Эколого-генетическое обоснование защиты генома при профессиональном воздействии никеля с помощью аскорбиновой кислоты

Перминова, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эколого-генетическое обоснование защиты генома при профессиональном воздействии никеля с помощью аскорбиновой кислоты
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-генетическое обоснование защиты генома при профессиональном воздействии никеля с помощью аскорбиновой кислоты"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КОЛЬСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР Институт проблем промышленной экологии Севера

На правах рукописи

Перминова Елена Владимировна

ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЗАЩИТЫ ГЕНОМА ПРИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НИКЕЛЯ С ПОМОЩЬЮ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Апатиты 2003

Работа выполнена в Институте проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра РАН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Г.Д.Засухина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Н.А.Бебякова доктор медицинских наук, академик РАЕН В.В.Худолей

Ведущая организация:

Санкт-Петербургская Академия постдипломного образования

Защита диссертации состоится «21 » марта 2003 г. в_часов на заседании

Диссертационного Совета КР 208.004.03. при Северном государственном медицинском университете по адресу: 163061, г.Архангельск, Троицкий проспект, 51.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Северного государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, доцент

1. Е.Дерягина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В ходе развития научно-технического прогресса преобразование человечеством окружающей среды (ОС) обращается негативным воздействием на здоровье и самочувствие. Отдаленные последствия воздействия химических и физических факторов ОС представляются на сегодня наиболее серьезными и сложными вопросами, стоящими перед исследователями. Около 80% онкопатологий связывают с повседневным влиянием на человека огромного количества химических, физических и биологических факторов ОС, для большинства из которых уже доказаны мутагенные и канцерогенные свойства (Худолей В.В., 1999; Smerhovsky Z. et al 2001, и др.).

Большой вклад в решение этих проблем вносит экологическая генетика (Рычков Ю.Г., 1991; Пузырев В.П., 1997; Инге-Вечтомов С.Г., 1998). Среди ее наиболее актуальных и одновременно крайне сложных задач особое значение придается изучению проблемы защиты наследственных структур от хронического воздействия антропогенных мутагенных факторов, являющихся в большинстве также и канцерогенами, на ранних доклинических стадиях (Засухина Г.Д и др., 1989-2002; Дурнев А. Д., Середешш С.Б., 1998; Odin А. Р., 1997; Rauscher R. et al., 1998 и др.).

Рабочие горно-металлургических предприятий и население, проживающее вблизи err заводов, представляют многочисленную группу риска, подверженных хроническому воздействию высоких и низких концентраций целого ряда тяжелых металлов и их соединений в сочетании с другими неблагоприятными факторами (Проблемы охраны.., 1984; Перминова И.Н., 1995; Domenz H. et al., 1996). В связи с этим в последние десятилетия пристальное внимание ученых сосредоточено на изучении генетических последствий и путей защиты организма человека при воздействии тяжелых металлов (Виталиев АБ., 1986; Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989 и др.).

Горно-металлургический комплекс играет главенствующую роль в экономике Мурманской области. Производство никеля представлено двумя крупными предприятиями по пирометаллургической переработке сульфидных медно-никелевых руд - "Печенганикель" и "Североникель". Приоритетными загрязнителями при данном типе производства являются малорастворимые и нерастворимые соединения никеля (Doll R-, 1990; Senil V. et al., 1992; Fletcher M. et al., 1994 и др.). В многочисленных работах сотрудников Инстшуга. проблем промышленной экологии Севера Кольского Научного Цешра РАН показан вклад никелевых предприятий в проблему загрязнения ОС и негативного, влияния на здоровье населения Кольского региона (Перминова И.Н. и др., 1997; Калабин Г.В., 2000 и др.). Предприятия по производству никеля занимают одно из первых мест в России по уровню профессиональной заболеваемости и показателям загрязненности воздуха рабочих зон вредными веществами и ru.uu.io среди промышленных предприятий.

Интерес исследователей во всем мире к никелю вызван полученными доказательствами его способности к формированию множественных повреждений в живых клетках. Имеется ряд. эпидемиологических данных, свидетельствующих о повышенной частоте возникновения рака носоглотки и легких (Sundemian F.W. et al., 1986; Grimsrud Т.К. et al., 2002 и др.), простата (Andersen A. et al., 2002), а также желудка (Artunina G.P. et al., 2002) у рабочих, хронически контакгирующих с соединениями никеля. Генотокеические эффекты никеля на половые клетки

РОС. i '.А ЦНОН А Л li !' А" БГ!БЛ*ОТЕКЛ

человека представляют потенциальную угрозу формирования нежелательных отдаленных последствии для будущих поколений.

Практически неизучен вопрос о возможных путях защиты генома при высокодозовои профессиональной экспозиции никелем и при широкораспространенном низкодозовом воздействии на • население. Интересы многих исследователей в последние десятилетия сосредоточены на поиске оптимальных уровней потребления витаминов и других аншмушгенов для повышения генетической стабильности ДНК (Ames B.N., 2001; Fenech M., Ferguson L.R., 2001 и др.). Изучение этих вопросов особенно актуально в районах Крайнего Севера с экстремальными природными условиями, для жителей которых, в частности, характерно более интенсивное протекание процессов свободно-радикального окисления. Одним из основных механизмов генотоксического действия никеля, как и многих других металлов с переменной валешиосгыо, является образование свободных радикалов (Costa M. et al., 1994; Huang X. et al., 1994; Kasprzak K.S., 2002 и др.). Поэтому для снижения неблагоприятных последствий действия никеля, на ДНК рабочих нами был использован аналог природного антиоксиданта— аскорбиновая кислота (АК).

При изучении мутагенеза и канцерогенеза, обусловленных конкретным физическим или химическим агентом, и подборе апеквашого антимутагена подчеркивается необходимость учета индивидуальной чувствительности в î-pyi шах людей как по отношению к мутагенному фактору, гак и к ангимутагеку (Слицьш В.А., 1991; Kelsey К .T. et al., 1995; Landi S. et al., 1996 и др.). В этом направлении, опирающемся на достижения в области изучения популяционного генешческого полиморфизма, существует много актуальных проблем, решение которых позволит осуществлять более эффективную профилактику негативных эффектов здоровья, в частности, обусловленных воздействием соединений никеля.

Настоящая работа посвящена проблеме изучения эффективных средств защиты генома up:! воздействии соединений никеля у рабочих плавильного производства чернового иикеля и населения, проживающего вблизи от предприятия.

Цели и задачи цссиедовапия

Целыо настоящего исследования явилась оценка уровней повреждения клеток человека соединениями ник&ля in vili'o и in vivo и ангимутагенной активности ЛК в группе рабочих плавильного производства чернового никеля с учетом факторен, модифицирующих уровни штогенетаческого показателя индивидуальной чувствительности к геиотоксическому действию соединений никеля и к защитным эффектам АК.

В связи с постатейной целью были определены следующие задачи:

1. Определение давней структурных изменений хромосом и репарации ДНК в лимфоцитах рабочих, контактирующих с соединениями никеля, до и после приема АК.

2. Изучение распределения цитогенетического показателя индивидуальной чувствительности к соединениям никеля и АК и его взаимосвязи с уровнем содержания никеля в организме, со стажем работы и стилем жизни.

3. Экспериментальная оценка способности соединений никеля к формированию адаптивного ответа (АО) в сомагаческих клетках человека in vitro.

Научная новизна исследования

• Впервые проведены комплексные исследования по изучению генетических эффектов соединений никеля на основе параллельного определения сгруктурных изменений хромосом и уровней содержа! шя никеля в организме рабочих плавильного производства чернового никеля ia Европейском Севере. Установлен достоверно повышенный уровень структурных изменений хромосом (р<0,01), который в цепом i ю группе не зависел ни от содержания никеля в организме, ни от стажа работы. Курение усиливало генотоксические эффекты никеля в лимфоцитах рабочих.

• Выявлена высокая степень вариабельности цитогенетического показателя в лимфоцитах рабочих при хроническом воздействии высоких концентраций соединений никеля как до, так и после курса приема АК, причем в большей степени индивидуальные различия проявлялись в группе плавильщиков в сравнении с рабочими вспомогательных профессий.

• Доказано, что прием АК по 1г в суг. в течение месяца сопровождался достоверным снижением уровня цитогенетических изменений хромосом в лимфоцитах рабочих пирометаллургии еского производства никеля (р<0,01).

• Впервые установлено, что в условиях in vitro NiS04 обладал способностью формировать перекрестный АО по отношению к повреждающему воздействию этого мутагена, у-радиации и 4-гопрохинолин- 1-оксида (4НХО).

Научно-практическая значимость работы

- Результаты исследований могут быть использованы при профессиональном отборе и профориентации рабочих по признаку чувствительности к соединениям никеля, а также при ежегодных профилактических обследованиях рабочих, занятых в процессе пиромегаллургической переработки сульфидных медно-гашелевых руд, для регистрации возможных генетических неблагоприятных изменений.

- Полученные результаты доказали состоятельность представленного в работе методического подхода при выборе и оценке эффективности путей и средств защиты генома в группах риска

__ при профессиональной экспозиции к никелю. - - -----

- Показана высокая эффективность АК в снижении уровней цитогенетических повреждений в лимфоцитах рабочих плавильного цеха производства никеля: курс приема АК в дозе 1г/суг. в течение месяца; что может быть использовано для разработки мероприятий по профилактике нежелательных генетических последствий воздействия соединении никеля.

организма к повреждающему действию некоторых химических соединеиий и радиации на популяциошюм уровне и требует продолжения исследований в этом направлении.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Соединения никеля обладают выраженной генотоксической активностью, вызывая повышение уровней стругаурных изменений хромосом и ингибирование репаративных процессов в лимфоцитах периферической крови обследованных рабочих плавильного цеха, более выраженные у курящих в сравнении с некурящими.

2. Прием АК (в дозе 1г/сут. в течение месяца) достоверно снижает уровни цигогенетических повреждений, индуцированных соединениями никеля в лимфоцитах рабочих, т.е. АК обладает ангимутагенным эффектом по отношению к соединениям никеля.

3. В целом показатель структурных изменений хромосом не зависит ни от стажа работы на предприятии, ни от уровня содержания никеля в организме рабочих. По-видимому, высокая вариабельность цикненетического показателя обусловлена дифференциальной чувствительностью обследованных индивидуумов к соединениям никеля, к курению и шпимутагенной активности АК, в зависимости от индивидуальных наследственных особенностей генашпа, а также значительным влиянием других генотоксических факторов на рабочих вспомогательных профессий.

4. Предобработка клеток человека низкими концентрациями сульфата никеля через определенный период времени формирует повышенную устойчивость клеток к повреждающему действию высоких концентраций згой соли, а также к у-радиации и стимулирует репаративный синтез ДНК (PC ДНК) по отношению к 4НХО.

Апробация работы Основные результаты доложены:

• ¡¡а Международной Медсестринской Конференции на Кольском полуострове (г.Апатиты, 28-30 сентабря 1999г.);

• на Конференции "Проблемы безопасности питьевой воды и продовольствия в арктических и субарктических регионах" (г.Мурманск, 17-19 марта 2000г.);

• на заседании лаборатории мутагенеза и репарации Инеппуга общей генетики им.Н.И.Вавилова (г.Москва, 31 октября 2000г.);

• на Всероссийской конференции "Научные аспекты экологических проблем России" (г.Москва, 13-16 июня 2001 г.);

• на VI Международной Конференции по никелю (г.Мурманск, 1-6 сентября 2002г.).

• XXVI Апатитский семинар "Физика авроралъных явлений (г.Апатиты, 25-28 февраля, 2003 г.)

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 131 сгршшцах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 17 рисунков и 8 приложений. Диссертация состоит из введения, обзора люературьт, описания материалов и методов, 3-х глав результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 78 отечественных и 187 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

Д'ш изучения щтготоксических и генотоксических эффектов соединении никеля в условиях in vitro использовали перевиваемые клетки линии рабдомиосаркомы (RD) и лимфоциты периферической крови человека.

Мутагенный потенциал соединений никеля и антимутагенную эффективность АК оценивали по цигогенетическим кригериям в лимфоцитах периферической крови рабочих (15 человек), запятых в процессе пирометаллургической переработки сульфидных медно-никелевых руд и профессионально контактирующих с соединениями никеля (пгт.Никель, Мурманская область). Основная группа состояла из рабочих основных (Г группа - плавильщики, конверторщик) и вспомогательных (П группа - сварщики, мастер, слесарь, каменщик-печник) профессий. Средний возраст рабочих плавильного цеха для плавильщиков составлял 40,3 года, для рабочих вспомогательных профессий - 33,5 лет. Время постоянного проживания на Севере обследованных рабочих в среднем для группы - более 17 лет. Проведенный опрос не выявил значимых отличий между индивидуумами по рационам питания, по использованию личного и общественного автотранспорта и расположению дома к проезжей части, а также по приметаемой для приготовлеюм пищи посуды.

В контрольную группу отбирались практически здоровые индивидуумы по принципу "копи-пары", не подвергающиеся воздействию вредных химических факторов в профессиональной деятельности и проживающие на территории, расположенной на значительном расстоянии от никелевого производства (г.Апатиты, Мурманская область). Группы для исследования формировались в соответствии с рекомендациями по анализу необходимого объема выборки для оценки уровней цитогенетических повреждений в популяции (Лазутка Ю.С., 1984). Отбор проб крови производился до и после курса приема витамина С, в зимне-весенний период. Кровь отбиралась из локтевой вены в гепаринизированные пробирки. Одновременно с первым отбором проб крови проводился отбор проб волос для анализа на содержание никеля у рабочих и в контрольной группе. Использованные реагенты

В экспериментах in vitro использовалась водорастворимая соль никеля NiSO^xfl^O (NiS04, Sigma, США) в диапазоне концентраций 10'7- 10"3 М. В качестве положительного котроля использовали мутагены, при воздействии которых восстановление повреждений происходит различными путями: 4-нитрохинолин-1-оксвд (4НХО, Sigma, США), УФ-миметик в диапазоне концепграций Ю'ЧО'5 и у-облучение (источник — l37Cs с мощностью дозы 486 рад/мин, установка ГУШС-800, ИОГен РАН).

В качестве антимутагена использована аскорбиновая кислота (АК, витамин С, С6Н806). Рабочие и обследуемые из контрольной группы принимали АК по lf/сутки в два приема (таблетки по 200мг, Nycomed Pharma AS, Норвегия) ежедневно в течение 1 месяца.

Методы исследований

Для определения спонтанного уровня сестринских хроматидных обменов (СХО) и скорости прохождения генерации (СПГ) лимфоциты суточной крови человека культивировали в пенициллиновых флаконах по стандартной методике. Фиксировали

клетки через 90-96 ч после стимуляции клеток фитогемагглютинином (ФГА). Окраску проводили по FPG-технике (ФПГ, фдюорохром плюс Гимза), предложенной Пери и Вольфом (Perry P.E., Wolff Sh., 1974), модифицированной Ю.С.Лазуткой и Р.КЛекявичюсом (1984). СХО считали в 15-20 клетках со стекла. Кинетику клеточного цикла оценивали по средней продолжительности генерации, которую определяли методом J.L. Ivett, R.R. Tice (Лазутка Ю.С., 1989)

Учет микроядер (МЯ) производили в культуре лимфоцитов суточной крови рабочих, контактирующих с соединениями никеля. Культивирование клеток (без цитохолазина В), фиксацию и окрашивание препаратов осуществляли стандартно по методике, описанной ранее для СХО. При анализе МЯ определяли частоту МЯ на 100 клеток. В каждом варианте эксперимента анализировали 2000 клеток. Перерасчет проводили по методике, модифицированной Г.П.Македоновым (2002). Учитывались только МЯ в клетках с хорошо сохраненной цитоплазмой.

PC ДНК, индуцированный 4НХО (10'7М), исследовали жидкостно-ашнтилляциошшм методом по включению JH-m\nwiHa. Для этого культуру лимфоцитов суточной крови культивировали в среде роста (в соотношении 1:5) в присутствии ФГА в течение 24 ч в пешщиллиновых флаконах при 37°С. Для подавления репликативного сшпеза через 24 ч вносили оксимочевину (ОМ, 2« 10"3М, Boehringer Mannheim GmbH, Germany) на 40 мин. 3Н-тимщшн (3,7хЮ"5 Бк/мл, Sigma, USA) вводили одновременно с мутагенами на 2 ч при 37°С. Об шггенсивности PC ДНК судили по индексу стимуляции репаративного синтеза ДНК (ИС PC ДНК) - отношению радиоактивности в мутаген-обработанных клетках к радиоактивности в контрольных образцах.

Для изучения феномена АО использовали следующие критерии: выживаемость клеток, способность соединений никеля влиять на процессы формирования разрывов ДНК и стимуляция PC ДНК.

Выживаемость клеток оценивали в тестс прижизненного окрашивания клеточной суспензии 0,4%-ным раствором трипанового синего (Sigma, USA). Находящиеся в монослое клетки RD, обрабатывали низкой концентрацией соли никеля (10"6М), которая не вызывала снижения выживаемости клеток, в течение 20 ч или облучали в дозе 10 сГр и затем пересевали в пенициллиновые флаконы. Через 2 ч клетки промывали свежей средой и обрабатывали NiS04 (ЗхЮ^охЮ^М) в течение 20 ч, затем их промывали и оставляли в свежей среде на 2-3 суток. Раствор трипанового синего смешивали с клеточной суспензией в соотношении 1:1. Подсчет живых, неокрашенных клеток проводили в камере Горяева.

Определение однонитевых разрывов ДНК в опытах по изучению АО проводили методом щелочной элюции по Кону (Kehn K.W. et al., 1974). Клетки, меченные 3Н-тимидином (1мкКи/мл; удельная активность - 186 ГБк/л), обрабатывали NÍSO4 (10"7М). Через 24 ч постинкубации клетки облучали у-лучами в дозе 10,20 и 30 Гр, после чего их Собирали на иитроцеллюлозные фильтры (1,2 цт, Sártorius), промывали и лизировали. Элюцию выполняли в темноте в течение 2 ч 0,02М раствором гидроксида тетраиропиламмония с рН=12,45. Относительную радиоактивность каждой элюированной фракции вычисляли по формуле К = (Р0 - Рф)/Р0, где Р0 -радиоактивность всех элюированных фракций плюс радиоактивность, оставшаяся на фильтре после элюции; - радиоактивность каждой фракции. 8

Для определения PC ДНК в опытах по изучению АО при посадке одновремешю с ФГА в культуру лимфоцитов вносили NiS04 (10'7М). Через 20 ч вводили ОМ на 40 мин. В остальном посадку и обработку мутагенами проводили стандартно, как описано выше.

Графики, представленные на рис. 5,6 и 7, построены по данным одного из трех независимых экспериментов.

Анализ проб волос на содержание никеля выполнен методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной аргоновой плазмой (прибор 1СЛР-9000 "Thermo Jarrell Ash", USA) в Центре биотической медицины (г.Москва).

Математическая обработка данных и построение диаграмм и графиков осуществлялись при использовании пакета прикладных программ статистической обработки "Excel 95" и "Statistica" на персональной ЭВМ. Для сравнения двух связанных выборок применяли критерий Вилкоксона, для несвязанных - U критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился по коэффициенту корреляции Спирмена. Характеристики распределений представлены в виде A (L, Н), где А -медиана, L — нижняя квартиль, Н — верхняя квартиль; или средней геометрической.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ_

1. Результаты цитогенетического мониторинга в группах рабочих предприятия по пирометаллургической переработке сульфидных медио-никелевых руд Оценка уровней структурных изменений хромосом в лимфоцитах рабочих

Для учета влияния мутагенных факторов производственной среды на рабочих плавильного цеха чернового никеля использованы два критерия оценки цито генетических повреждений (СХО и МЯ) в лимфоцитах. Установлено, что средние уровни СХО в лимфоцитах рабочих незначительно отличались от среднепопуляционных фоновых уровней спонтанного образования СХО (6-8 СХО/клетку) и составляли для I-ой и Н-ой групп соответственно 7,7 и 8,2 СХО/клетку.

Результаты микроядерного теста выявили в лимфоцитах рабочих значительные превышения среднепопуляционных значений МЯ 9,9 (9,2; 10,7) МЯ/100 клеток (рис. I), которые составляют по внутрилабораторным данным 1,5±0,54 МЯ/100 клеток (Македонов Г.П., Цховребова Л.В., 2002). Ранее повышенные уровни цитогенетических изменений в лимфоцитах рабочих, контактирующих с никелем на производстве, были зарегистрированы по критериям учета ХА (Deng С. et al., 1988; Senft V. et al., 1992), СХО (Wcrfel U. et al., 1998) и др.

В группе рабочих вспомогательных профессий уровень МЯ 10,3 (9,8; 10,7) МЯ/100 клеток превышал таковой в группе плавильщиков 9,5 (8,3; 9,9) МЯ/100 клеток. Подобная тенденция наблюдалась также по критерию СХО.

Курящие плавильщики характеризовались более высокими спонтанными уровнями МЯ (9,7 на 100 клеток) в лимфоцитах, чем некурящие (8,6 на 100 клеток) (рис. 1). График демонстрирует высокую степень вариабельности по уровню образования МЯ в лимфоцитах плавильщиков, особенно курящих, в отличие от рабочих вспомогательных профессий.

□

ZC Min-Max CD 25%-75% П Медиана

некурящие

n=5

курящие П=4

некурящие п=3

n=3

плаоилыцики рабочие вспомогательных профессий

Рис. 1. Средние уровни МЯ на 100 клеток в лимфоцитах рабочих основных и вспомогательных профессий с учетом статуса курения

Характеристика репаршшвного синтеза ДНК в лимфоцитах рабочих

Параллельно с оценкой цитогенстичсских изменений определялся показатель репаративных процессов в лимфоцитах рабочих и гампроля. Как известно, PC ДНК, с одной стороны, служит самостоятельной оценкой мутагенности, а, с другой, отражает способность клеток к восстановлению повреждений ДНК

• В группе рабочих плавильного цеха в 87% наблюдалось ингибирование процессов репарации, в то время как в кошролыюй группе лишь у 37% обследованных. Имеется ряд литературных данных, подтверждающих ингибирование репаративной активности соединениями никеля (Hartwig A. et al., 1994; Snyder R.D., 1994; Перминова И.Н. и др., 1997 и др.). Медианные значения ИС PC ДНК в группах рабочих основных и вспомогательных профессий находились на одном уровне (0,8), но при этом в группе рабочих вспомогательных профессий наблюдалась более высокая вариабельность показателя от 0,46 до 1,37, в сравнении с плавильщиками (от 0,66 до 1,01).

У курящих рабочих исходный уровень PC ДНК составлял 0,78 (0,71; 0,90), что на 17% ниже в сравнении с некурящими, у которых индекс стимуляции достигал в среднем 0,82 (0,71; 0,98). Достоверные различия (р=0,05) между курящими и некурящими наблюдались только во 11-ой группе, причем только среди некурящих рабочих вспомогательных профессий, наблюдалась тенденция к стимуляции PC ДНК в лимфоцитах но отношению к 4НХО (0,97).

Индивидуальный ответ па воздействие соединений гмкеля в зависимости от концентрации, пикет в волосах

Показатель формирования МЯ служил также основным биомаркером оценки индивидуальной чувствительности к никелю, содержание которого определяли в волосах

рабочих и контроля. В контрольной ipynne уровни накопления никеля в волосах были достоверно ниже (в 30 раз) таковых у рабочих и варьировали от 0,07 до 0,90 мкг/т, в то время как в ipynne рабочих плавильного цеха - от 3,29 до 30.86 мкг/г, что соответствует различию внешней дозы экспозиции никелем. Как и следовало ожидать, в группе плавильщиков уровни содержания никеля в волосах были достоверно выше в 2,3 раза (р=0,01), чем в группе рабочих вспомогательных профессий: 15,1 (7,0; 30,9) мкг/г и 6,3 (3,3; 13,5) мкг/г соответственно.

В целом взаимосвязи между уровнями образования МЯ и содержанием никеля в волосах ни в одной из обследованных групп обнаружено не было (рис. 2). Тем не менее, анализ индивидуальных различий позволил выявил, важные тендащии модифицирующего влияния на индивидуальную чувствительность к соединениям никеля таких факторов, как содержите никеля в организме, стаж работы и курение, с учетом профессиональных особенностей.

Во-первых, следует отметить, что, если во П-ой группе значения находились приблизительно на одном уровне 9,2-11,1 МЯ/100 клеток (рис. 2Б), то в группе плавильщиков показатель варьировал в широких пределах огг 6,7 до 11,6 МЯ/100 клеток (рис. 2А). Это, верояшо, свидетельствует о существенных различиях в индивидуальной чувствительности к никелю, обусловленной гаютипом, среди рабочих основных профессий, хронически экспонированных высокими концентрациями малорастворимых и нерастворимых соединишй никеля. Так, например, имеются доказательства высокой чувствительности носителей генотипа GSTM1 по отношению к моноэпоксибугану (Sasiadek M.et al., 1997; Sram R.J., Binkova В., 2000 и др.). Можно предполагать, что семейство генов GST также могут детерминировать чувствительность к никелю.

Во-вторых, можно выделить некоторые особенности индивидуальной реакции на влияние производственных факторов. Так, некоторые индивидуумы из основной группы (доноры №№ 8 и 9) с повышенными уровнями повреждений при низком содержании никеля в волосах, по-видимому, обладают повышенной чувствительностью к соединениям никеля (рис. 2А). Донор под № 1 характеризовался наиболее высоким уровнем Ni в волосах (30,9 мкг/г) при высоком уровне формировшшя структурных перестроек хромосом, что может указывать на недостаточную активность ферментов, принимающих участие в дегоксикации ксенобиотиков, в том числе, компонентов ангиоксидантной системы. Кроме того, в вышеперечисленных случаях, возможно, происходило усиление генотоксических эффектов курением. У индивидуумов под №№ 2 и 3 при высоких уровнях содержания никеля в организме (29,6 и 27,3 мкг/г) наблюдались относительно невысокие для данной группы уровни образования МЯ в лимфоцитах (8,3 и 9,3 МЯ/100 клеток), оба относились к некурящим. Можно предположить, что подобный эффект обусловлен включением адаптивных механизмов.

В-третьих, при том, что в целом по ipynne плавильшиков корреляции между количеством МЯ и стажем не наблюдалось, у рабочих основных профессий со стажем более 10 лет коэффициент корреляции по Спирмену был равен Rs=4),93 (р=0,008). Значительная отрицательная связь межну уровнями формирования МЯ и стажем, наблюдалась также в группе рабочих вспомогательных профессий Rs= -0,84 при р=0,04. Можно предположить, что для некоторых рабочих имеет место повышение устойчивости клеток к генотоксическим производственным факторам с увеличением стажа работы.

12. 9 , МЯ 71000 клеток'

6,3

п=9

12 15 18

21 24 27 30 содержание № в волосах, мкг/г

12 9 МЯ /1000 клеток

содержание N1 в волосах, мкг/г

Рис.. 2. Зависимость показателя количества МЯ а лимфоцитах рабочих от уровней ссдсрзхапия ыи<еля в волосах с учетом стажа работы на щждприятии (свепшые столбики в вариационном ряду по числу МЯ/100 клеток - некурящие, темные - курщие): А - в группе рабочих основных профессий; Б-в группе рабочих вспомогательных профессий; (19) - стаж-работы на предприятии.

Что 'касается оценки индивипуалыюй чувствительности в группе рабочих вспомогательных профессий (рис. 2Б), то выраженных отличий по критерию формирования МЯ

в лимфоцитах вьивлено не было. У сварщиков, работающих в плавильном цехе, зарегистрированы уровни цитогенегических повреждений хромосом, значительно превышающие среднегруиповой показатель (10,7, 10,6 и 10,0 МЯ/100 клеток), что согласуется с литературными данными Уе1теп О. й а1., 1994; 1е1теП О. й а1., 1995; \Verfel I). е1 а1., 1998).

Таким образом, геногоксическое влия!ше соединений никеля выражалось в значительном превышении (в 6,5 раз) средненопуляционных уровней формирования МЯ (1,5±0,5 МЯ/100 клеток) в лимфоцитах рабочих, подверженных воздействию высоких концентраций никеля на производстве, при одновременном ингибировании репаративной активности на 87%. Наблюдалась взаимосвязь между уровнями структурных изменений хромосом и профессиональными особенностями индивидуумов, а также привычкой к курению. Так, содержание № в организме и курение существенно модифицировали индивидуальную чувствительность к никелю в лимфоцитах рабочих, занятых в основных профессиях плавильного цеха Курение усиливало геногоксическое действие соединений никеля в группе плавильщиков, но не оказывало влияния на уровень содержания никеля в волосах.

2. Оценка эффективности аскорбиновой кислоты в снижении неблагоприятных генетических эффектов в лимфоцитах рабочих производства никеля Оценка изменений уровня структурных перестроек хромосом после курса приема аскорбиновой кислоты

После курса приема АК в контрольной группе наблюдалась тенденция к снижению уровней структурных изменений хромосом в лимфоцитах (р=0,08), которое по критерию СХО составило 8%. У некурящих антимутагенная эффективность АК была выражена в большей степени, чем у курящих (13% и 3% соответственно).

У рабочих прием АК привел к достоверному снижению числа МЯ в лимфоцитах на 30% с 9,5 МЯ/100 клеток по средней геометрической до уровня 6,7 МЯ/100 клеток (р=0,002). Это, возможно, свидетельствует о свободнорадикальных механизмах генетических повреждений в клетках работающих в плавильном цехе.

После приема АК достоверно понизились уровни формирования МЯ как в лимфоцитах плавильщиков, так и рабочих вспомогательных профессий: во Н-ой группе на 33% до уровня 6,6 (6,5; 7,0) МЯ/100 клеток, а в 1-ой на 27% до уровня 6,8 (6,1; 8,2) МЯ/100 клеток. В группе плавильщиков зарегистрирована высокая вариабельность показателя (рис.3), что, вероятно, указывает на значительные индивидуальные различия по чувствительности к АК и никелю. На показатель индивидуальной чувствительности к никелю и АК в лимфоцитах рабочих основных профессий существенное влияние оказывали содержание никеля в волосах, стаж работы на предприятии и привычка к курению. Наибольший эффект АК проявлялся у курящих, при низком содержании никеля в волосах и повышенном уровне цитогенетических повреждений, т.е. у индивидуумов, обладающих, по-видимому, наибольшей чувствительностью к соединениям никеля. Во П-ой группе подобной зависимости обнаружено не было.

