Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез внеклеточной эндонуклеазы SERRATIA MARCESCENS рекомбинантными штаммами ESCHERICHIA COLI и SERRATIA MARCESCENS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез внеклеточной эндонуклеазы SERRATIA MARCESCENS рекомбинантными штаммами ESCHERICHIA COLI и SERRATIA MARCESCENS"

. з о,.

казанский государственный университет

На правах рукописи

АНЦИЛЕВИЧ Лия Михайловна

биосинтез внеклеточной эндонуклеазы

SERRATIA MARCESCENS рекомбинантными штаммами ESCHERICHIA COLI и SERRATIA MARCESCENS

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

казань - 1994

Работа'выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженер ферментов Казанского государственного университета.

Научный руководитель: кандидат биологических наук.

доцент О. А. Гимадутдинов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Афиногенова А. Е

кандидат биологических наук, доц. Гизатуллин Ф. Е

Ведущая организация: АО "йютехнология"

Защита состоится "21" (х^ърлил 1994 г. в [Ч^час на заседании Специализированного Совета К 053.29.19 в И занском государственном университете по адресу: 420008, Казань, ул.Ленина, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиоте им. Е И. Лобачевского Казанского государственного университе им. Е И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул. Ленин

35.

Автореферат разослан "1994 года.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук ^ЬзйР^^ А'Е Аска

Актуальность проблемы. В настоящее время методы генетк-гской инженер™ применяются для решения широкого круга задач области молекулярной биологии и биотехнологии. Одной из та-их задач, наиболее часто реализуемой на практике, является эздание на основе технологии рекомбинантной ДНК штаммов, об-адающих способностью синтезировать в большом количестве необ-эдимый белок. Такой сверхсинтез может осуществляться как в еэультате повышения дозы гена, так и в результате увеличения го транскрипционной активности (Tso et al. , 1982. Gribskov; urgess, 1983). Немаловажную роль в этом процессе играет и летка-хозяин, в которую вводят рекомбинантную ДНК. Вопрос о заимодействии клетки-хозяина и рекомбинантной ДНК еще не полне изучен. Однако ясно, что существует взаимное влияние летки-хозяина и рекомбинантной ДНК, которое проявляется в ледующем: во-первых, рекомбинантная ДНК, попав в клетку, моет изменить такие свойства, как копийность. стабильность, пособность к транспозиции и рекомбинации; во-вторых, введение локированного гена в составе вектора в бактериальную клетку ожет оказывать как положительное, так и отрицательное влияние а ее физиологические и метаболические процессы. С одной сто-оны, векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, аюадае ей селективные преимущества. С другой стороны, верхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт, югут оказывать негативное влияние на рост и размножение кле-ок (Goldwin, Stater, 1979; Zund, Lebek, 1980). Все это в коечном счете может существенно влиять на биосинтез продукта ©комбинантных штаммов.

Эндонуклеаза Serratia marcescens в последние годы находит ирокое применение в биохимии, молекулярной биологии, медицине [ сельском хозяйстве. Возрастающие потребности в препарате вы-швают необходимость в исследованиях, направленных на получе-[ие новых сверхпродуцентов этого фермента и изучение его би-юитеза (Biedermann et al. , 1989; Miller et al. , 1991; Ball et il.. 1992; Friedhoff et al. , 1994).

Дель и задачи исследования. Целью настоящего исследования ¡вилось изучение биосинтеза эндонуклеазы Serratia marcescens >екомбинантными штаммами Escherichia coli и Serratia larcescens. В соответствии с этой целью нами были поставлены :ледующие задачи:

1. на основе штамма. Serratia marcescens 33. не Опособного

синтезировать эндонуклеазу, получить штамм, чувствительный ампициллину и тетрациклину.

2. На основе безнуклеазного штамма Serratia marcescer чувствительного к антибиотикам, получить рекомбинантный шта Serratia marcescens. несущий плазмиду pGR с геном эндонуклее Serratia marcescens.

3. Изучить влияние плазмиды pGR, несушей ген эндонуклеа Serratia marcescens. на рост и жизнедеятельность клеток-хоэ ев.

4. Изучить динамику биосинтеза эндонуклеазы Serrat marcescens рекомбинантными штаммами.

5. Изучить индукцию синтеза эндонуклеазы Serrât marcescens под действием температуры.

6. Исследовать поведение рекомбинантной плазмиды pGR клетках Е. coli и S. marcesccens.

Научная новизна. Впервые было изучено поведение рекомб нантшй плазмиды pGR, содержащей ген эндону^слеазы Serrat marcescens, в клетках Е. coli и S. marcesccens. Показано, ч способность к синтезу эндонуклеазы Serratia marcescens опрел ляется как клеткой - хозяином, так и рекомбинантной плазмвд pGR. Установлено, что в клетках рекомбинантных штаммов пр исходит изменение копийности плазмиды pGR. Показано, что на большей способностью синтезировать эндонуклеазу Serrat marcescens обладает рекомбинантный штамм Е. coli LK 111 (р nue г).

Практическая значимость. Полученные результаты моа использовать для дальнейших исследований в области промьппле ной микробиологии, для оптимизации синтеза эндонуклеа Serratia marcescens рекомбинантными штаммами, а также для из чения секреции фермента. Рекомбинантный штамм Е. coli LK 1 (pGR nue г), обладающий наибольшей биосинтетической акти ноетью, можно рекомендовать в производство для получения эвд нуклеазы в промышленных условиях.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены на ит говых научных конференциях КГУ (1991.1992, 1993, 1994) и Всероссийских конференциях (Мэсква, 1991, 1992,. 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научи работ.

Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена И? страницах машинописного текста. Состоит из введения, о

а литературы, описания материалов и методов исследований, дела результатов и их обсуждения, выводов и списка литералы. Работа содержит 7 таблиц, 15 рисунков, 2 фотографии, [сок литературы содержит 35 отечественных и 216 иностранных оров.

В работе были использованы рекомбинантные штаммы ;herichia coli DH5a (pGRnuc, pRK248 cl857), E. coli TGE900 31857, pGRnuc), E. coli LK111 (pGRnuc), S. marcescens 33 3R nuc) содержаще плазмиду pGR, в которой ген эндонуклеазы "ratia marcescens подстроен под Р1 промотор (Girradutdinow, ter, Pingoud, in press). Рекомбинантные штаммы E.coli DH5a ряду с плазмидой pGR содержали плазмиду pRK248, в которой ходится мутантный ген с1857, кодирующий температурочувстви-льный белок-репрессор. В штаммах Е. coli Т6Е 900 этот ген ходится в хромосоме. В качестве контроля были использованы аммы Serratia marcescens 9986, 33 и 28-13. Штаммы 33 и 28-13 ли получены из исходного штамма S. marcescens 9986 (nuc+) пум индуцированного мутагенеза. Штамм S.marcescens 33 (nuc-) растеризуется отсутствием нуклеазной активности, штамм marcescens 28-13 (nuc +) является суперпродуцентом нуклеазы имадутдинов с соав, 1990, 1991).

Клетки выращивали на мясопептонном бульоне (МПБ) и среде I (Маниатис, 1984) с добавлением ампициллина и тетрациклина, лественное определение нуклеазной активности проводили на юрдых индикаторных средах, содержащих высокомолекулярную ДНК толуидиновьгй синий (The Manual of Microbiological culture ■dia, 1988).

Для получения мутантных клонов, чувствительных к антибио-!кам, культуры клеток обрабатывали М-метил-М-нитро-N- нитро->гуанидином (Adelberg et al. , 1965; Guerola et al. . 1971).

Трансформацию плазмидной ДНК проводили с помощью хло-ictqvo кальция (Mandel, Hida, 1970)

Определение минимальной ингибирущей концентрации анти-яотика для рекомбинантных штаммов проводили по методике acrina с соавт. (Macrina et al. . 1974).

Для элиминации плазмиды pGR из клеток использовали стан-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

- 6 - \ дартные методики с применением интеркалируюодэгр красител бромистого этидия в концентрации 300, 350 и 400 мкг/мл (Iowas Kav. 1984).

Построение кривых роста и определение нуклеазной актив ности проводили по стандартной методике (Лещинская и др 1980).

Спектр внеклеточных белков анализировали методом электро фореза в системе Лэммли с SDS (Маниатис, 1984).

Определение ß-лактамазной активности проводили методом йодометрического титрования (Perret, 1954).

Плазмидную ДНК выделяли методом лизиса щелочью (Birnboim Dolv, 1979) и анализировали с помощью электрофореза в 0,8, агарозном геле (Маниатис, 1984).

