных структурах головного мозга крыс, подвергшихся ротационному стрессу.

Влияние ротационного стресса на экспрессию c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга крыс.

Влияние ротационного стресса на экспрессию c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК изучали в определенных структурах головного мозга крыс. Известно, что синтез c-fos мРНК начинается в нейрональной клетке уже через 5 минут после применения стимула, и достигает максимума к 90 минутам, после чего начинается снижение активности гена (Bullitt, 1990). Однако, через 2-4 часа экспрессия протоонкогена c-fos в активированной клетке еще продолжается. Вместе с тем, ИЛ-2 мРНК экспрессируется (как

■■ кснтрагъ шз стресс

Рис.1. Содержание с-1с« мРНК в лимфоцитах селезенки мышей в норме и через 2 часа после ротационного стресса (по результатам БроЬгибридизации). * - Р<0,05.

контроль !

tiiiiii контроль (KbHAt-Wl-iJ I

Ш& стресс (КонЛ-ИЛ-2) j

Рис.2. Содержание ИЛ-2 мРНК в стимулированных Кон-А+рИЛ-2 лимфоцитах селезенки мышей в норме и через 2 часа после ротационного стресса (по результатам зроЬгибридизации). * - Р<0,05.

это было показано на Г-лимфоцитах) (Muzaki et all., 1991), не ранее, чем чере: 2 часа после воздействия индуктора. Поэтому, для анализа синтеза мРНК того и другого гена в клетках головного мозга одного и того же животного, был выбран общий срок забора ткани и приготовления срезов, а именно, 1 часа после стрессорного воздействия. Содержание c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК i клетках определяли методом гибридизации in situ мРНК-кДНК на среза? головного мозга и подсчитывали количество меченых дигоксигенином (Dig' клеток, содержащих мРНК, на единицу площади (0.2 мм2 среза).

Анализ изменения экспрессии протонкогена с-Л« на уровне образования мРНК в клетках ткани головного мозга крыс при ротационном стрессе показал, что ротационный стресс повышает продукцию с-й^ мРНК в клетках таламуса, гипоталамуса и сенсо-моторной зоны коры мозга через 2 часа после воздействия. У интактных животных количество с-Го 5 мРНК содержащих клеток, во всех перечисленных структурах было различным, но более низким (единичные клетки) по сравнению со стрессированными животными. Ротационный стресс повышал количество содержащих с-Азв мРНК клеток в латеральном гипогаламическом поле (ЬНА), в 10 раз, в таламусе - в 4 раза и в сенсо-моторной зоне коры головного мозга - в 2,5 раза (Рис. 3).

Гипоталамус Сенсо-мотарная зона Таламус (LH/) коры

Рис.З. Количество клеток, продуцирующих c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК, в структурах головного мозга крыс через 2 часа после ротационного стресса (на единицу площади - 0,2 мм2). По результатам in situ гибридизации (dig*KflHK-MPHK). * - Р<0,05; **-Р<0,01

Параллельно в тех же структурах головного мозга исследовали экспрессию гена ИЛ-2 после ротационного стресса, при этом было показано, что содержание ИЛ-2 мРНК у контрольных животных, не подвергавшихся стрессорному воздействию, находится либо на крайне низком уровне (единичные клетки), либо мРНК вообще не обнаруживается. Наблюдалось повышение в 2-3 раза количества содержащих ИЛ-2 мРНК клеток во всех исследуемых структурах головного мозга через 2 часа после окончания ротационный стресса.

Сравнение полученных данных по анализу экспрессии гена c-fos и гена ИЛ-2 в клетках головного мозга крыс позволяет заключить, что количество клеток содержащих c-fos мРНК у контрольных животных значительно превышает содержание ИЛ-2 мРНК, и, что

стимулирующее влияние ротационного стресса более выражено в отношении активации экспрессии гена c-fos, чем экспрессии гена ИЛ-2.

Влияние болевых и комплексных стрессорных воздействий на экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в клетках спинного и головного мозга крыс.

Целью следующей серии экспериментов явился анализ экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 в различных структурах головного и спинного мозга крыс, получавших сгрессорные воздействия с болевым компонентом. В качестве стрессорных воздействий были выбраны: укол в икроножную мышцу задней конечности, имитирующий инъекцию, инъекция 5%-ного маслянного экстракта горчицы или растительного масла. В исследованиях Hunt et al. (1987) был использован сходный стимул (5% раствор горчицы на парафиновом масле) при анализе экспрессии c-Fos белка в клетках спинного мозга крыс. Подтверждение полученных им данных при отработке метода и исследование экспрессии генов немедленного и раннего ответа в клетках головного мозга крыс под влиянием болевых и комплексного (боль+химический агент) воздействий и обусловило выбор стрессорных агентов.

Небольшое количество единичных меченых клеток (c-fos мРНК-Dig-c-fos кДНК) было наццено в спинном и головном мозге (гипоталамусе, таламусе, хвостатом ядре (CaudN), амигдалоидном комплексе (Асе) и сенсомоторной зоне коры) ингактных животных, что соответствует данным литературы (Bullitt, 1990; Lee and Beitz, 1993).

Через 30 минут после болевого стимула (укол в икроножную мышцу правой задней ноги крысы) c-fos мРНК содержащие клетки были выявлены в крестцовых сегментах (L6, S-2) поверхностной пластинки серого вещества задних рогов спинного мозга. Экспрессия c-fos мРНК была отмечена и в головном мозге: в гиппокампе, паравентрикулярном ядре гипоталамуса (PVN), латеральном гипоталамическом поле (LHA), супрахиазматическом ядре гипоталамуса (SHN) и эпендиме III-его желудочка.

Инъекция растительного масла также стимулировала синтез c-fos мРНК (через 30 минут) в крестцовых сегментах (L6, S-2) поверхностной пластинки серого вещества задних рогов спинного мозга и меченые клетки обнаруживались в перечисленных выше структурах головного мозга, а также - в паравентрикулярном ядре таламуса PVT.

Тридцать минут спустя после инъекции масляного 5% экстракта горчицы синтез c-fos мРНК наблюдали в тех же структурах спинного мозга, что и при других воздействиях, а также - в гипоталамусе (PVN, дорсомедиальном ядре (DMN), LHA), таламусе, гиппокампе, сенсо-моторной зоне коры головного мозга, CaudN и Асе.

сенсомоторной зоне коры) интактных животных, что соответствует данным литературы (Bullitt, 1990; Lee and Beitz, 1993).

Для сравнения результатов, полученных при исследовании экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 через 2 часа после стрессорного воздействия были выбраны структуры головного мозга в диапазоне от -1,1 до -3,6 мм от Брегмы (NN 25,26, 27, соответственно стереотаксическому атласу головного мозга крысы Swanson, 1992). Выбор был обусловлен тем, что в этих структурах наблюдалась наиболее интенсивная индукция синтеза c-fos и ИЛ-2 мРНК при анализе экспрессии генов через 30 минут после применения болевого и комплексного стимулов.

Как было показано ранее, c-fos мРНК содержащие клетки в головном мозге определяются у интактных крыс в небольшом количестве.

При болевом уколе, имитирующем иньекцию в икроножную мьппцу, наблюдалась незначительная стимуляция синтеза c-fos мРНК в сенсо-моторной зоне коры через 2 часа после применения стимула (по сравнению с 30 минутами), что обусловлено нестабильностью и распадом с-fos мРНК в клетке (Veyrane, J., et all., 1995).

Как показали результаты эксперимента по влиянию инъекций растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы на синтез c-fos мРНК через 2 часа после воздействия, c-fos мРНК-экспрессирующие клетки локализовались, главным образом, в ядрах гипоталамуса, сенсо-моторной зоне коры головного мозга и Асе. При инъекции экстракта горчицы индукция c-fos мРНК была в 1.5-3 раза выше, чем при иньекции

ли экспрессия генов немедленного и раннего ответа в клетках головного мозга под влиянием используемых стимулов к синтезу белкового продукта. В следующей серии экспериментов исследовали экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 на уровне синтеза белка, в определенных структурах головного мозга крыс и мышей.

Иммунохимический анализ синтеза c-Fos-подобного белка проводили на срезах спинного и головного мозга крыс с применением поликлональных антител к белкам семейства c-Fos (Santa-Cruz Biotech.Inc.). Подсчет клеток, содержащих c-Fos-подобный белок, вели только в гипоталамических структурах: LHA, супраоптическом ядре (SON), SHN, аркуатном ядре (Arc), вентрамедиальном (VMN), PVN и DMN. Небольшое количество иммунорсактивных клеток было отмечено у интактных животных, что согласуется с данными Bullitt (1990), а также - через 2 часа после укола в LHA, Arc, PVN, DMN, SON гипоталамических ядрах (единичные клетки). В спинном мозге меченые клетки были обнаружены в задних рогах крестцовых сегментов.

После инъекции растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы с- Fos-подобный белок обнаруживался через 2 часа после применения стимула также в IV и V поясничных сегментах (поверхностной пластинки серого вещества задних рогов) спинного мозга. Единичные меченые клетки были выявлены в промежуточной зоне серого вещества на уровне центрального канала поясничных сегментов спинного мозга.

Значительное увеличение числа клеток (в 2-3 раза), содержащих c-Fos-подобный белок, наблюдали во всех исследуемых ядрах при инъекции растительного масла или маслянного 5% экстракта горчицы по сравнению с контролем. Причем наибольший подъем уровня синтеза белка наблюдался в LHA, SON и VMN. В большинстве ядер содержание c-Fos-подобного белка после инъекции горчицы превышало таковой после инъекции растительного масла.

Анализ синтеза ИЛ-2 подобного белка в структурах головного мозга мышей проводили после тех же воздействий, которые применялись и в предыдущих экспериментах: инъекция растительного масла, инъекция 5% масляного экстракта горчицы. Содержание ИЛ-2 -подобного белка определяли иммунологически с помощью ELISA- кита (Genzyme) в следующих структурах: кора головного мозга, гиппокамп, Асе, и выделенные совместно (из за трудности разделения) структуры таламуса и гипоталамуса. Эксперименты показали присутствие ИЛ-2- подобного белка у интактных животных во всех перечисленных структурах (за исключением гиппокампа) на довольно низком уровне. Эффекты влияния стрессорных воздействий исследовали через 24 часа после инъекции. Инъекция растительного масла в икроножную мышцу задней правой конечности мыши вызывала повышение

Рис.4. Экспрессия с-Гоэ мРНК в клетках головного мозга крысы в норме (А) и через 2 часа после инъекции 5% масляного экстракта горчицы (В). На микрофотографиях представлен участок латерального гипоталамического поля (отмечен рамкой на схеме С), стрелками указаны клетки, продуцирующие с-К« мРНК.

Рнс.5. Экспрессия ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга крысы в норме (А) и через 2 часа после инъекции 5% масляного экстракта горчицы (В). На микрофотографиях представлен участок латерального гипоталамического поля (отмечен рамкой на схеме С), стрелками указаны клетки, продуцирующие ИЛ-2 мРНК.

уровня ИЛ-2 -подобного белка во всех исследуемых структурах головного мозга с более выраженной индукцией синтеза белка в гиппокампе. Инъекция масляного 5%-ного экстракта горчицы во всех структурах индуцировала синтез ИЛ-2 - подобного белка. Сравнение уровня синтеза ИЛ-2- подобного белка выявило тот факт, что инъекция маслянного 5% экстракта горчицы способствует более интенсивной продукции ИЛ-2-подобного белка в амигдалоидном комплексе и коре, чем инъекция растительного масла.

Известно, что в индуцировании синтеза ИЛ-2 белка в Т-лимфоцитах принимает участие ИЛ-1, играющий роль ко-стимулятора продукции ИЛ-2 белка. Вполне вероятно, что ту же роль ИЛ-1, являющийся одним из цктокинов, наиболее рано реагирущих на сгрессорные воздействия, может играть и в клетках головного мозга, оказывая влияние на синтез ИЛ-2. Для проверки данного предположения были проведены эксперименты с применением метода ELISA для иммунохимической оценки сигезированного под влиянием ИЛ-1 белка ИЛ-2 в некоторых структурах головного мозга. С этой целью были выбраны те же структуры мозговой ткани, что и при воздействии болевых или комплексного стимулов (таламус+гипоталамус, амигдалоидный комплекс, кора головного мозга, гиппокамп). Согласно предварительным данным, инъекция мышам нативного ИЛ-lß (1.8 мкг/ г веса животного) стимулирует продукцию ИЛ-2-подобного белка в Асе и гиппокампе по сравнению с интакгными животными и животными, которым вводили физиологический раствор. Можно предположить, что наблюдаемый нами эффект стимуляции синтеза ИЛ-2 белка в определенных структурах головного мозга под действием инъецированного ИЛ-lß, может быть вторичным и опосредованным индуцирующим действием этого цитокина на синтез c-Fos белка, который, в свою очередь, трансакгивирует ген ИЛ-2. Однако, в дальнейшем необходимо продолжить исследования в данном направлении с использованием более точных методов оценки синтеза ИЛ-2 белка в структурах головного мозга. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что примененные в эксперименте сгрессорные стимулы индуцируют экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 не только на уровне транскрипции мРНК, но и на уровне синтеза белка.

На основании проведенной работы можно придти к заключению о воздействии стресса на молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе активации иммунной и нервной систем, а именно, что стресс индуцирует изменения функциональной активности гена немедленного ответа - c-fos и гена раннего ответа - ИЛ-2.

Проведенное исследование позволяет заключить что: 1) стресс вызывает индукцию синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки мышей и клетках головного мозга крыс; 2) имеет место сходная локализация экспрессии исследуемых генов в определенных структурах

головного мозга; 3) существуют различия в степени интенсивности и времени инициации синтеза с-Аэб мРНК, с-БоБ-подобного белка, ИЛ-2 мРНК и ЙЛ-2-подобного белка.

ВЫВОДЫ

1. Через 2 часа после ротационного стресса, наблюдается повышение содержания с-Аэб мРНК в культуре нестимулированных лимфоцитов селезенки мышей и ИЛ-2 мРНК в культуре стимулированных мигогеном лимфоцитов.

2. Через 2 часа после ротационного стресса, констатировано увеличение количества клеток, содержащих с-йээ мРНК и ИЛ-2 мРНК, в структурах таламуса, гипоталамуса и сенсомоторной зоны коры головного мозга крыс.

3 .Внутримышечная инъекция растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, индуцирует, через 2 часа после воздействия, увеличение количества клеток, синтезирующих с-Рэя мРНК и ИЛ-2 мРНК в структурах гипоталамуса, таламуса, сенсомоторной зоны коры, каудального ядра и амигдалоидного комплекса головного мозга крыс.

4.Внутримышечная инъекция растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, индуцирует, через 2 часа после воздействия, увеличение количества клеток, синтезирующих с-РоБ-подобный белок в ядрах гипоталамуса.

5. Через 24 часа после внутримышечной инъекции растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, наблюдается увеличение содержания ИЛ-2-подобного белка в гипоталамусе и таламусе, коре, гиппокампе и амигдалоидном комплексе головного мозга мышей.

6. Внутрибрюпшнная инъекция ИЛ-1Р, вызывает через 24 часа повышение содержания ИЛ-2-подобного белка в гипоталамусе и таламусе, коре, гиппокампе и амигдалоидном комплексе головного мозга мышей.

7. Комплекс проведенных исследований позволил показать эффекты действия стрессорных стимулов в ЦНС и лимфоцитах слезенки на уровне экспрессии генов немедленного и раннего ответа и выявить структуры мозга, реализующие реакцию организма на действие исследованных стимулов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Kazakova Т.В., Golovko O.I., Barabanova S.V., Nosov M.A., Novikova N.S. Stress induced changes in the interleukin-2 gene expression in mice T-cells.// Immunology Letters. - 1997,-V. 56, N. 1-3,-P. 472.

2. Kazakova T.B., Golovko O.I., Barabanova S.V., Nosov M.A., Novikova N.S., Korneva E.A. The IL-2 and c-fos gene expression in the rat nervous cells after mustard oil injection.// Immunology Letters.-1997.-V. 56, N. 4.« P. 242.

3. Барабанова C.B., Носов M.A., Головко О.И. Экспрессия гена интерлейкина-2 в головном мозге крыс в норме и при стрессорных воздействиях. 1-я Медико-биологическая Конференция молодых ученых Санкт-Петербурга. Санкт-Петербург, 1997, С.6.

4. Носов М.А., Барабанова С.В., Головко О.И. Экспрессия гена с-fos в головном мозге крыс в норме и при различных сенсорных стимулах. 1-я Медико-биологическая Конференция молодых ученых Санкт-Петербурга. Санкт-Петербург, 1997, с.6.

5. Barabanova S., Nosov М., Golovko О., Novikova N., Kazakova Т. C-fos gene expression in the rat brain after different stressful stimuli.// Pathophysiology. -1998.-V. 5. -Supplement l.-P. 147.

6. Novikova N,, Barabanova S., Nosov M., Golovko O., Kazakova T. Stress-induced fos-like protein in the different brain structures and spinal cord. // Pathophysiology.-1998.-V.5.-Supplement l.-P. 159.

7. Golovko O., Barabanova S., Nosov M., Novikova N., Kazakova T. Interleukin-2 and c-fos gene expression in murine T-lymphocytes in normal and stressful conditions..//Pathophysiology.-1998.-V.5.-Supplement 1.-P.151.

8. Nosov M., Barabanova S., Golovko O., Novikova N., Kazakova T. Expression of interleukin-2 gene in rat brain in normal and stress conditions. // Pathophysiology.-1998.-V.5.-Supplement 1.-P.159.

9. Kazakova Т., Golovko O., Barabanova S., Nosov M., Novikova N. Genetical mechanisms of stress induced disorders. .// Pathophysiology.-1998.-V.5.-Supplement 1.-P.153.

10. Барабанова C.B., Головко О.И., Новикова H.C., Носов М.А., Корнева Е.А., Казакова Т.Е. Влияние стресса на экспрессию индуцибельных генов c-fos и ИЛ-2 в клетках нервной и иммунной систем //Нейрохимия.-1998.-Т. 15. -N4.-C.380-387.

И.Nosov М.А., Barabanova S.V., Golovko O.I. IL-l-induced production of IL-2 protein in murine Brain.// Neuroinununomodulation. 1999. -V.6. -P.435.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Барабанова, Светлана Владимировна

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1.Стресс и иммунная система.

2.1.1.Взаимодействие нервной и иммунной систем.

2.1.2.Действие стресса на иммунную и нервную системы.

2.1.2.1 .Илшобилизационный стресс.

1.2.2.Психоэмоциональный стресс.

2.2.Экспрессия генов немедленного и раннего ответа как молекулярно-биологическая основа реализации реакций на стрессирующие воздействия.

2.3.Протоонкоген c-fos как маркер активации клеток ЦНС.

2.3.1.Общие сведения.

2.3.2.Экспрессия гена c-fos.

2.3.2.1.Индукторы активации гена c-fos и механизмы его экспрессии.

2.3.2.2.Экспрессия гена c-fos в клетках нервной системы.

2.3.3.Влияние стресса на экспрессию гена c-fos.

2.4. Интерлейкин-2 как маркер активации определенных клеток иммунной системы.

2.4.1.Общие сведения.

2.4.2.Общие механизмы регуляции индуцибельных генов.

2.4.3.Регуляция экспрессии гена интерлейкина-2 белковыми транс-факторами.

2.4.4.Экспрессия гена интерлейкина-2 в клетках нервной системы.

2.4.5 .Влияние стресса на экспрессию гена интерлейкина-2.

2.5.3аключение.

З.МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Анализ синтеза ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК лимфоцитами селезенки и клетками ткани головного мозга.

3.1.1.Мо дели стрессорного воздействия.

3.1.2. Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей селезенки.

3.1.2.1. Получение и инкубаг^я лимфоцитов.

3.1.2.2. Выделение тотальной мРНК.

3.1.2.3. Выявление комплекса dig^HK-MPHK.

3.1.3. Получение меченых ДНК-зондов.

3.1.3.1 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК, содержащей кДНК ИЛ-2 или кДНК v-fos.

3.1.3.2. Выделение плазмидной ДНК из E.coli методом щелочной экстракции.

3.1.3.3. Рестрикция ДНК эндонуклеазами.

3.1.3.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.1.3.5. Выделение фрагментов ДНК из лекгоплавкой агарозы.

3.1.3.6. Нерадиактивное мечение кДНК-фрагментов дигоксигенином.

3.1.4. Определение содержания c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках тканей головного мозга крыс.

3.1.4.1. Получение срезов головного мозга крыс.

3.1.4.2. Анализ содержания ИЛ-2 и c-fos мРНК методом гибридизации in situ па срезах головного мозга крыс.

3.1 А.З.Илшунодетекция комплекса dig*мРНК-1сДНК.

3.2. Иммунохимическое выявление c-Fos- и ИЛ-2-подобных белков в тканях головного мозга.

3.2.1. Иммунохимическое выявление c-Fos-подобных белков в тканях головного мозга крыс.

3.2.1.1. Получение срезов головного мозга крыс.

3.2.1.2. Иммунохимическое выявление c-Fos-nodo6nozo белка.

3.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2-подобного белка с использованием моноклональных ИЛ-2 антител.

3.2.2.1. Приготовление проб для определения содерэюания ИЛ-2-подобного белка в структурах головного мозга мышей.

3.2.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2-подобного белка.

3.3. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1.Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos и интерлейкина-2 в лимфоцитах селезенки мышей и клетках головного мозга крыс.

4.1.1. Влияние ротационного стресса на экспрессию гена c-fos и интерлейкина-2 в лимфоцитах селезенки мышей.

4.1.1.1. Влияние ротационного стресса па экспрессию c-fos мРНК в лимфоцитах селезенки мышей.

4.1.1.2. Влияние ротационного стресса на экспрессию ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки мышей.

4.1.2.Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга крыс.

4.1.2.1. Влияние ротационного стресса на экспрессию c-fos мРНК в клетках головного мозга крыс.

4.1.2.2. Влияние ротационного стресса на экспрессию ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга крыс.

4.2. Влияние болевых и комплексных стрессорных воздействий на экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в клетках спинного и головного мозга крыс.

4.2.1. Влияние стрессорных воздействий на синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в головном мозге крыс через 2 часа после применения стимула.

4.2.2.Влияние стрессорных воздействий на синтез c-Fos- и

ИЛ-2-подобных белков в головном мозге крыс.

5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в клетках головного мозга и селезенки при стрессорных воздействиях"

Актуальность темы.

Стресс-реакция, как одно из проявлений неспецифической защиты организма, является ответом на воздействия разного рода, в том числе вызванные экологическими и социальными факторами. Ответной

О 1 U реакцией организма является активация его защитных функции, в оптимальном случае нивелирующих негативное влияние неблагоприятных факторов внешней среды.

Реакция нервной системы (НС) на стресс проявляется при действии самых разных раздражителей - физических, химических, психоэмоциональных.

К настоящему моменту модулирующее влияние центральной нервной системы (ЦНС) на иммунную выявлено при всех известных формах иммунного реагирования организма (синтез антител, отторжение чужеродного трансплантата, противоопухолевая резистентность, аллергические реакции). Показано участие ЦНС в регуляции различных звеньев иммуногенеза (фагоцитоз, пролиферация и дифференцировка лимфоцитов, активность клеток-эффекторов иммунных реакций, миграция клеточных элементов иммунной системы) (Корнева и др., 1978; 1993; и мн. др.). Тем не менее, механизмы нейрогуморального воздействия на иммунную систему и иммунной системы на нервную не только при стрессе, но и в норме, изучены далеко не исчерпывающе.

В передаче информационного сигнала между НС и ИС могут принимать участие и такие биологически активные агенты, как интерлейкины, интерфероны, гормоны тимуса (Yaseen et al., 1993). Известно также, что цитокины играют важную роль в механизмах взаимодействия между ЦНС и клетками иммунной системы (Goldstone et al., 1995). Цитокины способны проникать через гематоэнцефалический барьер в определенных его участках (Barve et al. 1994) и воздействовать на функциональную активность мозга. Присутствие цитокинов в головном мозгу объясняется таюке их продукцией - экспрессией цитокиновых генов клетками глии и некоторыми нейронами (Nelson et al., 1994; Sei et al. 1995).

К сожалению, существует относительно небольшое количество сведений о возможных путях передачи информационного сигнала от ЦНС к ИС и лишь начато изучение механизмов передачи информации от ИС к ЦНС, о структурах ЦНС, вовлеченных в ответную реакцию на стресс или антигенное воздействие, и временных параметрах этого процесса.

Большое значение в исследованиях такого рода имеет совершенствование методических подходов. Появление высоко специфических, прецизионных методов анализа в различных областях биологии позволяет проводить исследования на стыке дисциплин.

Множественность путей передачи сигнала (Kemplay & Webster, 1986; Gaykema et al., 1998) создает трудности в исследовании механизмов коммуникации между обеими системами. Применение методов анализа функциональной активности той или иной системы на организменном или клеточном уровнях не позволяет решить вопрос о молекулярных механизмах изменения метаболизма клетки в ответ на внешние стимулы. Однако, появление высокочувствительных специфических методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа и применение их в сочетании с гистохимическими и иммунохимическими методами исследования позволило подойти к изучению проблемы механизмов нейроиммуномодуляции на генном уровне. Мишенью для такого рода исследований могут служить гены немедленного и раннего ответа, экспрессирующиеся в нервных или иммунокомпетентных клетках. Изменение характера их экспрессии при действии стимулов воздействий позволяет оценивать изменение функциональной активности клеток в ходе развития реакции на определенные стимулы.

Фундаментальной основой такого рода исследований является доказанное ранее положение, согласно которому клетки, участвующие в формировании ответа на примененный внешний стимул, усиливают или уменьшают экспрессию соответствующих генов, что необходимо для компенсации возникающих изменений гомеостаза (Du Bow, 1998). Определение генетически запрограммированного ответа, поиск соответствующих маркеров, позволяющих регистрировать изменения метаболизма клетки на ранних стадиях реакции на стимуляцию, и исследование экспрессии соответствующих генов создает основу для выяснения механизмов реализации влияния стресса на функции определенных клеток.

Признанным маркером активации нейрональных клеток является продукт гена немедленного ответа - протоонкогена c-fos, - c-Fos белок (Bullitt, 1990), выполняющий функцию регулятора транскрипции ряда индуцибельных генов и играющий существенную роль в процессах клеточного роста и дифференцировки (Heueretal., 1996).

Примером индуцибельного гена раннего ответа, кодирующего структуру одного из ключевых медиаторов иммунной системы, может служить ген интерлейкина 2 (ИЛ-2). ИЛ-2 является одним из важнейших цитокинов, обеспечивающих контроль над процессами пролиферации и дифференцировки Т-зависимых иммунокомпетентных клеток, и синтезируется Т- лимфоцитами - хелперами под действием митогенов, ИЛ-1 и некоторых других агентов. Существует большой объем литературы, посвященной проблеме регуляции активности гена ИЛ-2 специфическими белковыми трансфакторами (Arya et al., 1984; Novak et al., 1990; Granelli-Piperno& McHugh, 1991; Tu & Anders, 1997). 1С числу транс-факторов гена ИЛ-2 относится и белок c-Fos. Так, известно, что белок c-Fos (вместе с другими представителями семейства Fos) в комплексе с продуктами других протоонкогенов семейства Jun входит в состав транскрипционных факторов АР-1 и NF-AT, которые регулируют активность ряда индуцибельных генов, в том числе и гена ИЛ-2 (Vacca et al., 1992; Garrity et al., 1994; Whisler et al., 1997).

В настоящее время присутствие ИЛ-2 было обнаружено не только в Т-лимфоцитах, но и в различных структурах головного мозга, - в клетках олигодендроглии, астроцитах и нейронах (Rabber & Blom, 1994; Ram et al.,1994, Sei et al., 1995 и др.). Следовательно, можно предположить, что ИЛ-2 может участвовать в механизмах активации не только иммунокомпетентных, но и нервных клеток (Goetz, 1998).

Существует значительное количество данных, свидетельствующих об изменении экспрессии гена c-fos в ответ на неантигенные стимулы (Hunt et al., 1987; Bullitt et al., 1992, Honkaniemi, 1992, Lee & Beitz, 1993) и роли синаптической активности в синтезе иммунореактивного c-Fos белка (Morgan & Curran, 1986). Передача информационного сигнала может осуществляться через нервные пути, т.е. сигнал может поступать в мозг в очень короткие сроки (Gaykema et al., 1998) после определенного воздействия.

Однако, несмотря на интенсивные исследования физиологических и биохимических механизмов реализации реакций клеток ЦНС на неантигенные воздействия, в том числе, и стресс-индуцирующие, интенсивность экспрессии гена c-fos в иммунокомпетентных клетках и гена ИЛ-2 в клетках ЦНС практически не изучена. Решение данных вопросов представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие проблемы молекулярно-генетических механизмов реализации реакций НС и ИС на стресс и механизмов нейроиммунного взаимодействия.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы заключалась в изучении молекулярных механизмов реализации реакции организма на стрессорное воздействие, а именно в сочетанном исследовании экспрессии генов немедленного и раннего ответа - гена c-fos и гена ИЛ-2 - в клетках иммунной и нервной систем, и выявлении структур головного мозга, реагирующих на конкретные виды стресса.

В задачи работы входило:

1. Исследовать экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в лимфоцитах селезенки мышей после ротационного стресса по синтезу c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК.

2. Исследовать экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в клетках различных структур головного мозга крыс после ротационного стресса по синтезу с-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК.

3. Изучить влияние болевого и комплексного стрессорного воздействия на синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках различных структур головного мозга крыс.

4. Провести анализ гена синтеза c-Fos-подобного белка в клетках гипоталамических структур головного мозга крыс после болевого и комплексного стрессорного воздействия.

5. Провести анализ гена синтеза ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей после болевого и комплексного стрессорного воздействия.

6. Охарактеризовать влияние ИЛ-10 на синтез ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей.

Положения, выносимые на защиту

1 .Ротационный стресс вызывает индукцию синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки мышей.

2.Ротационный стресс вызывает индукцию синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках определенных структур головного мозга крыс.

3.Раздражители, содержащие болевой компонент: укол в икроножную мышцу задней ноги крысы, внутримышечная инъекция растительного масла или 5%-ного масляного экстракта горчицы, индуцируют (в различной степени) синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках одних и тех же структур головного мозга крыс, однако, ИЛ-2 мРНК синтезируется в более поздние сроки, нежели c-fos мРНК.

4.Примененные болевые раздражители стимулируют синтез c-Fos -подобного белка в клетках гипоталамических структур головного мозга крыс в более поздние по сравнению с c-fos мРНК сроки.

5.Примененные болевые раздражители стимулируют синтез ИЛ-2 белка в различных структурах головного мозга мышей через 24 часа после воздействия.

6.Инъекция ИЛ-ip приводит к повышению содержания ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей через 24 часа после воздействия.

Научное значение и новизна

По экспрессии генов немедленного и раннего ответа: c-fos и ИЛ-2 установлены структуры головного мозга крыс, активирующиеся после стресс-индуцирующих воздействий (ротационный стресс, болевые и комплексные раздражители), а также - время их активации.

Показана одновременная индукция синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки и клетках ЦНС при воздействии ротационного стресса. Функциональные изменения, протекающие в клетках НС и ИС на генном уровне могут иметь значение в процессе реализации стресс индуцируемых воздействий на защитные функции организма.

Научно-практическая значимость работы

Работа является экспериментальным исследованием и важным этапом в развитии приоритетного направления по изучению механизмов реализации стресс-реакции на уровне экспрессии генов немедленного и раннего ответа в клетках ЦНС и иммунной системы, что дает возможность также анализировать механизмы взаимодействия нервной и иммунной систем на генном уровне.

Реализация результатов исследования

Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярных механизмов стресса, а также -вопросов регуляции экспрессии индуцибельных генов. Кроме того, возможна рекомендация по включению полученных данных в педагогическую практику медицинских университетов.

Апробация работы

Материалы исследования были представлены на Российских и Международных Форумах:

4th International Congress on the Immune Consequeces of Trauma, Shock and Sepsis - Mechanisms and Therapeutic Approaches, Munich, Germany, 1997 1-я Медико-биологическая Конференция молодых ученых Санкт-Петербурга, 1997

13-th European Immunology Meeting, Amsterdam, 1997. Ill International Congress of Pathophysiology, Lahti, Finland, 1998 XVII Съезд Всероссийского физиологического общества им.И.П.Павлова, Ростов-на-Дону,Россия, 1998

The 4th International Congress of the International Society for Neuroimmunomodulation, Lugano, Switzerland, 1999

Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 209 источников, из них 193 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 3 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Барабанова, Светлана Владимировна

6.ВЫВОДЫ

1. Через 2 часа после ротационного стресса, наблюдается повышение содержания c-fos мРНК в культуре нестимулированных лимфоцитов селезенки мышей и ИЛ-2 мРНК в культуре стимулированных лимфоцитов (КонА+рИЛ-2)

2. Через 2 часа после ротационного стресса, констатировано , увеличение количества клеток, содержащих c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК, в структурах таламуса, гипоталамуса и сенсомоторной зоны коры головного мозга крыс.

3.Внутримышечная инъекция растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, индуцирует, через 2 часа после воздействия, увеличение количества клеток, синтезирующих c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в структурах гипоталамуса, таламуса, сенсомоторной зоны коры, каудального ядра и амигдалоидного комплекса головного мозга крыс.

4.Внутримышечная инъекция растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, индуцирует, через 2 часа после воздействия, увеличение количества клеток, синтезирующих c-Fos-подобный белок в ядрах гипоталамуса.

5. Через 24 часа после внутримышечной инъекции растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, наблюдается увеличение содержания ИЛ-2-подобного белка в гипоталамусе и таламусе, коре и амигдалоидном комплексе головного мозга мышей.

6. Внутрибрюшиштя ипъскцпя пативпого ИЛ-^(1,8 мкг/г), вызывает через 24 часа повышение содержания ИЛ-2-подобного белка в гипоталамусе и таламусе, коре и амигдалоидном комплексе головного мозга мышей.

7. Комплекс проведенных исследований позволил показать эффекты действия стрессорных стимулов в клетках ЦНС и лимфоцитах селезенки на уровне экспрессии генов немедленного и раннего ответа и выявить структуры мозга, реализующие реакцию организма на действие исследованных стимулов.

2.5.3аключение.

Несмотря на интенсивные исследования физиологических и биохимических механизмов неантигенных воздействий, в том числе, и стресс-индуцирующих, на активность нейрональных клеток и экспрессию гена c-fos, вопрос о молекулярных механизмах, лежащих в основе экспрессии гена c-fos в иммунокомпетентных клетках и гена ИЛ-2 в клетках ЦНС, а также о возможной корреляции этих процессов, практически не изучен. Решение данных вопросов представляется актуальным для расшифровки молекулярно-генетических механизмов стресса и нейро-иммуно взаимодействий.

Из представленного материала следует, что c-Fos белок , c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК могут служить маркерами активации как нейрональных, так и иммунокомпетентных клеток.

Анализ экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 в клетках ЦНС и клетках иммунной системы при стрессорных воздействиях позволит ответить на вопрос о возможной корреляции этих процессов во времени и локализовать структуры головного мозга, реализующие реакцшо на стресс на генном уровне путем активации транскрипции c-fos и ИЛ-2 мРНК и синтеза c-Fos-подобного белка.

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Анализ синтеза ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК лимфоцитами селезенки и клетками ткани головного мозга.

3.1.1. Модели стрессорного воздействия.

В качестве стрессорного воздействия использовали ротационный стресс и сенсорные стимулы.

При ротационном стрессе животные подвергались вращению на ротационной установке со скоростью 78 об/мин (4 раза по 10 мин с 5-минутными перерывами). Через 1 час после окончания стрессорного воздействия животных забивали.

В качестве сенсорных стимулов были выбраны:

1) Инъекция 20 мкл 5% масляного экстракта горчицы внутримышечно в заднюю правую конечность (gastrocnemius); 2) Инъекция 20 мкл растительного масла; 3) Укол инъекционной иглой.

3.1.2. Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей селезенки.

3.1.2.1. Получение и инкубация лимфоцитов.

У самцов 10-12-недельных мышей линии СВА извлекали селезенки. Суспензию клеток селезенки получали в асептических условиях мягким раздавливанием ткани в стеклянном гомогенизаторе в 2 мл RPMI 1640. Затем суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр (Becton Dickinson) и дважды промывали RPMI. Лимфоциты выделяли из субпопуляции селезеночных клеток центрифугированием в градиенте фиколп-верографин (Pharmacia) (r=l .09 г/л) в течение 40 минут при 4 ООО х g. В результате эритроциты оседали на дно, а обогащенная фракция лимфоцитов оставалась на границе раздела двух фаз: среды и смеси фиколл-верографин. Лимфоциты осторожно собирали и после трехкратной отмывки доводили концентрацию клеток до 1 млн в мл. Клетки инкубировали необходимое время при 37°С, 100% влажности, 5% СОг в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки быка, 10 mM HEPES, 2 мМ глутамина, 50 мМ 2р-меркаптоэтанола, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина. Контроль содержал 5-20 мкг/мл КонА+ 30 ед./мл рИЛ-2 (Гущин и Неустроева, 1989; Гущин, 1992).

3.1.2.2. Выделение тотальной мРНК

Выделение тотальной мРНК осуществляли методом Шомзинского и Сахи (Chomczyncki & Sacchi, 1987).

После инкубации в течение 4-6 часов в 5 мл среды RPMI с добавками (10бклеток/мл), клетки собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут, промывали стерильным lxPBS, и освобождали осадок от излишней влаги. К осадку добавляли 100 мкл раствора GITC (4 М гуанидин тиоционат, 25 мМ Na-цитрат рН 7,0, 0,5% Na-лаурилсаркозинат), 10 мкл Na-ацетата рН 4,0, 100 мкл фенола, насыщенного водой, 40 мкл раствора хлороформ .изоамиловый спирт (49:1). После внесения каждого из компонентов смеси пробирку осторожно встряхивали. Смесь окончательно перемешивали 10 секунд на Вортексе и помещали на 15 минут в лед. Затем пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут и отбирали водную фазу, содержащую РНК. Добавляли 100 мкл изопропанола и оставляли на ночь при -20°С. Осадок РНК получали центрифугированием проб при 8 000 об/мин в течение 1 часа, промывали 75% этанолом и основательно высушивали в вакуумном шкафу. Осадок растворяли в 5 мкл стерильной деионизированной воды и наносили на фильтр (ВА 85, 0,45 мкм, Шляхер и Шулль). РНК закрепляли на фильтре отжигом при 80°С в течение 30 минут.

3.1.2.3. Выявление комплекса dig*кДНК-мРНК.

Выявление комплекса с^*кДНК-мРНК осуществляли по методу Boehringer Mannheim (1995). Прегибридизацию фильтра проводили 1 час при 37°С в свежеприготовленном гибридизационнном растворе (5xSSC, 0,1% Na-лаурилсаркозинат, 0,02 % ДДС-Na, 50 мМ трис-HCl рН 8,0, 50% формамид, 5% блокирующий реагент). Фрагмент с^*-кДНК (получение меченых кДНК зондов см.п.3.1.3.) денатурировали путем кипячения в водяной бане при 100 °С в течение 10 минут и мгновенного переноса на лед. Фильтр с нанесенной мРНК помещали в гибридизационный раствор, содержащий dig^-кДНК. Гибридизацию вели в течение ночи при 37 °С.

После гибридизации фильтры с сорбированной на них dig*-кДНК отмывали при 68°С 15 минут в растворе, содержащем 2xSSC и 0,1% ДДС-Na, а затем двукратно по 15 минут в растворе 0,lxSSC и 0,1% ДДС-Na.

Описанные далее процедуры проводили при комнатной температуре. Фильтр ненадолго помещали в буфер 1 (100 мМ трис-HCl, 150 MMNaCl, рН 7,5), после чего переносили его в буфер 2, приготовленный на основе буфера 1 и содержащий 1% блокирующий реагент. Инкубацию проводили в течение 30 минут. Затем фильтр отмывали буфером 1, помещали в свежеприготовленный раствор антитело-коньюгата (150 м ед./мл) на буфере 1 и инкубировали 30 минут. Антитело-коныогат удаляли отмывкой фильтра двумя сменами буфера 1 по 15 минут. Фильтр переносили на 2 минуты в буфер 3 (100 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl2, рН 9,5). Инкубацию фильтра в свежеприготовленном красящем растворе (45 мкл NBT, 35 мкл раствора Х-фосфата, 10 мл буфера 3) проводили в темноте в течение ночи. Пятна dig*-i^HK, гибридизовавшейся с мРНК при dot-гибридизации окрашивались в сине-фиолетовый цвет разной степени интенсивности.

Степень окрашивания пятен, пропорциональную количеству мРНК ИЛ-2, измеряли на денситометре LKB Ultrascan XL Law Dencytomcter.

3.1.3. Получение меченых ДНК-зондов.

3.1.3.1. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК, содержащей кДНКИЛ-2 или кДНК v-fos.

В данной работе использовали клетки E.coli (штамм НВ 101), трансформированные рекомбинантными ДНК плазмид рАА1213 и pPL32, содержащими полноразмерные копии кДНК гена ИЛ-2 человека длиной 550 п.н., или плазмиды pUC, содержащей копию кДНК v-fos, вирусного аналога протоонкогена c-fos.

Трансформацию E.coli плазмидной ДНК осуществляли следующим образом. Для получения компетентных клеток 1 мл ночной культуры вносили в 100 мл среды LB и выращивали при 37°С с интенсивным перемешиванием до плотности примерно 5x105 клеток/мл (D 45О=0,5); обычно это занимало 3 часа. Культуру охлаждали в течение 10 минут во льду. Осадок клеток получали центрифугированием при 4000 х g в течение 20 минут при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли, клетки ресуспендировали в половине начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 шМ СаСЬ, 10 шМ трис-HCl, рН 8,0. Суспензию клеток помещали в ледяную баню на 15 минут. Осажденные клетки, полученные в результате центрифугирования при 4 000 х g, 4°С, в течение

20 минут, ресуспендировали в 1/15 начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 тМ СаСЬ, 10 тМ трис-HCl, рН 8,0 и оставляли при 4°С. Максимальная эффективность трансформации клеток достигалась через сутки.

К охлажденным компетентным клеткам в объеме 0,1 мл добавляли 100-200 нг плазмидной ДНК, растворенной в ТЕ буфере, размешивали и инкубировали смесь во льду 30 минут. Затем пробы помещали в водяную баню (42°С) на две минуты. В каждую пробу вносили по 1 мл среды LB и инкубировали их 1 час при 37°С.

Нужное количество клеток высеивали на чашки с агаром. Селекцию трансформированных клонов вели на устойчивость к ампициллину (Маниатис и др., 1984).

3.1.3.2. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli методом щелочной экстракции.

Для получения больших количеств плазмидной ДНК предварительно производили амплификацию плазмиды в богатой среде. Для этого 0,1 мл ночной культуры E.coli, трансформированной плазмидной ДНК, засевали в 25 мл среды LB с ампициллином (100 мг/мл) и инкубировали при 37 С при интенсивном встряхивании до тех пор, пока культура не достигала поздней логарифмической фазы (D46o=0,6). 25 мл культуры в поздней логарифмической фазе вносили в 500 мл среды LB с ампициллином и инкубировали примерно 2,5 часа при энергичном встряхивании. При достижении D46o=0,4 в культуру вносили раствор хлорамфеникола (34 мг/мл в этаноле) до конечной концентрации 170 мкг/мл, после чего клеточную культуру инкубировали при 37°С и интенсивном встряхивании еще 12-16 часов.

Бактериальные клетки собирали центрифугированием при 4 ООО х g в течение 10 минут при 4 °С и промывали 100 мл охлажденного во льду буфера STE (ОД М NaCl, 10 mM трис-HCl, рН 7,8,1шМ ЭДТА).

Осадок клеток бактерий, полученный из 500 мл культуры, ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозу, 25 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ ЭДТА и лизоцим в концентрации 5 мг/мл. Суспензию оставляли на 5 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 20 мл свежеприготовленного раствора, включающего 0,2 н NaOH и 1% ДДС-Na. Смесь инкубировали на льду 10 минут, затем добавляли 15 мл охлажденного ЗМ ацетата натрия, смесь снова инкубировали на льду в течение 10 минут, после чего центрифугировали при 20 000 об/мин в течение 20 минут при 4°С. К надосадочной жидкости добавляли 0,6 исходного объема изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 15 минут. При этом наблюдали помутнение жидкости. Осадок, полученный в результате последующего центрифугирования надосадочной жидкости при 12 000 х g в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали 70% этанолом, высушивали под вакуумом и растворяли в 5 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЭДТА). Для очистки плазмидной ДНК проводили равновесное центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым эти днем. К каждому мл раствора ДНК добавляли 1 г сухого хлористого цезия и перемешивали до полного растворения соли. На каждые 10 мл раствора с хлористым цезием добавляли 0,8 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Конечная плотность раствора при этом составляла 1,55 г/мл, а концентрация бромистого этидия была 600 мкг/мл. Градиент плотности устанавливали центрифугированием при 36 000 об/мин в течение 36 часов в роторе Ti-50 на ультрацентрифуге "Spinco" В-65 при температуре 15 С. ДНК очищали от бромистого этидия экстракцией равным объемом изопропанола. Смесь энергично встряхивали и центрифугировали при 2 000 об/мин в течение 3-х мину т при комнатной температуре. Затем отбирали нижнюю водную фазу в чистую пробирку. Экстракцию повторяли несколько раз, пока не исчезала розовая окраска у водной фазы. Диализ водной фазы проводили против нескольких смен буфера ТЕ рН 8,0.

Очищенную ДНК анализировали электрофоретически, при необходимости доводили концентрацию до желаемой осаждением спиртом и растворением в требуемом объеме буфера ТЕ (Маниатис и др., 1984).

3.1.3.3. Рестрикция ДНК эндонуклеазами.

Реакционная смесь приводится в расчете на 1 мкг ДНК. К раствору ДНК в стерильной пробирке типа "Эппендорф" добавляли деионизованную воду до объема 18 мкл и 2 мкл соответствующего буфера 10-кратной концентрации. Затем вносили 1 ед. рестриктазы и тщательно перемешивали. Смесь инкубировали при 37°С в течение 2-6 часов в зависимости от количества ДНК. Реакцию останавливали добавлением 0,5М ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

Необходимые фрагменты ДНК получали рестрицированием плазмид рАА1213-ИЛ-2 и плазмиды рРЬ32-ИЛ-2 по сайтам BamHI и SalGI а также плазмиды pUC-v-fos по сайтам Pstl.

BamHI реакцию проводили в буфере, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ. Для рестриктазы SalGI буфер имел следующий состав: 1 00 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ (Маниатис и др., 1984).

При расщеплении плазмиды pUC-v-fos, содержащей вирусную копию протоонкогена c-fos, рестрикцию вели рестриктазой Pstl в буфере, содержащем 50мМ Трис-HCl рН 7,5; ЮмМ MgCl2 и 1мМ dithioerythrilol.

Рестрикционные фрагменты ДНК анализировали электрофоретически в агарозном геле.

3.1.3.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 0,8% агарозе ("Sigma") в буфере, содержащем 40 мМ трис-ацетат рН 7,8 и 2 мМ ЭДТА на горизонтальных пластинах размером 8,5 х 12,5 см, при силе тока 25 мкА до вхождения образца в гель и, в дальнейшем, при 40 мкА. Гель окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в электрофоретическом буфере (Маниатис и др., 1984).

3.1.3.5. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы.

После обработки плазмид рАА1213-ИЛ2, рР132-ИЛ-2 и pUCv-fos рестриктазами, и предварительного пробного электрофореза, смесь фрагментов ДНК подвергали электрофорезу в 1% легкоплавкой агарозе. В растворенную легкоплавкую агарозу добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Гель заливали в электрофорезную плату и остужали при 4°С. После нанесения проб проводили электрофорез при 4°С, чтобы гель не расплавился во время разделения. Расположение фрагментов ДНК определяли в ультрафиолетовом свете. Кусочки геля, содержащие необходимые фрагменты ДНК, вырезали, помещали в пробирки и заливали пятью объемами 20 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ ЭДТА. Смесь прогревали при 65°С 5 минут. Пробу с расплавленным гелем экстрагировали равным объемом фенола при комнатной температуре. Водную фазу, содержащую ДНК, собирали после центрифугирования и повторяли фенольную экстракцию 4-5 раз. Затем собранную водную фазу экстрагировали смесью фенол: хлороформ (1:1) дважды и хлороформом 1 раз. Для осаждения ДНК к полученной водной фазе прибавляли 3 исходных объема этанола и 1/10 исходного объема ацетата калия. Смесь помещали при на ночь (Маниатис и др., 1984). После осаждения центрифугированием при 10 ООО х g в течение часа фрагменты кДНК метили дигоксигенином.

3.1.3.6. Нерадиоактивное меченые кДНК-фрагментов дигоксигенин ом.

Мечение фрагментов кДНК производили при помощи дигоксигенинового кита фирмы "Boeliringer Mannheim" (Boehringer Mannheim, 1996).

Основной принцип нерадиоактивного мечения состоит в том, что двухцепочечный фрагмент ДНК денатурируется в растворе, а затем по одноцепочечной нуклеотидной последовательности достраивается вторая цепь. При этом происходит внедрение в случайные места дУТФ, меченных дигоксигенином. Стероидный растительный гормон дигоксигенин присоединяется к дУТФ при помощи "спейсерной ножки" с образованием DIG-дУТФ. После специфической гибридизации кДНК с белками или мРНК гибриды фиксируются с использованием антитело-коныогата, представляющего собой антитела к дигоксигенину с пришитыми к ним гаптеновым комплексом щелочной фосфатазы, которая участвует в реакции окрашивания. Катализируемая ферментом цветная реакция, происходит с участием 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (X-фосфата) и нитросиней тетразолиевой соли .

Процедура мечения состояла в следующем. 1 мкг фрагмента ДНК, полученного после рестрикции эндонуклеазами и выделенного из легкоплавкой агарозы, растворяли в 5 мкл стерильной деиопизовашюй воды и денатурировали прогреванием при 95°С в течение 10 минут с последующим быстрым охлаждением, вызванным помещением пробирки в кювету со льдом на 5 минут. Затем к денатурированной ДНК добавляли 2 мкл 10-кратного гексануклеотидного буфера, 2 мкл смеси дезоксинуклеотидов, содержащей короткий праймер с произвольной нуклеотидной последовательностью, 1 мМ дАТФ, 1 мМ дЦТФ, 1 мМ дГТФ, 0,65 мМ дТТФ, 0,35 мМ DIG-дУТФ рН 7,5; доводили объем смеси до 19 мкл стерильной деионизованной водой, после чего вносили 1 мкл (2 ед.) фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Описанную процедуру проводили на льду. Затем смесь инкубировали около 20 часов при 37 иС. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,2 М ЭДТА. > (%*кДНК преципитировали внесением 2,5 мкл 4М LiCl и 75 мкл предварительно охлажденного этанола. Для эффективного осаждения dig* к ДНК пробирку оставляли на ночь при -20°С. Осадок меченой ДНК получали центрифугированием при 10 000 х g в течение 1 часа при 4°С, промывали 70% этанолом и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ.

3.1.4. Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей головного мозга крыс.

3.1.4.1. Получение срезов головного мозга.

Через фиксированное время после воздействия животным давали нембуталовый наркоз (60 мг/кг веса), затем вскрывали грудную клетку и проводили перфузию теплым физиологическим раствором с гепарином (10 ЕД/мл) через рорту со скоростью протекания 10-15 мл/мин. Затем вели перфузию фиксирующим раствором (4% параформальдегид на lxPBS). Выделение головного и спинного мозга производили через 1 час. Органы помещали в 30% раствор сахарозы на фиксирующем растворе и оставляли на ночь при -4°С. Далее ткань отмывали в растворе 30% сахарозы на lxPBS. Срезы толщиной 20-25 микрометров приготавливали на замораживающем микротоме.

Дальнейшие процедуры со срезами проводили в иммунологических стерильных планшетах (за исключением гибридизации, которая проводилась на стеклах) .

3.1.4.2. Анализ содержания ИЛ-2 и c-fos мРНК методом гибридизации in situ на срезах головного мозга крыс.

Срезы отмывали в растворе lxPBS в течение 5 мин, регидрировали в спирте (99% 2 раза, 96% 2 раза, 70% 1 раз и в воде 1 раз по 5 мин), обрабатывали протеиназой К 15 мин при 37° С (10мкг/мл в 50мМ Трис НС1, рН 7,5; ЮмМ ЭДТА; ЮмМ NaCl) и фиксировали 4% формальдегидом на lxPBS 5 мин. Для удаления излишка фиксатора срезы промывали 5 мин в стерильной воде и затем помещали на стерильные стекла.

Прегибридизацию проводили в течение 1 часа при 37°С во влажной камере в 1 мл гибридизационного раствора (60% деионизованный формамид; 0,3M NaCl; 0,03М цитрат Na; ЮмМ ЭДТА; 25мМ NaHP04 рН 7,4) содержащего 250 нг/мл фрагментированной ДНК спермы лосося.

Гибридизацию проводили при 37°С в течение ночи во влажной камере под покровным стеклом в 10 мкл гибридизационного раствора содержащего 200 нг денатурированной меченной кДНК ИЛ-2 или кДНК v-fos.

Покровное стекло удаляли в 60% формамиде на 2xSSC. Срезы переносили в иммунологические планшеты и отмывали в 2xSSC 30 мин, в lxSSC 30 мин при комнатной температуре, в 0,5xSSC 15 мин при 37° С, 0,5xSSC при комнатной температуре.

3.1.4.3. Иммунодетекцш комплекса dig^-кДНК- мРНК.

Срезы промывали буфером 1 (ЮОмМ Трис-HCl рН 7,5; 150мМ NaCl) 1 мин и 30 мин в буфере 2 (1% блокирующий реагент в буфере 1) с 0,3% Тритоном Х-100. Далее срезы инкубировали 1 час с антителами к дигоксигенину в 150 мкл буфера 1 с 0,3% Тритоном при покачивании. После чего срезы отмывались 2 раза по 15 мин буфером 1 и 2 мин буфером 3 (ЮОмМ Трис-HCl; ЮОмМ NaCl; 50mM MgCl2 рН 9,5).

Срезы инкубировали в 100 мкл красящего раствора в темноте в течение ночи, отмывали буфером ТЕ (ЮОмМ Трис-HCl рН8,0; 1мМ ЭДТА рН8,0) и помещали на стекла. Постоянные препараты готовили заключением срезов в желатин-глицериновую смесь. Фотографировали препараты, используя световой микроскоп. Число меченых клеток подсчитывали под микроскопом используя микроскопическую стандартную сетку.

3.2. Иммунохимическое выявление c-Fos- и ИЛ-2-подобиых белков в тканях головного мозга.

3.2.1. Иммунохимическое выявление c-Fos-подобных белков в тканях головного мозга крыс.

3.2.1.1. Получение срезов головного мозга крыс.

После глубокой анестезии (нембутал, 60 мг/кг веса животного) животным вскрывали грудную клетку и перфузировали интракардиально 50 мл нормального физиологического раствора, содержащего 50 ед/мл гепарина, затем 250 мл фиксирующего раствора:

4% параформальдегид, 0,2% пикриновая кислота в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4.

Через 1 час после фиксации ткань переносили в ОД М фосфат-забуференную 30% сахарозу (рН 7.4) для криопротекции; и оставляли в течение ночи при 4°С, пока мозг не опустится на дно раствора.

Приготавливали срезы на замораживающем микротоме.

3.2.1.2. Иммунохшшческое выявление c-Fos-подобиого белка.

Срезы отмывали в 0,1 М PBS (рН 7.4) при комнатной температуре 3 раза по 5 минут от излишка фиксажа и инкубировали их в растворе содержащем 10% телячью сыворотку на PBS и 0,4% тритон Х-100 около 1 часа. Отмывали PBS 3 раза по 5 минут и инкубировали с c-Fos антителами 2 суток при 4 С. Затем, после отмывки, инкубировали с вторичными антителами 1-2 часа, опять промывали и окрашивали 5-15 минут в растворе 0,02% диаминбензидина (DAB) на трис-буфере (5 мМ трис НС1 рН 7,4) с 0,001% Н202.

Далее срезы промывали, монтировали на стеклах (предварительно обработанных раствором желатина с хром-алюминевыми квасцами) и приготавливали постоянные препараты, покрывая канадским бальзамом.

3.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2 белка с использованием моноклональных ИЛ-2 антител.

3.2.2.1. Приготовление проб для определения содержания ИЛ-2 белка в структурах головного мозга мышей.

Через 24 часа после воздействия животных декапитировали, мозг извлекали, помещали на лед и отделяли исследуемые структуры: гиппокамп, таламическую и гипоталамическую области (совместно), кору и амигдалоидный комплекс. Каждую структуру гомогенизировали мягким раздавливанием в стерильном гомогенизаторе с добавлением ЮмМ HEPES-NaOH, рН7,2. На каждую пробу брались пробы от нескольких мышей. Пробы замораживали на 2 часа при -20°С, размораживали и центрифугировали 10 минут при 10000 об/минуту при 4°С. Собранный супернатант оставляли при -70°С.

3.2.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2 белка.

Определение содержания ИЛ-2 белка в пробах различных структур головного мозга мышей проводили по оригинальной методике InterTest Mouse IL-2 ELISA Kit (Genzyme) с использованием моноклональных ИЛ-2 антител.

Фотометрический анализ проб осуществляли на Multiskan Bichromatic (Labsystems).

3.3. Статистическая обработка результатов.

Данные, представленные в разделе "Результаты исследования" являются результатами 4-5 экспериментов, каждое определение проводилось в 3-4 повторах. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стыодента. Во всех расчетах за достоверный принимали 95% уровень значимости (Р<0,05).

Графики выполнены на IBM PC при помощи программы Origin, схемы головного мозга с помощью программы Corel Drow8 с использованием компьютерных карт Brain Maps (Swanson, 1992), анализ распределения метки в клетках головного мозга проводили с помощью системы ИстаВидеоТест 4.0.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Барабанова, Светлана Владимировна, Санкт-Петербург

1. Адо А.Д. Антигены как чрезвычайные раздражители нервной системы. М: 1951.-201 с.

2. Головко О.И., Гришина Т.В., Новикова Н.С., Носов М.А., Мюльберг А.А., Корнева Е.А., Казакова Т.Б. //Нейрохимия,- 1996. -Т. 13. N 3. - С. 195-205.

3. Гущин Г.В. Адренергические и холинергические механизмы функций лимфоидных клеток: Дис. . д-ра мед.наук.-С.-Петербург, 1992.-197 с.

4. Гущин Г.В., Яковлева Е.Э. Роль периферических холинергических и адренергических механизмов в регуляции иммунологических процессов.// Нейрогуморальная регуляция иммунного гомеостаза. -Л: -1986. -с. 101-102.

5. Казакова Т.Б., Гришина Т.В., Головко О.И., Гущин Г.В., Мюльберг А.А. Активация транскрипции гена интерлейкина-2 ядерными факторами селезенки и мозга иммунизированных крыс.//Бюлл.эксп.биол. и мед. 1994. - N5. - с.523-526.

6. Корнева Е.А. Нервная система и иммунитет. // Вестн.АМН CCCP.-1988.-N.il.-С.76-85.

7. Корнева Е.А., Клименко В.М., Шхинек Э.К. Нейрогуморальное обеспечение иммунного гомеостаза. Л.: Наука, 1978.-175 с.

8. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л.: Наука, 1988.-251 с.

9. Ю.Лондон Е.С. О влиянии удаления различных частей головного мозга на иммунитет голубей в отношении сибирской язвы. //Арх.биол.наук.-1899.- Т.7. С.177-187.

10. П.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984. 480 с.

11. Меерсон Ф.З., Сухих Г.Т., Каткова Л.С. Адаптация организма к стрессорным ситуациям и предупреждение стрессорных повреждений.// Вест.АМН СССР. 1984. - Т.4. - С.45-51.

12. Савченко Г.И. К вопросу о невосприимчивости к сибирской язве.//Врач. 1891.-N.5. - С.132-134.

13. Фролов Б.А. Стрессорные нарушения функций иммунной системы и их предупреждение: Дис. д-ра мед.наук. -Оренбург, 1987.373 с.

14. Чипенс Г.И., Корнева Е.А., Склярова С.Н., Клименко В.М., Клуша В.Е., Иевиня Н.Г., Вегнер Р.Э., Папсуевич О.С. // Рига, Латв.Акад.Наук. 1987.- С. 1-54.

15. Шхинек Э.К., Достоевская Л.П., Бирюков В.Д. О роли глюкокортикоидов в развитии гуморального иммунного ответа в целостном организме. //Пробл. эндокринологии. 1982. - Т.82. - N.1. -С.64-70.

16. Angel P., Imagama М., Chin R. et al. Phorbl ester-inducible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated trans-acting factor.// Cell. 1987. - V.49. - P.729-739.

17. Arajio D.M., Lapchak P.A.,Collier В., Quirion R. Localization of interleukin-2 immunoreactivity and interleukin-2 receptors in the rat brain: Interaction with the cholinergic system.//Brain Res. 1989. - V.498. - P.257-266.

18. Arya S.K., Wong-Staal F., Gallo R.C. Dexamethasone-mediated inhibition of human T cell growth factor and y-interferon messenger RNA.// J. Immunol.-1984. V.133. - P.273-276.

19. Awatsuji H., Furukawa Y, Nakajima M, Furukawa S, and Hayashi K. Interleukin-2 as a neurotrophic factor for supporting the survival of neurons cultured from various regions of fetal rat brain. //J Neurosci.Res. 1993.- V.35.-P.305-311.

20. Azad N., Agrawal C., Emmanuele M.- et al. Neuroimmunoendocrinology. //Amer.J. Reprod. Immunol. 1991. - V.26.-P.160-172.

21. Bading H., Ginty D.D., Greenberg M.E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. //Science. N.260. - P.181-186.

22. Baeurle P. A. The inducible transcription activator NF-kB: regulation by distinct protein subunit./ZBiochem.Biophys., Acta. 1991. -V.1072. - P.63-80.

23. Banks W.A., Kastin A.J., Broadwell R.D. Passage of cytokines across the blood-brain barrier.//NeuroImmunoModulation. 1995. - V.2. -N.4.-P.241-248.

24. Barve S.S., Cohen D.A., De Benedetti A., Rhoads R.E., Kaplan A.M. //Immunol. 1994. - V.152. -N.3. - P.l 171-1181.

25. Benveniste E.N., Merrill J.E. Stimulation of oligodendroglial proliferation and maturation by interleukin-2.//Nature. 1986.-V.321. -P.610-613.

26. Benveniste E.N., Whitaker J.N., Gibbs D.A., Sparacio S.M., Butler J.L. Human В cell growth factor enhances proliferation and glial fibrillary acidic protein gene expression in rat astrocytes. //Int.Immunol. 1989. - V.l. -P.219-228.

27. Bernardin R., Calogero A.F., Mauceri G. Rat hypothalamic corticotropin-realising hormone secretion in vitro is stimulated by interleukin-1 in an eicosanoid-dependent manner.//Life Sci.-1990. V.47. - P. 1601-1607.

28. Bialy M., Kaczmarek L. c-Fos expression as a tool to search for the neurobiological base of the sexual behaviour of males. //Acta-Neurobiol. Exp.Warsz.- 1996. V.56. - N.2. - P.567-577.

29. Bindoni M., Perciavalle V., Berretta S., Belluardo N., Diamanstein T. Interleukin-2 modifies the bioelectric activity of some neurosecretory nuclei in the rat hypothalamus .//Brain Res. 1988. - V.462. - P.10-14.

30. Blalock J.E. The immune system as sensory organ.//J.Immunol.1984. V.132. - P.1067-1070.

31. Bonaz В., Tach Y. Water-avoidance stress-induced c-fos expression in the rat brain and stimulation of fecal output: role of corticotropin-realising factor. //Brain Res. 1994. - V.641. - N.21. - P.21-29.

32. Bourne J.A. Handbook of Immunoperoxidase Staining Methods. Daco Corporation. Santa Barbara, 1983.- P.39.

33. Bozas E., Tritos N., Phillipidis H., Stylianopoulou F. At least three neurotransmitter systems mediate a stress-induced increase in c-fos mRNA in different rat brain areas. // Cell.Mol. Neurobiol. 1997. V.17. - N2. - P. 157169.

34. Brandhuber B.J., Boone Т., Kenney W.C., McKay D.B. Three-demensional structure of interleukin-2. //Science. 1987. - V.238. - P.1707-1709.

35. Brown J.R., Gozes J. Stress genes in the nervous system during development and aging diseases. In: Stress of life, from molecules to man.

36. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. N-Y. 1998. -V.851. - P.123-128.

37. Bullitt E. Expression of c-Fos-like protein as a marker for Neuronal Activity following noxious stimulation in the rat. //The J. of Comparative Neurol. 1990. N.296. - P.517-530.

38. Bullitt, E., Lee, Ch. L., Right, A.R. and Willcockson, H. The effect of stimulus duration on noxious-stimulus induced c-fos expression in the rodent spinal cord.// Brain Res. 1992. - V.580. - P. 172-179.

39. Bulloch K. Neuroanatomy of lymphoid tissue: a review. //Neuronal modulation of immunity.New York. 1985. - P.l 11-140.

40. Bulloch K., Moore R.Y. Innervation of the thymus gland by brain stem and spinal cord in mouse and rat.//Amer.J.Anat. 1981. - N162. - P.157-166.

41. Cavigelli M., Dolfi F., Claret F.-X., Karin M. Induction of c-fos expression through JNK-mediated TCF/Elk-1 phosphorylation. //EMBO J. 1995. V.14. - N. 23. - P.5957-5964.

42. Cerretti.D.P., Kereghan K., Larsen A. et al. Cloning, siguence, and expression of bovine interleukin-2.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1986. - V.83. -P.3223-2227.

43. Chaudhuri A. Neural activity mapping with inducible transcription factors. //Neuroreport. 1997. - V.8. - N.13. - P.iii-vii.

44. Chen D., Rothenberg R.V. Molecular basis for developmental changes in interleukin-2 gene in ducibility. //Mol.Cell.Biol. 1993. - V.13. -P.228-237.

45. Chen J., Kelz M.B., Hope B.T., Nakabeppu Y., Nestler E.J. Chronic Fos-related antigens : stable variants of delta FosB induced in brain by chronic treatments. //J.Neurosci. 1997. V.17. - P.4933-4941.

46. Chrousos G.P. Stressors, stress, and neuroendocrine interaction of the adaptive response. In: Stress of life, from molecules to man.

47. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. N-Y. - 1998. -V.851. - P.311-335.

48. Chrousos G.P., Gold P.W. The concepts of stress and stress system disorders: overview of physical and behavioral homeostasis. //JAMA. 1992. -V.267. P. 1244-1252.

49. Clark A., Docherty K. Negative regulation of transcription in eukaryotes. //Biochem.J. 1993. - V.296. - P.521-541.

50. Cohen F.E., Kosen P.A., Kuntz I.D., Epstein L.B., Ciardelli T.L., Smith K.A. Structure-activity studies of interleukin-2//Science. 1986. -N234. - P.349-352.

51. Crabtree G.R., Clipstone N.A. Signal transmission between the plasma membrane and nucleus of T-lymphocytes. // Annu.Rev.Biochem. -1994.-V.63.-P.1045-1083.

52. Curran T. The fos oncogene. In:The oncogene Handbook (Eds. E.P.Reddy and A.M.Skalka). 1988. P.307-325

53. Curran Т., Teich N.M. Candidate product of the FBJ murine osteosarcoma virus oncogene: characterization of a 55,000 dalton phosphoprotein.//J.Virol. V.42.P. -114-122.

54. Curran Т., Van Beveren C., Ling Nand Verma I.M. Viral and cellular fos proteins are complexed with a 39,000 dalton cellular protein.//Mol.Cell.Biol. 1985. -V.5. -P. 167-172.

55. Didier M., Roux P., Piechaczyk M., Verrier В., Bockaert J., Pin J.P. Cerebellar granule cell survival and maturation induced by K+ and NMDA correlate with c-fos proto-oncogene expression.//Neurosci.Lett. 1989. -V.107. - P.55-62.

56. Dragunow M., Goulding M., Faull R.L., Ralph R., MeeE., Frith R. Induction of c-fos mRNA and protein in neurons and glia after traumatic brain injury: pharmacological characterization.//Expl.Neurol.l990. V.107. -P.236-248.

57. Dragunow M., Robertson H.A. Localization and induction of c-Fos protein-like immunoreactive material in the nuclei of adult mammalian neurons. //Brain Res. 1988. V.440. - P.252-260.

58. Dragunow M.,Peterson M.R., RobertsonH.A. Presence of c-fos like immunoreactivity in the adult rat brain.//Eur.J.Pharmacol.l987. V.135. -P.113-114.

59. Du Bow M.S. The detaction and characterization of genetically programmed responses to environmental stress. In: Stress of life, from molecules to man. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. -N-Y. 1998. - V.851. - P.286-291.

60. Durand D.B., Shaw J.P., Bush M.R. et al. Characterization of antigen receptor response elements within interleukin-2 enhacer.//Mol.Cell.Biol. 1988. - V.8. - P.1715-1724.

61. Elliot J.F., Lin Y., Mizel S.B. et al. Induction of IL-2 messenger RNA inhibited by cyclosporin A. // Science. -1984. V.226. - P.1439-1441.

62. Felten D.L., Felten S.Y., Bellinger D.L., et al. Noradrenergic sympathetic neural interactions with the immune system: structure and function.//Immunol. Rev. 1987. - V.100. - P.225-260.

63. Flanagan W.M., Corthesy В., Bram R.J., Crabtree G.R. Nuclear association of a T-cell transcription factor blocked by FK-506 and cyclosporin A.//Nature. 1991. - V.352. - P.803-807.

64. Foletta V.C. Transcription factor AP-1 and the role of Fra-2.// Immun. and Cell Biol. 1996. V.74.-N.2. - P. 121-133.

65. Fraser J.D., Irving B.A., Crabtree G.R., Weiss A. Regulation of interleukin-2 gene enhancer activity by T-cell accessory molecule CD28.//Science. 1991. - V.251. - P.313-316.

66. Garrity P.A., Chen D., Rothenberg E.V., Wold B.J. Interleukin-2 transcription is regulated in vivo at the level of coordinated binding of both constitutive and regulated factors.// Mol. Cell. Biol. 1994. - V.14. - N.3.- P. 2159-2169

67. Gillis S., Crabtree G.R., Smith K.A. Glucocorticoid-induced inhibition of T-cell growth factor production. I. The effect on mitogen-induced lymphocyte proliferation.//J.Immunol. 1978. - V.123. - P. 16241631.

68. Gillis S., Crabtree G.R., Smith K.A. Glucocorticoid-induced inhibition of T-cell growth factor production. I. The effect on the in vitro generation of cytolitic T-cells.//J.Immunol. 1978. - V.123. - P.1632-1637.

69. Giulia С., Cirafici A.M., Vecchio G. Induction of the c-fos oncogene by thyrotroic hormone in rat thyroid cells in culture. //Science. 1986. V.233. - N.4762. - P.458-460.

70. Glaser R., Kennedy S., Lafuse W/Р/ et al. Phsychological stress-induced modulation of interleukin-2 production in periferal blood leukocytes.//Arch.Gen.Psychiatry. -1990. V.47. - P.707-712.

71. Glover J.N.M., Harrison S.C. Cristal structure of the heterodimeric bZIP transcription factor c-Fos-c-Jun bound to DNA. //Let. to Nature. 1995. -V.373. P.257-261.

72. Goetz M. Haw are neurons specified: master or positional control? //Trends in Neurosci. 1998. - V.24.-N.4.

73. Goldstone S.D., Fragonas J.-Ch., Jeitner T.M., Hunt N.H. //Biochim.Biophys.Acta.- 1995. V.1263. -N.2. - P.l 14-122.

74. Grabstein K., Dower S., Gillis S. et al. Expression of interleukin 2, interferon-y and IL-2 receptor by human pheripheral blood lymphocytes.// J.Immunol. 1986. - V.136. - P.4503-4508.

75. Grabstein K.Dower S., Gillis S. et al. Expression of interleukin-2, interferon-y, and IL-2 receptor by human periferal blood lymphocytes. // J.Immunol. 1986. - V.136. - P.4503-4508.

76. Granelli-Piperno A., McHugh P. Characterization of a protein that regulates the DNA-binding activity of NF-AT, the nuclear factor of activited T-cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V.88. - P. 11431-11434.

77. Greene W.C., Depper J.M., Kronke M., Leonard WJ. The human intrleukin-2 receptor: analisis of structure and function//Immunol.Rev. 1986. -V.92. - P.26-48.

78. Gullian W.E., Helmreich D.L., Watson S.J. Fos expression in forebrain afferents to the hypothalamic paraventricular nucleus following swim stress.//J.of Comparative Neurology. 1996. - Y.368. - N.l. - P.88-99.

79. Guthrie K.M., Gall C.M. Odors incriease Fos in olfactory bulb neurons including dopaminergic cells. //Neuroreport. 1995. Y.6. - N.16. -P.2145-2149.

80. Hamilton J. Colony stimulating factors, cytokines and monocyte-macrophages some controversies. //Immunology Today. - 1993. - Y.14. -P. 18-23.

81. Hanisch U.K., Seto D., Qurion R. Modulation of hippocampal acetylcholine release: a potent central action of interleukin-2.// Neursci. -1993. V.13. - P.3368-3374.

82. Hata R., Mies G., Wiessner C., Hossmann K.-A. Differential expression of c-fos and hsp72 mRNA in focal cerebral ischemia of mice. //NeuroReport. 1998. - N.9. - P.27-32.

83. Haugen P.K., Letourneau P.C.: Interleukin-2 enhanced chik and rat sympathetic, but not sensory, neurit outgrowth.//Brain Res.-1990.-V.25.-P.443-452.

84. Herrera D.G. and Robertson H.A. Unilateral induction of c-Fos protein in cortex following cortical devascularization. //Brain Res. 1989. -Y.503. P.205-210.

85. Hill C.S., Triesman R.//Cell. 1995. N.80., P.199-211.

86. Hillhouse E.W. Interleukin-2 stimulates the secretion of arginine vasopressin but not corticotropin-releasing hormone from rat hypothalamic cells in vitro. //Brain Res. -1994. -Y.650. -P.323-325.

87. Honkaniemi J., Kainu Т., Ceccatelli S., Rechardt L., Hijkfelt Т., Pelto-Huikko M. Fos and jun rat central amygdaloid nucleus after stress. //Mol.Neurosci. 1992. - N.3. - P.849-852.

88. Hunt S.P., Pini A. and Evan G. Induction of c-Fos-like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation.//Nature. 1987.- V.328. -P.632-634.

89. Hunt S.P., Pint A., Evan G. Induction of c-fos like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation. //Nature. 1987. - V.328. -N.6131. - P.632-663.

90. Jain A.J, Valge-Archer V.E., Sinskey A.J., Rao A. The AP-1 site at -150 b.p., but not the NF-кВ site, is likely to represent the major target of protein kinase С in the interleukin-2 promoter. //J.Exp.Med. -1992. -V.175. -P.853-862.

91. Jamali A.K., Tramu G. Daily cycle of fos expression within hypothalamic POMC neurons of the male rat. // Brain Res. 19S>7. V.771. N.l. 45-54.

92. Janssen R.A.J., Mulder N.H. The Т.Н. and de Leij L. The immunological effects of interleukin-2 in vivo.//Cancer Immunol.Immunother. 1994. V.39.P.207-216.

93. Jelinek D.F. and Lipsky P.E. Comparative activation requirements of human peripheral blood, spleen, and lymph node В cells.//J.Immunol. 1987. V.139. P.1005-1013.

94. Kakiuchi Т., Tamura Т., Gyotoku Y. and Nariuchi H. IL-2 production by В cells stimulated with a specific antigen. //Cell Immunol. 1991.V.138 .P.207-215.

95. Kashima N., Nishi-Takaoka C., Fujita T. et al. Unique structure of murine interleukin-2, as deduced from cloned cDNAs.// Nature.- 1985,-V.313.-P. 402-404.

96. Kasof G.M., Smeyne R.J., Curran Т., Morgan J.I. Developmental expression of Fos-LacZ in the brain of postnatal transgenic rats.//Brain Res. Develop.Br.Res. 1996. V.43. N.l-2. P. 191-197.

97. Kemplay, S.K. and Webster, K.E. A qualitative and quantitative analysis of the distributions of cells in the spinal cord and spinomedullary junction projecting to the thalamus of the rat.//Neurosci. -1986.-V.17.-P.769-789.

98. Пб.Копопеп J., Honkaniemi J., Alho H., Koistinaho J., Iadarola M., Pelto-Huikko M. Fos-like immunoreactivity in the rat hypothalamic-pituitary axis after immobilization stress.// Endocrinology. -V.130. -P.3041-3047.

99. Korneva E.A., Rybakina E.G., Fomicheva E.E., Kozinets I.A., Shkhinek E.K. Altered interleukin-1 production in mice exposed to rotation stress. // Int.J.Tiss.Reac.-1992. -V.XIV. N.5. -P.219-224.

100. Kruijer W., Cooper J.A., Hunter Т., Verma I.M. Platelet-derived growth factor induces rapid but transient expression of the c-fos gene and protein. // Nature. V.312. N.20/27. P.711-715.

101. Kujubu D.A., Lim R.W., Varnum В., Herschman H.R. Induction of transiently expressed genes in PC12 pheocromocytoma.//Oncogene. -1987. -N.l. -P.257-262.

102. Kuziel W.A., Green W.C.//J.Invest.Dermat.-1990.-V.94.-N27S.?

103. Kuziel W.A., Greene W.C. Interleukin-2. In A.Thompsen (Ed) The Cytokine Handbook. Academic Press.London.l991.p.83-102.

104. Lanterni-Minet, M., Weil-Fugazza, J., De Pommery, J. and Menetry, D. () Hindbrain structures involved in pain processing as revealed by the expression of c-Fos and other immediate early gene proteins.// Neurosci.-1994.-V.58.-P.287-298.

105. Lapchak P.A. A role for interleukin-2 in the regulation of striatal dopaminergic function.//Neuroreport. 1992. -V.3. -165-168.

106. Lapchak P.A., Arajio D.M., Quirion R.,Beaudet A.: Immunoautoradiographic localization of interleukin-2-like immunoreactivity and interleukin-2 receptors (Tac antigen-like immunoreactivity) in the rat brain.//Neuroscience.-1991.-V.44.-P. 173-184.

107. Lavrovsky Y., Mastyugin V., Stoltz R.A., Abraham N.G. Specific inhibition of c-fos proto-oncogene expression by triple-helix-forming oligonucleotides.//J. of Cellular Biochemistry. 1996. N.61. P.301-309.

108. Le Roux I., Joliot. A.H., Bloch-Gallego E. et al. Neurotrophic activity of the Antennapedia homeodomain dependson its specific DNAbinding properties.// Proc. Natl. Acad.Sci. USA.- 1993.- V.90.- P. 91209124.

109. Lee, J.H. and Beitz, A.J. The distribution of brain-stem and spinal cord nuclei associated with different frequences of electroacupuncture analgesia.// Pain.-1993.-V.52.-P.l 1-28.

110. Levi-Montalcini R., Aloe L., Alleva E. //Progress in NeuroEndocrinelmmunology.- 1990. -V.3. -P. 1-10.

111. Lord K.A., Abdollahi A., Hoffman-Liberman В., Liberman D.A. Proto-oncogenes of the fos/jun family of transcription factors are positive regulators of mieloid differentiation. //Mol.Cell Biol. -1993. -V.13. P.841-851.

112. Maki Y., Bosch T.J., Davis C., Starbuck M., Vogt P.K. Avian sarcoma vims 17 carries the jun oncogene. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA. -1987. -V.84. P.-2848-2852.

113. Maniatis Т., Goodbourn S., Fischer J.F. Regulation of inducible and tissue-spesific gene expression.//Science. -1987. -V.236. -P. 1237-1245.

114. Marshall C.J. Oncogenes and growth control.//Cell. -1987. -V.49. P.723-725.

115. McCaffrey P.G., Perrino B.A., Soderling T.R., Pao A. NF-ATp, a T-lymphocyte DNA-binding protein that is a target for calcineurin and immunosuppressive drugs.//Biol.Chem. -1993. -V.268. -P.3747-3752.

116. McHaughton L.A., Hunt S.P. Regulation of gene expression in astrocytes by excitatory amino acids.// Mol.Brain Res. 1992. 261-266.

117. Mehler M.F., Goldstein H., Kessler J.A.//Cytokines and the CNS/ Ed.Ransoholff R.M., Benweniste E.N., Roca Ration, New York, London, Tokyo: CRC Press Inc. -1996. -P.l 16-150.

118. Melia K.R., Ryabinin A.E., Schoroeder R., Bloom F.F., Wilson M.C. Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress.// J.of Neuroscience. 1994. V.14. N.10. P.5929-5938.

119. Merrill J.E. Interleukin-2 effects in the central nervous system. //Ann.NY Acad.Sci. -1990.-V.594.-P. 188-199.

120. Mitchel P.J., Wang C., Tjian R. Positive and negative regulation of transcription in vitro: enhancer-binding protein AP-2 is inhibited by SV40 T antigene.//Cell. -1987. -V.50. -P.847-861.

121. Monjan A.A. Stress and immunologic competence: studies in animals.//Psyhoneuroimmunology. -New York. -1981. -P. 185-228.

122. Morgan J.I. and Curran T. Role of ion flux in the control of c-fos expression./ZNature. 1986. -V.322. -P.552-555.

123. Mouzaki A., Zulber R.H., Doucet A., Rungger D. ■ Trans-active factors controlling the IL-2 gene in adult human T-cell subsets.//Mediators of Inflamation. -1992. -V.l. -P.33-37.

124. Mouzaki A., Weil R., Muster L., Rungger D. Silencing and transactivation of the mouse IL-2 gene in Xenopus oocytes by proteins from resting and mitogen-induced primary T-lymphocytes.// The EMBOY. -1991. -V.10.-N6.-P.1399-1406.

125. Muller Y.M., Krauss В., Kaltschmidt C., Baellerle P.A., Rupee R.A. Hypoxia induces c-fos transcription via a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway. //J.Bio.Chem. 1997. V.272. N.37. P.23435-23439.

126. Muller R., Mumberg D., Lucibello F.C. Signals and genes in the control of cell-cycle progression. //Biochim.Biophis.Acta. -1993. -V.l 155. -P.151-179.

127. Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J. and Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc.// Nature.-1984.-V.312.-P.716-720.

128. Murphy Т.Н., Worley P.F., Nakabeppy Y„ Christy В., Gastel J. and Baraban J.M. Synaptic regulation of immediate early gene expression in primary cultures of cortical neurons. //J.Neurochem. -1991. -V.57. -P. 18621872.

129. Naito Y., Fukata J., Tominaga Т., Masui Y., Hirai Y., Murakami N., Tamai S., Mori K., Imura H. Adrenocorticotropic hormone-releasing activities of interleukins in a homologus in vivo sistem.// Biochem.Biophis.Res.Commun. 1989. -V.164. P. 1262-1267.

130. Nelson B.N., Lord J.D., Greenberg P.D. //Nature.-1994.-V.594.-P.188-199.

131. Nirula A.,Moore D.Y., Gaynor R.B. Constitutive binding of the transcription factor interleukin-2 (IL-2) enhancer binding factor to the IL-2 promoter. //J.Biol.Chem.-1997.-V.272.-N.12.-P.7736-7745.

132. Nistico G., De Sarro G. Is interleukin 2 a neuromodulator in the brain? //Trends in Neurosciences. -1991.- Vol.l4.-N.4.-P. 146-150.

133. Northrop J.P., Hos N., Chen L. et al. NF-AT components define a family of transcription factors targeted in T-cell activation.// Nature. -1994. -VJ% -P.497-502.

134. Parrott R.F., Vellicci S.V. Stress-induced changes in c-fos immunoreactivity in the porcine brain. //British Veterinary J. -1994. -V.150. -N.4. P.355-363.

135. Peretti M., Becherucci C., Scapigliati G. The effect of adrenalectomy on IL-1 release in vitro and in vivo.//Br.J.Pharmacol. 1989.V.98.P.1137-1142.

136. Petitto-JM; Huang-Z. Molecular cloning of a partial cDNA of the interleukin-2 receptor-beta in normal mouse brain: in situ localization in the hippocampus and expression by neuroblastoma cells.//Brain-Res.-1994.-V.650.-N1.-P.140-150.

137. Pulverer B.J., Kyriakis J.M. Avruch J. et al. Phosphorylation of c-jun mediated by MAP kinases.// Nature. -1991.-V.353. -P.670-674.

138. Raber J. and Bloom F.E.IL-2 induces vasopressin release from hypothalamus and the amigdala: Role of nitric oxide-mediated signaling. //J.Neurosci. 1994. -V.14. -P.6187-6195.

139. Ram Z., Walbridge S., Heiss J.D., Culver K.W., Blaese R.M. , Oldfield E.H. In vivo tranfer of the human interleukin-2 gene: negative tumoricidal results in experimental brain tumors.// J.Neurosurg. 1994. -V.80. -P.535-540.

140. Reed J.C., Alpers J.C., Nowell P.C. Sequential expression of proto-oncogenes during lectin-stimulated mitogenesis of human lymphocytes.//Proc.Nat.Acad.Sci.USA -1986. -V.83. -P.3982-3986.

141. Reeves R., Spies A.G., Nissen M.S. et al. Molecular cloning of a functional bovine interleukin-2 cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986.-V.83.- P. 3228-3232.

142. Rivest S., Laflamme N. Neuronal activity and neuropeptide gene transcription in the brains of immune-challenged rats.//J.Neuroendocrinol. -1995. -V.7. -N.7. -P.501-525.

143. Rossi D., Conti A.M.F., De Grada L., Larizza L. Hypertonic stress induces c-fos but not c-jun expression in the human embryonal EUE epithelial cell line. // European J. of Cell Biology. 1995. N.68. P.457-462.

144. Roy S., Chapin R.B., Cain K.J., Charboneau R.G., Ramakrishnan S., Barke R. МофЫпе inhibits transcriptional activation of IL-2 in Mouse Thymocytes.//Cellular Immunology.-1997.-N.179.-P. 1-9.•■.„•.-г

145. Rybakina E.G., Shanin S.N., Kozinets I.A., Fomicheva E.E., Korneva E.A. Cellular mechanisms of cold stress-related immunosuppression and the action of interleukinl. //Int.J.Tiss.Reac.-1997.-V. XIX.-N.3/4.-P.135-140.

146. Sagar S.M., Sharp F.R., Curran T. Expression of c-Fos protein in brain:metabolic mapping at the cellular level. //Sci. -1988. -V.240. -P.1328-1331.

147. Samalli A.S., Cotter T.G. Heat shock proteins increase resistance to apoptosis. //Exp.Cell.Res. 1996. N.223. P.163-170.

148. Sei Y., Vitkovic L., Yokoyama M.M. Cytokines in the central nervous system: regulatory roles in the neuronal function, cell death and repair.// Neuroimmunomodulation.- 1995.-V.2.-P. 121-133.

149. Seigel L.J., Harper M.E., Wong-Staal F. et al. Gene for T-cell growth factor: location on human chromosome 4g and feline chromosome В1.//Science.- 1984.-V.223.-P. 175-178.

150. Selye H. A syndrome produced by diverse nocuous agents. //Nature.-1936.-V.138.-P.32.

151. Selye H. Stress and disease. // Science. 1955. N.122. P.625-631.

152. Selye H. Thymusand adrenals in the response of the organism to injuries and intoxication. // Br.J.Exp.Pathol. 1936a. N.17. P.234-248.

153. Sepiashvili R.I., Malashkhia Yu.A., Nadareishvili Z.G., Malashkhia V.Yu. Immune system of the brain, neuroAIDS, problem and perspectives (Facts and conceptual position). //Int.J.Immunorehabilitation. -1996.-N.3. -P. 11-16.

154. Shaw J.P. Utz P.J. Durand D.B. et al. Identification of a putative regulation of early T cell activation genes.// Science. -1988. -V.241. -P.202-205.

155. Sheng M., Greenberg M.E. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system.//Neuron. 1990,- V.4. -P.477-485.

156. Sheridan J.F., Feng N., Bonneau R.H. et al. Restraint stress differentially affects anti-viral cellular and humoral immune responses in mice.//J. Neuroimmunol.-1991 .-V.31 .-P.245-255.

157. Shimojo M., Imai Y., Makajiama K., Mizushima S., Uremura A., Kohsaka S. Interleukin-2 enhanced the viability of primary cultured rat neocortical neurons.//Neurosci.Lett.-1993 .-V. 15.-170.

158. Smith E.M., Blalock J.E. A complete regulatory loop between immune and neuroendocrine system.//Enkephalins and endorphins: Stress and immune system. -1986.-P. 119-127.

159. Stagaard M., Balslev Y., Lundberg J.J., Mollgaed K. Microglia in the hypendyma of the rat subcommissural organ following brain lesion with serotonin neurotoxin. //Neurocytol.-1987.-N.16.-P. 131-142.

160. Swanson L.W. Brain maps computer grafics files. Amsterdam,The Netherlands: Elsevier Sci. B.V., 1992.

161. Swanson L.W. Brain maps: Structure of the rat Brain. -N.Y.:Elsevier, 1992.

162. Szekly A.M., Barbaccia M.L., Costa E. Activation of specific glutamat receptor subtypes increases c-fos proto-oncogene expressioninooprimary cultures of cerebral granule cells.//Neuropharmacology.V.26.P.1779-1782.

163. Szekly A.M., Costa E., Grayson D.R. Transcriptional program coordination by N-metil-D-aspartat-sensetive glutamate receptor stimulation in primary cultures of cerebellar neurons. //Mol.Pharmacol. V. 38. P.624-633.

164. Tancredy V., Zona C., Velotti F., Eusebi F., Santoni A. Interleukin-2 suppresses established long-term potentiation and ihibits its induction in the rat hippocampus.//Brain Res.-1990.-V.525.-P.149-151.

165. Taniguchi T. and Minami Y. The IL-2/IL-2 receptor system: A current overview//Cells.-1993 .-V.73.-P.5.

166. Taniguchi Т., Matsui H., Fujita Т., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., Hamuro J. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2//Nature.- 1983.-V.302.-P.305-310.

167. Tedeschi В., Barrett J.N., Keane R.W. Astrocytes produce interferone that enhances the expression of IL-2 antigens on a subpopulation of brain cells.//J.Cell.Biol. 1986. V.102.P.2244-2253.

168. Triesman R. Transient Accumulation of c-fos RNA following serum stimulation requires a conserved 5'element and c-fos 3'sequences. //Cell. 1985. V.42. P.889-902.

169. Tsigos С., Chrousos G.P. Stress, endocrine mamilar station and diseases. In: Handbook of Stress Medicine. Ed.Cooper C.L. CRC Press, Boca Raton, Fl. 1995. P.61-65.

170. Tu Z. and Anders M.W. Enhancement of gene expression by transcryption factor AP-1 is dependent on orientation of AP-1 element. // BBRC.-1997.-V.238.-N.2.-P.285-288.

171. Varmus H.E. Oncogenes and transcriptional control.// Science.1987.-V. 238. -P.1337-1339.

172. Vellucci S.V., Parrott R.F. Expression of c-fos in the ovine brain following different types of stress, or central administration of corticotropin-realising hormone. //Experimental Physiology. 1994. V.79. N.2. P.241.

173. Veyrune J.L., Carillo S., Vie A., Blanchard J.M. c-fos mRNA instability determinants present within both the coding and the 3' non coding region link the degradation of this mRNA to its translation. //Oncogene. 1995. V.ll. N.10. P.2127-2134.

174. Wan W., Wermore L., Sorensen C.M., Greenberg A.H., Nance D.M. Neural and biochemical mediators of endotoxin and stress-induced c-fos expression in the rat brain. //Brain Res.Bull. 1994. N.34. P.7-14.

175. Weir M.P., Chaplin M.A., Wallace D.M. et al. Structure-activity relationships of recombinant human interleukin-2.// Biochem.1988,- V.27.-P. 6883-6892.

176. Welsh M.S., Gaestel M. Small Heat-shock protein family: function in health and disease. In: Stress of life, from molecules to man. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. N-Y. 1998. V.851. P.28-34.

177. Wingender E. Compliation of transcription regulating proteins.// Nucleic Acids Res.-1988.-V.16.-N5.-P.1879-1902.

178. Wolfe S.A., Zhou P., Dijtsch V., Chen L., You A., Mo S.N., Crabtree G.R., Wagner G., Verdine G.L. Unuseal rel-like architecture in the DNA-binding domain of the transcription factor NFATc.// Nature.-1997.-V.385. N.6612.-P.172-176.

179. Yaseen N.R., Maizel A.L., Wang F., Sharma S.Comparative analysis of NF-AT (nuclear factor of activated Tcells) complex in human T and В lymphocytes.//J. Biol. Chem.--V.268.-N.19.-P. 14285-14293.

Информация о работе

Барабанова, Светлана Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в клетках головного мозга и селезенки при стрессорных воздействиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы