Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование генетических эффектов новых композиционных антимутагенов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование генетических эффектов новых композиционных антимутагенов"

1 АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ

—г>.1Л |1Л1. л, ТИПУН идиттг'апигаипт тгм ¡тпаат—и^ишм

На правах рукописи

ЗЕЙ НАЛОВА ФАХРИЯ РАФИК кызы

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ НОВЫХ КОМПОЗИЦИОННЫХ АНТИМУТАГЕНОВ

Специальность: 03.00.15— Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

БАКУ—Ш)7

Работа выполнена в Институте генетики и селекции Академии Наук Азербайджанской Республики.

Научный руководитель:

--доктор биологических наук, профессор, академик У. К. Алекперов.

Официальные оппоненты:

—доктор биологических наук Э. М. Расулов, —кандидат биологических наук А. И. Ахунд-заде.

Ведущее учреждение: Азербайджанский Госу дар сгвенн ы и Медицинский Университет им. Н. Нариманова.

Защита состоится »-^Î^Mjggy r. в_^3_час.

па заседании Специализированного совета Д.004.20.01 при Институте генетики и селекции Академии Наук Азербайджанской Республики: 370106, г. Баку, пр. Азадлыг, 155.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института генетики и селекции АН Азербайджанской Республики.

Автореферат разослан «—-Η»—^^^5^—1997 г.

.ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Г. МИРЗА-ЗАДЕ.

j

Общая характеристика работы Актуальность темы. Проблема генетических последствий загрязнения окружающей среды остается одной из самых актуальны*, так как большинство загрязнителей сельскохозяйственного, промышленного и бытового происхождения обладают мутагенной и канцерогенной активностью, что приводит к нарушению структуры и функций генетического аппарата. Индуцированные средовыми генотоксикантами нарушения генерационных и регуляционных функций генетического аппарата являются одной из решающих причин возникновения целого ряда болезней и патологических состояний, таких как врожденные и наследственные пороки, злокачественные новообразов ния, сердечнососудистые и нервные заболевания, преждевременное старение у людей, снижения продуктивности и воспроизводительной способности у сельскохозяйственных объектов и природных видов, уменьшения биоразнообразия (Дубинин, 1966; Дубинин, Алтухов, 1980; Шевченко, Померанцева, 1985; Бочков, Чеботарев, 1989; Hoffman, 1981, Smigematsu, Kalo, 1984, Sofuni, Hayashi, Matsuoka. 1987; Von Forstel, Drake, Loeb, 1996).

Исследования в области антимутагенеза, начатые А.Новиком и П.Сцилардом (Novick, 1952, 1957), были успешно продолжены (Алекперов, 1967; 1979; 1984; Алиев, 1987; Гончарова. 1965; 1974; Дубинин и др. 1964; 1967; Моссе, 1974; 1990; Ramel, Alekperov, Ames et.al. 1986; Shankel, Kuo, Hughes et al,1990). Особую актуальность приобрела теория комплексной профилактики генетических последствий загрязнения сре-пы, которая может осуществляться на технологическом, компонентном и компенсационном уровнях (Alekperov, 1981). В основе развития теории антимутагенеза лежит выявление и использование биологически активных препаратов - антимутагенов, регулирующих устойчивость биологических систем, что является элементом компенсационного подхода, являющегося одним из маиболее перспективных путей подавления эффекта ;редовых генотоксикантов (Alekperov, 1982; Shankel, 1986; De Flora, Issoti, 3ennicelli 1993; Waters, 1994).

Ряд исследований показали, что одним йэ реальных практических путей регуляции генетической устойчивости и снижения отдаленных последствий влияния экстремальных факторов, в том числе загрязнения окружающей среды, являются использование явления антимутагенеза, -ITO также следует из цикла работ в этой области (Дубинин, Щербаков, I965; Алекперов, 1968; 1979; Alekperov, 1979; 1981; Гончарова, 1974; Иоссе, 1974; Засухина, 1989; Агабейли, 1989; Алиев, .990). Формой практического использования антимутагенов может быть применение препаратов с генозащитными свойствами в виде специальных пищевых продуктов и добавок к ним, а так же фармакологических средств нового поколения (Дурнев, Середин, 1994). В этом плане наиболее перспективными представляются природные соединения, получаемые из различ-

ku-í источников, o осеоаннсош из растений. В последние годы опубликован цикл работ, проведенных в этом направлении (Алекперов, 1984; 1990; Таги-заде, 1993; Гусейнова. 1994; Shankel, Кио, Ghee 1994; Mitscher, Telikepalli, Ghee et. al, 1996).

Интересным и перспективным явилось теоретическое обоснование и экспериментальное исследование нового класса композиционных антимутагенов, элементы которых способны одновременно влиять на различные этапы мутационного процесса (Alekperov, 1993; Alekperov, Gulieva, 1693; 1994; Кулиева. 1995).

На современном этапе развития антимутагенеза разработка теоретических основ й практических путей создания новых композиционных антимутагенов является актуальным направлением, обеспечивающим повышение эффективности геноэащитных средств путем одновременного влияния на различные этапы мутационного процесса? что и определяет актуальность настоящего исследования.

Цель И задачи исследований. Целью настоящей работы явилась комплексная оценка генозащитной эффективности препаратов, полученных из плодов белого тута M.alba; корки граната P. granatum и их композиции.

В задачи исследования входили:

1. Изучить генетическую активность исследуемых препаратов в отношении различных объектов, индукторов мутаций и мутационных тестов.

2. Провестй сравнительную оценку эффективности препаратов на генном и хромосомном уровнях в условиях спонтанного, химического и радиационного мутагенеза и определить особенности модификации действия генотоксикантов с различным механизмом действия.

3. Изучить возможность повышения эффективности генозащитных свойств природных соединений путем создания их композиций.

4. Определить пути практического применения новых антимутагенов и их композиции для снижения генетического риска, вызванного действием средовых генотоксикантов и возникающего в процессе старения.