Гидролиз ДНК рестриктазами проводили по методу1 (Маниатис 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Получение безнуклеазного штамма Serratia marcescens, чувствительного к ампициллину и тетрациклину.

Беэнуклеаэный штамм S. marcescens, чувствительный к антибиотикам, получали методом индуцированного мутагенеза с применением N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина (ННГ). На начально* стадии эксперимента были подобраны оптимальные условия дж проведения мутагенеза с помощью ННГ. Были выбраны концентрация ННГ, равная 1 млг/мл,и время обработки мутагеном 20 минут, при которых число жизнеспособных клеток составило порядка 2%. В результате двухкратной обработки мутагеном культуры клето? безнуклеазного штамма Serratia marcescens 33 были получены 1 клонов, чувствительных к ампициллину в концентрации 5мкг/мл,1 2 клона, чувствительных одновременно к двум антибиотикам - ь ампициллину и тетрациклину в концентрациях б мкг/мл и 1Л мкг/мл соответственно. У мутантных клонов была снижена скорость роста, изменена фо£ма колоний, однако несмотря на это, полученные мутантные культуры оказались достаточно жизнеспособными для использования в дальнейшей работе.

2. Клонирование гена зндонуклеазы Serratia marcescens в беэнуклеаэный штамм S. marcescens, чувствительный к антибиотикам

Мутантные штаммы S. marcescens, чувствительные к ампицилли-

г и тетрациклину и не обладающие нуклеаэной активностью, deh<jформировались плаэмидой pGR. несущей ген эндонуклеазы marcescens в прямой и обратной ориентации относительно PI зомотора.

В результате клонирования двух вариантов плазмид было гобрано 27 клонов S. marcescens, которые приобрели устойчи-эсть к ампициллину, причем уровень устойчивости различался в ависимости от ориентации чужеродного гена относительно PI ромотора. У рекомбинантных пггаммов, у' которых ген эндонуклеа-а находился в обратной ориентации относительно PI промотора, ровень устойчивости к ампициллину в 3,3 раза ниже, чем у гаммов, у которых ген эндонуклеазы находится в прямой ориен-ации.

Для доказательства введения чужеродной ДНК в клетку был спользован метод элиминации плазмид. Как видно из таблицы 1, ффективность элиминации для штаммов с прямой ориентацией гена уклеазы в плазмиде pGR при концентрации бромистого этидия 350 кг/мл составила 98%, с обратной ориентацией при концентрации ромистого этидия 400 мкг/мл - 99%, а в контроле без элимини-ующэго агента не наблюдалось исцеления от плаэмиды.

Таблица 1

Элиминируемость плазмид из клеток рекомбинантных ■ штаммов Е. coli и S. marcescens

Кол-во клеток утративших

Рекомби- плазмиду (%)

.нантные Фенотип

штаммы концентрация EtBr. мкг/мл

0 300 350 400

S. marces. (pGRnuc г) Amp* Nuc- 0 92 98 90

S. mairces. (pGRnuc f) Amp^ Nuc- 0 64 82 99

E. coli LK111(pGRnuc r) Amp* Nuc+ 0 100

E. coli LK111(pGRnuc f) Атр* Nuc+ 0 95

E.coli DH5a (pGRnuc r) Amp* Nuc+ 0 99

E.coli DH5a (pGRnuc f) Amp* Nuc+ 0 93

E.coli TGE (pGRnuc r) Anpft, Nuc+ 0 98

E. coli TGE (pGRnuc f) Anp^Nuc+ 0 91

На основе этих результатов можно сделать вывод, что ре-

комбинантные штаммы S. marcescens приобрели устойчивость к амш циллину не в результате спонтанной мутации или транспозищ гена из плазмиды в хромосому, а за счет трансформации плазм] дой pGR.

3. Изучение влияния плазмиды pGR, несущей ген эндонуклеазы Serratia marcescens, на рост и жизнедеятельность клеток-хозяев.

