Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СПЕЦИФИЧНОСТЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В КЛЕТКАХ BACILLUS BREVIS VAR. G-B

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СПЕЦИФИЧНОСТЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В КЛЕТКАХ BACILLUS BREVIS VAR. G-B"

ей- г$гчъ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

■ і.

ДСБЕИЦА Анатолий Павлович- і

ШЕЩФИЧНХТЬ ШТИЛИРОВАНШ ДНК В КЛЕТКАХ ; ВАСПДОЗ ВЮЗУТЗ УАЛ. в-В

Биохимия /03.00»04/

■ Автореферат • диссертации на ооискание ученой степени кандидата биологических наук

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА* 1975

.і. ■ ■ Л' ■ -'А

Л

ц ■■'■■ "'•^•'^■^'/■¿Ui; ., ■ У:-''"-:.:<.■••■:• v.¿ЛГ- ',>■' '-V - '■ iwS/Î.'V 7A''Л:

■.:.-■',■;.■■ -. .-„ч/' -гг.,- 1 «у«1 vt-J ; ~ >i"' ■■ - -■

. ï ' ■ 1 "■ '' ■ - ■"■'-■' V'-'Î'■■■■-■*■. : ~-' ■ =..■ ■■: •;

• ; ; P86^ выполнена'на кафедре бяохмге растений Биологиче-; '

ското факультета МГУ Аав^вафвдрой;-/академвк;А.С.;

;- i: вЧ Межфакультетсной,лаборатории биоорганической яшии МГУг'г.л

/зав.лабораториев - члев-корреспондвнт АВ СССР В.П; Скулачев/. , 'j "

';■ - Назгшыйiруководжтеяыд-• ---/С/'I; ' . '".у'У. 1-

l:. ^.-■УуЛО--':: . доктор биологических наук Б.Ф» : Ванюшин. ' • ' .'••:• '„•'.-

YvTA'Сфипиальшв овпоЕвнты: • ; : у, '/•::••<'..: v'- h

У Г* { ; ' - Л;'-' -'1 ч' доктор биологических наук, профвооор / v'-'1^

'у ; : ' ' 3 v/' ; '^ Тжхонввяо ; ' : -У\\ v - ' ;;j yz-f f-;- ; г:' ' ; . :

. ( '■ ' : ' ; . ;V '.'••'o v : • кандидат медицянскЕХ наук И«И; Самойлевко. *. ,

Ведушев: предприятие : ; Инотихут. физиологии - и биохимии V- , .V " ï 'i: ^ ' ^ ' микроорганизмов АН ; СССР /г.Пущино-на-Оке/г; '- '' • ; > • > '• ; ц>'U-¿î

I97S:rt- : , V-\.

Зашита диосерташи состоится 'JT - " ' 1975 - г. ' " -.' ■ •

у / в ^^""час." на заседании Секционного Совета по^Вотанике

фязиалогсь-йиозшмического; отделения Биологического ;факультета>^' .:;^5 '

' • ' ,.10.'/ /Москва,'."Ленинские горы,' Биологический ф-т'МГТА;-. ' • . •

j ■■'■"■■* ¿.»v'' ; .-V -

. . . ' ' ' c диссертацией могно ^знаномитъоя в

: Л'; ч-" ческого факультета ЫГТ» - '.'• >• -'V : > .■ "':'. '• ,'• г'"-'' ' .'..-".'•• v'

'' ^ '■ | '"'У',' ^ ^ ^ ^

' ' ; . • Учевый секретарь Совета ';• Г. ' V; . • : :: • ' ; ? •' ^ ; ^

■■, ' ■■■"< >--С L- "Ч ■. "■ ' '

-■-J ' ■ ■ - . ' ■ . ^ . ' - ^ 1Г- Ж'-'-: UTTI/r^Tf ЯТП A ' - ■■.■. '

i. ^ V Д - 1 Л»«. НИКОЛАЕВА

i1

'4- t

X' ¡v', * , f '-„"s1";'-"" Г-//:..»4.'^"Г-"''-•:4- • ^i ' \ '' ^vi'c'V/-' Л:.'- -r- '„' т?Д' . r

- c ■■ r^ -r'r''/ ^"s ■'i-''^',iFrT;-^ii"'■y-/''"^" --- >i-^'V

.'У

В ДНК многих бактерий к фагов встречаются минорные основания - 5-метющитозин я N тжладенин♦ Наличие, природа s количественное содержание определенных минорншс оснований является видо- ж шташовоспешвфичным. Эта основания возникают на полшну-клеотидном уровне в результате избирательного метилирования остатков цитозива шш аленина в определенных нукдеотидкых последовательностях специфическими ДЕШ-метилазами.

Специфическое метилирование остатков азотистых оснований в поливуклеотидюга цепях придает уникальные черта бактериальным и фаговым ДНК и лежит в основе модификации и рестрккщя фагов в клетках некоторых бактерия. В результате сопряженного действия модифицирующих ДНК-мвтилаэ и рестргцирувшжх эвдонуклеаз бактерия чпредохраняют от деградации собственные и дискриминируют чужеродные, в частности, фаговые ДНК. Этот механизм может играть важную роль в процессах переноса генетического материала между бактериями - кооптации, трансформации и т.д. Не исключено, что метилирование ДНК играет полифункциональнув роль и имеет отношение к регуляции транскрипции, репарации в репликации ДНК,

В ДШС развит вариантов диссоциирующей культуры Baeillua brevis var. G-B /R,s,p+,p~ / содержится как 5-метилцитозин, так и в е-метиладенин. Диссоциация этой культура сопровождается значительным изменением уровня метилирования цнтозвва. в ДНК. Предполагалось, что изменение содержания 5-метилцитозкна в ДНК вас. brevis var. G-B при диссоциации может быть обусловлено индукцией профага/ов/ и появлением новых фаговых ДКК-метилаэ /VauayushUi et al. , 1968/.