Научная новизна работы. В работе впервые установлены гено-защитные свойства препаратов из плодов Morus alba и их композиции с препаратом из Púnica granatum. Экспериментально доказана физиоло-гичность и универсальность их действия на эукариотах (растения, животные), в отношении различных классов мутаций (генные мутации и аберрации хромосом) и мутагенеза, индуцированного факторами различной физико-химической природы. Использование изученных препаратов в композиции позволило установить высокую антимутагенную эффективность композиционного антимутагена, превышающего эффект его компонентов.

Практическая значимость исследований. В экспериментах на лабораторных животных определена возможность практического применения

препаратов и их композиции в качестве генозгцитных средств при воздействии средовых факторов и старении.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались, демонстрировались и обсуждались на научной конференции аспирантов (Баку, 1995); на III конгрессе по растениеводству и селекции (Tabriz, Iran, 1994); на VI Северо-Американском съезде по изучению ксенобиотиков (Raleigh, USA, 1994); на Vil Международном конгрессе по токсикологии (Washington, US/., 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, экспериментальной части, состоящей из 5 глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 130 стр. машинописного текста содержит 26 таблиц и 9 рисунков. Список литературы состоит из 278 наименований, в том числе 189 иностранных источников.

Материал и методы исследования Объекты исследования. При выполнении настоящей работы использованы различные тест-системы. Из растительных объектов - лук-репчатый (Allium сера), пшеница (Triticum aestlvum, сорт Безостая-о и араби-допсис (Arabldopsls thaliana), из животных объектов - белые беспородные-крысы и мыши. Исследования выполнены с использованием методов генетического анализа (см. рис. 1).

Индукторы и модификаторы мутационного процесса В качестве индукторов мутационного процесса были использованы:

1. Ионизирующие излучения (рентгеновские лучи • 3 Гр) установка. РУМ-17, сила тока 15 Ma, КФР - 30 см без тубуса, фильтр • Си 0,5, AL -1 мм;

2. Химические мутагены:

а) фтористый натрий (NaF, мутагенный эффект которого связан с влиянием на процессы репарации ДНК), использовали в концентрации 20 мг/на 100г. веса животного

б) алкилирующие соединения - нитрозогуаиидин (НГ), диметилбен-эантрацет - (ЯМБА); этилметансульфонат (ЭМС) в концентрации

1 мМ; нитрозогуаиидин 3 мг/на 100 г веса животного.

В качестве модификаторов мутационного . процесса изучали лиофилизаты спиртового и водного экстрактов из плодов белого тута-Morus alba - Э1; Э2; экстракт из корки плодов граната • Púnica granatum -ЭЗ, полученные в лаборатории "Технология получения биос. ; »чески активных веществ" ИГиС АН Азербайджанской Республики. Препараты из Morus alba содержат сахара (преимущественно фруктоза), азотистые вещества, органические кислоты (лимонная, ябж .ная), железо, пектиновые и дубильные вещества. Препарат из Púnica granalum, содержит мономерные и конденсированные фенояьные соединения

Рис. 1. Объекты и методы исследований

(эллаготанины, таниды, катехины, антоцианы, пектиновые вещества, ланнит и др.) (Турова, Сапожникова, 1982; Дамиров.Прилипко, 1982; 1етрушевск1<й, 1985; Бликовз, Яковлева, 1990; Mitscher, Drake, Rao, 1S86; Иустафаев, Гасымов, 1992).

Модификаторы мутационного процесса были изучены на растениях в сонцентраципх 0,001-100 мкг/мл; на животных - 5,15, 45; 95мкг/100г, 30 и 50 мкг/100, в композиционной смеси - 0,1; 0,01 мкг/мл (Э2) - 0,1; 0,01 и кг/мл (ЭЗ) на растительных тест-объектах и 45 мкг/ЮОг веса (Э1 и Э2) и 30 мкг/ЮОг (ЭЗ) на животных объектах.

Методы исследования В соответствии с задачами настоящей работы осуществлялись:

1. Анализ частоты генных мутаций путем подсчета ядерных хлорофиль--1ых мутаций в недозревших стручках Arabidopsis thallana.

2. Анализ частоты аберраций хромосом в анафазных клетках меристемы корешков проростков растений.

3. Анализ частоты аберраций хромосом в клетках костного мозга бедренных костей млекопитающих. .

4. Анализ спектра структурных мутаций хромосом.

5. Анализ пролиферативной активности клеток.

5. Анализ жизнеспособности семпн и активность их ростовых процессов. Т. Статистический анализ полученных результатов.

Обработку экспериментальных данных проводили общепринптыми методами математической статистики (Лакин, 1990).

Результаты и обсуждение Рлиппио препаратор из Morus alba и Púnica nranatum на спонтанный мутационный процесс Первоначально исследования препаратов были направлены на изучение их генетической активности в различных концентрациях (0,001100 мкг/мл) для выявления Hai более эффективных доз и анализа их действия на уровень спонтанной мутабильности старых семян (рис.2).

Результаты цитогенетичеекого анализа показали, что препарат Э1 проявляет антимутагенный эффект о низких концентрациях - 0,01-0,001 мкг/мл, увеличение концентрации до 100 мкг/мл приводит к полному подавлению всхожести семян лука и пшеницы, а действие его в концентрации 1; 0. í мкг/мл - почти к полному подавлению мктс -зв.

Антимутагенный' эффект препарта. Э1 проявляется только при действии о низких концентрациях; на луке - 0,01; 0,001 мкг/мл, на пшенице - 0,1; 0,0t мкг/мл.

В отличии от действия препарата Э1 (спиртовый экстракт), препарат Э2 в к.нцентрации 0,001; 0,01 мкг/мл на только снижает уровень мутабильности с высокой статистической достоверностью íp > 0,01) но и обладает высокой эффективностью. В частности, в этих вариантах ФЭА равнялся, соответственно, 0,79 и 0,63.

8

А

8

Б

6-

6-

Рис. 2. Влияние препаратов

0.001 0.01 0.1 1 10 100 концентрация, мкг/мл

О -f-1-1-1-1-Г

0.001 0 01 0.1 1 10 100 концентрация, мкг/мл

31(1),32(2), Э3(3) на спонтанный

мутационный процесс а клетках меристемы корешков А.сера (А) и препаратов 02(2) и 33(3) на Т.аеБЧуит (Б) по оси ординат: аберрации хромосом, %

Сравнительный анализ полученных данных по возможным проявлением токсичности у спиртового и водного препаратов из М.а1Ьа показал, что водный экстракт при действии в концентрациях 100; 10; 1 мкг/мл на растения не приводит к подавлению всхожести семян и не увеличивает уровень мутабильнпсти хромосом в растительных клетках.

В результате анализа спекла структурных мутаций хромосом было установлено, что антимутагенное действие исследуемых препаратов не приводит к изменениям в соотношении отдельных категорий аберраций хромосом.

Анализ пролиферативной активности клеток А. сера и Т. аезНуит показал, что препарат Э1 проявляет цитотоксичность при увеличении концентрации до 1 мкг/мл, в отличии от препарата Э2 - водного экстракта, который при действии в диапазоне концентраций 0,001-100 мкг/мл стимулирует пролиферативную активность.

Влияние препаратов на мутационный процесс, индуцированный

Проведена серия экспериментов по изучению генетической активности препарата Э1 при его воздействии на индуцированный ионизирующими излучениями мутационный процесс растительных клеток А.сера и Т. аезиуит. Из рис.3 видно, что препарат Э1 оказал эффективное антимутагенное действие в низких концентрациях (0,010,001 мкг/мл) на А.сера и в 0,01-0,1 мкг/мл на Т. аеБНуит. Отсутствие антимутагенного эффекта этого препарата в высоких концентрациях, а также обнаруженное в эксперименте его угнетающее на прорастание

ионизирующими излучениями

семян и пролиферативную активность действие .чаргэтерно для спиртового экстракта и наблюдалось в экспериментах со спонтанным мутированием.

Также, как и в предыдущих опытах, анализ модификации мутационного процесса в экспериментах с индукцией мутаций ионизирующим излучением показал, что наиболее эффективными в пролвлении антимутагенного эффекта оказались концентрации 0,010,001 мкг/мл на А.сера и 0,1-0,01 мкг/мл на T.aestivum (рис.. 3). Так, в опытах с T.aestivum с 15,87±1,1б% клеток с аберрациями, наблюдаемых при действии рентген-лучей, число аберрантных клеток снизилось до 7,77+0,96% и 11,42+1,20%, соответственно, tdiff-5,3;2,6. Однако, как видно из рис. 3, на этом объекте наиболее эффективное действие наблюдалось при действии препарата в концентрации 0,1 мкг/мл, что, очевидно, связано со спецификой объекта, так как на другом объекте -А.сера, концентрация 0,1 мкг/мл не приводит к антимутагенному эффекту, также как и при исследовании антимутагенного действия экстракта на спонтанную мутабильность А.сера. Как видно, в зависимости от объекта происходит сдвиг концентраций в отношении их эффективности на порядок.

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые. была установлена способность препарата Э1 модифицировать спонтанную и индуцированную ионизирующими излучениями мутабильность хромосом в меристемных клетках корешков растений в диапазоне концентраций 0,01-0,001 мкг/мл на А.сера и 0,1-0,01 мкг/мл на T.aestivum.

Заслуживает внимание сравнительная оценка двух препаратов Э1 и , ЭЗ по степени снижения ими уровня спонтанной и индуцированой мутабильности. Так, препарат ЭЗ проявляет генозащитную эффективность в более широком диапазоне концентраций (0,001-100 мкг/мл) и характеризуется более высокими показателями ФЭА (0,66-0,80). В то же время препарат Э1 проявляет антимутагенные свойства в более узком диапазоне. Также низки показатели ФЭА (0,28-0,51).

Характер модификации мутационного процесса, индуцированного химическими мутагенами

В исследованиях по изучению действия антимутагенов используются различные подходы. Среди них наиболее распространенными и информативными пвляются опыты, в которых эффективность ингибиторов мутабильности исследуется в отношении индукторов мутаций, вызывающих различные типы повреждений ДНК и действие их изучается на штаммах, деффектных по различным генам (Огаке,1996). С другой стороны, среди общих характеристик антимутагенов, используемых для их сравнительной оценки, важнейшим является их универсальность, характеризующая способность ингибировать мутабильность, вызванную различными индукторами (Ramel, Alekperov, Ames et. al. 1936).

6_

2~ .

—1-1-1-Г

»-лучи 0.001 0.01 0.1 концентрация, мкг/мл

Т

-г

I......I

х лучи 0.С01 0.01 0.1 концентрация, мсглм

Т-1-1-1-1-1—г

х-лучи 0.001 0.01 0.1 1 10 100 концентрация, мкг/мл

Т-1-Т-Г-1-1—г

х-лучи 0-С01 0.01 0.1 1 10 100 кэицэнф&иш, шгЬм

?ис.- 3. Влияние х-яучэй из мугабилыюстъ хромосом о кгатха* меристем керошжоа А-сэра (А),Т.аз5Иугия1 (ь) и еэ модификация гротзт^тгзна Э1 53) я Э2(2)

А

16-

12-

1«

I-

6

2

и

Исходя из этого, в соответствии с планом настоящей работы, были изучены особенности влияния исследуемых препаратов на мутабиль-ность, индуцированную химическими мутагенами. В качества таковых были использованы ИГ. ДМБА и ЭМС. Выбор указанных индукторов был связан со спецификой их воздействия на мутационный процесс, при котором генетические нарушения происходили за счет прямого алкилиро-вания в одном случае и являлись косвенными мутагенами • во втором;

Исследования проводились на тест-объекте - Arabidopsis thaliana, который, благодаря короткому жизненному циклу (30 дней), удобству культивирования в лабораторных условиях, позволяет анализировать влияние различных факторов на частоту генных мутаций (Иванов, 1974). Последнее обстоятельство также являлось важным, поскольку могло характеризовать универсальность по показателю мутационных тестов. Арабидопсис широко используется в генетическом скрининге, в том числе и ь исследованиях по антимутагенезу (Redei, Acedo. Sandhu, 1983' Gichner, Veleminsky, 1964; Alekperov, Mirza-zade, 1S91). Результаты анализа влияния Э1 на частоту, хлорофильных мутаций, индуцированных НГ; ДМБА и ЭМС у Arabidopsis thaliana, представ, ->ны в таблице 1. K¿ :< показывают результаты и в этих экспериментах экстракт из M.alba (Э1) проявлял генозащитные свойства. Действие экстракта в концентрации 10 мкг/мл на индуцированные химическими мутагенами генные мутации у A.thaliana привело к их снижению в зависимости от мутагена от 40 до 60% (Agabeili, Zeinalova, 1995)

Как видно из таблицы 1, действие НГ привело к увеличению частоты генных мутаций у A.thaliana до 25,22+2,86%, которая была снижена при обработке исследуемым экстрактом до 10,34 + 1,62%, соответственно, tdiff=4,5.