Как уже было сказано выше, ввёдение рекомбинантной ДНК клетку-хозяина может существенно влиять на ее мизнедеятел) ность. В конечном итоге изменение метаболизма клетки может с; щественно сказаться на ее росте и размножении. Поэтому бы. изучено влияние плазмиды pGR, несущей ген зндонуклеа; Serratia marcescens, на динамику роста рекомбинантных штамме Е. coli и S. marcescens. В результате исследований было пою зано, что рост рекомбинантных штаммов Е.coli и S.marcescens зависимости от генотипа происходит с разной интенсивность! Как видно из рисунка 1, наибольшей скоростью роста по сравн< нию со штаммом S. marcescens 28-13(.nuc+) обладали рекомбинан' ные штаммы Е. coli LK 111 (pGR nue), не содержащие ген-ре] рессор cl857. Напротив, рекомбинантные штаммы E.coli ВД5а (р( nue, pRK 248 cl857) и Е. coli TGE 900 (Xcl857,pGR nue), соде1 жащие ген-репрессор Cl857, характеризовались пониженной екк ростыр роста, причем его локализация оказывала влияние на i рост. Как видно из рисунка 1, клетки штаммов, несущие зтот г< в плазмиде pRK 248 (с1857), обладали большей скоростью рос по сравнению с клетками, у которых этот ген локализован в хр< мосоме. Существенное влияние на рост клеток оказывала и орие: тация самого нуклеазного гена относительно PI промотора. Т; скорость роста клеток, в которых ген эндонуклеазы находится обратной ориентации по отношению к PI-промотору, была выше i сравнению с клетками, в которых этот ген ориентирован правил] но (рис 1).

4. Изучение динамики биосинтеза эндонуклеазы Serratia marcescens рекомбинантными штаммами.

Аналогичная корреляция наблюдалась и - при изучении экспрессии гена внеклеточной эндонуклеазы S. marcescens в рекомб; нантных штаммах Е. col i и S. marcescens. Как видно из рисунка ; эндонуклеазная активность культуральной жидкости клеток реш

количеств

кагток/ма

LK tn (pGR Г> SaAJTCC 9986.

О 10 30 ЗО . ЧО

РИС 1 КРМЭЫЕ РОСТД РСКОКЗММЛНТМЫХ ИТ/еККав Е. col N t<4«c V отдмнаэ S. iMiamw

осхЗГ

ООО

ООО

гяккицы

АКТИВНОСТИ

мо

500

'HC X НШШЭКМ дикость РСКОНвИНДНТНЫХ ШТАИИОВ С. col t(440

И IT«MOB S. iMTOtscan*

бинантного штамма Е.coli LK HKpGR nue), у которых ген эндс нуклеазы S. marcescens находится, одновременно под контролем F и Pnuc промоторов была на 15% выше, чем клеток шгамма-суперг родуцента S. marcescens 28-13 (nuc+). В случае, когда ген эндс нуклеазы S. marcescens находится под контролем только собствен ного Pnuc промотора (обратная ориентация), активность фермент в культуральной жидкости по сравнению со штаммом S. marcescer 28-13 ( nue+) была на 5% ниже. У рекомбинантных штамме S. marcescens 33 AT (pGR nue) нуклеазная активность отсутствс вала (в случае обратной ориентации гена эндонуклеазы относ* тельно PI промотора) или восстанавливалась частично (в случг прямой ориентации). На основе полученных данных можно предпе дожить, что мутация в безнуклеазном штамме S. marcescens с затрагивает не структурную часть гена эндонуклеазы, а регул! торные гены, участвующие в его экспрессии.

Совсем иная картина наблюдалась, когда экспрессия reí эндонуклеазы S. marcescens контролировалась температурочувств! тельным С1857 белком-репрессором. Уровень синтеза внеклеточне эндонуклеазы S. marcescens клеток рекомбинантных иггаммов Е. со] DH5a (pGR nue. pRK 248 cl857) и E.coli TGE 900 (Acl859, p( nue), y которых ген эндонуклеазы находится в прямой ориентащ относительно Р1-щюмотора, и следовательно, репрессировг Cl857 белком, был значительно ниже, чем у клеток дикого штам) S. marcescens АТТС 9986 (nuc+). При этом степень репрессии бы. выше у клеток штамма Е.coli TGE 900 (Ас1857, pGR nue), у коте рых ген-репрессор с1857 находится в хромосоме, что, по-видимо) связано с усилением его транскрипционной активности.

5. Изучение индукции синтеза эндонуклеазы Serratia marcescens под действием температуры.