Вопрос о специфичности метилирования ДНК в клетках разных вариантов Вас. brevis var. G-B представляя существенные интерес в свози с проблемой соотношения этой модификации ДНК и дифференциации клеток. Кроме того, изучение природа метилируемых последовательностей в ДНК имеет,большое значение для выяснения механизма функционирования соответствующих ДНК-ыетилаз и для решения проблемы узнавания на уровне белково-нуклеиновых взаимодействий.

В настоящей работе осуществлено сравнительное изучение специфичности метилирования ДНК в клетках разных вариантов вас.

ííb'KU.;-. . , . , і'с-.ї.да. í ' V ■■ ¿»4Í

;_____ ZS2<&

ЬгеУІе лгаг. й-в , причем основное внимание уделено исследова-нкв структура цитозив-метюшруемой последова тельности в ДНК Вас. Ьгеуів лгаї, (5—В.

Эта работа является частью в продолжением многолетних исследований по специфичности нуклеиновых-кволот микроорганизмов, начатих и проводившихся на кафедре биохимии растений МГУ псщ руководством академика А.Н. Белозерского.

Пигрояа МИНОРНЫХ оснований В ДНК Вас, ьвзуів уаг. о-в

После выращивания клеток метиошш-ауксотррфного мутанта 3-варианта Вас, ьгеуів угц?. о-в , полученного нами по методу Ддельберга /АаеіЬеге еъ аі. , 1965/, в присутствии /метил-эН/-метиоиква практически вся обнаруживаемая в их ДНК радиоактивность содержится в 5-метилкитозине /МС/ и м^-ме тиладенмне /МА/. В других основаниях /аденин, гуанин и цитозин/ метка не обнаружена* Небольшая радиоактивность присутствует в тимине, однако доля ее невелика /около 1%/, и она не может заметно влиять не результата изучения распределения минорных оснований по их радиоактивности. Таким образом, практически все радиоактивность в пнримидиновых олигонуклеотидах исследуемой нами ДНК Вас.ьгетіе в принадлежит МС.. Это давало нам возможность по изу-

чению распределения радиоактивности в олвгошримидиношх фрагментах после их разделения на ДЭАЭ-Сефадексе /Мазин, Баншик, 1967/судить о локализации МС в соответствующих пиримидиношх последовательностях. Лш исследования локализации Г4С в ДНК Вас. ьгєуів таг. й-в мы выбрали ДНК клеток б-варианта, поокольку именно эти ДНК характеризуются наиболее высоким содержанием МС /0,45 мол.?/ по сравнению с ДНК других вариантов этого же вида / УапуивЫп еЪ аі. , 1968/.

Локализация 5-метиЛцитозина в пиримдщиношх фрагментах ДІЖ Бас. ЬгеУіе Б_

Анализ пиримидиношх изоплят из ДНК клеток Бас. йгєуіз с /мет-/, вырайенннх в присутствии /метил-3Н/-метионика, покази-

вает, что практически воя радиоактивноеть пиримиднновах оснований этой ДНК сосредоточена поровну в моно- и дипиримидиновых яугагеотидах /тавл. I/. Доля радиоактивности во' всех остальных пиришдвновых изошштах / о^З / крайне «ала х со-

ставляет менее 2-3SS от радиоактивности всех пнримиДвновых фрагментов ДНК. Эта величина близка к фоновому значению, и как можно будет видеть далее, она» в сущности, обусловлена яёкой ми-

Табл*"а X

Распределение З-метилцитозина по пиримидиновны изошштам В ДНК Sac. brevis з

Радиоактивность Изопляты имо/мин %

• /1/ /2/ /I/ /2/

I 13680 9121 49,1 48,8

п I3Ö84 9089 49,1 48,6

ш 189 271 0,1 1.4

IT 127 100 0,5 0,5

т 84 67 0,3 0,4

п 40 27 . 0,1 0,1

64 35 0,2 0,2

эерной активностью тимина или остаточной активностью MC. Как видно из таблицы. 2, во фракции монопиримидяновых фрагментов -практически вся радиоактивность содержится в нуклеозиддифосфа-?в рСр.-"Таким образом, • половина всего MC в ДНК Вас. ьгєуіз s . .содержится в последовательности рч-Ш-рч . При анализе пири-иидиношх динудлеотидов установлено, что вся радиоактивность этой фракции содержится в /С, Т/-динуклеотиде. Радиоактивность je динуклеотнде CG очень мала и сходна с активностью динуклео-тида TT, который заведомо не может содержать УЮ, Значит, MC не содержится в динуклеотиде ОС и локализован в /С, Т/-динуклеотиде. Выделенный меченый /С,Т/-динуклеотид последовательно Обрабатывали фосфомонозстеразой б.,.coli и фосфодизстеразой змея-

него яла ж определяли радиоактивность в полученных продуктах /н и г® /. Практически вся радиоактивность выделенной смеси динуклвозвдтрлфосфатов рСрТр к рТрСр после такой энзиматнчвекой обработка и разделения полученных продуктов обнаруживается в нуклеозидах /н / /табл. 3/. Следовательно, МС локализован в последовательности Pu-mc-t-fu , Таким образом, в ДНК s-варианта Bac.brevis var. G-Б весь МС поровну содержится в последовательностях pu-mc-Pu и pu-lic-t-pu.

