Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз из термофильных штаммов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Свадьбина, Ирина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Системы рестрикции-модификации.

1.1. Классификация систем рестрикции-модификации прокариот.

1.1.1. Системы рестрикции-модификации типа 1.

1.1.2. Система рестрикции-модификации типа III.

1.1.3. Система рестрикции-модификации типа II.

1.1.3.1. Ортодоксальный, IIE и IIF подтипы.

1.1.3.2. РМ системы подтипа IIS.

1.1.3.3. РМ системы подтипа IIG.

1.1.3.4. РМ системы подтипа ИТ.

1.1.3.5. РМ системы подтипа IIB.

1.1.3.6. РМ системы подтипа IIM.

1.2. Структура эндопуклеаз рестрикции.

1.3. Механизм гидролиза эндоиуклеазами рестрикции фосфодиэфирных связей.

I 1.4. Классификация эндонуклеаз рестрикции по способу контроля расщепления

ДНК по двум цепям.

II. ДНК-метилтрансферазы систем рестрикции-модификации типа II.

II. 1. Классификация ДНК-метилтрансфераз.

11.2. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз.

11.3. Биологическая роль систем рестрикции-модификации.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

III. 1. Материалы.

111.2. Оборудование.

111.3. Методы.

111.3.1. Электрофорезы.

111.3.2. Реакции, использованные в работе.

111.3.3. Секвестрование ДНК.

111.3.4. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой рестрикции.

111.3.5. Приготовление электрокомпетентиых клеток.

111.3.6. Электротрансформация клеток E.coli.

111.3.7. Щелочное выделение плазмид (мини-преп).

111.3.8. Очистка ДНК.

111.3.9. Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М13 (мини-преп).

111.3.10. Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М13 (макси-преп).

111.3.11. Выделение одноцепочечной формы ДНК фага на основе М13.

111.3.12. Метод кислотной депуринизации.

111.3.13. Метод тонкослойной хроматографии нуклеиновых оснований.

111.3.14. Локализация метилцитозина бисульфитным методом (реакция конверсии).

111.3.15. Скрининг штаммов на наличие в них эндонуклеаз рестрикции.

111.3.16. Получение и очистка лизата клеток для колоночной хроматографии.

111.3.17. Выделение эндонуклеазы AfcpLK.

III.3.18. Выделение эндонуклеазы BspZE\.

111.3.19. Выделение эндонуклеазы BspUJA.

111.3.20. Выделение метилаз 5соК1А и ЯсоК1В.

111.3.21. Определение активности эндонуклеаз рестрикции во фракциях.

111.3.22. Определение функциональной чистоты эндонуклеазы.

111.3.23. Метод гель-хроматографии.

111.3.24. Анализ фракций па наличие метилазной активности.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

IV. 1. Принцип детектирования эндонуклеаз рестрикции.

IV.2. Эндонуклеаза рестрикции BspZEl.

IV.2.1. Выделение эндонуклеазы рестрикции BspZEl.

IV.2.2. Оптимальные условия работы фермента.

IV.2.3. Определение активности эндонуклеазы рестрикции BspZEl.

IV.2.4. Функциональная чистота препарата фермента BspZEl.

IV.2.5. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой BspZEl.

IV.2.6. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой BspZEl.

IV.2.7. Влияние метилирования dam на расщепление узнаваемого сайта.

IV.2.8. Сравнение B.species ZE с другими штаммами, содержащими эндонуклеазы

Ъ изошизомеры С1а\.

IV.3. Эндонуклеаза рестрикции jYs/?LKI.

IV.3.1. Выделение эндонуклеазы

IV.3.2. Оптимальные условия работы выделенной эндонуклеазы.

IV.3.3. Функциональная чистота препарата фермента jVspLKI.

IV.3.4. Определение сайтов узнавания Ab/?LKI.

IV.3.5. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой jV$/?LKI.

IV.4. Эндонуклеаза рестрикции BspUJAl.

IV.4.1. Определение зависимости содержания эндонуклеазы от фазы роста клеток.

IV.4.2. Выделение эндонуклеазы BspUJ41.

IV.4.3. Оптимальные условия работы эндонуклеазы BspUJAl.

IV.4.4. Функциональная чистота препарата BspUJAl.

IV.4.5. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой BspUJAl.

IV.4.6. Определение положения фосфодиэфирных связей, гидролизуемых на ДНК эндонуклеазой BspUJAl.

IV.4.7. Очистка ДНК от эндонуклеазы BspUJAl.

IV.4.8. Определение молекулярной массы BspUJAl.

IV.4.9. Получение «лестниц» молекулярных длин фрагментов ДНК.

IV.5. Метилазы системы рестрикции-модификации из штамма Bacillus coagulans К

IV.5.1. Выделение ДНК-метилтрансфераз.

IV.5.2. Определение специфичности ДНК-метилтрансфераз.

IV.5.3. Определение природы основания, метилируемого M.iJcoKIA, методом тонкослойной хроматографии.

IV.5.4. Определение положения метилируемого цитозина.

IV.5.5. Получение ДНК рекомбинантного фага M13tgl30(BcoK).