Так как температурночувствительный белок-репрессор C18J инактивируется при повышенной температуре, изучалась индукц экспрессии гена эндонуклеазы S. marcescens под действием темп« ратуры. Результаты этих экспериментов представлены на рисунге 3 и 4. Как видно из рисунков 3 и 4, температурная индукц приводит в значительному увеличению синтеза внеклеточной энд нуклеазы, причем с увеличением температуры индукции увеличив: ется и уровень экспрессии гена эндонуклеазы. Эти реэульта1 были подтверждены и данными электрофоретического анализа бе, ков культуральной жидкости рекомбинантных штаммов Е. col

сяинииы

АКТИВНОСТИ <• ЮОО )

ИН1ШШИЯ

И

20

16

ia

1111—J—1—1 > 1— —Г" «С —Г —

— Е«е CH9k<pGRг, р«К2«8>

; : V

F-c DH3« <pGR f. рИС 24© \ Ж

-

Е ; \ J7C —

i i If ц!¡ИС |2PCI ~

4>мс)

О 10 30 23 26 эо

РИС 3 ИНДИКЦИЯ СИНТЕЗ* имысдаы S. MTCMCMW "Т«М«И CHS* (BGK nue. РИС 248 свЭ7> ПОЯ ЯСЯСТВИСИ ТСНПЕРАТЫРЫ

12

lo

единицы

АКТИВНОСТИ ( • 1М0 >

индукция

—г- -г—г—1—]—1—1— -1-- 1 * 1

— 1

7

- " Г i -

/ -

— f 39С

TŒWtaCRO 4

-Í-. л —

* * i l Ш Г 1 Й УК ~ ,«¡ -

ЧЧ4С)

о lo го 23 26 эо

РИС f ИНЦШШИЯ СИНТЕЗА НЖИСМЫ &МГСИОП1 ИТ4НМ4НИ ТСС 909 CKCB57. pGR nue > ПОЯ ЯСВСТВИСИ ТСИПСР4ТУРЫ

После индукции при 42С у рекомбинантных штаммов увеличивается количество белка в зоне, соответствующей положению белка эндо-нуклеазы (29кД), тогда как у неиндуцируемых рекомбинантных штаммов Е. col i (с обратной ориентацией гена) такого увеличения не наблюдалось.

Следовательно, исследуемые штаммы Е. coli DH5a- (pGR nuc, pRK 248 el857) и E. coli TGE 900 (Acl857, pGR nuc) представляют собой удобную и экономичную систему регуляции, позволяющую в любой момент включить экспрессию нуклеаэного гена S. marcescens при повышении температуры инкубации. Штаммы, исследованные в данной работе, позволяют получать белок эндонуклеазы в количестве, равном или большем, чем у S. marcescens 28-13 (nuc+). Кроме того, у рекомбинантных штаммов Е. col i в культуральную жидкость секретируется значительно меньше посторонних белков, что также может быть полезно при очистке продуктов нуклеаэного гена. Эти преимуадзетва дают возможность использовать описанные выше штаммы в дальнейшей работе по изучению секреции и регуляции экспрессии нуклеаэного гена S. marcescens.

6. Исследование поведения рекомбинантной плазмиды pGR в клетках Е. coli и S. marcescens.

Известно, что поведение плазмиды в различных клетках-реципиентах может изменяться. Такие изменения могут быть связаны:

1) с изменением копийности плазмиды (Voltkairp, Stuitjov, 1981; Пасынкова, Зуева, 1982; Gribskov, Burgess, 1983);

2) с амплификацией гена в составе одной плазмиды (Revereng et al,, 1982; Miwa et al., 1983; Дебабов, 1984);

3) с транспозицией его в хромосому (Gutterson, Koshland, 1983: Vasseghi, Claverys, 1983).

В ряде работ было показано, что существует связь между дозой гена, обуславливаюадэго устойчивость к ампициллину, и его экспрессией, то есть обнаружена линейная зависимость между устойчивостью к ампициллину и синтезом фермента и между синтезом фермента и копийностью гена. Шказано также, что увеличение числа копий плазмид сопровождается повышением уровня резистентности к ампициллину (Uhlin, Nordstrom, 1977; Ely, Staudenbaner, 1981). Таким образом, изменение уровня устойчивости к антибиотику и активности р-лактамазы может служить косвенным доказательством изменения количества ее генов. Для

• - 13 -

проверки вышесказанного проводилось определение активности £-лактамазы и минимальной ингибирующей концентрации ампициллина для рекомбинантных штаммов Е. coli и S. marcescens, несущих плазмиду pGR. Результаты экспериментов приведены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, уровень резистентности к антибиотику значительно варьирует у разных штаммов. Установлено, что наибольшей устойчивостью к ампициллину (>55000 мкг/мл) обладает штамм Е. coli LK 111 (pGR nue г), a наименьшей (150 мкг/мл) -штамм Е. coli TGE 900 (pGR nue f). Кроме того, y всех рекомбинантных штаммов наблюдается корреляция менду уровнем устойчивости к антибиотику и ориентацией гена эндонуклеазы S. marcescens относительно Pl-промотора. Штаммы, у которых ген эндонуклеазы находится в прямой ориентации относительно Pl-промотора, обладают повышенной устойчивостью к антибиотику по сравнению с теми, у которых он находится в обратной ориентации. Чтобы выяснить, коррелирует ли изменение уровня минимальной ингибирующей концентрации антибиотика с изменением активности ß-лактамазы, проводили измерение активности фермента. Как. видно из таблицы 2, штамм Е. coli TGE 900 (pGR nue f), растущий на среде с ампициллином в концентрации не более 150 мкг/мл, обладает наименьшей активностью £-лактамазы (117 ед. ). efo сравнению с ним пггамм Е. coli TGE 900 (pGR nue r) устойчивее к антибиотику в 33 раза. Соответственно, и активность р-лактамазы у него выше в 38 раз. Подобная корреляция наблюдается и для других рекомбинантных штаммов (таблица 2). Наиболее резистентный к ампициллину штамм Е. coli LK 111 (pGR nue г) (>55000 мкг/мл) обладал и наивысшей активностью ^лактамазы (412500 ед. ). Столь значительные различия в уровне минимальной ингибирующей концентрации ампициллина и активности &-лактамазы рекомбинантных штаммов, как уме было сказано, можно объяснить: или увеличением копийности плазмиды pGR, или амплификацией гена внутри плазмиды, или транспозицией его в хромосому. Для проверки возможности транспозиции гена из плазмиды в хромосому использовали метод элиминации плазмид (Torres, Kay, 1984). Как видно из -таблицы 1, в результате элиминации, плазмиды клетки всех рекомбинантных штаммов приобретают чувствительность к ампициллину. Кроме того, электрофоретический анализ также показал, что в результате действия элиминирующего агента происходит удаление плазмид из клеток. Это означает, что изменение количества копий гена ß-лактамазы связано не с транспозицией

Таблица 1

Уровень устойчивости к ампициллину и активность £-лактамазы рекомбинантных штаммов Е. coli и S: marcescens

Штамм Уровень • резистентности к ампициллину (мкг/мл) Кол-во разрушенных кл. в мл Активность £-лактамаэы по ампициллину (в условных ед. ВНИИА, ±6) Предполагаемое изменение числа копий плазмиды относительно nrraMMaTGEC pGRnucf)

S. marcescensC pGR nuc г) 18000 2.1*10~5 17708 ±80 151

S. marcescensCpGR nuc f) 5500 2.15*10Л5 3670± 53 31

E. coli LKlllCpGR nuc r) >55000 1.81*10-45 412500 ±160 3526

E. coli LKlllCpGR nuc f) 30000 2*10Л5 30000 ±120 256

E.coli DH5a (pGR nuc r) 650 2.1*10л5 384 ± 19 3,3

E. coli DH5a CpGR nuc f) 200 1.95*10~5 181+9 1,5

E. coli TGE (pGR nuc r) 5000 2.12*10~5 4444 ± 53 38

E. coli TGE (pGR nuc f) 150 . 2. 23*10~5 .117 ± 7 1

го в хромосому, а с событиями, происходящими в самой плазми-

Такими событиями могут быть изменение копийности плазмиды пи амплификация гена внутри нее. Однако анализ плазмид, выде-энных из рекомбинантных штаммов, показал, что в данном случае ? наблюдается увеличения молекулярной массы плазмид. Более эго, количество ДНК, выделенной из одинакового количества петок рекомбинантных шт&чмов, коррелировало с уровнем агсгив-эсти ji-лактамаэы. Следовательно, в данном случае не происхо-ит амплификации гена внутри плазмиды. Остается последний ва-иант обьяснения происходящих событий - в клетках рекомбинант-ых штаммов изменяется копийность плазмиды, и, соответственно, эменяется количество входящих в нее генов. Как видно из таб-ицы 2, меньше всего копий плазмиды pGR содержится в штамме Е. э1i TGE 900 (pGR nue Л. В других штаммах ее копийность от-эсительно штамма Е. coli TGE 900 (pGR nue f) значительно уве-ичивсются.

На основе полученных результатов можно сделать вывод, го, по-видимому, при клонировании плазмиды pGR в различные гаммы Е. coli и штамм S. marcescens AT происходит изменение исла ее копий.

\

Выводы

1. На основе штамма Serrâtia marcescens 33, не способной синтезировать эндонуклеазу, получен штамм Serrâtia marcescení 33 AT, чувствительный к ампициллину и тетрациклину.

2. Получены рекомбинантные штаммы Serrâtia marcescens 3í AT (pGR nue), несущие плазмиду pGR, в которой ген эндонуклеаз] S. marcescens подстроен под Р1 промотор.

3. Изучено влияние плазмиды pGR, несущей ген эндонуклеаз! Serrâtia marcescens, на рост и жизнедеятельность клеток - хозяев. Показано, что присутствие плазмиды pGR в клетке в зависимости от природы клетки-хозяина уменьшает скорость ростг культуры в 1,5 - 4 раза. Наибольшей скоростью роста обладаем штамм Е. col i LK 111 (pGR nue).

4: Изучена динамика биосинтеза эндонуклеазы Serrâti< marcescens рекомбинантными штаммами. Показано, что максимальный синтез фермента осуществляется-в начале стационарной фаз1 роста. Наибольшей биосинтетической активностью обладает штам! Е. coli. LK 111 (pGR 'nuc), в котором ген эндонуклеазы Serrati< marcescens находится под двойным промотором.

5. Показано, что у рекомбинантных штаммов S. marcescení 33 (pGR nue) нуклеазная активность отсутствует или восстанавливается частично. Это связано, по-видимому, с тем, что мутация в исходном безнуклеазном штамме S. marcescens затрагивав: не структурную часть гена эндонуклеазы, а регуляторньк гены, участвующие в его экспрессии.

6. Изучена индукция синтеза эндонуклеазы Serrâti; marcescens под действием температуры. Показано, что рекомбинантные штаммы Е. coli DH5a (pGR nue, pRK 248) являются боле< индуцибельными, что, по-видимому, связано с особенностями регуляции.

7. Исследовано поведение плазмиды pGR в клетках Е coli ] S. marcescens. Показано, что в зависимости от природы клетки -хозяина происходит изменение копийности плазмиды.

Список работ, опубликованных по -теме диссертации.

1. Гимадутдинов О. А.. Анцилевич Л. Ы. Получение ыутантных клонов Serratia marcescens, чувствительных к ампициллину и тетрациклину. /КРУ - Казань, 1992. - 14с.: ил. - Бйблиогр.: 10 наз. - Деп. ВИНИТИ 07.04.92, N 1200-В92.

2. Гимадутдинов О. А.. Анцилевич jl М. Регуляция экспрессии гена внеклеточной эндонуклеааы Serratia marcescens в рекомби-нантных штаммах Escherichia coli./ КРУ - Казань, 1993. -17с.: ил - Еиблиогр.: 17 назв. - Деп. в ВИНИТИ 31.03.93, N 790-И93

3. Гимадутдинов О. А., Анцилевич Л.М. Синтез внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens рекоъбинантными штаммами Escherichia coli.// Биотехнология. - 1993. - N б. - с. 15 - 17;

4. Гимадутдинов О. А., Анцилевич Л. М. Поведение плаамидо-pGR в рекомбинантных штаммах Escherichia coli и Serratia marcescens - продуцентах внеклеточной эндонуклеааы. // Биотехнология. - 1993. - N 9. - с. 21 - 23.

5. Гимадутдинов О. А., Анцилевич Л М. Характеристика новых рекомбинантных штаммов Escherichia coli - продуцентов внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens. // Всес. конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами".: Тез. докл. - Москва.., 1993. - В печати.

6. Гимадутдинов О. А., Анцилевич Л. VL , Хабибуллина Г. А. Изменение копийности плаамиды pGR, несущей ген эндонуклеазы Serratia marcescens, в рекомбинантных штаммах Escher ich'а coli и Serratia marcescens. // Всес. конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами". : Тез. докл. - Мэсква., 1993. - В печати.