Изученная ДНК по характеру распределения МС резко отличается ОТ ДНЕ сравнительно близкородственной бактерии Bae.eubtilis, в которой, как у Е. ooli , МС полностью отсутствует в последовательности Pu-mc-fu , зато выявляется в /С,Т/-динуклеотиде И более ДЛИННЫХ ПИрИМИДИНОВЫХ олигонуклеотидах / Boeoocll, somnyra , 1965/. Все это указывает на уникальный характер метилирования ЦИТ03ИН0ВЫХ остатков в ДНК Вас. brevis var. S-B и выраженную видовую специфичность этой энзиматической модификации ДНК у бактерий.

Метилирование разных ДНК In vitro экстрактами из клеток вариантов .Вас, brevis var. g-b

В клетках всех изученных вариантов Bao. brevis var. g-b содержатся ДНК-^яетилазные активности, которые способны in vitro метилировать гомологичную к разные гетерологичные ДНК по цито-зиновым и адениновым остаткам. Практически вся ДНК-метилазная активность, ответственная за метилирование остатков цитозива в ДНК &-варианта Вас, brevis таг. G-B , /около 96%/ содержится в растворимой цитоплазматической фракции; небольшая активность /около 2%/ найдена во фракции мембран; Около $4% аде-ниновой ДНК-метилазной активности обнаружено в цитоплазматиче-ской фракции и лишь С% во фракции мембран. Фракцию мембран получали из бактериальных протопластов после разрушения их осмотический шоком.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ДНК-метилазы Бас. breviв var. g-b либо не ассоциированы с мембранами, либо связь этих ферментов о мембранами очень слабая. ДНК-ме-

. Таблипа 2

Локализация 5-метилдитозина в пирюдщшовшс олигояук-леотадак ДЕК Bag, brevia s

Радиоактивность Установленная Иэошшты Олигонуклеотида ----- последова-

ИМП/ЫИЕ % ТбЛЬНОСТЬ

I 9757 264 97,4 2,6 ... Ри-Ш-Ри ...

СйДз ' 188 1,8

п „ ■ СТРЗ 3832 96,2 ... Ра-/МС,Т/-Ри

тгРз 206 2,0

Таблиц» Я

Локализация 5-метилшггозина в /С.Т/динтклеотидах из ДНК Bao, bravie s

Продукти гкяроишза Радиоактивность Установленная

смеси ÇpT и ТрС ------последовательность

ФДЭ эм.яда имп/мин %

Нунлеозида /Н / IXQI3 99,6 ... Pu-UC-T-Pi ...

Нуклеогцвд /рн / ¿9 0,4

Примечание: представленные результаты являются средними двух отдельных определенна.

тилазная активность, обнаруживаемая нами в мембранной фракции, может быть обусловлена ферментами, которые были связаны о ДЕК в момент выделения фракции мембран. Комплекс ДНК с мембранами обнаружен у многих бактерий /Коротяев, 1974/.

Ферменты Бао. brevis var. g-b, модвфицирувдие остатки ци-тозина в ДНК, способны метилировать век нативные, так и денатурированные нагреванием или щелочью ДНК. В этом отношении ш-тозиновая ДНК-метилазная активность из клетон Вас. brevis var.g-b сходна С ДНК-метидазами Вас. eubtills / Ойа, Магшиг , 1966/ и отличается от ДНК-метилаа Е. сои' и фага И, которые неспособна метилировать денатурированные ДНК / Gold, aurwitz ,2964; Brooke в et al. , 1972/.,

После метилирования in vitro нативной и денатурированной ДЦК PS. aeruginosa экстрактами из клеток Вас. brevis S отношение рапиоактивноотей МЗ/МА в этих ДНК составляло, соответственно t 1,4 в 13,3. Денатурация ДНК сопровождается уменьшением уровня метилирования остатков аденина в большей степени, чем остатков цитоэива. Значит, целостность вторичной структура ДНК особенно важна для ДНК-ыетилаз Вас. brevis таг. g-b , осуществляющих модификацию адениновых, но не цитозиновых остатков. ДНК-метилаэы,Вас. brevis var. g-b метилируют также фраг-гантированные ультразвуком двутяжеше и однотякевые ДНК ps. aeruginosa . При этом уровень метилирования и соотношение метилируемых остатков цитозина и аденина в двутяжевых фрагментах ДНК значительно не изменяются /МС/МА > 1,5-1,6/, а в одно-тяжевых фрагментах, по-прежнему, метилируются преимущественно только датозиновые остатки /МС/МА = 8,8-9,5/. Таким образом, фрагментация ДНК ультразвуком не сказывается значительно на ее акцвптирувщей способности при метилировании ферментами Вас. brevis var, g-b .

ДЕК всех вариантов Вас. brevis var. G-B способны in vitro акцептировать СНд-грушш из s-аденозилметаогава /sAM/ в присутствии гомологичных ДНК-метилаа /табл.4/. Это означает, что в исходных клетках ДНК может быть частично недометилироваиа, Недометилированность ДНК Bao.brevis var. G-B, по-видимому, объясняется известной разобщенностью во времени процессов репли-

кают к метилирования ДНК в клетках этой культуры. Долгое время считалось, что бактериальные ДНК, в отличие от ДНК эукарно-гов, вообще вв метилируются in vitro гомологичными ферментам*.