IV.5.6. Определение положения в сайте BcoYA метилируемого аденина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз из термофильных штаммов"

В бактериальных клетках защиту от чужеродной ДНК обеспечивают так называемые системы рестрикции-модификации (РМ), которые состоят из комплекса двух ферментов - ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции. Метилтрансферазы и эндопуклеазы узнают в ДНК короткую (4-8 п.о.) специфическую последовательность (сайт). Эндонуклеазы расщепляют ДНК в фиксированных точках внутри или вблизи сайта, если сайт не метилирован парной ей метилазой. Метилтрансферазы метилируют (модифицируют) по одному основанию - А или С - в каждой цепи сайта и тем самым защищают ДНК клетки от гидролиза соответствующей эндонуклеазой. При введении в клетку немодифицированной ДНК, например, ДНК фага, сайт-специфические эндонуклеазы при наличии в этой ДНК своих сайтов узнавания гидролизует ее. Следовательно, систему РМ можно рассматривать как примитивную «иммунную» систему прокариот. Эндонуклеазы рестрикции в свое время легли в основу техники рекомбинантных ДНК, и в настоящее время они остаются незаменимыми и самыми востребованными ферментами в современной биохимии и молекулярной биологии. Несмотря на уже имеющиеся более чем 3600 продуцентов эндонуклеаз рестрикции и 600 ДНК-метилтрансфераз, продолжается интенсивный поиск новых продуцентов. Это обусловлено тем обстоятельством, что обнаружение эндонуклеаз с новыми специфичностями расширяет возможности манипулирования ДНК (конструирования рекомбинантных ДНК, картирование геномов, секвенирование, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, амплификация ДНК с вытеснением цепи и др.); обнаружение ферментов с новой специфичностью иногда приводит к появлению новых технологий. Кроме того, новые штаммы-продуценты нередко производят эндопуклеазу либо в большом количестве, либо достаточно стабильную, в результате чего она имеет преимущество для практического использования. ДНК-метилтрансферазы используются для получения больших фрагментов геномных ДНК, определения уровня метилированных цитозинов в ДНК эукариот, изучения структуры хроматина. Именно на метилтрансферазе системы РМ (M.Hhal) был впервые обнаружен феномен «выпетливания» метилируемого основания из двойной спирали ДНК в процессе катализа. Учитывая роль метилирования ДНК как эпигенетического уровня наследственности, интерес к метилтрансферазам РМ систем возрастает.

Еще один аспект, привлекающий внимание к ферментам системы РМ это то, что сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы представляют собой идеальные объекты для изучения специфического ДНК-белкового взаимодействия, благодаря необыкновенно высокой точности как узнавания строго определенной последовательности, так и разрезания ДНК или ее метилирования.

Таким образом, задача поиска новых продуцентов метилаз и рестриктаз остается актуальной. Особенно перспективен поиск штаммов-продуцентов этих ферментов среди термофильных микроорганизмов, так как белки из термофильных микроорганизмов более стабильны при хранении и более устойчивы к различным воздействиям, денатурирующих белок, чем их аналоги из мезофильных микроорганизмов. Кроме того, поиск термофильных штаммов продиктован еще и тем, что в последние годы возрастает интерес к ферментам, работающими в сочетании с термофильными ДНК-полимеразами.

Целью исследования было выделение и изучение эндонуклеаз рестрикции из термофильных бактерий Bacillus species LU4, Bacillus species ZE и Nocardia species LK, a также выделение и изучение ДНК-метилтрансфераз из термофильного штамма Bacillus coagulans К.

Для достижения поставленной цели были поставлены и выполнены следующие задачи:

1. Поиск и скрипирование термофильных штаммов на наличие эндонуклеаз рестрикции.

2. Выделение и характеристика эндонуклеаз из штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции.

3. Выделение ДНК-метилтрансфераз из Bacillus coagulans К и специфичности этих метилаз.

4. Определение оснований, модифицируемых метилазами в узнаваемом сайте.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Системы рестрикции-модификации

Более 50 лет назад Луриа и Хьюман (Luria et al, 1952) было открыто явление фенотипических вариаций у бактериофагов, заключающиеся в изменении эффективности посевов на различных штаммах бактерий в зависимости от хозяина, на котором выращивался фаг. Эффективность посева максимальна на том штамме бактерий, на котором фаг выращивали в последний раз. На некоторых других штаммах она могла быть снижена на несколько порядков. Ограничение роста фага получило название рестрикции (restriction - ограничение). Однако, если взять фаг из негативной колонии, выросшей на рестриктирующем хозяине, то он уже не ограничивается на этом хозяине. Фаг приобретает модификацию. Если же модифицированный фаг пропустить через цикл роста на исходном штамме, то модификации утрачиваются, и фаг снова будет ограничиваться рестриктирующим хозяином. Таким образом, было показано, что специфические модификационные вариации и рестрикции фага определяются клеткой-хозяином и не являются генетическими изменениями фагового генома.

Позднее было установлено, что за явление рестрикции-модификации ответственно два типа ферментов - эндонуклеаза рестрикции и ДНК-метилтрансфераза (Arber et al, 1962). Оба фермента узнают на ДНК одну и ту же последовательность из нескольких нуклеотидов (сайт). Метилазы осуществляют перенос метильной группы с Б-аденозил-Ь-метионина на одно из оснований в каждой цепи сайта. Эндонуклеаза рестрикции, как правило, расщепляет двунитевую ДНК только в тех случаях, если ни в одной из цепей соответствующие основания узнаваемой последовательности не модифицированы. ДНК хозяина не подвергается расщеплению, так как вскоре после репликации она метилируется метилазой. При введении в клетку немодифицированной ДНК при инфекции фагом (или за счет коныогации или трансфекции) в клетке осуществляется два процесса: с одной стороны, ^модифицированная ДНК расщепляется эндонуклеазой рестрикции, с другой стороны, она метилируется метилазой. При этом для инактивации ДНК фага достаточно одного разрыва, а для ее защиты необходимо, чтобы все сайты были прометилированы. Поэтому степень рестрикции фага зависит от числа специфических последовательностей на его ДНК, хотя многие фаги выработали специфические способы преодоления системы рестрикции хозяйской клетки (Linn et al, 1968).

Впервые ферменты рестрикции-модификации (РМ) были выделены и охарактеризованы из Haemophilus influenzae и E.coli в 1968 г. (Linn et al, 1968, Meselson et al, 1968). Эти ферменты расщепляли ДНК без образования гомогенных фрагментов. В 1970 г. Смит с соавторами из Haemophilus influenzae выделили эндонуклеазу рестрикции, которая расщепляла ДНК с образования гомогенных фрагментов. Эндонуклеазы рестрикции (ЭР) с такими свойствами стали основой методов генной инженерии, что привело к революции в молекулярной биологии.

Последовавший после 1970 г. стремительный рост количества различных систем РМ и их разнообразие заставило ввести специальную номенклатуру (Smith et al, 1973). В названии системы входят первая буква рода бактерии, две первых буквы - вида, обозначение конкретного штамма или экстрахромосомного элемента, кодирующего РМ систему, и номер системы в порядке их обнаружения в штамме, например EcoKV. Часто клетки содержат более одной системы РМ. Рекорд принадлежит штамму Helicobacter pylori J99, геном которого содержит 23 потенциальные системы РМ (Kong et al, 2000).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Свадьбина, Ирина Владимировна

выводы

1. Из термофильных штаммов выделены и охарактеризованы три эндонуклеазы рестрикции типа II: BspZEl, NspLKl и #spLU4I.

2. Из термофильного штамма Bacillus coagulans выделены и охарактеризованы две метилазы - BcoKIA и ВсоКШ. Показано, что М./?соК1А является цитозин-специфичной, а M.Z?coKIB - аденин-специфичной.

3. Тонкослойная хроматография показала, что М./?соК1А метилирует остатки цитозина в положении N4, a M.ZteoKIB метилирует остатки аденина в положении N6.

4. Определены основания, метилируемые в сайте, узнаваемом метилазами: М./?соК1А метилирует первый цитозин в последовательности СТСТТС, М.ДсоКШ метилирует последний аденин в последовательности GAAGAG.

5. Предложен новый метод для определения метилируемого основания независимо от типа метилирования, который основан на использовании IIS эндонуклеаз рестрикции.

Список публикаций по материалам диссертационной работы

1. Железнякова Е.Н., Железная JI.A., Свадьбина И.В., Матвиенко Н.И. (1998) Сайт-специфическая эндонуклеаза из термофильного штамма Bacillus species ZE - изошизомер Clal. Биохимия, 63, 1675-1681

2. Забазная Е.В., Железная J1.A., Свадьбина И.В., Матвиенко Н.И. (1999) Сайт-специфическая эндонуклеаза AbpLKI - изошизомер эндонуклеазы НаеШ. Биохимия, 64, 234-238

3. Свадьбина И.В. Железнякова Е.Н., Железная JI.A., Матвиенко Н.И. (2003) Bacillus species LU4 - эффективный продуцент термостабильной сайт-специфической эндонуклеазы BspLU4I, изошизомера Aval. Биохимия, 68, 529-536

4. Свадьбина И.В., Зелинская Н.В., Ковалевская Н.П., Железная JI.A., Матвиенко Н.И. (2004) Выделение и характеристика сайт-специфических ДНК-метилтрансфераз из Bacillus coagulans К. Биохимия, 69, 372-379

5. Свадьбина И.В. Матвиенко Н.Н., Железная JI.A., Матвиенко Н.И. (2005) Определение оснований, метилируемых метилазами BcoYAA и ЛсоК1В в сайте 5/-СТСТТС-3//5/-GAAGAG-31. Биохимия, 70,1363-1366

6. Свадьбина И.В. Кузык П.М., Железная JI.A. «Определение метилированного аденина, метилируемого ДНК-метилтрансферазой BcoKI при помощи нового метода». 5-я Пущинская конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века», 2001 г.

7. Свадьбина И.В. Железная JI.A. «Картирование метилированных цитозинов при помощи мультисайтиого олигонуклеотидного дуплекса». XIV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2002 г.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе работы было найдено 25 почвенных термофильных бактерий, содержащих системы рестрикции-модификации типа II. Наибольшее количество бактерий содержало систему рестрикции-модификации AfrpLKI - изошизомер системы НаеIII. Такую распространенность именно этого типа систем можно объяснить тем, что среди двух других систем РМ, найденных нами, только эта система узнает тетрануклеотидную последовательность (две остальных узнают шестинуклеотидную последовательность). Этот факт согласуется с представлением о системах РМ как о самостоятельных единицах жизни, подобных вирусам и транспозоиам, и борьбе между ними за «существование» преимущество в которой принадлежит системам, узнающим короткие последовательности. Найденные штаммы отличаются от штаммов-прототипов более высоким выходом эндонуклеаз рестрикции, а штамму Bacillus species LU4 принадлежит по этому параметру пока абсолютный рекорд. Пока слабо изучены механизмы регуляции систем рестрикции-модификации, поэтому трудно даже предположить причины такой высокой продуктивности этого штамма.

Выделенные и охарактеризованные в работе эндонуклеазы рестрикции, благодаря высокой степени функциональной чистоты и стабильности, и в настоящее время используются в нашей текущей работе и в работах других Лабораторий (Института белка РАН, Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН). Полученный в ходе работы на основе эндонуклеазы рестрикции BspUJAl маркер длин высокомолекулярной ДНК также постоянно используется.

Выделенные и охарактеризованные ДНК-метилтрансферазы расширили в банке ферментов систем рестрикции-модификации REBASE диапазон специфичных последовательностей, модифицируемых ДНК-метилазами. Тот факт, что для этих метилаз определены метилируемые основания позволяет использовать их для получения больших фрагментов ДНК, а так как узнаваемый ими сайт представляет собой полипуриновый/полипиримидиновую последовательность, то это свойство может быть использовано для получения триплексных ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Свадьбина, Ирина Владимировна, Пущино

1. Allan, B.W., Beechem, J.M., Lindstrom, W.M. and Reich, N.O. (1998) Direct real time observation of base flipping by the EcoKl DNA methyltransferase. J. Biol. Chem. 273, 23682373

2. Aim, R.A., Ling, L.-S.L., Moir, D.T., King, B.L., Brown, E.D., Doig, P.C., et al. (1999) Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature, 397, 176-180

3. Arber, W. and Dussoix, D. (1962) Host Specificity of DNA Producted by Escherichia Coli: I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol., 5, 18

4. Barrett, Т.Е., Savva, R., Panayotou, G., Barlow, Т., Brown, Т., Jiricny, J. and Pearl, L.H. (1998) Crystal structure of a G:T/U mismatch-specific DNA glycosylase: mismatch recognition by complementary-strand interactions. Cell, 92, 117-129

5. Barrett, Т.Е., Scharer, O.D., Sawa, R., Brown, Т., Jiricny, J., Verdine, G.L. and Pearl, L.H. (1999) Crystal structure of a thwarted mismatch glycosylase DNA repair complex. EMBOJ., 18, 6599-6609

6. Bellamy, S.R.W., Milson, S.E., Scott, D.J., Dniels, L.E., Wilson, G.G. and Halford, S.E. (2005) Cleavage of individual DNA strands by different subunits of the heterodumeric restriction endonuclease BbvCI. J. Mol. Biol., 348, 641-653

7. Berg, D.E. and Logan, R.P. (1997) Bioassays, 19, 86-90

8. Bitinaite, J., Wah, D.A., Aggarwal, A.K. and Schildkraut, I. (1998) FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc. Natl Acad. Sci U.S.A. 95, 10570-10575

9. Bocklage, H., Heeger, K. and Muller-Hill, B. (1991) Cloning and characterization of the Mboll restriction-modification system. Nucl. Acids Res. 19, 1007-1013

10. Boros, I., Venetianer, P. and Posfai, G. (1984) High-copy-number derivatives of the plasmid cloning vector pBR322. Gene, 30, 257-260

11. Bozic, D., Grazulis, S., Siksnys, V., Huber, R. (1996) Crystal structure of Citrobacter freundii restriction endonuclease Cfr\01 at 2.15 A resolution. J. Mol. Biol., 255,176-186

12. Bron, S., Murray, K. and Trayther, T.A. (1975) Restriction and Modification in B. subtilis: Purification and General Properties of a Restriction Endonuclease from Strain R Mol. Gen. Genet., 143, 13-23

13. Brown, N.L. and Smith, M (1980) A general method for defining restriction enzyme cleavage and recognition sites. Methods Enzymol, 65, 391-404

14. Bujnicki, J.M. and Radinska, M. (1999). Molecular evolution of DNA-(cytosine-N4) methyltransferases: evidence for their polyphyletic origin. Nucl. Acids Res., 27, 4501-45099

15. Bujnicki, J.M. (2001) Understanding the evolution of restriction-modification systems: clues from sequence and structure comparisons. Acta Biochemica Polonica, 48, 935-967

16. Cal, S. and Connolly, B.A. (1997) DNA distortion and base flipping by the £coRV DNA methyltransferase J. Biol. Chem. 272, 490-496

17. Cheng, X., Kumar, S., Posfai, J., Pflugrath, J.W. and Roberts, R.J. (1993) Crystal structure of the Hhal DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. Cell, 74, 299-307

18. Cheng, X. and Roberts, R.J. (2001) AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucl. Acids Res., 29, 3784-3795

19. Dagert, M., Ehrlich, S.D. (1979) Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of E.coli. Gene, 6,23

20. Deibert, M., Grazulis, S., Sasnauskas, G., Siksnys, V. and Huber, R. (2000) Structure of the tetrameric restriction endonuclease A^oMIV in complex with cleaved DNA. Nature Struct. Biol., 7, 792-799

21. Dong, A., Yoder, J. A., Zhang, X., Zhou, L., Bestor, Т. H. and Cheng, X. (2001) Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA. Nucl. Acids Res. 29, 439^48

22. Dower, W.J., Miller, J.F. and Ragsdale, C.W. (1988) High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation. Nucl. Acids Res., 16,6127-6145

23. Ellis, D., Dryden, D.T.F., Berge, Т., Edwardson, J.M. and HendersoT R.M. (1999) Direct observation of DNA translocation ana cleavage by atomic force microscopy. Nuture Struct. Biol., 6, 15-17

24. Embleton, M.I., Syksnys, V. and Halford. (2001) DNA cleavage reactions by type II restriction enzymes that require two copies of their recognition sites. J.Mol.Biol., 311, 503-514fmol DNA Sequencing System Technical Manual

25. Friedrich, Т., Fatemi, M., Gowhar, H., Leismann, O. and Jeltsch, A. (2000) Specificity of DNA binding and methylation by the М./чШ DNA methyltransferase. Biochim. Biophys. Acta, 1480, 145-159

26. Gelfand, M.S. and Koonin, E.V. (1997) Avoidance of palindromic words in bacterial and archaeal genomes: a close connection with restriction enzymes. Nucl. Acids Res., 25, 2430-2439

27. George, J and Chirikjian, J.G. (1978) Diospecific fractionation matrices for sequence specific endonucleases Nucl. Acids Res., 5,2223-2232

28. Goedecke, K., Pignot, M., Goody, R.S., Scheidig, A.J. and Weinhold, E. (2001) Structure of the N6-adenine DNA methyltransferase M. Taq\ in complex with DNA and a cofactor analog. Nat. Struct. Biol. 8,121-125

29. Gong, W., O'Gara, M., Blumenthall R.M. and Cheng X. (1997) Structure of Pvull DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment. Nucl. Acids Res., 25, 2702-2715

30. Goodwin, C.S., Armstrong, J.I., Chivlers, Т., Peters, M., Collins, M.D., Sly, L., McConnell, W. and Harper, W. Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 397-405

31. Hadi, S.M., Bachi, В., Shepherd, J.C.W., Yuan, R., Ineichen, K. and Bickle, T.A. (1979) DNA Recognition and Cleavage by the EcoV\5 restriction endonuclease. J. Mol. Biol., 134, 655-666

32. Halford, S.E., Bicock, D.T. and Stanford, N.P. (1999) Restriction endonuclease reactions requiring two recognition sites. Biochem. Soc. Trans., 27, 696-699

33. Handa, N., Nakayama, Y., Sadykov, M. and Kobatashi, I. (2001) Experimental gemone evolution: large-scale genome rearrangements associated with resistance to replacement of a chromosomal restriction modification gene complex. Mol. Microbiol., 40,932-940

34. Hollis, Т., Ichikawa, Y. and Ellenberger, T. (2000) DNA bending and a flip-out mechanism for base excision by the helix-hairpin-helix DNA glycosylase, Escherichia coli AlkA. EMBOJ., 19, 758-766

35. Horton, J.P. and Cheng, X. (2000) PvwII endonuclease contains two calcium ions in active sites. J. Mol. Biol., 300, 1049-1056

36. Hosfield, DJ., Guan, Y., Haas, B.J., Cunningham, R.P. and Tainer, J.A. (1999) Structure of the DNA repair enzyme endonuclease IV and its DNA complex: double-nucleotide flipping at abasic sites and three-metal-ion catalysis. Cell, 98, 397-408

37. Hsieh, P.-C., Xiao, J.P., Loane, S.-Y. and Xu, S.-Y.(2000) Cloning, expression and purification of a thermostable nonhomodimeric restriction enzyme, Bsl\. J.Bacteriol., 182, 949-955

38. Huai, Q., Colandene, J.D., Chen, Y., Luo, F., Zhao, Y., Topal, M.D. and Ke, H. (2000) Crystal structure of Nael-an evolutionary bridge between DNA endonuclease and topoisomerase. EMBO J., 19,3110-3118

39. Janulailis, A., Petrusyte, M., Maneliene, Z., Klimasauskas, S. and Burkus, V. (1992) Purification and properties of the Ecobll restriction endonuclease and methylase prototypes of a new class (typelV). Nucl. Acids Res., 20,6043-6049

40. Janulailis, A., Vaisvila, R., Timinskas, A., Klimasauskas, S. and Burkus, V. (1992) Cloning and sequence analysis of genes coding for 2sco57I type IV restriction-modification enzymes. Nucl. Acids Res., 20, 6051-6056

41. Jeltsch, A. and Pingoud, A. (1996) Horizontal gene transfer contributes to the wide distribution and evolution of type II restriction-modification systems. J. Mol. Evol. 42,91-96.

42. Jeltsch A., Roth, M. and Friedrich T. (1999) Mutational analysis of target base flipping by the EcoRV adenine-N6 DNA methyltransferase J. Mol. Biol. 285, 1121-1130

43. Jeltsch A., Christ, F., Fatemi, M. and Roth M. (1999) On the substrate specificity of DNA methyl transferases J. Biol. Chem, 274, 19538-19544

44. Jeltsch, A. (1999) Circulai permutations in the molecular evolution of DNA methyltransferase. J. Mol. Evol., 49,161-164

45. Karlin, S., Burge, C. and Campbell, A.M. (1992) Statistical analysis of count and distributions of restriction sites in DNA sequences. Nucl. Acids Res., 20, 1363-1370

46. Karlin, S., Campbell, A.M. and Mrazek, J. (1998) Comparative DNA analysis across diverse genomes. Annu. Rev. Genet., 32, 185-225

47. Karreman,C. and De, W.A. (1990) Agmenellum quadruplicatum MAqu\, a novel modification methylase. J. Bacteriol., 172,266-272

48. Kessler, C., Manta, V. (1990) Specificity of restriction endonuclease and DNA modificationmethyltransferases. Gene, 92, 1-248

49. Kita, K., Tsuda, J., Okamoto, K., Yanase, H. and Tanaka, M. (1999) Evidence of horizontal transfer of the £co0109I restriction-modification gene to Escherichia coli chromosomal DNA. J. Bacteriol., 181,6822-6827

50. Klimasauskas, S., Kumar, S., Roberts, R.J. and Cheng, X, (1994) Hhal methyltransferase flips its Ь target base out of the DNA helix. Cell, 76,357-369

51. Klimasauskas, S. and Roberts, R.J. (1995) M.Hhal binds tightly to substrates containing mismatches at the target base Nucl. Acids Res., 23,1388-1395

52. Kobayashi, I. (1998) Selfishness and death: raison d'etre of restriction, recombination andmitochondria. Trends Genet., 14, 368-374

53. Kobayashi, I., Nobusato, A., Kobayashi-Takahashi, N. and Uchiyama, I. (1999) Shaping the genome-restriction-modification systems as mobile genetic elements. Curr. Opin. Genet. Dev. 9, 649-656.

54. Kong, H., Morgan, R.D., Maunus, R.E. and Schildkraut, I. (1993) A unique restriction \ endonuclease, Bcgl, from Bacillus coagulans. Nucl. Acids Res., 21, 987-991

55. Kong, H., Roemer, S.E., Waite-Rees, P.A., Benner, J.S., Wilson, G.G. and Nwankwo, D.O. (1994) Characterization of Bcgl, a new kind of restriction-modification system. J. Biol. Chem., 269,683-690

56. Kong, H. and Smith, S.L. (1998) Analyzing the functional organization of a novel restriction-modification enzyme. J.Mol.Biol., 279, 823-832

57. Kong, H. (1998) Substrate DNA and со factor regulate the activities of the multi-funtional restriction-modification enzyme, Bcgl. Nucl. Acids Res., 25,3687-3692

58. Kong H., Lin L-F., Porter N. Stikel., Byrd D., Posfai J., Roberts R. (2000) Functional analysis of putative restriction-modification system genes in the Helicobacter pylori 399 genome. Nucl. Acids Res., 17,3216-3223

59. Kostrewa, D. and Winkler, F.K. (1995) Mg2+ binding to the active site of EcoRV endonuclease: a crystallographic study of complexes with substrate and product DNA at 2A resolution. Biochemistry, 34, 683-696

60. Kovall, R.A. and Matthews, B.W. (1999) Type II restriction endonucleases: Structural, functional and evolutionary relationships. Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 578-583

61. Kruger, D.H., Kupper, D., Meisel, A., Reuter, M, and Schroeder, C. (1995) The signficance of distance and orientation of restriction endonuclease recognition sites in viral DNA genome. FEMS Microbiol. Rev., 17,177-184

62. Malone, Т., Blumenthal, R.M. and Cheng, X. (1995) Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyltransferases and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. J. Mol. Biol., 253, 618-632

63. Malygin, E.G., Ovechkina, E.G., Zinovev, V.V., Limdstrem, U.M. and Reich, N.O. (2001) DNA-(N4-cytosine)-methyltransfrease from Bacillus amyloliquefaciens: kinetic and substrate binding properties. Mol. Biol. (Mosc), 35, 42-51

64. Marshak, A. and Vogel, H.J. (1951) J. Biol.Chem., 189,597-601

65. Mayer, H., Grosschedl, R., Schutte, H. and Hobon, G. (1981) Cla\, a new restriction endonuclease from Caryophanon latum L. Nucl. Asids Res., 9, 4833-4845

66. McClelland, M., Nelson, M. and Rashke, E. (1994) Effect of site-specific modification on restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases. Nucl. Acids Res., 22, 36403659

67. Meisel, A., Bickle, T.A., Kruger, D.H. and Schroeder, C. (1992) Type III restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage. Nature, 355,467-469

68. Meisel, A., Mackeldanz, P., Bickle, T.A., Kruger, D.H. and Schroeder, C. (1995) Type III restriction endonucleases translocate in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis. EMBO. J., 14,2958-2966

69. Meselson, M. and Yuan, R. (1968) DNA restriction enzyme from E.coli. Nature, 217,1110-4

70. Middleton, J.H., Edgell, M.H. and Hutchison III, C.A. (1972) Specific fragments of РЛ/Х174 deoxyribonucleic acid produced by a restriction enzyme from Haemophilus aegyptius, endonuclease Z. J. Virol., 10,42-50

71. Mol, C.D., Izumi, Т., Mitra S. and Tainer, J.A. (2000) DNA-bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APEI DNA repair and coordination. Nature, 403,451-456

72. Newman, M., Strzelecka, Т., Dorner, L.F., Schildkraut, I and Aggarwal, A.K. (1994) Structure of restriction endonuclease ВатШ and its relationship to EcoKl. Nature, 368, 660-664

73. Olek A., Oswald, J. and Walter, J. (1996) A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucl. Acids Res., 24, 5064-5066

74. Pallen, M.J. (1999) Microbal genomes. Mol. Microbiol., 32, 907-912

75. Parikh, S.S., Mol, C.D., Slupphaug, G., Bharati, S., Krokan, H.E. and Tainer, J.A. (1998) Base excision repair initiation revealed by crystal structures and binding kinetics of human uracil-DNA glycosylase with DNA. EMBOJ., 17, 5214-5226

76. Piekarowicz, A., Golaszewska, M., Sunday, A.O., Siwinska, M. and Stein, D.C. (1999) The НаеIV restriction modification system of Haemophilus aegyptius is encoded be a single polypeptide. J. Mol. Biol., 293, 1055-1065

77. Pingoud, A., Jeltsch, A., Maxwell, A. and Sherratt, D. (2001) Enzymes that keeps DNA under control. EMBO reports, 21, 271-276

78. Pingoud, A. and Jeltsch, A. (2001) Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucl. Acids Res., 29,3705-3727

79. Petrusyte, M., Bitiniate, J., Menkevicius S., Klimasauskas, S. and Butkus, V. (1988) Restriction endonuclease of new type. Gene, 74, 89-91

80. Pukkila, P.J., Peterson, J., Herman, G., Modrich, P. and Meselson, M. (1983) Effects of high levels of DNA adenine methylation on methyl-directed mismatch repair in Escherichia coli. Genetics, 104, 571-582

81. Reinisch, K.M., Chen, L., Verdine, G.L. and Lipscomb, W.N. (1995) The crystal structure of HaeIII methyltransferase covalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell, 82, 143-153

82. Reuter, M., Kupper, D., Meisel, A., Schroeder, C. and Kruger, D.H. (1998) Cooperative binding properties of restriction endonuclease EcoKW with DNA recognition sites. J. Biol. Chem., 273, 8294-8300

83. Rice, M.R. and Blumenthal, R.M. (2000) Recognition of native DNA methylation by the PvuW restriction endonuclease. Nucl. Acids Res., 28, 3143-3150

84. Roberts R.J. (1995) On base flipping. Cell, 82, 9-12

85. Roberts, R.J. and Macelis, D. (2000) REBASE restriction enzymes and methylase. Nucl. Acids Res., 28, 306-307

86. Roberts, R.J., Vineze, Т., Posfai, J. and Maeelis, D. (2005) REBASE restriction enzymes and DNA methyhransferases. Nucl. Acids Res., 33,230-232

87. Rochepeau, P., Selinger, L.B. and Hynes, M.F. (1997) Transposon-like structure of a new plasmid-encoded restriction-modification system in Phizobium leguminosarum VF39SM. Mol. Gen. Genet., 256, 387-396

88. Rosamond, J., Edlich, B. and Linn, S. (1979) Elecrton microscopy studies of the mechanism of action of the restriction endonuclease of Escherichia coli B. J. Mol. Biol., 1239, 619-635

89. Saha, S., Ahmad, I., Reddy, Y.V.R. and Krishmanurthy, V. (1998) Functional analysis of conserved motifs in type III system restriction-modification enzymes. Biol. Chem., 379, 511-517

90. Saha, S. and Rao, D.N. (1995) ATP hydrolysis is required for DNA cleavage by Eco?\ restriction enzyme. J. Mol. Biol. 247, 559-567

91. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467

92. Sasnauskas, G., Halford, S.E. and Siksnys, V. (2003) How the BJll restriction enzyme uses one active site to cut two DNA strand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 6410-6415

93. Scavetta, R.D., Thomas, C.B., Walsh, M.A., Szegedi, S., Joachimiak, A., Gumport, R.I. and Churchill, M.E. (2000) Structure of Rsrl methyltransferase, a member of the N6-adenine beta class of DNA methyhransferases. Nucl. Acids Res., 28,3950-3961

94. Schluckebier, G., Labahn, J., Granzin, J., Schildkraut, I. and Saenger, W. (1995) A model for DNA binding and enzyme action derived from crystallographic studies of the Taql N6-adenine-methyltransferase. Gene, 157, 131-134

95. Schluckebier, G., O'Gara, M., Saenger, W. and Cheng, X. (1995) Universal catalytic domain structure of AdoMet-dependent methyltransferases. J. Mol. Biol., 247, 16-20

96. Siksnys, V., Skirgaila, R., Sasnauskas, G,M Urbanke, C., Cherny, D., Grazulis, S. and Huber, R.1999) The Q?10I restriction enzyme is functional as tetramer. J. Mol. Biol., 291, 1105-1118

97. Simoncsits, A., Tjornhammar, M.-L., Rasko, Т., Kiss, A. and Pongor, S. (2001) Covalent joining of the subunits of homodimeric type II restriction endonuclease: single-chain PvuW endonuclease. J.Mol.Biol., 309, 89-97

98. Skinner, M.M., Puvathingal, J.M., Walter, R.L. and Fridman, A.M. (2000) Crystal structure of ^ protein isoaspartyl methyltransferase: a catalyst for protein repair. Structure, 8, 1189-1201

99. Smith, H.O., Nathans, D. (1973) Asuggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. Mol. Biol., 81,419-423

100. Stankevicius, K., Lubis, A., Timinskas, A., Vaitkevicius, D. and Janulaitis, A. (1998) Cloning and analysis of the four genes coding for Ври 101 restriction-modification enzymes. Nucl. Acids Res., 26, 1084-1091

101. Stein, D.C., Gunn, J.S. and Piekarowicz, A. (1998) Sequence similarities between the genes encodimg the SJVgoI and HaeII restriction/modification systems. Biol. Chem., 379, 575-578

102. Studier, F.W. and Bandyopadhyay, P.K. (1988) Model for how type I restriction enzymes selectcleavage sites in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 87, 8070-8074

103. Tomb, J.F., White, Q., Kerlavage, A.R. et al (1997) The complete genome sequence of the gastric payhogene Helicobacter pylori. Nature, 388, 539-547

104. Vanamee, E.S., Santagata, S. and Aggarwal, A.K. (2001) Fokl requires two specific DNA sites for cleavage. J. Mol. Biol. 309,69-78

105. Verdine G.L. (1994) The flip side of DNA methylation. Cell, 76, 197-200

106. Wah, D.A., Hirsch, J.A., Dorner, L.F., Schildkraut, I. and Aggarwal, A.K. (1997) Structure of the multimodular endonuclease Fokl bound to DNA. Nature, 388, 97-100

107. Wilson, G.G. and Murrey, N.E. (1991) Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627

108. Yang, A.S., Shen, J.-C., Zingg, J.-M., Mi, S. and Jones, P.A. (1995) Hhdl and Hpall DNA methyltransferases bind DNA mismatches, methylate uracil and block DNA repair. Nucleic Acids Res. 23, 1380-1387

109. Yuan, R., Hamilton, D.L., and Burckhardt, J., (1980) DNA translocation by restriction enzyme from E.coli K. Cell, 20,237-244

110. Zhang, X., Zhou, L. and Cheng, X. (2000) Crystal structure of the conserved core of protein arginine methyltransferase PRMT3. EMBOJ. 19, 3509-3519

111. Zheleznaya, L.A., Shiryev, S.A., Zheleznyakova, E.N., Matvienko, N.N., Matvienko, N.I. (1999) R.&pD5I is neoschizomer of Hph\ producing blunt end DNA fragments. FEBS Letters, 448, 3840

112. Zhu, Z., Samuelson J.C., Zhou, J., Dore, A. and Xu, S-Y. (2004) Engineering strand-specific DNA nicking enzymes from the type IIS restriction endonucleases Bsal, BsmBl, and BsmAl. J. Mol.Biol., 237,573-583

113. Zieger, M., Patillon, M., Roizes, G., Lerouge, Т., Dupret, D. and Jeltsch, J.M. (1987) Two restriction endonucleases from Bacillus sphaericus: BspXl and BspXU. Nucl. Asids Res., 15, 3919

114. Определитель бактерий Берджи, под ред. С. Уильямса, издание 9, Москва, Мир, 1997 Бурьянов Я. И., Веножинскис М. Т. (1982) Биохимия, 47, 1375-1377

115. Васильева Л.Ю., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. (2000) Клонирование и экспрессия новой сайт-специфической метилтрансферазы M.&cLlI из Staphylococcus sp. L1. Биохимия, 65, 665-671

116. Мапиатие Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. 1984, Москва, Мир

117. Матвиенко Н.Н., Крамаров В.М., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. (1993) Выделение сайт-специфических эндонуклеазы и метилазы из Bacillus cereus 83. Биохимия, 58, 1845-1860

118. Ковалевская Н.П., Железная JI.A., Зелинская Н.В., Матвиенко Н.И. (1994) Новый термофильный штамм Bacillus coagulans продуцент сайт-специфической эндонуклеазы BcoKl. Микробиология, 63,235-238

119. Цветкова Н.В., Милейковская М.М., Грубер И.М., Поляченко В.М., Буткус В.В., Япулайтис А. А. (1987) Выделение и определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Bcml. Мол. геиет. микробиол. Вирусология. 4, 19-22

120. Юнусова, A.JL, Рогулин, Е.А., Артюх, Р.И.,. Железная, J1.A, Матвиенко, Н.И. (2006) Белок, кодируемый открытой рамкой считывания, расположенной рядом с геном никазы BspD6\, в комплексе с никазой образует эндонуклеазу рестрикции. Биохимия, в печати