У 3-х человек из" 14-ти отмечалось отсутствие антимутагешюго эффекта По всей видимости, отсутствие эффекта АК согласуется с полученными ранее Ю.Г.Рычковым с соавторами данными о том, что 15-18% здоровых людей не способны к ассимиляции АК (1985).

Интересно отметить, что у лиц старше 45 лет АК в меньшей степени проявляла защитный эффект, чем у более молодых индивидуумов.

мя

ЛИ М1п-Мах □ 25%-75% Р Медиана

МЯ+С МЯ МЯ+С

группа II/ п»6 группа I, п-й

Рис. 3. Уровни МЯ в лимфоцитах рабочих основных и вспомогательных профессий до и после курса приема АК.

Характеристика динамики показателей репаративного синтеза ДНК при воздействии аскорбиновой кислоты

Существенных отличий средних уровней РС ДНК в контрольной группе от таковых в основной группе как до, так и после приема АК выявлено не было. До приема витамина показатель в контроле был равен 0,68, то после - 1,07.

В таблице I представлены результаты по стимуляции РС ДНК 4НХО в лимфоцитах рабочих плавильного цеха до и после курса приема АК. Достоверного изменения ИС РС ДНК в группе рабочих не наблюдалось, можно лишь отметить, что этот показатель имел тенденцию к незначительному повышению с 0,79 до 0,96. При этом доля лиц, у которых не наблюдалось стимуляции РС ДНК, после приема АК снизилась на 23% и составила 64%.

Таблица /.

Индекс стимуляции РС ДНК, индуцированного 4НХО, до начала и после курса приема аскорбиновой кислоты в группе рабочих основных и вспомогательных профессий

Группа курящие, ср. геом. некурящие, ср. геом.

ИС ИС+С п ИС ИС+С п

Группа I ' 0,83 0,83 4 0,76 1,21 4

Группа И 0,64 0,88 3 0.97 0,93 3

п - количество человек

Эффекты влияния • АК на систему репарации ДНК в клетках рабочих характеризовались высокой степенью вариабельности: or выраженной стимуляции в диапазоне от 10% до 74% у 6 человек до ее отсутствия у 8 человек из 14 обследованных. В среднем в группе курящих рабочих как исходный уровень репаративной активности (0,74), так и после курса приема витамина (0,86) были существенно ниже в сравнении с некурящими, у которых индекс стимуляции достигал в среднем 0,85 и 1,08 соответственно до и после приема ЛК.

В целом для группы рабочих влияния профессиональных особенностей на уровень PC ДНК выявлено не было. Вместе с тем, следует отметить, что в группе рабочих основных профессий в лимфоцитах некурящих индивидуумов АК проявляла высокую эффективность, ИС PC ДНК достигал 1,21, в то время как у курящих не наблюдалось изменения среднего уровня показателя. Некурящие индивидуумы из Н-ой группы характеризовались относительно высоким уровнем репарации до приема АК, после курса приема витамина этот уровень не изменился. У курящих, также как и в 1-ой группе, существенной стимуляции репаративного синтеза обнаружено не было.

Таким образом, установлена выраженная ангимутагенная активность АК: прием АК привел к достоверному снижению числа МЯ в лимфоцигах рабочих (р=0,002). У плавильщиков наблюдался значительный разброс значений цигогенетического показателя после приема витамина С в зависимости от стажа работы, содержания никеля в волосах и привычки к курению. У рабочих вспомогательных профессий наибольшая активность АК проявлялась при наиболее высоких уровнях повреждений в лимфоцитах Известно, что АК способна к прямому перехвату свободных радикалов, что выражается в снижении количества первичных повреждений. Это может объяснить отсутствие выраженной стимуляции PC ДНК. В то же время значительное снижение числа МЯ после приема АК может говорить об активизации других этапов репарации, а также о возможности стабилизации структуры ДНК при участии АК или за счет снижения проницаемости клеточных мембран.

3. Экспериментальное изучение in vitro адаптивного ответа в клетках человека, предобработанных сульфатом никеля или у-радиацией, при воздействии высоких доз этих же мутагенов

Формирование адаптивного ответа (АО), как одного из механизмов защиты клетки от гснотоксического действия мутагенов и канцерогенов - in vitro на клетках человека впервые установлено для соединений никеля. Механизмы формирования АО на уровне клеточных структур до сих пор остаются до конца нераскрытыми.

Мы предположили, что поскольку мутагенное действие тяжелых металлов и, в частности, соединений никеля, также как и при воздействии у-радиации, опосредовано образованием свободных радикалов в клетках (Saplakoglu U. et al., 1997; Hamdan S. et al., 1999; Kasprzak K.S., 2002), то можно ожидать, что феномен адаптации при воздействии у-радиации и никеля может иметь общие пути.

Кинетика выживаемости клеток человека, предобработанных сульфатом никеля или -/-радиацией, к повреждающим дозам этих же мутагенов

На рис. 4 показано, что выживаемость клеток RD линейно снижалась при увеличении концентрации NiS04 от 5х10"6М до 5x10"4М (кривая 1). LD50

соответствовала концентрации соли никеля 5х10"5М. Предобработка клеток низкой концентрацией сульфата никем (10'6М, 24 ч) привела к повышению их выживаемости при всех повреждающих концентрациях соли никеля (5x10"6, 5х10"5, 5x1 О^М, 24 ч) (кривая 2). При воздействии NiS04 в концентрации SxlO^M предобработка клеток низкой дозой этого мугагена привела к повышению выживаемости в 3 раза в сравнении с необработанными предварительно клетками. Предварительное облучение клеток RD у-лучами в дозе 10-14 сГр при последующем воздействии повреждающей дозы NiS04 5х10'6М сопровождалось выраженным повышением выживаемости клеток RD (кривая 3). При дальнейшем увеличении концентрации сульфата никеля было отмечено снижение показателя цитотоксичности соли. При концентрации N1SO4 5х10"1М наблюдалась одинаковая эффективность как при использовании в качестве адаптирующего фактора сульфата никеля, так и у-радиации.

xl 04 клеток/мл 180 j

I' 150 --

С5 К

* 120 •-. Э

S 90 4

- I

« 60 о г я

2 30.;

о -к

Рис. 4. Выживаемость при АО клеток RD человека, обработанных NiS04 в концентрациях SxlCT1, SxlCT5, 5x106М. 1 - без предварительной обработки; 2-е предобработкой NiSOj в концентрации 1(Г6М, 24ч; 3-е предварительным облучением в дозе 10-14 сГр.

Изучение способности низких концентраций NiSO4 к повышению устойчивости tmemoK человека к у-радиации по критерию формирования разрывов ДНК . , На рис.5 представлены результаты серии экспериментов по изучению формирования АО в клетках RD, предобработанныхнизкими концентрациями NiS04 к последующему воздействию высоких доз у-радиации (10-30 Гр).

На рисунке кривая графика, отражающая показатель у-ивдуцировашых разрывов ДНК в предварительно обработанных адаптирующей концентрацией NiS04 (10"7М) клетках, расположена выше кривой индукции разрывов ДНК у-лучами в клетках, необработанных NiS04, что свидетельствует о протагторном действии сульфата никеля. В опытах без предварительной обработки клеток. 'JniSOj наблюдалось линейное снижение доли цельной ДНК, оставшейся на

фильтре после эшоции. В предобработанных клегках, yвeJшчeниe дозы у-излучетя до 20 Гр сопровождалось сначала снижением целостности нити ДНК, а затем при дальнейшем повышении дозы до 30 Гр отмечалась стабилизация показателя, что, возможно, объясняется индукцией РС ДНК адаптирующей дозой Ы1Б04 или формированием сшивок.