Кз всех 13ученных ДНК Bao. brevis var. g-b наибольшей акцепторной способностью при метилировании 1д vitro гоиоло-■ гичными ферментами обладает ДНК R-вартанта. При гомологичном метилировании in vitro во всех случаях происходит модификация как цитозиновых, так к адениновых остатков. В гомологич-ноЯ системе из клеток Bao. brevis r , а также F+ преобладает. . метилирование адениновых, а в системах s л Г - цитозиновых остатков /табл. 4/. Из веет изучения здесь диссоциантов наибольшей акцепторное способностью прх гетерологкчном метилировании обладает ДНК s-варианта, в особенности при ыетили-рованхи экстрактов из клеток Р~-варианта, В этой ДНК в основ-нон модифицируются именно цитозиновые остатки, несмотря на то, что среди ДНК прочих вариантов Вас. brevis var. g-b она характеризуется самым высоким содержанием 5-метилцитозина. Худшим акцептором прх гетерологкчном метилировании среди дко-социантов является ДНК клеток Р*. Хотя ДНК всех изученных вариантов почти не отличаются по содержанию MA ш vivo , тем не менее вое они как при гоыо-, так а гетерологичном метилировании модифицируются по адешшовым остаткам.

Гетерологичная ДНК PS. aeruginosa метилируется in vitro экстрактами всех вариантов Bao. brevis в различной отепени. Таким образа«, одна х та хе ДНК /судя по величине и соотноша-- дню радиоактивяоетей ОО/ÍÍÁ/ по-разному метилируется ферментами из клеток разнвх вариантов Bao.brevis var. g-b . Как и другие данные из табл. 4, это, в принципе, могло указывать на то, что специфичность метилирования ДНК различна в зависимости от источника ДШ-мегидаэной активности. Иыешо такая разнокачест-ве ян ость гетерологичного метилирования ДНК у разных штаю-гов Е. coli послужила в свое время основой для вывода о шташовой специфичности ДНК-метилаз и метилирования ДНК у бактерий вообще /Gold, Hurwitz , 1964/. В данном случае она не могла служить основой для предположения о различной специфичности нети-

2-№1

Таблица 4

Гомо- и гетерологичное метилирование in vitro ДНК вариантов Бас. brevis; var. g-b ферментами из меток этих вариантов

Радиоактивность МС/МА (итАгт/

\ ДНК Экстракт4^ Bae.brevis R Bae.brevis S Вас brevis Р+ Бес. brevis Ps.aeruginosa

клеток

Bae.brevis Б 339 925 0,37х Ж 7 17 191 83 93 0,89 309 368 0,84 9166 5364 1,71

Bae.brevis S 150 59 2,54 ш I(7e* 73 38 43 0,88 ¡L 26 1098 526 2,09

Sac.brevls Р+ 49 357 0,14 ш 5,59 58 39 59 0,66х 63 150 0,42 10744 3391 3,Г7

Bae.brevis 335 733 0,46 4,92 466 62 100 0,62 341 299 1,14х 18874 5651 3,34

х - гомологичная система

лирования ДНК s клетках вариантов Bao. brevis var. g-b , поскольку акцепторная способность в характер метилирования ДНК /отношение меченых ДО/ЫА/ ыогут заметно зависеть от самых раз« личных факторов /возраст культуры, условия выделения, инактивация отдельных ыетилазннх активностей в препаратах при хранении/. Поэтому единственно надеиным критерием специфичности соответствующих ДНК-метилазлых активностей является собственно анализ метилируемых ими последовательное!ей.

Локализация S-мегидцитозина в таримидиновых олигонтклео-

тидах ДНК, метилированных ta vitro ферментами разных вариантов Bao, bravia var. G-B

Хорошими акцепторами СН3-групп из /метил-5Н/-з -аденозял-метиошша служат нативные ДНК ИЗ PseudотOnas aeruginosa и тимуса теленка. Поэтому мы н использовали эти разные по составу я последовательности ДНК для изучения специфичности ферментов разных вариантов Вас. ьrevis vac. g-Bj реакциях гетероло-гичного метилирования. Как следует из табл. 5 и 6, ДНК-метила-зная активность из клеток вариантов R, в к У осуществляет in vitro включение CH3-ipynn из /метил-3Ц/-зАМ только S моно-2 дияиримядиновые фрашеиты ДВК тимуса теленка hps. aeruginosa. Детальный анализ этих фрагментов показал, что в результате метилирования lu vitro МС появляется только в последовательностях pu-C-tu и Pu-C-T-Pu . Это означает, что метилирование цитоэиновых остатков в нативных /двутякевнх/ гетерологич-ных ДШС осуществляется в тех не нуклеотидных последовательностях, ЧТО И В ГОМОЛОГИЧНЫХ ДИК ИСХОДНЫХ клеток bao. brevis 3. Иными словами, по налим данным специфичность ДШС-метилазаой активности Вас. brevie var. G-B in vivoH in vitro одинакова. Поэтому реакцию гетерологичного метилирования вполне можно использовать для дальнейшей расшифровки природы последовательности, В которой ЦИТОЗИН метилируется ферментами Вас. brovis. Специфичность этой модификации не зависит от природы гетерало-гичвнх ДНК /в таких разных ДВК, как ДНК тимуса теленка и Ps. aeruginosa , штоэиноше остатки метилируются в одинаковых последовательностях/ /табл. 6/. Тот факт, что экстракты из разных

ТяЛптптя ft

Распределение радиоактивного 5-иетвлцитозгаа б шрими-днновых олигонуклеотидах ДНК FS. aeruginosa , ивГЙЛИ-рованной in vitro экстрактами клеток вао, brevis var. G-B

У'эошгиты

Источник ДНК-метилаз

Экстракт клеток Вас. brevls S

Экстракт клеток

Вас. brevlB Н

Радиоактивность

Установленная последовательность

иш/мин % ишг/иин %

X 2673 30,8 10774 32,5

п 5665 65,1 21987 66,2

ш 140 1,6 189 0,6

IT 98 I.I 65 0,2

У 56 0,6 70 0,2

л 22 0,3 41 0,1

»УП 45 0,5 67 0,2

Иаоплита Олиго- нуклео- тидш

I * 2638 9&f £ - -

"¿2 106 3,8 - -

. • .Pu-MC-Pu...

С^Рз 10Э 1,8 410 1,9

П СТрд 5653 96,8 20749 97,8 ...Ри-/1К!,Т/-Рц...

Т2рд 80 1,4 61 0,3

Анализ смеси СрТ и ГрС /гидролиз ФДЭ зиеиного яда/

Нуклеоздцы /Н/ 1721 97,1 16194 99,3 ...Pu-MC-T-Pu... Нуклеотщда /jjsr/ 51 2,9 108 0,7

Примечание: представленные данные являются средними не менее, чем двух отдельных определений.

Табдапа ^

Содержание радиоактивного б-метилиатозина в пиримакаадо-енх олигонуклеотидах разных гетерологичяых ДНК, метилированных уХ'Ьео ферментами из клеток Вас. Ы>от1»

Иэошшта

Источник ДНК

Ре, аеги£1лова Тимус теленка

Установленная последовательность

Радиоактивность

имп/шя % шп/ига *

I- Г 072 34 Д 4811 37,4

п ъаи 64,2 7851 61,0

1П 23 0,7 63 0,6

1У 9 0,3 44 0,3

7 2 од 40 0,3

Л 1 0,2 32 0,3

12 0,4 18 ОД

Олигонуклеотидн

Сгрз 52 2,4 129 2,0

СХРЗ 2068 97, 0 €236 97,6

Т2РЗ 12 0,6 28 0,4

..»Ри-ЫС-Ри...

Анализ смеси СрТ г ТрС /гидролиз ФДЭ змеиного яда/

Вуклеозщщ /я/ 1526 Нуклеотадн /рН/ 38

97,6 5674 2,4 46

99,2 0,8

ирпючанке: предсгавлекше данвне являются средними не менее, чей двух отдельных определений.

вариантов Bao.brevis var. g-b At, s, F"/ метилируют в різних ЩС одни и те se цитоэив-содержапше последовательности, свидетельствует о том, что у разных вариантов Bao.brevis var. g-b специфичность метклярования цитозиновых остатков в ДНЕ одинакова, и, по-видимому, они не отличаются и по соответствующим ферментам*

ДНК-метилаза из клеток Вас. brevis Б метилирует в денатурированной и двутяхевой дак из Ps. aeruginosa ,по-виддаому, одни и те же аитозин-есдержащие последовательности. В денатурированной, как и в нативной ДНК, весь ЫС возникает только в ■ моно- и дипиримидивовах фрагментах и содержится в последовательностях Pu-MC-Pu и Pu-MC-T-Pu

Анализ ближайших к 5-метилпитоэияу пуринових оснований и реконструкции метилируемой последовательности

Итак, в ДНК Бас. brevís vaíü G-Вцитозин-метилируемые последовательности содержат фрагменты Pu-MC-Pu и Pu-MC-T-,Pu. Для дальнеШаеЙ идентификации этих метилируемых фрагментов необходимо было установить природу соседствующих о МС пуринових остатков. Для этой цели денатурированную нагреванием ДНК Ps. aeruginosa инкубировали с экстрактом из клеток Вас. brevis S в присутствии /метил-эН/- йам. Для этой реакции гетерологично-го метилирования в качестве акцептора СН3-грутг мы намеренно использовали денатурированную, а не ватпвную ДНК. Это обусловлено тем, что в денатурированной ДНК /как указано ранее/ преимущественно метилируются цитозиновые остатки. Радиоактивность метилированных адениновых остатков в этой ДНК в наших условиях не превышала 6-7£ от всей включившейся в ДНК радиоактивности. Меченую таким образом in vitro ДНК гидролиз овали, панкреатической ДНКазой и полученные продукты разделяли по длине с помощью хроматографии на ДЭАЭ-Сефадексе. Оделенные динуклеоти-ды разделяли с помощью высоковольтного электрофореза по составу и определяли в них радиоактивность. На алектрофореграмиах радиоактивность выявлялась только в пятнах, соответствующих /А,с/, /g,C/ и /С,т/-динуклеотвдам /радиоактивность в них со-

ставляла, соответственно, 1794; 4201 и 2188 имп/шн/. Стало бить, йлижайпшми соседями метилируемого остатка вдтозина являются аденин, гуанин и тимин. Выделенные / & ,С/- и /А,С/-динук-леотиды последовательно обрабатывали фосфомоноэстеразой В. еоіі и фосфодиэстеразой змеиного яда. Практически вся радиоакшв-йооть / є,С/-динуклеотида /99,2.%/ после такого гидролиза обнаруживается в нуклеотидах /рн /. Это означает, что в/о ,С/-да-нуклеотице МС содержится в последовательности. &-МС. После аналогичного анализа /А,С/-динуклеотида почти воя его радиоактивность найдена в нуклеозидах № /. Стало быть* в /А,С/-динукле-огиде Ж! локализован в последовательности МС-А. Таким образом, обязательным соседом МС слева является гуанив, а справа могут быть аденин ели тимин. Значит, найденные нами метилированные фрагменты Ри-ыс-Ри и ри-мс-т-ри на самом деле имеют вид: О-МС-А ... и ... й-Ш-Т-Ри ... .

Эти фрагменты частично различаются по своей последовательности справа от МС. Они могут узнаваться либо двумя разными ферментами /метжлазами/, либо одним, который узнает некую вырожденную последовательность. Из анализа пиримидашов нам известно, что эти фрагменты в ДНК Бас. Ьг^ів vaг. й-в содержатся в отношении 1:1. Если в клетках Вас. ьгє-уіз уаг. с-в имеется одна ДНК-метилаза, осуществляющая модификацию цитоэшювых остатков, то она должна узнавать оба эти фрагмента в одной комплементарной.структуре, которая после метилирования, по-видимому, представлена следующей последовательность» из пяти нуклеотид-ных пар:

5* ... и'-о-мс-т- о-с-м ... з*

3* ... ЇГ -С- О-А-Ш-С-Н' ... 5*

/подчеркнута расшифрованные нами последовательности/.

Эта реконструированная метилированная последовательность полностью соответствует нашим аналитическим данным. Она обладает врашательной симметрией второго порядка, ось которой проходит через пару АТ. ДНК-метила за Вас. Ьгегіз уат. С-В в обеих цепях узнает одну шрожденную нуклеотидную последовательность: сс^єс . Эта последовательность отличается от всех изученных до сих пор субстратных участков ДНК-метилаз.

Привода и свойства нуклеиновой кислота Фага 1Р*"Ф

Как уже било отмечено ранее, предполагалось, что резкие различия по содержанию № в ДНК разных вариантов Вас. brevis ver. G-в могут быть связаны с разный содержанием профагов в клетках дяссоциантов или индукцией фагошх ДНК-метилаз при диссоциации. В этой связи особый интерес приобретало изучение свойств ДНК некоторых специфических для Бао. brevis var. ii-в фагов и характера метилирования фаговых нуклеиновых киолот in vivo и in vitro.

В такого рода исследовании нами был использован выделенные недавно фаг И^ф /Михайлов а др., 1974/, Бактериофаг 1Р*ф является вирулентным мутантом умеренного фага Р*-варианта Вас. brevis var,' tt-B.

Нуклеиновая шслота фага 1Р+ф не гидролизуетоя щелочью /0(5 MNaOH, 37°, 18 часов/ и устойчива к действию панкреатической РНКаэы /100 мкг/мл, 37°, I час/. После гидролиза фаговой нуклеиновой кислоты по методу Бартона / Burt СП, Petersen, I960/ в реакционной -дмесн развивается окраска, типичная для по-линуклеотидов, содержащих дезоксирибозу в качестве углеводного компонента. Все это свидетельствует о том, что нуклеиновым компонентом фага 1Р*ф является ДНК.

ДНК фага 1Р+ф обладает высокой величиной гиперхромизма /более 4СЙ/, что свойственно высокомолекулярным нативным двутяже-выы ДНК. Кривая термической денатурации ДНК фага 1Р+ф имеет ш-ражевшй симметричный характер с узким температурным интервалом структурного перехода спираль-клубок у£Г = 3,7°/. Величина 2 0", отражающая степень гетерогенности ДНК по составу, равна всего 1,7 моя.Зй 1Ц* Это указывает на высокую гомогенность популяции молекул ДНК фага как по длине, так и по составу. Величина T-JJ ДНК фага 1Р*ф в стандартном солевом растворе равна 83,гК В ДНК фага 1Р*ф «отечество гуанина равяо количеству от-тозина, а содержание аденина соответствует содержанию тимина. Это указывает на комплементарный двутяжевый характер ДНК фага 1Р*ф. Данные по содержанию 1Ц-пар, полученные с помощью хроматографии и спектрофотоыетрического определения отдельных оснований, а также рассчитанные по величине Т^, практически совпадают /содержание Щ-пар составляет, соответственно, 34,5 и

33,9 мол.?/.Таким образом, ДНК фага ГР^ф является двуошрель-аой без существенных аномалий во вторичной структуре и не содержит заметных количеств необычных оснований /З-оксииетилци^ тозин, 5-оковиетидурадил, урацжл и т.д./.

По нуклеотидному составу ДНК фага четко отличается от ДНК хозяина - Вас. brevls таг. G-в /ГЦ = 45,7 мол.?/, а по характеру распределения пиримидииов по отдельным взоплихам они довольно близки /табл. 7/. Это может указывать на существование неких общих чеит организации их вуклеотидной последовательности.

Таблица 7

Количество разных ппримкднновех изоплвт в ДНК фага 1Р*ф и его хозяина

Иаопяиты _Содержание изоплит. мол.? /5±и/

ДНК фага 1Р*ф ДНК Bao. brevis .

/Мазия, Бангшш, 1969/

12,64+0,09 13,72+0,16

П 11,90+0,04 12,26+0,13

Ш 8,03^0,21 8,50±0,22

IV 4,81+0,16 4,84+0,24

V 4,19+0,22 2,20+0,14 Я 3,54±0,Ю

УП 3,12±0,21

>УШ 1,77+0,17 8,4^0,17^

х/ а >6

Примечание: Число отдельных определений равно пяти.

Метилирование ДНК Фага 1Г+Ф ш тнуп и 1п „

По содержанию МА /около 0,3.мол.?/ ДНК фага 1?*"$ практически не отличается от ДНК его хозяев - Р" и б-вариантов Бас. Ъгетг±з гаг. в—в /табл.8/. Количество МС в ДНК бактешоФага

примерно вдвое меньше, чем МА. Несмотря на то, что уровень метилирования нитозина в ДНК разных хозяев /Р~ и s-варианты Bao. brevis var. G-B / различается более чем в 10 раз, количество МО в ДНК фата, вырешенного на этих разных культурах, практически одинаково. Иными словами, уровень метилирования цитозвна в фаговой ДНК не изменяется в зависимости от природы хозяина. Таким образом, встречаемость цитозин-метилируемых последовательностей в ДНК фага ХР^ф при выращивании на клетках Р~ и s-ва-риантов одинакова. Это может указывать на то, что клетки этих вариантов обладают цитозив-модифицирующими ДНК-метилаэами с одинаковой специфичностью.

ДНК-ыетилазы Вас. brevis з не метилируют in vitro ДНК фагов 1Р*"ф /Р~/ л IP^í / S /, выращенных на разных хозяевах -Р~ и 5-вариантах в*о. brevis var. G-B , соответственно, в то время как в тех же условиях гомологичная ДНК Вас. bravis S и гетерологичкая ДНК Ре. aeruginosa акцептируют СНд-грушн из SAM. Следовательно, ДНК фага 1Р*Ф после выращивания его в клетках Р~ И . s-вариавтов Batí. bravia var. G-B прометшшро-вана полностью по соответствующим остаткам цитозина и аденина и не содержит последовательностей /участков/, доотупяых дата действия in vitro ДНК-метилаз Вас. brevie S . Эти данные, как и результаты, приведенные ранее, свидетельствуют об отсутствии' вариантных различий специфичности метили рова'ния ДНК в клетках Вас. brevis таг. G-B.

Итак, выявленные ранее различия по содержанию МС в ДНК разных вариантов Вас. brevia var. G-B /„Vanyushin et al. , 1968/ не могут объясняться появлением новых ДНК-метилаз или каким-либо изменением специфичности их действия при диссоциации вао. ъreviв var. g-B , Эти различия, по-видимому, обусловлены разной частотой встречаемости цитозин-метилируемых последовательностей в этих ДНК, Это не кажется невероятным, если учесть, что изученные варианты вас. brevis var. g-b -полилизогенше культуры, которые могут различаться по набору профаговых ДНК в клетках /Жарикова и др., 1971/.

После выращивания фага на Вас. brevis и /мет"*/ в среде с /метил-3Н/—метионином установлено, что практически вся

Таблида 8

Содержание минорных оснований в ДОС фага 11"*ф и его хозяев

Иоточвин ДИК

Основания. мол.%

5-метилцатозин и ь-метиладенин Щ

Фаг 1Р*ф выращен на Bao. brevis р-

Фаг 1Р*ф выращен

На Вас. brevis s Вас. bravia Р~

0,18

0,17 0,04 0,45

0,32 0,28 0,30

0,31

34,5

34.6

45.7 45,6

YY

Вас. bravie S •

х/ Результаты получены H.A. Кокуриной, хх/ Vanyushin et al. , i960.

обнаруживаемая а-ЛИК фага радиоактивность принадлежит МС и МА, Эти результаты подтверждают данные о наличии этих минорных оснований в ДНК фага 1?*$, полученные с помощью хроматографии и спектрофотометрии. Величина отношения радиоактивностей в МА и МС, выделенных из меченой ДНК, составляет 2,1, что отвечает соотношению количества этих минорных оснований /1,9/ в ДНК фага по данным прямого определения /табл. 8/. Меченая таким образом ДНК фага бала использована для анализа распределения МП по лиркмидиновым изоплатам этой ДНК.

Как мы уже знаем, ДНК хозяина фага - культуры нас. brevis var. g-b свойственен очень специфический характер распределения МС по пиркмидиновым иэоплитам. В этой ДНК МС обнаруживается лишь в моно- и дипиршидиновых блоках, причем количество МС в этих изоплитах одинаково /табл. I/.

ДНК фага И^ф обладает совершенно иным распределением ДО по пиримидиновым изоплитам /табл. 9/. Радиоактивность, соответствующая МС, найдена во всех пиримидиновых изоплитах, полученных из ДНК фага 1Р*ф. Moho-, ди- и трширимидиновые фраг-

їв

Таблица 9

Распределение 5-метилпятозина /радиоактивноЬти/ по пиримидивовым изоплитам ДНК фага 1Р*ф .

Радиоактивность

Изоплаты .....

ищ/квн %

I 1642 21,0

П 2145 27,4

В 1627 20,7

ІУ 940 12,0

г 540 6,9

71 527 6,7

>7П 415 5,3

менты этой ДНК содержат около 70? от общего количества №.

Максимальное содержание № выявляется во фракции пирвмидиновнх динуклеотидов /~27£/, Таким образом, фаговая ДНК в клетках вес, brevla G-B метилируется иначе, чем хозяйская ДНК.

Различный характер метилирования остатков цитоэина в ДНК фага 1Р|"ф и ДНК хозяина, по всей вероятности! обусловлен- участием в процессе метилирования фаговой ДНК некой специфической ДНК-метилазы, индуцируемой фагом 1Р*ф. Кая отмечено ранее, ДНК фага 1Е*ф не содержит участков, доступных in vitro действию метилаз вео. brevie s , Следовательно, фаговая ДНК полностью прометвлирована in vivo ,бактериальными ферментами. Таким обрезом, в метилировании цитозиновых остатков в ДНК фага ХР*ф заняты, по крайней мере, два разных по происхождению фермента. Фаговая ДНК в клетках вас. brevls v&r. G-Б метилируется хозяйскими ферментами, которые приводят к появлению Ш только в moho- и диыиршидиновых фрагментах. Кроме того, она метилируется индуцированным при фаговом размножении ферментом о иной специфичностью, который метилирует остатки цитозииа и в- длинных шс-рныидиновых последовательностях. К сожалению, пока неясно, где закодирована структура этого индуцируемого фермента - в бактериальном или фаговом геноме. Специфичная для фага 1Р*ф ДНК-ме-тилаза, по-видимому, зарепрессирована и не осуществляет мети-

лироваше фаговой и бактериальной ДНК, когда фаг IF1"® содержится в клетках Bao. ь revi a vac. G-B в состоянии профага. Как известно, фаг 1Р+ф является вирулентным мутантом умеренного фага, по которому лязогенна культура Р^-варканта Вас. brevis var. G-в /Михайлов и др., 1974/. Действие даК-метилазы, индуцируемой фагом 1Р+ф, обнаруживается только при размножении этого фага в клерках вас. brevis var. G-в.

шведа

I, Выделен метионин-зависишй ауксотроф s-варванта Bacillus brevis var. g-в , и изучен характер распределения 5-ме-тюшхтозина /МО/ в его ДНК после выращивания бактерий с /ые-тюг-3Н/-метиошшом. При анализе выщепленных из ДНК пиршндино-вых фрагментов установлено, что весь 5-метшщитозин содержится ТОЛЬКО В олигонуклеотцдах Ри-Ш-Ри и PU-liC-T-PU в зквимолярных количествах* Расшифрована природа соседствующих с 5-метилшмозином пуриновых нуклеотидов и показано, что он локализован во фрагментах g-wc-a и ü-íw-ih?«.

П. Модифицирующая цитозвновые остатки ДНК-уетилаза Вас. brevis var. ü-в , по-видимому, узнает вырожденную нуклеотидную последовательность: gc£gc » которая входят в комплементарную структуру с вращательной симметрией второго порядка:

5' ..." ... Э*

Зт ... я -v-ü-a-u-G-in' ... 5*

/Знаком * обозначены метилируемые остатки цитозвна/.

Ш. I. В клетках вариантов Вас. brevis var. У-В / а.ь.р*,?-/ обнаружена ДНК-метилазная активность, осуществляющая in vitro метилирование цитозивовых и адененовых остатков не только в ге-терологичныт, но и гомологичных ДНК. Следовательно, в бактериальных клетках /Ьас.brevis var. u-в/ ДНК может быть частично педометилирована.

2. Специфичность метилирования остатков цптозина в ДНК ! ферментами Вас,brevis var. U-ií ia vivo И in vitro одинакова и не зависит от природы ДНК.

3. ДНК-метилазы Вас. brevis var. о-в метилируют ia vitro цитозиновыв остатки в дативных и денатурированных ДНК в одинаковых последовательностях.

ГУ. Варианты вас.brevis var. g-b ие различаются по специфичности метилирования цитозиновых остатков в ДНК.

7« Изучены природа л свойства нуклеиновой кислоты фага 1Р*ф -Вас. Ь re via var. G—в.

1. Нуклеиновой кислотой фага является двутяже-вая ДНК АТ-типа All к 34,5 мол.?/.

2. По характеру распределения пиримидиновых изошшт фаговая днк близка днк хозяина - вас. brevis var. g-b.

3. ДНК фага IFNj содержит 5-метилцитозин и м6-метил-адешш, она не метилируется in vitro ферментами Бас. brevis S.

4. Содержание минорных оояовавий в ДНК фага 1Р*ф, выращенного на разных диссоциантах Вас. brevis vor. g-b , одина-

'еово и не зависит от природы хозяина /Р", s-варианти/.

5. Специфичность метилирования остатков цитозияа в ЛИ фагз ГР^ф и его хозяина - вас. brevis var. g-b различна. По-видимому, в процессе метилирования цитозиновых остатков в фаговой ДНК, наряду с хозяйской ДНЮ-метилазой, участвует некая специфическая метилаза, индуцируемая фагом ХР^ф.

Материала по теме диссертации опубликованы в следуицюс,

1. Добрица АЛ. О природе цитозин-метюгаруемнх последователь-

ностей В ДНК Bacillus brevis var. G-B , В С(5.:Струк-тура а функции нуклеиновых кислот и нуклеопротеи-дов. Материалы симпозиума, посвященного памяти академика А.Н, Белозерского, М., 1974, 27-28.

2. Ванпвии Б.Ф., Добрица А.П. Специфичность метилирования ци-

тозвновах остатков В ДНК Bacillus brevis var. G-B. Молекулярная биология, 1975, ¿¿5-A9S.

3. Добрица А.П., Михайлов А.А., Зарубина А.П., Жарикова Г.Г.,

Ваншин Б.Ф. Некоторые свойства бактериофага IF1"® Bacillus brevis ver. g-b и его нуклеиновой кислота. Молекулярная биология, 1975,6C2.-6CS.

iV'-v

r. : ' 4. .Добрив А ЛІ ¿Г Михайлов Ванюшин Б.Ф.:Швтклированив-" < ;

дЕК'фага .Bacillus bx'«vis varV G-B V Киптуотд,' '•

доложены на Международном симпозиуме,"Структура и функции '•-.• ; '' .;• нуклеиногых kbcjíót и нуклеопротеидов", посвященном памяти ака- •: .

% vi;

у ¿хгГ.: -г V ¿es/ jeßtse^cu ¿g:#-t ^

•->.• V '4,'-/.у... :'*Л* У',;-'.-/:' ••.-..

. •• /• ^ " """'л*. /• .• ' -'ел

. Ч^-Т^УГ '-.'■■ vï'y T.Í, ■„

-i"-

■VI ...... ...

: : v" ; к печ'эт^ЛГ- Ç^iV: : " - Ф 60 ХЭ0/, í 7.4 J ' ;•: ,'rv

■■' it-S. ; •';„ ^ " Vv: ■ ;;: '': 'í v Г. " v L' 3, : -

í'j-só1 ' V.'¿ Московского, университета, Москва, K-9/.-V'-.''v'V V

» >;! -і": -1 ' Типография Изд-яа МГУ.! Москва,' Л ангоры " f"-1 - ; Î1

-..V. і"- - - V ^ V.C V* :•;/:*•'-:-'X; '• ' ^