Таблица 1

Влияние препарата Э1 на уровень доминантных эмбриональных хлорофильных леталей, индуцированных у Arabidopsis thaliana НГ, ДМБА и ЭМС

Варианты Количество Из них с мутациями

опыта проанализированных стручков чисг.о % Достоверность разницы, Id ФЭА

НГ 230 58 . 25.22+2,86 - -

НГ+Э1 348 36 10,34+1.61 4,5 0,59

ДМБА 215 24 11,16+2,14 - -

ДМБА+Э1 285 18 6,ЗН1,44 1.3 0,43

ЭМС 259 41 15,8*2,27 - -

ЭМС+Э1 270 23 8,52tV69 2.5 0,46

Мутагенное действия ДМ,-,A it ЭМС, приведшее к увеличению частоты генных мутаций у A.thaliana до 11,16+2,14% и 15,8+22%, было также значительно снижено при использовании экстракта в концентрации 10 мкг/мл в качестве модификатора индуцированной мутэбильности. Так, действие экстрата снизило идуцированную ДМБА частоту генных мутаций до 6,3+1,44, а индуцированные мутации ЭМС были снижены до 8,52+1,69%, соответственно, tdiff-1,8; 2,5. Следует отметить, что в первом случае статистические различия малозначимы.

Таким образом, результаты проведенных испытаний позволили впервые выявить способность препарата, полученного из Morus alba, ингибировать как аберрации хромосом, так и генные мутации в условиях воздействия химических мутагенов.

Результаты этих опытов позволили также выявить некоторые закономерности в индукции и модификации мутаций у араб допсиса. В частности, в зависимости от механизма и путей действия, химические мутагены оказали не одинаковое влияние на возникновение хлорофиль-ных мутаций. Хотя для всех трех мутагенов использовалась одна и та же концентрация (1 мМ), тем не менее наибольшее количество генных мутаций возникало в результате действия НГ. Вторым по мутагенной эффективности было алкилирующее соеди нение ЭМС. Что касается ДМБА, которое как известно, является мутагеном не прямого действия и требует метаболической активации, то при его действии индуцировалось наименьшее число мутаций. Во-вторых, в опытах с индуцированной мутабильностью повторяются закономерности, выявленные при анализе зависимости эффективности антимутагенов от первоначального уровня мутирования, т.е. в большей стеиени генные мутации модифицируются в вариантах, где их уровень высок (табл.1).

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА МЛЕКОПИТАЮЩИХ Модификация мутационного процесса, индуциров: иного естественным старением

Практика создания продуктов с генозащитными свойствами, как пищевых, так и фармакологических, предусматривает необходимость изучения их на объектах, которые позволяют в той или иной степени экстраполировать полученные данные на человеке. В качестве таковых наиболее информативными являются лабораторные животные, млекопитающие, которые широко используются в работах с подобными задачами (De Flora. 1993; Wang, Semple, 1995).

В связи с изложенным, была проведена серия экспериментов с использованием лабораторных животных, на которых изучалось влияние препаратов 32 и ЭЗ на мутационный процесс, индуцированный старением и средовыми генотоксикантами.

В таблице 2 представлены данные, полученные при анализе антимугагенной эффективности препаратов в отношении мутабильности.

обусловленной естественным старением. В экспериментах использованы белые половозрелые лабораторные крысы в возрасте 28 недель. Как видно из результатов эксперимента, все исследуемые дозы препарата 32 приводят к снижению частоты аберраций хромосом в клетках костного мозга крыс, однако наиболее эффективным оказалось использование экстракта в концентрации 45 мкг/ЮОг веса животного, когда это снижение составило 40% эффективности.

Таблица 2

Влияние препаратов 32 и 33 на уровень аберраций хромосом а клетках костного мозга крыс

Вариант опыта Концентрация в мкг/100г Число изученных Клетки с аберрациями хромосом Достоверность разницы. 1(1 ФЭА

животных клеток число %

контроль - 6 1814 81 4.46±0.48* - -

5 6 2032 76 3,47+0,42 1.1 0,16

15 6 2133 69 3.23+0.38 2.0 0,27

32 45 6 1940 52 2.68+0,36 2.9 0,39 '

90 6 2006 60 2.99+0,38 2,4 0.32

ЭЗ 30 6 2325 68 2,92+0,34 2.6 0,34

60 6 2174 54 2,4810,33 3,3 0.44

• • контроль - молодые крысы -1.85 ♦ 0.28 %

Так, если число анафаз с аберрациями хромосом в контроле составило А,46+0,43%, то действие экстракта в указанной концентрации снизило это число до 2.68+0,35% соответственно ГсМ(=2,9, препарат в концентрации 30 и 60 мхг на ЮСг веса животного, также, показал высокую антимутагенную эффективность снизив относительное число мут^рочягоних клеток почти до 50%.

Обращает на себя внимание тот факт, что эффективность исследуемых препаратов является достаточно высокой. Хотя показатель ФЭЛ составляет для препаратов Э2 и ЭЗ максимально 0,39 и 0,44, следует иметь войду, что для модификации относительно невысокого уровня мутаций эта цифра является достаточно высокой. Это позволяет считать, что в результате проведения настоящих исследований выявлены новые высокоэффективные геропротекторы, способные снижать темпы мутирования при старении.

Результаты этих экспериментов, а также данные, представленные ниже, показали, что универсальность антимутагенного действия изученных препаратов подтверждается и в опытах с млекопитающими-крысами, у хотсгы! в кач1-стеа индукторов мутаций были использованы иснизиру.з-.

щие ислучения, химический мутаген алкилирующего типа нитрозогуа-нидин (НГ) и фтористый натрий.

Модификация рапиационно-индуцированного мутагенеза Представленные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, чтс препараты Э2 и ЭЗ проявляют антимутагенный эффект и в условия» радиационного мутагенеза на модели ¡n vivo. Действие рентген-лучей привело к увеличению аббеоаций хромосом в клетках костного мозга крыс с 1,47+0,22% до 9,7+0,62%. Препарат ЭЗ привел к модификации индуцированной радиацией мутабильности, снизив их число до 3,11+0,37% и 2,80t0,38%, соответственно tdiff-9,2; 9,5. Действие препарата Э2 снизило количество клеток с аберрациями хромосом до 3,70+0,42 и 3,86+0,42 при действии концентрации 45 и 90 мкг/100 г соответственно (табл.3).

Следует отметить, что в отличии от степени эффективности, обнаруженной в опытах с модификацией мутабильности, возрастающей в результате естественного старения организмов, когда максимальные величины ФЭА составляли 0,39 и 0,44, а опытах с радиационной индукцией ФЭА был значительно выше (максимальные величины для препаратов- 0,62 и 0,71). Характер этих опытов был таков, что защитные вещества вводились до облучения, т.е. профилактически. Результаты экспериментов показывают перспективу использования выявленных препаратов в качестве профилактических средств а условиях высокого профессионального риска. Поскольку ионизирующие излучения

Таблица 3

Влияние» препаратов 32 и ЭЗ на индуцированный облучением мутационный процесс о клетках костного мозга крыс

Вариант Концентрация, Изучено Клетки С Достоьср- ФС

опыта ВМКГ/ЮОГ, клеток аберрациями ность -

доза в Гр хромосом разницы, td

число %

О(комтроль) - 2921 43 1,47*0,22 - •

Х-лучи 3 2238 219 9,78+0,62 -

Э2+Х-лучи 5 2150 97 4,51*0,44 6,9 0,!

Э2+Х-лучи 15 2225 96 4,30±0,43 7,2 0,!

Э2+Х-лучи 45 1Э98 74 3,70*0,42 8,1 0.I

Э2+Х-лучи 90 2044 79 3,86t0,42 7,2 0,1

ЭЗ+Х-лучи 30 2150 6t 3.M¿ 0,1* • 9,2 0,"

ЭЗ» Х-лучи 60 1875 53 2,81+0,38 9.5 о;

к

используются также в медицинской диагностике и терапии, то очевидно, что этот принцип и выявленные вещества являются перспективными и в этом направлении.

Влияние на химический мутагш:б.. Изучение принципиальной возможности практического использования выявленных природных геноззщитных соединений для ингибирова-ния мутагенеза, индуцированного химическими соединениями, представлялось чрезвычайно важным. Это было связанно с тем, что химические токсиканты являются наиболее распространенными средовыми факторами, легко транспортируются в окружающей среде и по пищевым цепочкам, кумулируются в органи: ме. Помимо этого, химические соединения, не являющиеся токсичными для генетических структур изначально, могут приобретать эти свойства в процессе взаимодействия с другими химическими средовыми факторами или при метаболической активации в организме (Shankel, 1990).

В связи с этим, были изучены особенности модификации препаратами из M.alba и P.granatum мутационного процесса, индуцированного нитрозогуанидином.

Как видно из результатов таблицы 4, оба препарата проявили генозащитные свойства в отношении мутаций, индуцированных НГ в клетках костного мозга крыс. Однако эффективность препарата ЭЗ (ФЭА=0,53) превышает антимутагенную эффективночть препарата Э2 (ФЭА-0,42). Так, нитроэогуанидин стимулировал повышение мутабиль-ности в клетках костного мозга крыс с 2,15+0,39% в контроле до 11,71±0,66 в опыте, тогда как действие всех изученных препаратов привело к снижению индуцированной мутабильности в варианте с Э2 до 6,77+0,50% (tdiff-5,7) и с ЭЗ до 5,50+0,46% (tdiff-7,7).

Таблица 4.

Влияние препаратов 32 и ЭЗ на индуцированный нитрозогуанидином (НГ) мутационный процесс в клетках костного мозга крыс

Вариант опыта Концентрация а мкгЛООг Изучено клеток Клетки с аберрациями хромосом Достоверность разницы.М ФЭА

число % '

0(контроль) - 2445 53 2,15t0^9 -

НГ - 2348 275 11,71 tO.68

НГ+Э2 5 1947 184 9,45±0.66 2.4 0,19

НГ+Э2 15 2132 158 7,41+0,50 ' . t' 4.9 0,36

НГ+Э2 45 2125 144 6,77+0,54 5,7 0,42

НГ+Э2 90 2210 158 7,14+0,54 5,3 0,39

НГ+33 ■ 30 2107 128 б,07±0,52 6.7 0.48

НГ+ЭЗ 60 2342. 129 5.50±0,46 7.7 0,53

Таким образом, установлена способность изученных новых препаратов ингибировать мутационный процесс в условиях воздействия химического мутагена алкилирующего типа действия. Что касается сравнительной эффективности препаратов, го сопоставление данных показывает, что исследуемые вещества в большей степени модифицируют мутации, индуцированные ионизирующими излучениями, нежели нитрозогуанидином. В первом случае максимальный показатель ФЭА составляет -0,71, во втором-0,53.

В число средоаых мутагенов определенное место занимают фтористые соединения. В связи с этим, в качестве модельного химического мутагена был использован, также, фтористый натрий.

Эксперименты были выполнены на лабораторных животных, в качество которых служили белые беспородные крысы 8-10 недельного возраста. Результаты экспериментов с фтористым натрием представлены в таблице 5, из которой видно, что препараты 02 и ЭЗ снижают индуцированную фтористым натрием частоту аберраций хромосом о клетках костного мозга крыс. Так, в экспериментах с препаратом Э2, число анафаз с аберрациями хромосом при действии фтористого натрия увеличилось с 1,8540,23% в контроле до 6,81+0.56%. Действие препарата ЭЗ в концентрациях 30 и 60 мкгЛООг веса снизило количество клеток с аберрациями хромосом до 2,69+0,34% и 2,34+0,33%. На основании I ¿лученных данных можно сделать заключение о том, что изученные растительное пропараты но содержат мутагенных продуктов в исходном виде. Основанием этому служит еыяаланноэ отсутствие »а влияния на спонтанный мутагенез и отсутствие синергизма с гонотоксическим

Таблица 5

Влияние препаратов 32 и ЭЗ на индуцированный фтористым натрием мутационной процесс о клетках костного мозга крыс

Вариант Концентрация Поучено Клетки с Достовер- ФЭА

опыта о мкгЛООг клеток аберрациями ность

хромосом разницы,

число %

0 (контроль) - 2321 43 1,8510,28 - -

Иа*- • 2011 137 6.81+0,56 -

Э2+Ыа? 5 2520 89 3,4010,35 6.2 0,50

Э2+ШР 15 2440 86 3.52+0.36 4,9 ' 0,49

45 2216 60 2,70+0,34 6,3 0,60

Эе+ЫаЯ 00 2354 71 3,01+0,35 5,8 0.55

. £0 2223 60 2,69+0.34 6.2 о.ео

__ 60 2С45 •59 е,о 0.65

IT

действием радиации и химического мутагенов. Обращает на себп внимание высокая эффективность препаратов при профилактике генетических нарушений, вызванных фтористым натрием. Особо эффективные концентрации Э2 (45 мкг/100 г) и ЭЗ (60 мкг/100 г) снижают частоту мутаций практически до контрольного уровня. Несмотря на то, что в этих вариантах цифры выше контрольного, тем не менее эти колебания находятся в пределах ошибки и статистически не значимы.

Таким образом, получонныо данные показывают, что изученные препараты из растений могут быть практически использованы для контролирования темпов мутирования, вызванных мутагенами среды. В то же время, выпаленная возможность этого создает условия для разработки технологии реализации этого этого принципа.

Композиционные ингибиторы мутабильности в нейтрализации генетоксичности

Было выдвинуто предложение об использовании нового класса антимутагенов, которые были названы композиционными антимутагенами (Alekperov, 199J). Идея создания нового класса антимутагенов предпологала, что каждый из элг иентов, входящих э состав антимутагена, способен был влиять на определенные этапы мутационного процесса, что могло бы способствовать повышению эффективности препарата при модификации генотоксичности, индуцированной мутагенами с различным механизмом действия.

Как показали результаты ряда исследований (Norkus, 1985), многие антимутагены, проявляя высокий индекс универсальности, в то же время неодинаково эффективны в нейтрализации генотоксичности, индуцировзнной мутагенами с различным механизмом действия. Генетические структуры подвергаются воздействию различных факторов окружающей среды, в том числе мутагенных и вызывающих различные нарушения в механизмах, обео.ечивающих устойчивость и нормальное функцирование генетических систем. Многие их них действуют одновременно, вызывая многоцелевые прямые повреждения ДНК и чарушают нормальное течение метаболических процессов, чаправленных на поддержание структурной и функциональной делостности генома. Очевидно, что в этих условиях наиболее эффективная защита генетической системы может быт^ обеспечена тутем конструктирования композиции из генозащитных средств, элементы которой могут влиять на конечные показатели мутабильности )а счет профилактики и терапии нарушений на всех этапах зозникновения и реализации потенциальных повреждений ДНК Alekperov, 1994).

IB

Оценка сравнительной эффективности изученных препаратов в различных экспериментальных системах

Результаты анализа генозащитной эффективности препаратов на растительных тест-системах показали, что оба препарата снижают частоту аберраций хромосом с высокой эффективностью колеблющейся от 43% до 80%. Однако, препарат ЭЗ во всех экспериментах проявил более высокую эффективность по сравнению с препаратом Э2 и составил 70% на арабидолсисе. На пшенице эффективность его достигала 80%. Прет парат Э2 проявляет практически одинаковую антимутагенную эффективность на всех трех объектах (снижение от 46% до 55%). было выявлено, что эффективность препарата в значительной степени зависит от природы индуцирующего фактора и, соответственно, характере вызываемых им повреждений. В наибольшей степени достигается защита от ионизирующих излучений, что, наряду с другими, может быть следствием наличия большого количества антиоксидантов у обоих препаратов.

На рис.4 представлены результаты анализа относительной эффективности изученных препаратов на млекопитающих in vivo. Из рисунка видно, что во всех вариантах эксперимента изученные препараты проявили высокую антимутагенную эффективность. В то же время, ясно, что в экспериментальной системе индуцированная мутагенами с различным механизмом действия мутабильность модифицируется неодинаково. Во всех вариантах действие препарата ЭЗ проявляет наиболее высокую эффективность, однако имеет специфичность в ингибнроаании мутагенного действия генотоксикаитов с различным механизмом действия. В наибольшей степени и на животных объектах снижается мутабильность, вызванная действием ионизирующих излучений.

В связи с результатами, которые были получены в процессе исследований, было проведено экспериментальное исследование нового препарата, обладающего комплексом биологически активных веществ, элементы которого способны оказывать влияние на различные этапы формирования мутаций, что было показано ранее для других антимутагенных препаратов,полученных из растений (Кулиева P.A., 1995). Композиция из изученных нами двух препаратов дополняет друг друга высоким содержанием полисахаридов и фенольных соединений. Соответственно при составлении композиции исследуемые препарата были использованы в наиболее эффективных концентрации, проявленых в настоящих исследованиях.

Влияние композиции антимутагенов на спонтанную и индуцированную мутабильность в различных тест-системах

Как показали наши исследования, применение композиции антим'утагенов (КА), который был получен из М alba Э2 и P.granatum ЭЗ, не привело к- увеличению мутабильности. Следует отметить, что это является закономерным, так как оба элемента композиции при

Эг Эз Зг Эз Эг Эз Эг Эз

. старениэ облучение НаР нитрозогуанидин

Рис. 4. Антимутагенная активность препаратов Эг и Ээ при их воздействии на уровень аберраций хромосом в клетках костного мозга лабораторных, животных индуцированных генотоксикантами с различным механизмом действия

по оси ординат: антимутагенная эффективность. %

:о

исследовании о широком диапазоне концентраций не проявили общей токсичности и не вызывали нарушений генетического аппарата. Однако, поскольку подобное могло иметь место как следствие химического взаимодействия и метаболической активации, то проведение этих экспериментов позволило исключить возможную генотоксичность соединений.

Препарат КА оказался эффективным в отношении ингибировония генотоксичиости, обусловленной старением (таблица 6). Выявленный антимутагенный эффект композиции из указанных источников свидетельствует о том, что возможное возникновение синергических эффектов не приводит к проявлению генотоксичиости. Действие композиции антим> гагеноо на частоту аббераций хромосом у растительных тест-объектов (А.сера, Т.ае^уит) и млекопитающих (крысы), с низкой частотой спонтанных мутаций не вызывает изменения темпов мутирования, тогда как влияние композиции антимутагенов- на мутабильность обусловленную старением нейтрализует ее на 62% у А.сера; на 40% у Т.аезНуит и на 59% у крыс (табл.6).

Сравнительная оценка эффективности композиции с эффективностью составляющих ее компонентов (рис.5) показала, что эффективность композиции значительно выше, а в ряде экспериментов превышает максимальную эффективность компонентов, входящих о ео состав. Исключение составляют лишь результаты, полученные в опытах с фтористым натрием, когда как элементы, так и сам композиционный антимутаген обладали одинаковой эффективностью. Это, очевидно, объясняется тем, что во всех вариантах степень снижения уровня мутабильности была высокой и превышала 60%. Таким образом, результаты исследований показали, что композиционный антимутаген (КА) приводит к проявлению геропротекторного эффекта и нейтрализует мутабильность, возникающую при старении у растений и крыс. Аналогичные результаты были получены и о экспериментах на мышах. Так, (таблица 7) мутабильность хромосом костного мозга мышей снизилась при добавлении о рацион их питания КА с 4,97+0.53% в контроле до 1,60+0.30% в опыте. Обращает на себя внимание тот фахт, что композиционный антимутагон был чрезвычайно эффективен на старых мышах, в опытах с которыми темпы мутирования снизились до 1,60+0,30%, что практически было равно контрольному уровню.

Проведена серия экспериментов по изучению эффективности композиционного антимутагена в отношении генотоксичиости, индуцированной факторами различной физико-химической природы, о клотках растений и клетках костного мозга мышей. Антимутагенная эффективность композиционного антимутагена исследована в отношении аберраций хромосом, индуцированных радиацией и химическими мутагенами - нитрозогуанидиноги и фтористым натрием. Из результатов таблицы 6 ойлчо. что композиционный антимутаген проявляет высокую антимута-

Таблица 6

Действие препарата КА иа мутационный процесс, обусловленный старением

Объект Вариант Изучено «латки с Достоверность ФЭА

опыта клоток • аберрациями хромосом разницы, 1с1

число %

Контроль 2719 141 5,18+0,42 -

Крыса интактный

КА 2445 51 2,03+0,28 е.ч 0,59

А.сера 0 (контроль) 1018 62 6,09^0,74 -

КА 1080 29 2.30+0,23 4.8 0,62

Т.аег^ус 1 0 (контроль) 612 13 2,12+0,53 - -

КА 823 9 1,09+0.36 1.7 0,48

Таблицп 7

Влияние препарата КА на уровень аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей

Вариант опыта Изучено клеток Клетки с аберрациями хромосом Достоверность разницы. 1с1 ФЭА

число О' -О

Контроль (интактный) 1649 82 4,97+0,53 - -

КА 1730 28 1,60+0,30 | 5.5 0,67

Таблица 8

Влиян! з композиции антимутагеиов (КА) на уровень индуцированной мутабильности в клетках костного мозга мышей

Вариант опыта Изучено клеток Клетки с аберрациями хромосом ФЭА

число %

Контроль (интактный) 2321 43 1.85+0.79 -

Облучение 2244 390 17.37t0.79 -

КА-облучение 2354 92 3.90*0,39 0,77

ЫаР 2011 137 6,81*0.56 -

КА+ЫаР 2005 49 2,44+0,34 0,64

Контроль(интактный) 2-145 53 2,1610,29 -

НГ 2343 275 11.71*0,66 -

КА+НГ 2125 103 4,84+0,46 О.ЕЗ

80-

70-

60-

10.

зо_

20

10

старение

облучение

нитрозагуандин

ряа

а

■Л

7-У

'/•а

ш

Эг Эз КА Эг Эз КА Эг Эз КА Эг Эз КА

Рис. 5. Сравнительная оценка антимутагенной эффективности препаратов Э2, ЭЗ и их композиции (КА) на уровень индуцированных различными мутагенами аберраций хромосом в клетках костного мозга животных

по оси ординат: антимутагенная эффективность, %

40

генную активность и эффективность его- действ! 1 как при нейтрализации мутагенного действия радиации, так и при действии химических мутагенов чрезвычайно высока. Из результатов таблицы видно, что наиболее высокие значения эффективности КА были получены при модификации радиационно-индуцированной мутабильности • до 77%. Эти данные подтверждают результаты, полученные нами в других экспериментах, на других экспериментальных моделях, представленых выце, а также наглядно демонстрируют результаты сравнительной оценки эффективности препаратов из М.а1Ьа, Р.дгапаШгп и композиционного антимутагена (рис.5). Во всех экспериментах использование композиционного антимутагена привело к высокой антимутагенной эффективности, а в ряде экспериментов к более высоким, чем каждый его компонент изученный изолированно

Таким образом, результаты исследований показали, что использование композиционных антимутагекоа в .нейтрализации генотоксичности может являться одним из реальных способов повышения эффективности антимутагенов по отношению к гёнотоксикаитам с различным механизмом действия. Одновременно с определением теоретических возможностей эффективной экспериментальной регуляции мутационного процесса, полученные данные имеют практическую перспективу. Проведённые-опыты со средовыми гейотоксикантами и е условиях естественного старения показали, что новый композиционный инп.иитор мутабипьиогги, а также вошедшие в его состав элементы могут быть использованы для разработки фармакологических средств, пищевых продуктов и пищевых добавок нового поколения, перспективных для снижения текущего и-отдаленного негативных результатов у групп высокого профессионального, экологического и возрастного риска.

выводы

1. Впервые в экспериментах с эукариотами: растениями (однодольные и двудольные) и млекопитающие (крысы и мыши) установлена способность препаратов, полученных из плодов Morus alba, проявлять антимутагенные свойства.

2. Установлена универсальность генозащитных свойств препарата на различных объектах по разным мутационным тестам (аберрации хромосом и генные мутации) и при индукции мутаций старением и факторами различной физико-химической природы. При этом установлена неодинаковая эффективновсть препарата к индукторам, различающимся механизмом действия. В наибольшей степени модифицируются мутации, индуцированные ионизирующими излучениями и связанные преимущественно с прямыми повреждениями ДНК и образованием свободных радикалов, в меньшей с генотоксикантами, вызывающими нарушения в вилхах репликации ДНК.

3. Действие препарата ингибирует мутабильностъ в низких концентрациях. Высокие концентрации препарата не проявляют генотоксических и цитотоксических свойств, не обладают другими отрицательными побочными эффектами.

4. Препарат, полученный из M.alba, восстанавливает процессы клеточной пролиферации, нарушенные действием генотоксических факторов физической и химической природы.

5. Снижение уровня спонтанной и индуцированной мутабильности осуществляется без статистически достоверных изменений в спектре мутаций.

6. На базе препаратов из плодов M.alba и корки плодов P.granatum составлен новый композиционный антимутаген. На различных

. биологических объектах изучена сравнительная эффективность препаратов, показавшая, что генозащитное действие композиции значительно выше составляющих его элементов.

7. Продемонстрирована принципиальная возможность использования испытываемы., препаратов и их композиции для снижения генетического риска, связанного с влиянием природных и производственных генотоксикантов, а также при спонтанных отказах эндогенных систем надежности и старении.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ингибирование генотоксичес.ких эффектов 7,12 - диметилбенэатрацота природными соединениями /Зейналова Ф.Р. //Материалы науч.конф. аспирантов АН Азерб. Республики., 1995, с 93

2. New generation of food - stuffs and food additives with genoprotective properties from traditional plant sources. /U.K.AIekperov, R.A.Guiieva, S.S.Huseypova, F.R.Zeinalova. Third Iranian congress on crop Production and Breeding Sciences. Tabriz University. Tabriz, Iran,1994,p5.

3. Inhibition of cytotoxic and genotoxic effects of xenobiotics by natural compounds. /U.K.AIekperov, F.R.Zeinalova, R.A.Guiieva, et. al, ln:Proceedings of International Sosiety on study of Xenobiotics, Volume 6, 1994, p286..

t. Enhament of Genetical stability by plant preparations. /П. Agabeily, F. Zeinalova. Karadeniz Yournal of Medical Sciences. Volume 6. N4, 1995 p.220-221.

>. Prevention of hereditary and non-hereditary damages induced by genotoxicants. /U. Alekperov, F. Zeinalova, U. Gashimova, et. al, In: Abstracts of VII International congres on Toxicology, Washington, 1995, p286.

>. The inhibition of xenobiotics genotoxicity by multicomponent

intimutagens / U.AIekperov, R.Gulieva, F.Zeinalova. R.Agabeily. 1SJX

'roceedings, Volume 10.1996, p 110.

Зеих компвзиаш! 1<а№>шен.1зрнн кенетик еффектлэришш тадгигы ЗДналова Ф.Р. Хуласа

. Илк дафа еукариотлар; бнткшшр (бирлополилар во икнлапалилэр) В8 мэмэлилэр (сичовуллар во сичанлар) узэринда апарылан тэчрубе-лардэ Morus alba мс]валэришю1< альшан преиаратларын антнмутакеи то'сир костормак, физики во KHMjaBH табиатли амиллорнп ксноток-сики то'сири натичэсиндо нозулмуш hyscjpo пролифсрас^асы иро-ссслорннн стабиллошдирмак хусуащвтларииин олмасы Myojjuii сдил-мншдир. M.alba mcjboch bo P.granatum ме^восинин габыгыидаи алмнан препаратларын осасында jemi комиозисиои антимутакен ]арадылмыш-дыр.

Мухтолиф тэчрубо систсмлариида онуи мупуисолц сффсктивли)'и о]ронил-мишдир.

Муэцан еднлмншдир ки, композис^аньш кеномудафиэ то'сири онуи тэркиб Ьиссэси олан компонентларин то'сириндои хе]ли ]уксэкдир. . '

Лаборатор»уа hejt«uuiapbi узориндо апарылан тачруби натичасиида Ьомии препаратларын во оиларыи комнозисщасыныи, скстрсмал муЬит факторларьшын по гочалманыи то'сири замани, ксиомудафиа васитосикими практики таибш олунма мумкунлу]у «¡ракилмшидир.

investigation of genetic effects of new compositional antimutagens Zelralova F.R.

Summary

At first in'experiments on the eycariots:piants (monocotyledonous and dicotyledonous) and mammals (rats and mice) determined ability tor preparation attained from fruits Morus alba, show aniimuiagenic properties, stabilize processes of cell proliferation, damaged by action of genotoxic factors of physical and chemical characters.

. On the base of preparations from fruits M.alba and peel fruit P.granatum made up new compositional antimutagen.

Its comparative effectiveness was studied on the different experimental systems, it is established, that genoprotective effectiveness of composition is considerably above of its constituent components.

In the experiments on laboratory animals possibility of practical application of preparations and their composition as genoprotective substances with influence of extremal environment and aging was determined

/