60 •

10 20 "зо Гр

Рис. 5. Индукция у-лучами разрывов ДНК в клетках М) человека. I - без предварительной обработки; 2-е предварительной обработкойШБО^ (1(Т7М), 24 ч.

Репаративный синтез ДНК

Концентрация сульфата никеля (10'7М), использованная в качестве адаптирующей, не вызывала изменений включения Н3-тимидина (ИС РС ДНК=1,00) в ДИК лимфоцитов здорового донора. При использовании концентрации №804 10"3М наблюдалась существенная стимуляция репарации (1,55). Сравнивая уровни репаративного синтеза при АО в опытах с 4НХО и N¡80^, мы обнаружили, что в первом случае имеет место стимуляция РС ДНК с 1,60 до 2,23. В опытах с N¡804 уровень РС ДНК практически не отличался в клетках, предобработанных низкими концентрациями никеля (1,61), и в клетках без предварительной обработки (1,55). Полученные данные свидетельствуют о неспецифичности процессов, лежащих в основе стимуляции репарации ДНК в предобработанных солью никеля клетках при использовании разных повреждающих факторов. В основе объяснения стимуляции РС ДНК по отношению к 4НХО может лежать предположение о стимуляции процессов индуцибельной репарации, как основного механизма при АО (Львова Г.Н., Засухина Г.Д., 2002; Шмакова Н.Л. и др., 2002 и др.).

Таким образом, можно предположить, что низкие концентрации никеля формируют АО по отношению к повреждающим концентрациям как самого никеля, так и некоторых других мутагенов, т.е. в наших опытах воспроизведен феномен кросс-адаптации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных данных позволяет заключить, что рабочие, контактирующие с соединениями никеля, характеризовались высокой индивидуальной чувствительностью к генотоксическому действию никеля и антимутагенной активности АК. По-видимому, индивидуальные отличия, помимо генотипической обусловленности, определялись также влиянием таких факторов, как уровни экспозиции к никелю, привычка к курению и, вероятно, различиями адаптивных резервов организма. Вместе с тем вполне возможно, что при обследовании большего контингента рабочих с учетом генотипа, определяющего индивидуальную чувствительность, будут выявлены и другие связи и закономерности взаимосвязи уровней накопления никеля в организме рабочих и исследуемыми цитогенетическими биомаркерами. Из группы обследованных рабочих можно выделить людей, характеризующихся повышенной чувствительностью генома к мутагенному воздействию никеля и нуждающихся в защитных и реабилитационных мероприятиях.

Явление кросс-адаптации при воздействии малых доз №2+ и у-радиации, установленное в опытах in vitro,- может являться теоретической основой последующих эпидемиологических исследований, ориентированных на оценку эффектов здоровья групп риска среди населения, экспонированного никелем из многочисленных источников ОС.

ВЫВОДЫ _

1. На основании эколого-генетической оценки последствий воздействия соединений никеля показана их генотоксическая активность для рабочих в условиях производства чернового никеля: обнаружены повышенные уровни микроядер и ингибирование репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах.

2. Установлено достоверное превышение содержания никеля в волосах рабочих основных профессий плавильного цеха в сравнении с рабочими вспомогательных профессий в 2,3 раза (р=0,01).

3. Оценка индивидуальной чувствительности к соединениям никеля выявила высокую степень вариабельности цитогенетического показателя в лимфоцитах плавильщиков в зависимости от содержания никеля в волосах и курения, усиливавшего генотоксическое действие никеля.

4. Прием аскорбиновой кислоты (1г/сут в течение месяца) сопровождался достоверным снижением числа микроядер на 30% (р<0,01) и тенденцией к стимуляции репаративного синтеза ДНК (на 18%) в лимфоцитах, что может быть использовано медицинскими - учреждениями для разработки профилактических мероприятий с применением аскорбиновой кислоты, как эффективного антимутагена в различных группах риска, экспонированных соединениями никеля.

5. Индивидуальная чувствительность к витамину С проявлялась в разнонаправленных эффектах: от выраженного снижения числа микроядер в лимфоцитах рабочих (на 60%) до отсутствия сдвигов после курса приема аскорбиновой кислоты.

6. Впервые в условиях in vitro доказано, что предобработка низкими концентрациями сульфата никеля формировала перекрестный адаптивный ответ в соматических клетках человека к последующему воздействию повреждающих концентраций NiS04 и у-радиации.

7. При разработке и проведении защитных и реабилитационных мероприятий в группах высокого профессионального риска производства чернового никеля необходим цитогенетический мониторинг, позволяющий диагностировать повышенную чувствительность генома рабочих к генотоксическому действию соединений никеля.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Перминова Е.В., С'инелыцикова Т.А., Перминова И..Н.., Засухина Г.Д. Сравнение адаптивного ответа в клетках человека при воздействии у-радиации и сульфата никеля//Радиационная биология. Радиоэкология. - 2000. - Т. 40. - №2. - С 173-176.

2. Перминова И..Н., Синельщикова 'Г.А., Алехина Н.И., Перминова Е.В., Засухина Г.Д. Биомониторинг в лимфоцитах рабочих, контактирующих с соединениями никеля, и подход к снижению генетических эффекгов/ЛДитолсгия и генетика. - 2001. - № 3. - С. 59-65.

3. Перминова И.Н., Синельщикова Т.А., Алехина Н.И., Перминова Е.В., Засухина Г.Д. Индивидуальная чувствительность к генотоксическому действию никеля и антимутагенной активности аскорбиновой кислоты//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - Т. 131. - № 4. - С. 437-441.

4. Перминова Е.В., Синельщикова Т.А. Перминова И..Н.. Сравнение . уровней адаптивного ответа при у-облучении и воздействии тяжелых металлов в клетках человека/АГезисы докл. Международного симпозиума "Хроническое радиационное воздействие: возможности биологической индикации", 14-16 марта. - Челябинск, 2000. -С. 170-171.

5. Яковлева МП, Перминова И.Н., Перминова Е.В., Синельщикова ТА Сравнительное действие ингибитора ангиоксидангного фермента - СОД при у-облучении и воздействии сульфата никеля/Лезисы докл. Международной Конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков", 20-24 ноября. - Москва, 2000. - С. 64-65.

6. Перминова И.Н., Перминова Е.В., Алехина Н.И. Роль аскорбиновой кислоты в снижении генотоксических эффектов соединений никеля у курящих и некурящих рабочих никелевого производства//Тезисы докл. Всероссийской Конференции "Научные аспекты экологических проблем России", 13-16 июня. - Москва, 2001. - С. 278.

7. Perminova Е., Sinelshchikova Т., Perminova I. Nickel-induced adaptive response in human cells/ЛЪе abstracts of Sixth Intern. Nickel Conference, September 1-6. - Murmansk, 2002.-P. 91.

8. Perminova I., Yakovleva M., Perminova E. Approaches to DNA damage.protection from exposure to nickel in high risk population groups//The abstracts of Sixth Intern. Nickel Conference, September 1-6. - Murmansk, 2002. - P. 92.

9. Perminova E.V., Yakovleva M.N., Perminova I.N., Zasukhina G.D. Experimental study of y-radiation effects on human cells//The abstracts of XXVI Annual Seminar "Physics of Auroral Phenomena", February, 25-28. - Apatity, 2003. - P. 22.

-Л

fijj » Z О г А

■ф J О v) '

Автореферат

ПЕРМИНОВА Елена Владимировна

ЭКОЛОГО-ГИНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЗАЩИТЫ ГЕНОМА ПРИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НИКЕЛЯ С ПОМОЩЬЮ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Технический редактор В.А.Ганичев

Лицензия ПД 00801 от 06 октября 2000 г.

Подписано к печати 25.12.2002

Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Гарнитура Times/Cyrillic

Уч.-изд.л. 1.0. Заказ № 11. Тираж 100 экз.

