Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Скрининг, выделение и изучение специфичности новых рестрикционных эндонуклеаз

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Скрининг, выделение и изучение специфичности новых рестрикционных эндонуклеаз"

8 ОД

На правах рукописи УДК 577.1о2.314'14

КОРОЛЕВ СЕРГЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

СКРИНИНГ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ НОВЫХ РЕСТРИКЦНОННЫХ ЭНДОНУКЛЕАЗ

(03.00.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Центре "Биоинженерия" РАН и Институте Виомедлцинской Химии РАМН.

Научный руководители: доктор биологических наук кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук кандидат бнологичсеких наук

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится " 7 1 ы ____ 1996 г. в у ~7"

час на заседании Диссертационного совета (Д.001.02.01) при Институте шггания РАМН по адресу: 109240, Москва, Устьинский проезд, 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН.

Автореферат разослан "■47" с£. юэа г-

Н.Н.СОКОЛОВ М.А.ЭЛЬДАРОВ

Л.Б.Ребров В.О.Речинекий

ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

У/. ,, г, -//.с

Учеяый секретарь Диссертапионного совета, кандидат медидипскях ваук

В.М.Жшшченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБЛЕМЫ

Актуальность проблемы. Обнаружение с начале шестидесятых годое феномена хозяйской специфичности (Lüne S.E., Human M.L., 1052; Bertani G., Weigie J.J., 1953) и изучение лежащих в его основе биохимических мехзшззмов привели к открытию ферментОЕ системы R-M (рестрикиии-модифгжвции) (Arber V/., Dussoix D., 1962; Arber W., 1065). Одним ил компонентов этой системы являются сайт-специфические зндонуклеазы (рестриктазы класса II; КФ 3.1.23.4), узнающие на ДНК определенные участки последовательности нуклеотидов (сайты) и гпдролизующие двунитевуга ДНК на фрагменты по строго ограниченному числу точек расщепления. Другой компонент системы R-M представляет собой специфическую ДНК-метилазу, осуществляющую метилирование определенных оснований в сайте расщепления и защищающую тем самым участок ДНК от воздействия сопряженной рестриктазы. Таким образом, координированное функционирование зтих двух компонентов системы R-М в клетке предотвращает гидролиз собственной ДНК и позволяет узнавать и быстро разрушать проникающую в клетку чужеродную ДНК.

Уже первая сайт-специфическая зндонукдеаза Hindll из Haemophillus influenzae была успешно использована при физическом картировании структуры нуклеиновой кислоты впруса SV40 (Danna К., Natlrans D., 1971). Наследовавшее вслед за этим обнаружение ряда рестриктаз с коеой специфичностью (EcoHl, BamHl, Л/uJ и др.), а также выделение ДШС-лигаоы, дало исследователям уникальные возможности для манипулирования генетическим материалом. В настоящее время рестриктазы класса И широко используются в структурных исследованиях ДНК, молекулярном клонировании, являются удобной моделью для изучения механизмов ДНК-белковых взаимодействий (Wilson J.J., 1991).

На сегодня известно более 2500 зндонуклевз рестрикции, обладающих 198 различными специфичностяии (Roberts R.J., Macelis D-, 1994), однако поиск новых рестриктаз, особенно что касается еверхкрутгаощепяхцгех ферментов, узнающих протяженные участки яуклеотпдной последовательности на ДНК, не утратил своей актуальности. Основным стимулом для этих исследований служит необходимость пополнения: арсенала рестриктаз ферментами с новой субстратной специфичностью, и тем самым, расширения возможностей их кеполь.зешапкя л молекул-ярпо-гецоткческЕх работ«х. При атом, s ходе поиска выявляются ферменты как ■? повей специфичностью действия

(прототипы), так и аналога уже известных рестриктаз (изонлазомеры). Кроме того, немаловажное значение имеет обнаружение более активных продуцентов кэошкзомеров известных рестриктаз, что позволяет упростить к удешевить технологию кх получения, замена патогенных для человека, штаммов-продуцентов па условно патогенные и непатогенные, получение новых данных о распространении рестриктаз в клре прокариотических организмов, что имеет значение для выбора перспективных для поиска рестриктаз таксонов микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в поиске штаммов микроорганизмов, продуцирующих новые эндонуклеазы рестрикции класса II, их выделении п идентификации. В соответствии с поставленной деяью решались следующие задачи:

- выявление штаммов бактерий, обладающих сайт-специфической активностью, в том чж еле и сверхкрупнощепящих рестриктаз, оптимизация условий культивирования продуцентов;

- выделение препаратов новых ферментов рестрикции, имеющих высокую степень функциональной чистоты, характеристика их некоторых свойств и изучение субстратной специфичности;

- определение строения сайта узнавания и положения точки расщепления нуклеотидной последовательности дли новых рестриктаз.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате поиска сайт-специфических эндонуклеаз, проведенного среди 195 штаммов бактерий, обнаружено 22 рацее не описанных продуцента этих ферментов. На основе известкой гипотезы МакКлелланда (1988) о корреляции между структурой сайта узнавания рестриктаз класса II и содержанием GC пар в хозяйской ДНК, синтезирующих эти ферменты микроорганизмов, успешно апробирован новый подход к поиску сверхкрупнощепящих рестриктаз, крайне удобный для контролируемого растепления крупных геномов. Результатом этого явилось обнаружение у штаммов Brevibacterium я Corynebactertum днух новых сверхкрупнощепящих эндонуклеаз, одна из которых, CspBÍ, была выделена и идентифицирована как истинный изошнзомер Notl, узнающий восьминуклеотидный сайт э'-GC4GGCCGC-3' . Кроме того, получены в очищенном виде препараты еще шести новых рестриктаз, изучены некоторые их свойства, субстратная специфичность, определены структура сайтов узнавания и положение точки расщепления нуклеотидной последовательности на ДНК.

Практическая значимость работы заключается в том. что в ходе ее выполнения были выделены истинные изошизомеры ряла рестриктаз (АтП, ВатШ< Нас III, Рои II, /Vo£I), нашедших широкое применение в генно-пнжекерных и бкотехкологяпеских работах. Препараты новых ферментов пропхтп апробацию в научно-исследовательской работе в Институтах системы РАН п РАМН, имеются положительные отзывы о высокой степени функциональной чистоты этих рестриктаз и их пригодности для целей мояекулярно-геяетическях исследований.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Евроазиатском симпозиуме по современным направлениям биотехнологии: генодиагностика и гевотерапия (Турцля, Анкара, 1935), неоднократно докладывались на совместных научных семинарах лабораторий генетической инженершт ИБМХ РАИН и центра "Биоинжеяеригя" РАН.

Пуб.тктацют. По материалам диссертации опубликовано и находится а печатп 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включая 12- табл. и рис., и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы п методы", "Результаты и их обсуждение", "Выводы", "Приложения" и "Список литературы".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные культуры, использованные в качестве объектов для поиска новых продуцентов рестриктаз, были получены из коллекций ГИСК им. Л.А. Тарасовича, ВКМ РАН, музеев культур ИБМХ РАМН и ИБФМ РАН. Культивирование штаммов микроорганизмов проводили при 37°С в аэробных условиях на качелках или я ферментере до поздней логарифмической фазы роста на среде Хоттянгера или питательной среде состава (г/л): бактотрнптон - 10; дрожжевой экстракт - 5 (Difco, США), NsC). - 10. Биомассу хранили при -20°С. Определение сайт-епецнфической эндонуклеззиой активности в микробных клетках проводили с помощью толуольного экспресс-метода (Соколов H.H. с соавт., 1984). Активность рестриктаз в исследуемых препаратах тестировали по их способности специфически фрагдгентировать ДИК фага X илп иные ДНК-субстраты с известной первичной структурой. Определение активности рестриктаз проводили в оптимальных условиях (New Englajid liioLabs, cat. 1989-

1995>. За единицу активности рестриктаз принимали количество фермента (в мкд), необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага /. {ДНК Ас12 для СзрШ) з& 1 ч инкусашш в оптимальных условиях тшкубацконной смеси. Электрофоре.": ДНК в эгарозкьк и полиакрилампдных гелях проводили как описано (Sainbrook ■!.. е.a., 10S9). Электрофорез белков в полиакрпламидном геле в присутствии додецллсульфата натрия проводили по Laeminli (1970).

Выделение рестрпктаа из бесклеточных экстрактов, полученных после ультразвуковой дезинтеграции микробных клеток и последующего ультрацектрвфуптрования (105.000 g, 60 мин), проводили путем жидкостной колоночной хроматографии на фосфоцеллюлозе, ДЭАЭ-пеллюлозе (DE 52: Whatman, Англия), геларикагарозе CL-6B, голубая сефароза CL-6B, ДНК-целлюлоза (Pharmacia, Швеция). Все операции по очистке рестрнктаз осуществляли при +4°С.

Для определения структуры участка узнавания реетриктаз и точки расщепления нуклеотидной последовательности ДНК использовали метод Brown и Smith (1980), основанный на расщеплении продуктов элонгации ДНК-полимеразкой реакции, полученных на матрице, содержащей сайт рестрикции, с помощью соответствующего прайкерз. Сопоставление подвижности в секвеикрующем геле продуктов гидролиза со стандартными образцами реакции секвеяирования по Сзнгеру, полученных с помощью ДНК-полтшерэзы фага Т7 ("секвеназы") в тех же уеловиях, позволяет точно определить как последовательность нуклеотидов сайта-мпшени, так и точку расщеплепия фосфодизфирной связи на ДНК для соответствующей сайт-специфической зндонуклеазы.

В работе использовали рестрпктазы Notl, Нас III, Agéí, ДНК вирусов Ad2, SV40, фХ174, фага Т7 производства фирмы New England Bi.oLabs (США), PvuII, EcoRl, BamHl, Hindlll, Avail, Pstl и др. - фирма Promega (США), рестриктазу BavAl (ИБМ.Х РАМН), Ecoi.1l - производства фирмы MBI Fermentas (Литва); ДНК- лигазу фага Т4, ДНК-ползшеразу фага Т4, ДНК-полнмеразу фага Т7 ("секвеназа") - коммерческие препараты фирмы USB (США)- ДНК фага /.CÍÍ8Ü7S7, рВК322, pUCíS, pBbiesoript SK выделены, как. описано (Sambrook J., е.а., 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Скршпшг продуцентов новых рестриктаз класса II,

В настоящее время для поиска новых, жтаммоя-продуцентов ондонуклеаз рестрикции используются три основных методических подхода:

1) генетический, основанный на ограничении развития фагов различными бактериальными хозяевами (Luria S.E., Human M.L., 1952).

2) биохимический, заключающийся в том, что бесклеточный экстракт после разрушения клеток подвергают хроматографии на том или ином сорбенте, после чего в частично очищенном препарате определяют сайт-специфическую эндонуклеазкую активность (Green P.J., е. а., 1978; PirottaV., Bickle Т.А., 1980).

3) в последние годы широкое применение для поиска продуцентов рестриктаз нашли экспресс-методы анализа, главное преимущество которых состоят в простоте и экономичности при серийном скрининге большого числа микроорганизмов на наличие рестриктазной активности (Smith D.I., е. а., 1976; Соколов H.H. с соавт., 1986; Белавин П.А. с соавт., 1988; Repin V.E., Degtyarev S.K., 1932).

В нашей работе в качестве методического подхода для скрининга штаммов-продуцентов новых рестриктаз был использован экспресс-метод определения салт-специфнческой зндонуклеазной активности в толуольньтх лизатах бактериальных клеток (Соколое H.H. с соавт., 1984). Метод основан на локализации рестриктаз в периплазматическом пространстве и (или) ва внешней поверхности цитоплазматической мембраны (Heppler L.A., 1971), вследствие чего вызываемое органическим растворителем нарушение целостности клеточной стенки в результате экстрагирования липидного комплекса приводит к повышению ее проницаемости и высвобождению пйришхазматических белков. Экспресс-метод позволяет тестировать рестриктазную активность как у грамположительных, так и у грамотрицательных микроорганизмов, хорошо воспроизводим, экономичен, удобен для скринирования большого числа образцов биомассы, выращенных в небольших объемах среды.

Для определения сайт-специфической зндонуклеазной активности в микробных клелт<ах биомассу выращивали в 30-50 мл среды, собирали центрифугированием, суспендировали в 10 мМ калий-фосфатном буфере, pH 7.4, содержавшем 1 мМ 2 мерк-аптозгзнол и 0,5 мМ ЭДТА. до А260=15-17 ОЕ и суспензию обрабатывали толуолом в конечной концентрации

10%. Тояуодыше экстракт. <1-80 мкл) инкубировали с ДНК-субстрзтом (5-30 кии, 37°С) б буферном растворе со средней ионной силой (Маыиатис Т., Сзмбрук Дж., 1084), после чего реакцию останавливали и продукты гидролиза ДНК анализировали методом электрофореза в агарооиом геле.

На рис.1 приведена типичная элоктрофореграммэ разделения продуктов гидролиза ДНК фага л. толуольными экстрактами из клеток Bacillus cereus ВКМ-814 (аналогичные эдектрофорегр&ммы для др. продуцентов не приведены).

Рис.1. Злектрофоретическое разделение в 1% агарозв ом геле продуктов гидролиза ДНК фага толуольными экстрактами из клеток В. eurem. Пробы объемом 50 мкл содержали ДИК фага к (1 мкг), инкубационный буфер для BcuAl п годуольвый экстракт: 2.5 (1), 5 (2), 7.5 (3), 10 (4), 12.5 ккл (5). Инкубация при 37«с в течение 15 мин.

До последнего времени стратегия поиска новых рестрпктаз предполагала либо бессистемный ("стихийный") анализ активности »тих ферментов у представителей различных таксономических групп, либо тестирование звдонуклеаавой активности у -ликроорганизмов б пределах одного вида или рода (Реяни В.Е., Щелкунов С.Н., 1990). Именно по этим двум направлениям и развивались наши исследования на первых этапах работы, когда были скршшрованы представители таксонов микроорганизмов, наиболее широко представленных в списках эндонукяеаз рестрикции Р.Робертса (Roberts R.J., 1930-1994): Bacillus, Esherichia, Pseudomonas и др.

4

1 2 3 4 5

Как видно яд тлйл.1, среди 195 сбследоваляых штаммов бактерий у 22 была йь/явлева .активность звдонуклсаз, специфически фрагментирующвх ДНК фага X. Активность эндояуклеаз проявлялась в присутствии лишь ионов Mg2+, SAM и ATP не являлись кофакторами ферментов. Согласно классификации рестриктаз (Boyer H.V., 1971) эти зндонуклеазы были отнесены к рестриктазам класса II и обозначены в соответствии с общепринятой номенкля турой ферментов рестрикции (Smith И.О., Nathans D., 1373).

Микроорганизм Число Число % GC

обследованных обнаруженных пар

штаммов рестриктаз

Acetobacter 4 - 55-61

Arthrobacter 15 4 60-72

Azotobacter 4 1 63-66

Bacillus 37 3 32-62

Brevibacterium. 11 2 58-67

Caulobacter 10 . 64-67

Cellulomonas 4 3 71.7-72.7

Chromobacterlum 9 . 63-72

Corynebacterlum 3 3 52-68

Flavobacterlum 6 - 63-70

Halobacterlum 3 66-68

Micrococcus 31 - 66-75

Mycobacterium 1 60-70

Pseudomonas 21 58-70

Rhtzobium 25 4 59.1-65.5

Staphylococcus 19 2 30-40

Tkermus 3 — 64-67

Xantkomonas 3 63.5-69.2

Всего 195 22

Табл.1. Распространение эндонуклеаз рестрикции в исследованных штаммах микроорганизмов. Данные о содержании GC пар взяты из определителя микроорганизмов Берга (Berg Р., е.а., 1963).

В качестве объектов для дальнейшего более детального исследования был выбран ряд штаммов Bacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Brevtbacterlum, Corynebacterium и Staphylococcus, характеризовавшихся наиболее стабильной и высокой активностью рестриктзз г: относительно низким уровнем активности интерферирующих нуклеаз.

Результативность поиска новых ферментов рестрикции определяется го± только чувствительностью использованного метода анализа, но и миогижя др. факторами: числом- обследованных штаммов, уровнем активности рестриктаз и песпепифическкх нуклеаз б микробных плетках, конкретными таксонами, выбранными для скрининга (изейстио, что существуют "нулевые" штаммы без систем R.-M), спег:тром использованных ДНК-субстратов, ареалом обитания микроорганизмов (почва, вода, воздух) и рядом др. Учитывая сказанное выше, не исключено, что результативность проведенного нами поиска новых рестриктаз могла бы быть н выше, тем пе менее, частота встречаемости штаммов-продуцентов зндонуклеаз рестрикции в нашей работе (11,3%) вполне согласуется с цифрами др. авторов, выполнявших аналогичные исследования (Mayer Н., Reinchenbach Н., 1978; Sugisaki Н., е. а., 1982; ffiraoka N-, е. а., 1985; Соколов H.H. с соавт., 1988; Репин В.Е., Щелкунов С.Н., 1990).

Особый интерес представляют результаты скрининга новых продуцентов СЕврхкрупнощепящих рестриктаз.

Приступая к поиску сверхкрупнощепящих рестриктаз при подборе возможных продуцентов этих ферментов мы опирались на известную гипотезу МакКяелланда (McClelland М., 1988) о тесной корреляции между структурой сайта узнавания рестрикпионных зндонуклеаз класса II и содержанием GC пар в хозяйской ДНК продуцирующих их микроорганизмов. Все известные рестриктазы, узнающие на ДНК сайт из 8 нуклеотидов (Fse I, Я oil, 3зе83871, Srfl, Swal и др.), были выделены из бактерий, содержание в геномной ДНК которых GC пар превышает 60%. Исходя из этого и подбирались микроорганизмы для скрининга.

Рестриктаза СзрШ, узнающая сайт из восьми нуклеотидсв, была обнаружена у штамма Corynebacterium яр. В, хозяйская ДНК которого относится к GC типу (52-68% GC пар). Следует отметить, что рестриктаза CspBI является всего 11-ой из описанных в литературе рестриктаз, имеющих 8-ми цуклеотидяый участок узнавания, и третьим изопшзомероы Noil. Заслуживает внимания и другая экдонуклеаза рестрикции Бес АЛ, продуцируемая Brevibacterium species А. Этот фермент расщепляет лишь ДНК Ad2 и не имеет сайтов узнавания на ДНК фага "к, SV40, фХ174, pBR322 и Т7. Учитывая субстратную специфичность рсстриктазы BecAI, можно с большой долей вероятности утверждать, что

фермент узнает протяженную вуклеотидную последовательность на ДИК к может быть отнесен к сверхкрупкощепаящм. рестршиазам.

В экспериментах по тестированию сверхкрупнотяпящюс рестриктаз субстратом служила ДНК аденовируса типа 2, являющаяся, пожалуй, единственной пп фаговых и плззкпдныл ДНК с известной первичной структурой, на которой имеются участки уеиаваншг для этих ферментов. В ряде опытов в качестве субстратов использовали ДНК штазмид рВЙ822, риС19. фага Т7 я вируса 5У40.

Резюмируя изложенные выше результаты следует сказать, что нами разработан и практически реализован новый подход к проблеме поиска еакт-спепифических эндонуклеаз, основанный на фундаментальных представлениях о структуре нуклеиновых кислот и расщепляющих их ферментов, и представляющий большой практический интерес в плане расширения спектра рестрпктаз и возможностей их использования в молекулярко-генетическях работах.

П. Разработка способов очистки новых сайт-специфических, эндонуклеаз рестрикции.

При изучении новых эндонуклеаз рестрикции одним из основных моментов является получение высокоочищенаых, в плаке отсутствия примесей интерферирующих всуклеаз и фосфатаз ферментов, пригодных для проведения: различных генно-инженерных работ.

В качестве исходного материала для очистки новых рестриктаз использовали клеточные экстракты, полученные после ультрэ.центрифугирования обработанной ультразвуком суспензии клеток. Стратегия очистки ферментов рестрикции определялась уровнем активности нес пештф и ч еск и х эндонуклеаз, экзонукяеаз и фосфатаз, спектром присутствующих в экстракте балластных белков, стабильностью рестриктаз к другими факторами.

Наиболее простая схема очистки разработана для эндонуклеазьт рестрикции ВсиАЗ. из ВасШш сегеи.$, что было связано с относительно низкой активностью интерферирующих нуклеаз в толуольном экстракте (рисЛ'ь Для'-выделеяия этого фермента использовали метод, примененный ранее (Кореска Н., 1975) при очистке рестриктаз Н1тиШ и НЫЛИ. Сульфат-аммонийкую белковую фракыаю (80-60% насыщения) валосили на колонку с ДЕАЕ-сефарозок, и препарат фермента эяюггровали линейным градоеятои в ксццсктраыин КС! О-Ш (зоны элюппл ■ 0,2-

'j/óbtl). lio-i^ чзб-йый. ф^^веп GL'l'Í сбооодби от примвс&й

иесивцифи-ческил элдо- к акзоауклеаа к фосфатам (табл. 2 и рис. 2а).

При выделения все>: других реетриктаз (табл. 2) были использованы двух-трехстадийные процедуры жидкостной колоночной хроматографии, причет« иа первом этапе очистки октсрзлты наносили на колонку с фосфопеялвзяоаой: (ФЦ), ранее использованную при выделении многих ферментов рестрикции (Green Р., е.э., 1978). В результате хроматографии на ФЦ получены препараты рестрнктаа BsplöSAI, ВзрЪШШ и J3.-;p400Ül, пригодные для физического картирования' ДНК, но содержавшие, однако, примесь кеспецифических нуклеаз, для удаления которых была проведена дополнительная очистка этих ферментов хроматографией на ДЕАЕ-целлкзлозе (ДЕАЕЦ). Как видео из рис. 2Ь , после элюции с этого сорбента рестриктазы из трех штаммов ВасШия species не содержали примесей интерферирующих нуклеаз и фосфатаз.

Для получения очищенных, препаратов ряда других рестриктаз (CspAl, СзрЫ, BecAl, БесАИ и Apibñl) была применена хроматография на ДЕАЕЦ, не давшая удовлетворительного результата. Поэтому схема выделения этих- ферментов была дополнена двумя последовательными этапами хроматографии на гепарин-агзрозе и голубой сефарозе, нашедших широкое применение при получении дысокоочищениых эндонуклеаз рестрикции (Pirotta V., Bielde Т.Д., 1980; Baksi Ii., е.а., 1978). Таким образом, с использованием последовательности хроматографических этапов: ФЦ-тгепарштагароза (ГА)—»-голубая сефароза (ГС), удалось выделить рестриктазы CspAl и СзрЫ, не содержавшие примесей ковтамевирующих нуклеааных активностей. Следует отметить, что для очистки рестриктазы Apiból из Azotobacter species оказалось достаточно лишь хроматографии фракции с ФЦ на ГА,

Особо следует остановиться на выделении ферментов Be.cAl и ßccAII, продуцируемых штаммом Brevibacterturn species, А. Так при фракционировании бесклеточных экстрактов на колонке с ФЦ было обнаружено 2 пика эндонуклеазной активности, отличающихся по специфической картине фрагментации ДНК-еубстратов и элюировавшихся при концентрации KCl 0.2-0.3М и 0,4-0,45М, соответственно. Рестрикт&за BecÁI (первый пжк) гидролизовзла лишь ДНК Ad2 и не имела участков узнавания на ДНК фага h, Т7. фХ174 и pBR322. После разделения на колонке с ФЦ, рестрлктаза БесАЗ.1 (второй пик) была очищена путем

последовательной хроматографии к& колонках с Г'А и ДИК-целлюлозой и идентифицирована как шзошкзомер ПаеIII.

Рестриктаз а Последовательные стадии хроматография

I | II III

ВсиА! (МН4)2804 (0-30%), (30-60%), БА ДЭАЗ-СФ (1,5х 10см), БА, 0-1М КС1, 200т1, 0.2-0.3 -

ВесАЛ ФЦ (4,5x1 ]си), ВА, 0,05-1 М КС1, 1500 мл, -0,4 М ГА (2,5x12 см), ЕБ, 0-1 М КС1, 200 мл, 0,6-0,66 м ДЭАЭЦ (2,5x12 см), БА, 0-1 М КС1, 100 мл, 0,46-0,52 М

С.?рА1 ФЦ (2,5x10см), БА, 0-1 М КС), 500 мл, 0,25-0,3 М ГА (2x7 см), ББ, 00,6 М КС1, 200 мл, 0,4-0,5 М ГС (2x7 смО, БВ, 01 М КО, 200 мл, 0,2-0,3 М

Ар1Ш ФЦ (3,2x10 см), БА, 0-1 М ЫаО, 800 мл, 0,35-0,5 М ГА (1,6x15 см), ББ, 0-1 М НаО, 300 мл, 0,65-0,85 М

СзрШ ФЦ (2,5x20 см), БА, 0-1 М КС1, 160 мл, 0,3-0,5М ГА (0.9x20 см), ББ, 0-1 М Ь'аС!, 100 мл, 0,6-0,7 М ГС (2,5x7 см), БВ, 0-1 М КС1, 200 мл, 0-25-0,4 М

ВссА1 ФЦ. (3x20 см), БА, 01 М КС1, 1100 мл, 0,2-0,3 М ГА (2x20 см), ББ, 0-1 М КО, 500 мл, 0,25-0,3 М или ДЭАЭЦ (2,5x12 смО, 0-1 М НаС1, 600 мл, 0,3-0,4 М

ВярШ! ФЦ (2,5x10 см), БА, 0-1 М ЫаС1, 2000 мл, 0,5-0,6 М ДЭАЭЦ (2,5x12 см), ББ, 0-1 М N801, 500 мл, 0,3-0,4 М -

В«рМ391 ФЦ (2,5x10 см), ВА, 0-1 М ЫаС1, 2000 мл, 0,58-0,64 М ДЭАЭЦ (2,5x12 см), ББ, 0-1 М №С1, 400 мл, 0,2-0,3 М -

В«р400<4 ФЦ (3x20 см), БА, 01 М N301, 1500 мл, 0,45-0,5 М ДЭАЭЦ (2,5x10 см), ББ, 0-0.8 М ЫаС1, 500 мл, 0,15-0,25 М -

Табл. 2. Условия хрокэтографической очистки некоторых новых

рестриктаз.

Примечания: ГА - гепаркн-агароза; Г'С - голубая сефароза; ДЭАЭ-СФ - ДЭАЭ-сефароза; ДЭА.ЗЦ - ДЗАЭ-целлюлоза; ФЦ - фосфоцедлюлоза; БА -20мМ К-фосфятвый буфер (рН 7.0), 7иМ 2-рМЭ, 1мМ ЭД'ГА: ВВ - 20мМ Трис-НС! (рИ 7.4), 7мМ 2-(ШЭ, 0,5мМ. ЭДТА; БВ - 20мМ Трис-ИС1 (рН 7.4), ЮмМ 2-|ШЭ, 5мМ 1^С12- Последовательно удаадяны сорбент, размер

колонки, буфер, интервал концентрация соли б злюенте (ликейный градиент), интервал концентрации соли, н котором эпгюируется фермент. Первый этап очистки - дезинтеграция клеток УЗ н ультрацентрифугирование (60000g, 60 мин). Частично очищенные препараты рестриктаз иолучадц с использованием одной стадии колоночной хроматогра.фии на ФЦ.

Что касается рестрикгззы SecAI, то выделить очищенный препарат итого, вероятно сверхкрупнощепящего фермента, не удалось, несмотря на использование для очистки фракции с ФЦ других сорбентов (ГА, ДЕАЕЦ). Это было связано с высоким уровнем активности неспецифических нуклеаз и крайней нестабильностью фермента, который почти полностью инактивировался в течение 5-6 часов уже после первого этапа хроматографии на ФЦ.

Все вышеуказанные эндонуклеазы рестрикции характеризовались высокой степенью чистоты. Свидетельством этого являются идентичность картины фрагментации ДНК фага Я при 60 мин. и. при 16-18-часовой ивкубации избытком фермента (рис. 2а-Ь), и результаты постановки реакции рестрикции-лигирования-повторной рестрикции (рис. За-с.).

При разработке способов очистки новых рестриктаз мы не ставили своей целью получение гомогенных препаратов ферментов, тем не менее результат электрофореза рестриктаз Bsp 1531, Apí55I и СзрЩ в ПААГ/SDS (рис.4) показали наличие, на фоне нескольких минорных полос одной основной белковой зоны (соответственно, 22, 28 и 44 кДа), что коррелирует с литературными данными по оценке молекулярной массы субъединиц рестриктаз класса II (Modrieh Р., Zabel D., 1976; Lee J.M., Chirjian. J.G., 1979; Bielde T.A., s.a., 1980).

Рис. 2. Электрофорегрздемз продуктов расщепления ДНК фага К инкубированной в течение 1 часа (1) и 16 часов избытком фермента: 2. 3. 4 - треки соответственно 10, 20, 30 ед./мкл. а - ВсмАТ; Ь - В-чр400Щ.

Рис. 3. Оценка степени функциональной чистоты препаратов реетркктаз BspM39I (a), Api55I (Ь) и BcuAl (с). Электрофорез в 0,8% -ном аггрозпом геле. ДНК фага X расщепляли рестриятазамн, после чего проводили дотирование фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигезы фага Т4 (New England Biolabs, cat. 1989) с повторным расщеплением соответствующими рестриктазама. 1, 5, 9 - ДНК фага X после обработки ферментами рестрикции; 2, б, 10 - продукты ДНК-лигазной реакции,- 3, 7, .11 - фрагментация ДНК рестриктазами после повторной сшивки.

Рис. 4, Электрофорез в 12,5%-ном ПААГ/SDS толуольных экстрактов и очищенных препаратов эндовуклеэд рестрикции. 1, 3, 5, 7 -очищенные препараты, соответственно рестриктаз Вес KS., CspBl, £.sp4009L £spl53AJ; 2, 4, 6, 8 - толуольные экстракты из клеток бактерий, продуцирующих соответственно BecAl, CspBl, Bsp4009l, BsplaSAI; 9 -белковые маркеры молекулярных весов.

Известно, что выход рестриктаз при. очистке определяется различными факторами: содержанием ферментов в биомассе и их стабильностью, а также количеством этапов очистки, зависимом от уровня активности неспецифических нуклеаз б бесклеточвом экстракте. Выход выделенных нами ферментов варьировал от 200 (CspBl) до 14000 ед./г биомассы для BcuAI, что вполне сопоставимо с аналогичными цифрами для многих ферментов рестрикции (Янулактис A.A., 1985).

Препараты новых рестриктаз получены с высокой удельной активностью от 400 ед./мл для БесАП до 10000 ед./мл у рестриктазы Взр400Э1. Подбор условий тестирования активности рестриктаз осуществляли на основе данных о соответствующих прототипах (New England Bioiabs, cat., 1989-1996) и далее пх уточняли, экспериментальным путем (табл. 3). Хранение ферментов в течение 6-12 месяцев при -20°С не сопровождалось значительным снижением их активности.

Выделенные препараты новых рестриктаз, обладающие высокой степенью функциональной чистоты, в дальнейшем использовали в экспериментах по их идентификации, то есть определение специфичности действия.

ЦаячанкА » Конц«нтряи;г-г;т, mmol Опти-

ферменте i i ! ^зльняя температуря. °C

i ; NbCl 1 Трис-KCi MgCI, DTT j Triton X-100 USA mpr/ml

Беи AI 100 50 5-10 ! 1 100 30-37

Ар;ЬЫ 150 10 10 I 100

Esp№9l 25-100 10 7.5-10 1 ' 100 37

BsplSSAI 50 10 10 I i 100 37

Bspmoi 100 50 10 1 | 100 37

CspAI 100 50 10 1 ! 100 37

CspBl 50 10 10 1 0.1 100 37

Bee All 50 10 10 1 - 100 37

Табл. 3. Оптимальные условия для определения активности выделенных рестриктаз.

III. Определение специфичности новых ферментов рестрикции.

Для определекпя специфичности рестриктаз использовали несколько подходов:

а) визуальное сравнение злекгрофоретической картины разделения продуктов гидролиза субстратной ДНК в агарозном геле;

б) определение частоты растепления ДНК-субстратов и размеров образующихся фрагментов (Fuchs С., е.а. 1980);

в) фиаическое картирования ДНК. (Suteliffe S. G., 1978);

г) компьютерное моделирование аналогичных электрофореграмм (Detereux J., е.а., 1984);

д) прямое секвепирование участков узнавания рестриктаз на ДНК (Brown N. L., Smith М., 1980).

Анализ результатов тестирования активности рестриктаз в ходе их очистки показал, что некоторые из выделенных нами ферментов были сходны в отношении фрагментации ДНК-субстратов. Всего было обнаружено две пары таких ферментов: AplSüI и BsplOOQl; Bspl53AI и BspM.39I. При коглбянированпом. гидролизе субстратной ДНК каждым из обоих сравниваемых ферментов было установлено, что указанные пары |залХJ^aaaOC СХ^, дл^али^

Предварительное заключение о структуре сайтов узнавания новых рестриктаз было сделано на основании определения частоты расщепления субстратных ДНК: фагов /. и Т7, вирусов ipX174, SV40 в Ad2 и плазмид pUC19, pBR322 (табл. 4). Полученные экспериментальные данные о числе и длине фрагментов сравнивали с аналогичными табличными данными для соответствующих субстратных ДНК ( New England Biolabs cat., 19891995).

С целью определения нуклеотидной последовательности, узнаваемой рестриктазами fi.splo.3Al, Bsp4003I, BeuAI, BecAl, EecAII, CspAI и CspBI, сравнивали характер электрофоретического распределения фрагментов, полученных при действии исследуемых и известных рестриктаз на ДНК фага л (или Ad2, в случае CspBI ) (рис. бз-f и табл. 4).

Микроорганизм Фермент (прототип) Свит узнавания | Число сайтов узнавания на ДНК

л. Ad2 SV40 ! фХ174 j pBR322

Azotobacter species' 55 Apil (BamYll) GGlATCC 5 3 1 j 0 1

Bacillus species 4009 Bspmmi j GG-ATCC | 5 j 3 I 1 I 0 (BamHi) j | j | | 1

Bacillus species 153A BsplbSAI j CAGiCTG { 15 | 24 \ 3 | 0 (PvvJJ) I j ! J j 1

Bacillus species 39Iv5 Bsp39Ml (Pvull) CAGiCTG 1 15 I i 24 ; 3 | 0 ......j ! 1

Bacillus cereu.3 BKM-814 BcuAl (AwiII) GCiWCC 35 ...... 73 1 6 i 1 j j i 1 8

Brevibacterium species 386 ВесШ (ЯоеШ) GGiCC 149 216 19 j 11 I I 22

Conjnebaeterlum species 243 CspBI (Notl) GCiGGCCGC 0 ! 7 i ! 0 I 0 i 0

Corynebacteriu.ni j CspAl species 301 | (Agel ?) AiCCGGT j >10 j 5 I i 1 , . „ i --- 0 ! 0 I 0 1 i

Табл.4. Рестршстазы, обнаруженные у обследованных штаммов бактерий.

Результаты проведенных исследований позволили предположить, что реетриктазы Bsplo'AAl и ВерЪША являются иэоишзомерами Pmll

(комбинированное расщепление проводили с BauAI - пзошкзомером fvulD, экдонуклеаза ЗесАИ - изошизомером Нае III (перекрестное расщепление с НаеШ.), CspAl - изошиоомером Agel (сочетаяное расщепление с Age Т), рестртстазз BcuAI - изошизомером Avail (комбинированное расщепление с Ecoill), рестриктэзэ CspBI изоптизомером Notl (перекрестное расщепление с Notl), рестриктазы В«/>400Э1 и Apiubl ■ изошизомерамп ВятШ.

Окончательное заключение о строении участка узнавания новых рестриктаз и положении точки расщепления фосфодиэфирной связи ДНК было сделано после проведения анализа по методу Брауна и Смита (19S0), основанного на расщеплении продуктов элонгации ДНК-полимеразной реакции осуществленной на матрице ДНК, содержащей сайт узнавания исследуемой рестриктазы, с помощью соответствующего праймера. В качестве матрипы для рестриктаз Bsp4009l, Aplool, BecAll и CspBl был а использована ллазмяда pBiuescript SK, содержащая сайты рестрикции для Нае III, ВатШ и Notl в составе полилинкера. Матрицей для рестриктаз BsplaSAI и служила плазиида pUC19, имеющая сайт

узнавания Pvull в последовательности гена lacZ, а для рестриктазы BcuAI - производное вектора pUC19 со вставкой, содержащей сайт Auall на расстоянии 90 п.н от- З'-кокца "универсального" праймера. Продукты элонгации после инактквапик "секвеназы" расщепляли соответстзухощей рестриктазой, часть полученной смеси для достройки выступающих конпов обрабатывали ДНК полимераэой: фага Т4 в присутствии всех четырех dNTP и оба образца анализировали в 5% денатурирующем ПААГ параллельно с продуктами четырех стандартных реакций секвенирования по Сэнгеру, той же плазмидноп ДНК с помощью "универсального" праймера.

Сопоставление локализации соответствующего рестрикта относительно фрагментов структурной лестницы (рис. 6а) с учетом правил интерпретаций позволило определить, что рестриктаза BecAll расщепляет узнаваемый сайт следующим образом: o'-GGiCC-S' и является истинным изошизомером НаеШ.

Рис. 5. Электрофореткчеексе сравнение продуктов расщепления ДНК фага X (или ДНК АА2 в случае С.чрШ) Х1сследуемыми п известными рестриктазами. а - В.уз153А1 (1), Взр1айА1+РоиИ (2), РииМ (3); Ь - к /НтсШ1 (1), ВсиА! (2), ВсиА1-ЬЕсо471 (3), £сс?471 (4); с - 5«р40091 (1), ВврЮШ+ВатпШ (2), ВатШ (3); й - СврАЛ (1), СзрМ+А^1 (2), АееI (8); е -С«рВ1 (1), СярШ+ЫоЛ (2), ЫоИ (3); £ - ВесШ (1), ВесА1ЬЯаеП1 (2), НаеIII (3). На всех рисунках 4 (кроме Ь) - ДНК фага К расщепленная ЯшсШТ.

Эвдонуклеазы рестрикции Вер) 53А1 и Бз/?М391 узнают последовательность: 5'-САД*-СТО-3' и расщепляют ее в участке указанным стрелкой, являясь иетапяыми изошизоиерамэт Puu.il (ркс. 6Ь).

Установлено, что рестрикштоипые аидокуклеазы ЛрШЫ а Bspi.0091, узнают в гидроллчуют аоследовэт<»лькость: 5'-GiGATCC-3* и являются истинными изошияоиерами рсстриктазы ВатШ. (рис. flc-d).

Показано, что сайт-специфическая зндонуклеаза BcuAl узнает на двувитевой ДНК нукяеотиднует последовательность: 5' -G-i-GfА/Т)СС-3' и расщепляет ее, как указано, представляя собой истинный изоптизомер рсстриктазы Avail (рис. бе).

Рестриктаза C.ipBl узнает и расщепляет двухценочечную последовательность ДНК: 5'-GCiGGCCGC-3 и, следовательно является истинным изопымокером Not I (рпс. Sf) .

Уточнение сайта узнавания и места расщепления для эндонуклеаяы рестрикции CspAl не проводили ввиду отсутствия субстратной ДНК с сайтом узнавания для Agcl, однако исходя из предварительно полученных дзнкых о субстратной специфичности и экспериментов по независимому и параллельному расщеплению ДНК фага Я, можно с большой долей вероятности предположить изощизомерию рестриктаз CspAI и A gel (сайт узнавания o'-A-iCCGGT'-S', Yamada Y., е.а., 1989).

Анализ специфичности расщепления различных субстратных ДНК с известной первичной структурой, описанными в литературе рестриктазами, имеюших восьминуклеотидный участок узнавания (Pad, Notl, A.iel, Sse3871, Fsel, Srfl, Swal и Pmel) ( Roberts R. J., 1995) и рестриктазой В ее AS позволяет предположить возможную нзошизомерию с эндонуклеазой Fsel (Nelson J. М., е.а., 1990). Так же как Fsel, рестриктаза ВесА! не гидролизует- ДНК фага к, фХ174, SV40, Т7 и плазмиду pBR322, а имеет участки узнавания только на ДНК Ad2. С другой стороны, нельзя исключить того, что рестриктаза BecAl является прототипом, т.е. эндонуклеазой рестрикции с новой специфичностью. В настоящее зремя ведется работа по получению очищенного препарата рестриктазы BecAI и ее идентификации.

В результате проведенных исследований из еосьми пгтзжмов-продуцентов выделено и охарактеризовано 9 эндонуклеаз рестрикции, узнающих шесть различных нуклеотидных последовательностей ДНК (табл. 4). Среди них идентифицированы два сверхкрулнощепящнх фермента, ранее не обнаруженные в таксонах Corynebacteriu.nl и Brevtbacterium. Как литературные, так и полученные результаты позволяют утверждать, что два рода микроорганизмов Brevibacterium и Corynebacterium являются перспективным источником для поиска новых

сайт-специфических, узнающих протяженный участок нуклеотидаой

последовательноеги на ДНК, что подтверждает известкую гипотезу Мак-Клеллакда.

+ о А тс ' •* |'-4/ -4 д. - м*тт Г'Л • га С А Т С да -а иммйЯяВ1' *''■•'■ ' " ь

-Г О А Т С ^^^^^^^ кипе, * «Я / с + О А Т . С .. -г Щ** _I; &

+ в А Т С «в»» (Я^в е + С А Т С £

Рис. б. Определение строения сайта узпавания и положения точки расщепления изученных эндонуклеаз рестрикции. Электрофореграмма в 5% денатурирующем ПААГ, в. А, Т, С - продукты стандартных реакций секвенирования по Сэнгеру субстратной ДНК, содержащей сайт исследуемых эндонуклеаз рестрикции. Матрицами служили: I - ДНК риС19; II - ДНК pBluescri.pt ЙК.; III - ДНК рИС19 со вставкой, содержащей

сайт Auu.ll. Для каждой из матриц использованы соответствующие прайиеры. (-) - продукт элоигални праймера из матрице после гидролиза <;оотвествумщей рестриктазои. (+) - то же самое, но после достройки ДНК-полидерязой фа го Т4 и присутствии четырех (ШТР. а - Вес АЛ; Ь -ВзрША1; с ■ Ар/551; с! • Вар4Ш1; с - ВсикЬ. £ - СярВЬ

ВЫВОДЫ

1. Скрининг новых продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз, проведенный среди 195 микроорганизмов 16 таксономических групп, позволил выявить 22 штамма, обладающих эвдонуклеазной активностью. На основании специфического характера фрагментация ДНК-субстратов с известной первичной структурой и потребности в кофакторах эти эндонукяеазы были отнесены к рестриктазам II класса.

2. Разработан и апробирован новый подход к. поиску сверхкрупнощепящих рестршстэз, ословзттый на известной гипотезе МакКлеллэнда о корреляции между структурой сайтов узнавания .этих ферментов к содержанием ОС пар в хозяйской ДНК штаммов-проду центов. Результатом этого явилось обнаружение у штаммов Вгги1Ьас1егшпг и СогупеЬаа.ег1ит. двух новых сверхкрупнощепящих эндонуклеаз рестрикции. Одна из них, СзрШ, была выделена и идентифицирована как истинный изошизомер Мо&, узнающий восьминуклеотидньш палиндром В клетках штамма Вгеи1ЬасГепип, помимо рестриктазы НаеШ, присутствует активноегь эндонуклеазы рестрикции ВсеА1, расщепляющей только ДНК А(12, и не имеющей сайтов узнавания на ДНК фага X. <рХ174, Т7, ЗУ40 и рВЯ322.

3. С использованием методов ионообменной и аффинной колоночной хроматографии получены очищенные препараты новых рестриктаз Ар1551, Вз/>40091, В«р153А1, Взр№91 ВсиМ, ВесАП, СзрА1 и СзрРЛ, обладающие высокой удельной активностью (5000-10000 ед/мл) и практически свободные от примесей неспецпфическнх эндонуклеаз, экзонуклеаз и фосфатаз. Изучены оптимальные условия определения ферментативной активности новых рестриктаз (потребность в кофакторах, оптимумы действия рН и температуры и др.), их стабилизации и хранения.

4. На основании результатов изучения субстратной специфичности, физического картирования ДНК, комбинированного гидролиза ДНК фага /., прямого секвенирования участков узнавания рестриктаз на ДНК и определения положения точки расщепления фосфодиэфирной связи

установлено, что рестриктазы ВарХаЗЛ! в BspM.391 являются истинными Еоошизомерамз эвдоЕ^клеазы рестрикции РииЛ; Вар4009Î п Api551 -изошизомеры ВатШ; ВесАЛ - Hctelll, a BcuAÏ - /kvall. Сделано предположение о возможной специфичности действия некоторых других новых ферментов: CspAI, Agll, Азр27&1, Аяр2881, Rhp571Т, SslAl и à'effiL

ПРАКТИЧЕСКИЕ Р ЕК О M Б H Д А И ИИ

Препараты, новых рестриктаз могут быть использованы наряду с их прототипами (БитИ, Pouïl, Avall, Haelll, Notï) в генно-инженерных работах. Особый интерес среди этих ферментов представляет сверхкрупнощеиящая ресгриктаза CspBI. крайне удобная для целей физического картирования ДНК эукариоткческих организмов, клонирования крупных фрагментов ДНК п создания представительных геномных библиотек. На препараты новых зндонуклеаз рестрикции получены положительные отзывы из ряда институтов системы РАН и РАМН, свидетельствующие о высокой степени их функциональной чистоты и пригодности для использования в ыолекулярно-говетических экспериментах.

Автор глубоко благодарен чл.-корр-. РАСХН проф. Скрябину К.Г. за создание благоприятных условий работы, своим коллегам за сотрудничество при выполнении ряда экспериментов.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. NiJtolai N.Sokoîov, Michael A. Eldarov, Alexis A. Kalugin. Sergey V. Korolev. Study, characterizat-ion and prospects of application of iww restriction endonucJeases. Karadeniz Journal oi Médical Sciences. 1995, V.8, N.4, P.231-232.

2. А.А.Калугин, М.Рина, М.А.Зльдаров, М.Маркаки, С.В.Королев, О.Т.Самко, Э.Б.Хорошутина. Н.Н.Соколов, В.Боуриотис. BsplôSAI и ВзрМЗ'Л - новые изошизомеры рестриктазы . Pvull. Биооргаяическая химия. 1996, N.2, с. 108-110.

3. А.А.Калутив, М.Рина, М.А.Эльдаров, М.Маркаки, С.В.Королев, Э.Б.Хорошутина, Н.М.Омельянюк, Н.Н.Соколов, В.Боуриотис. Выделение и определение специфичности новой рестриктазы В.чрМОШ - изодгизомера BamHL Молекулярная генетика, биохимия и вирусология. 1396, в печати.

4. С.В.КоролеБ, О.Т.Самжо, М.А.Эльдаров, А.А.Каяугин, Э.Б.Хорогоутика, Н.М.Омельчук, Н.Н.Соколов, К.Г.Скрябин. Сапт-ссецЕфпческая зпдонуклеааа ЗеиА! л us А. Бстооргащпгеская