Ордена Ленина Кольский научный центр им.С.М.Кирова 184209, Апатиты, Мурманская область, ул.Ферсмана, 14

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Перминова, Елена Владимировна

Введение.

Глава 1. Экогенетические аспекты изучения последствий загрязнения окружающей среды соединениями никеля и путей защиты генома человека.

1.1. Значение современной методологии оценки риска воздействия химических мутагенов на человека для защиты здоровья населения.

1.1.1. Критерии оценки генетических последствий воздействия химических факторов загрязнения окружающей среды.

1.1.1.1. Структурные изменения хромосом при индуцированном химическими веществами мутагенезе.

1.1.1.2. Значение репаративного синтеза ДНК в механизмах защиты генома от индуцированного химическими веществами мутагенеза.

1.2. Оценка генетических последствий воздействия соединений никеля на клетки человека и животных.

1.2.1. Роль физико-химических свойств соединений никеля в процессах мутагенеза и канцерогенеза в биологических системах.

1.2.2. Цитогенетические эффекты в лимфоцитах людей, контактирующих с соединениями никеля в условиях никелевого производства.

1.2.3. Модификация генотоксических эффектов соединений никеля при комбинированном и сочетанном действии с мутагенными факторами окружающей среды.

1.3. Применение антимутагенов как подход к защите генома человека от неблагоприятных последствий загрязнения окружающей среды мутагенами.

1.3.1. Классификация антимутагенов.

1.3.2. Аскорбиновая кислота как антиоксидант и модификатор мутагенной активности химических соединений.

Глава 2. Объекты и субъекты, материалы и методы исследований.

2.1. Объекты и субъекты исследований.

2.2. Исследуемые вещества.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Определение спонтанного уровня сестринских хроматидных обменов и скорости прохождения генерации.

2.3.2. Микроядерный тест.

2.3.3. Определение репаративного синтеза ДНК методом сцинтилляционной радиометрии.

2.3.4. Определение выживаемости клеток методом прижизненного окрашивания раствором трипанового синего.

2.3.5. Определение формирования разрывов ДНК методом щелочной элюции.

2.3.6. Анализ проб волос на содержание никеля.

2.3.7. Математическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты цитогенетического мониторинга в группах рабочих предприятия по пирометаллургической переработке сульфидных медноникелевых руд.

3.1 Краткая характеристика заболеваемости и смертности населения Мурманской области, Печенгского района и г.Апатиты (контрольная группа).

3.2. Оценка уровней структурных изменений хромосом в лимфоцитах рабочих.

3.3. Характеристика репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах рабочих.

3.4. Индивидуальный ответ на воздействие соединений никеля в зависимости от уровней содержания никеля в волосах.

Глава 4. Оценка эффективности аскорбиновой кислоты в снижении неблагоприятных генетических эффектов в лимфоцитах рабочих производства никеля.

4.1. Оценка изменений уровня структурных перестроек хромосом в лимфоцитах рабочих после курса приема аскорбиновой кислоты.

4.2. Характеристика динамики показателя репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах рабочих при воздействии аскорбиновой кислоты.

Глава 5. Экспериментальное изучение in vitro адаптивного ответа в клетках человека, предобработанных сульфатом никеля или у-радиацией, при воздействии их высоких доз.

5.1. Кинетика выживаемости клеток человека, предобработанных низкими дозами сульфата никеля или у-радиации, к повреждающим дозам этих же мутагенов.

5.2. Изучение способности низких концентраций сульфата никеля повышать устойчивость клеток человека к у-радиации по критерию формирования разрывов ДНК.

5.3. Стимуляция репаративного синтеза ДНК сульфатом никеля по отношению к повреждающей концентрации 4НХО.

Обсуждение результатов. р. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эколого-генетическое обоснование защиты генома при профессиональном воздействии никеля с помощью аскорбиновой кислоты"

Актуальность проблемы

В ходе развития научно-технического прогресса человечество преобразует окружающую его среду обитания и ощущает ответную реакцию техногенной среды, которая выражается в негативном воздействии на здоровье и самочувствие. На пороге XXI столетия последствия деятельности человека зачастую приобретают черты необратимых изменений окружающей среды (ОС) как на локальном и региональном, так и глобальном уровнях. Недостаточность научно-обоснованной информации о последствиях таких изменений для здоровья и отсутствие единого антропоэкосистемного подхода к проблемам сохранения популяционного здоровья создают реальную угрозу выживания человечества.

На сегодня наиболее серьезными и сложными вопросами, стоящими перед исследователями, представляются отдаленные последствия воздействия химических и физических факторов ОС. Одним из междисциплинарных направлений, занимающихся изучением этих вопросов, является экологическая генетика [Рычков, 1991; Пузырев, 1997]. По определению, предложенному С.Г. Инге-Вечтомовым, "экологическая генетика - это область знания, исследующая взаимовлияние генетических процессов и экологических отношений" (1998). Среди ее наиболее актуальных и одновременно крайне сложных проблем — защита наследственных структур от хронического воздействия антропогенных мутагенных факторов, являющихся в большинстве также и канцерогенами, на ранних доклинических стадиях. В связи с этим в последние десятилетия особое значение придается исследованиям процессов антимутагенеза [Засухина и др., 1989-2002; Дурнев, Середенин, 1998; Odin, 1997; Rauscher et al., 1998 и др.]. Генетические методы имеют первостепенное значение при проведении оценки риска факторов ОС для здоровья человека. В этих целях наиболее эффективными на сегодня признаны цитогенетические показатели.

Пристальное внимание ученых сосредоточено на изучении генетических последствий и путей защиты организма человека при воздействии тяжелых металлов. Тяжелые металлы представляют наибольшую опасность для здоровья населения не только по причине интенсивного повсеместного загрязнения различных ОС, но и из-за разнообразия вызываемых цито- и генотоксических эффектов [Бигалиев, 1986; Бочков, Чеботарев, 1989; Бочков, Катасова, 1994 и др.]. Рабочие горно-металлургических предприятий и население, проживающее вблизи от заводов, представляют многочисленную группу риска, подверженных хроническому воздействию высоких и низких концентраций целого ряда тяжелых металлов и их соединений в сочетании с другими неблагоприятными факторами [Проблемы., 1984; Перминова, 1988, 1995; Domenz et al., 1996].

Горно-металлургический комплекс и, в частности, производство никеля играют главенствующую роль в экономике Мурманской области. По расчетам специалистов запасы сырья могут обеспечить успешное развитие предприятий по производству никеля на Кольском полуострове как минимум в течение 20-25 лет [Блатов, 2000]. В многочисленных работах сотрудников Института проблем промышленной экологии Севера Кольского Научного Центра РАН показано значение горно-металлургического профиля промышленности Кольского региона в проблемах загрязнения окружающей среды и негативного влияния на здоровье населения [Перминова и др., 1997; Кашулин и др. 1999; Калабин, 2000 и др.] (см. приложение 1). Предприятия по производству никеля занимают одно из первых мест в России по уровню профессиональной заболеваемости и показателям загрязненности воздуха рабочих зон вредными веществами и пылью среди промышленных предприятий. Рабочие предприятий по пирометаллургической переработке сульфидных медно-никелевых руд, а также население, проживающее вблизи от предприятия, представляют группу повышенного риска для здоровья, хронически подвергающуюся воздействию высоких доз никеля и оксидов серы [Перминова и др., 1979-1997; Odland et al., 1997 и др.].

По общепринятой классификации, разработанной Международным агентством по изучению рака (IARC), никель отнесен к канцерогенам группы 1, т.е. к безусловным канцерогенам для человека [IARC Monographs., 1990]. Исследования мутагенеза и канцерогенеза никеля, выполненные в России и за рубежом, объясняют возможные механизмы его генотоксического действия, и, тем не менее, многое в этом вопросе остается неясным [Kawanishi et al., 1994; Costa, 2002; Kasprzak, 2002 и др.]. Немало экспериментальных сведений накоплено о разнонаправленных генотоксических эффектах никеля [Nieboer, 1992; Costa, 1995; Kasprzak, 2002 и др.]. В то же время результаты «цитогенетического биомониторинга в группах рабочих никелевой промышленности представлены не так широко [Nieboer et al., 1984; Senft et al., 1992; Jelmert et al., 1995; Odland et al., 2000]. Кроме того, до сих пор остается практически неизученным вопрос о возможных путях защиты генома от мутагенного влияния никеля, как при высокодозовой профессиональной экспозиции, так и при низкодозовом воздействии на население. Интересы исследователей в последние годы сосредоточены на поиске оптимальных уровней потребления витаминов и минералов для повышения генетической стабильности ДНК, а также восстановления ее повреждений, вызванных различными мутагенными факторами ОС

Ames, 2001; Fenech, Ferguson, 2001 и др.]. Вопросы изучения уровней жизненно-необходимых микронутриентов в рационах питания особенно актуальны в районах Крайнего Севера и других регионах с экстремальными природными условиями.

Известно, что одним из основных механизмов генотоксического действия никеля, как и многих других металлов с переменной валентностью, является образование свободных радикалов [Costa et al., 1994; Huang et al., 1994; Kasprzak, 2002 и др.]. Поэтому для снижения неблагоприятных последствий действия никеля на ДНК нами был использован аналог природного антимутагена - аскорбиновая кислота (АК).

На протяжении последнего десятилетия при изучении мутагенеза и канцерогенеза, обусловленных конкретным физическим или химическим агентом, и подборе адекватного антимутагена, многими исследователями подчеркивается необходимость учитывать степень вариабельности показателей индивидуальной чувствительности как по отношению к основному мутагенному фактору, так и к антимутагену [Спицын, 1991; Kelsey et al., 1995; Landi et al., 1996 и др.]. Тем не менее, в этом направлении, опирающемся на достижения в области изучения популяционного генетического полиморфизма, по-прежнему, остается много "белых пятен", связанных со сложностью, дороговизной и недостаточной развитостью методов изучения проблем выше упомянутого уровня.

Настоящая работа посвящена проблеме поиска и изучения эффективных средств защиты генома рабочих производства чернового никеля и населения, проживающего вблизи от предприятия.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилась оценка уровней повреждения клеток человека соединениями никеля in vitro и in vivo и антимутагенной активности АК в группе рабочих плавильного производства чернового никеля с учетом факторов, модифицирующих цитогенетический показатель индивидуальной чувствительности к генотоксическому действию соединений никеля и к защитным эффектам АК.

В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Определение уровней структурных изменений хромосом и репарации ДНК в лимфоцитах рабочих, контактирующих с соединениями никеля, до и после приема АК.

3. Экспериментальная оценка способности соединений никеля к формированию адаптивного ответа (АО) в соматических клетках человека in vitro.

Научная новизна исследования

• Впервые проведены комплексные исследования по изучению генетических эффектов соединений никеля на основе параллельного определения структурных изменений хромосом и уровней содержания никеля в организме рабочих плавильного производства чернового никеля на Европейском Севере. Установлен достоверно повышенный уровень структурных изменений хромосом (р<0,01), который в целом по группе не зависел ни от содержания никеля в организме, ни от стажа работы. Курение усиливало генотоксические эффекты никеля в лимфоцитах рабочих.

• Доказано, что прием АК по 1г в сут. в течение месяца сопровождался достоверным снижением уровня цитогенетических изменений хромосом в лимфоцитах рабочих пирометаллургического производства никеля (р<0,01).

Научно-практическая значимость работы

- Результаты исследований могут быть использованы при профессиональном отборе и профориентации рабочих по признаку чувствительности к соединениям никеля, а также при ежегодных профилактических обследованиях рабочих, занятых в процессе пирометаллургической переработки сульфидных медно-никелевых руд, для регистрации возможных генетических неблагоприятных изменений.

- Показана высокая эффективность АК в снижении уровней цитогенетических повреждений в лимфоцитах рабочих плавильного цеха производства чернового никеля: курс приема АК в дозе 1г/сут. в течение месяца; что может быть использовано для разработки мероприятий по профилактике нежелательных генетических последствий воздействия соединений никеля в группах риска.

- Наличие АО в клетках человека при низкодозовом воздействии никеля, установленного in vitro, дает основание предполагать формирование неспецифически повышенной резистентности организма к повреждающему действию некоторых химических соединений и радиации на популяционном уровне и требует продолжения исследований в этом направлении.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 17 рисунков и 8 приложений. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3-х глав результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 78 отечественных и 187 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Перминова, Елена Владимировна

выводы

4. Прием аскорбиновой кислоты (1г/сут в течение месяца) сопровождался достоверным снижением числа микроядер на 30% (р<0,01) и тенденцией к стимуляции репаративного синтеза ДНК (на 18%) в лимфоцитах, что может быть использовано медицинскими учреждениями для разработки профилактических мероприятий с применением аскорбиновой кислоты, как эффективного антимутагена в различных группах риска, экспонированных соединениями никеля.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Перминова, Елена Владимировна, Апатиты

1. Алекперов У.К. Антимутагенез: Теоретические и практические основы. М.: Наука, 1984. - 104 с.

2. Антиоксиданты и адаптация / Сб. науч. трудов. Под ред. Соколовского. Л.: ЛСГМИ, 1984. - 64 с.

3. Артамонова Е.Ю., Синелыцикова Т.А., Засухина Г.Д. Различия в антимутагенной активности витаминных препаратов в клетках человека при воздействии мутагенов различной природы // Генетика. 1994. - Т.ЗО. - №11. - С. 1556-1557.

4. Бенко В., Гейст Т., Арбетова Д., Дхармадикари Д.М., Свандова Е. Биологический мониторинг загрязнения окружающей среды и экспозиции человека некоторым микроэлементам // Журн. гигиены, эпидемиологи, микробиологии и иммунологии. -1986.-Т.ЗО.-№ 1.-С. 1-10.

5. Берштейн Л.М., Онкоэндокринология курения. СПб.: Наука, 1995. - 127 с.

6. Бигалиев А.Б. Генетические эффекты ионов металлов. Алма-Ата: Наука, 1986. - 136 с.

7. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образ, ж. 1998. - № 10. - С. 18-24.

8. Блатов И.А. Кольская горно-металлургическая компания. Цветные металлы. 2000. -№4.-С. 9-12.

9. Бобылева Л.А. Модификация аскорбиновой кислотой генотоксических эффеетов соединений молибдена в условиях эксперимента и производства: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1992. - 21 с.

10. Бобылева Л.А., Чопикашвили Л.В., Алехина Н.И., Засухина Г.Д. Модификация аскорбиновой кислотой спонтанного и индуцированного уровней ХА и СХО в лимфоцитах рабочих, контактирующих с солями молибдена//Генетика. 1993. - Т. 29. -№3.-С. 430-434.

11. Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. -М.: Медицина, 1989. 272 с.

12. Бочков Н.П., Катасова Л.Д. Группы повышенного риска среди населения в условиях загрязнения окружающей среды // Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека. Сб. докладов. М., 1994. - Ч.И. - С. 234-267.

13. Васильева И.М. Чекова В.В., Львова Г.Н., Кусаинова К.А., Чопикашвили Л.В., Засухина Г.Д. Стимуляция репарации ДНК у рабочих, контактирующих с хлористым14.

Информация о работе

Перминова, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Апатиты, 2003
ВАК 03.00.16

Диссертация

Эколого-генетическое обоснование защиты генома при профессиональном воздействии никеля с помощью аскорбиновой кислоты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы