Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli

Крякунова, Елена Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli"

На правах рукописи

Крякунова Елена Вячеславовна

ВЛИЯНИЕ БАЗАЛЬНОГО УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЭНДОНУКЛЕАЗ SERRATIA MARCESCENS И ANABAENA SP. НА СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI

03.02.03 - микробиология

48568В9

1 з ОКТ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2011

4856889

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Гимадутдинов Олег Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, заведующий лабораторией Коксин Владимир Петрович

кандидат биологических наук, доцент Вершинина Валентина Ивановна

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН.

Защита диссертации состоится 27 октября 2011 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08. при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 35. e-mail: lsl@ksu.ru

Автореферат разослан 21 2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

А1луальность проблемы. Значительный прогресс в производстве ряда важных для человека белков в промышленных масштабах был достигнут благодаря применению генно-инженерных методов для создания соответствующих рекомби-нантных микроорганизмов. Сверхсинтез белка в таких микроорганизмах может осуществляться как в результате повышения количества копий гена в клетке, так и в результате повышения интенсивности его транскрипции. Однако до настоящего времени нет общей теории, позволяющей предсказать уровень экспрессии того или иного гена в гетерологичной клетке, а большинство используемых в настоящее время генно-инженерных конструкций допускают слабую экспрессию клонированного гена даже в присутствии репрессора. В результате такой экспрессии происходит синтез репрессируемого белка в небольших количествах - так называемый ба-зальный уровень экспрессии гена [Bahar et al., 2011].

В последние годы эндонуклеазы Serratia marcescens (NucSma) и Anabaena sp. (NucA) находят широкое применение в биохимии, молекулярной биологии, медицине и сельском хозяйстве. Эти ферменты принадлежат к одному семейству родственных эндонуклеаз, активные сайты которых имеют одинаковую высококонсервативную аминокислотную последовательность, так называемый DRGH-мотив [Pin-goud et al., 1999]. К настоящему времени изучено большинство функционально значимых аминокислотных остатков в £>/?G//-mothisc, описаны пространственная структура и механизм действия данных ферментов [Meiss et al., 1998; Chen et al., 2009]. Хотя на сегодняшний день эндонуклеазам NucSma и NucA приписывается лишь трофическая функция, но известно, что другие представители этого семейства эндонуклеаз принимают участие в репликации, репарации и рекомбинации ДНК [Dake et al., 1988; Ruiz-Carillo et al., 1993; Rangarajan et al., 2002]. Также было показано, что экзогенные ДНКаза I и эндонуклеаза NucSma в малых дозах усиливают пролиферативные процессы в микробной клетке, а именно синтез ДНК и деление клеток [Куприянова-Ашина, 1991]. К настоящему времени гены эндонуклеаз NucSma и NucA проклонированы в клетках Escherichia coli [Ball et al., 1987; Гима-дутдинов и др., 1993; Meiss et al., 1998], однако до сих пор не известно, как базаль-ный уровень экспрессии генов эндонуклеаз NucSma и NucA влияет на свойства ге-терологичных клеток.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - определить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens (NucSma) и Anabaena sp. (NucA) на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli.

В соответствие с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить наличие базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900.

2. Сконструировать референс-плазмиду с известным числом копий для косвенного определения количества содержащихся в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 генов Ыа по количеству синтезируемой клетками Р-лактамазы.

3. Установить зависимость между количеством генов Ыа в плазмидах, количеством синтезируемой Р-лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900.

4. Изучить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900.

5. Установить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на стабильность наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

6. Установить зависимость уровня устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к ингибиторам репликации ДНК от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов.

Научная новизна работы. Впервые показано, что величина базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA зависит как от клетки-хозяина, так и от плазмиды. Установлено, что базальный уровень экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA оказы-

вает положительное воздействие на выживаемость бактерий. Получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт для косвенного определения количества генов Ыа по количеству синтезируемой бактериальной клеткой ß-лактамазы. Установлено, что в клетках рекомбинантных штаммов Е coli LK111X и Е. coli TGE900 количество генов Ыа в плазмидах pHisNucSma и pHisNucA зависит от активности исходных и му-тантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Впервые показана возможность участия эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации плазмидной ДНК в рекомбинантных штаммах Е. coli.

Научно-теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты вносят вклад в понимание способов регуляции экспрессии клонируемого гена в гетерологичной клетке и возможностей достижения сверхсинтеза его продукта. Полученные данные можно использовать для дальнейших исследований в области промышленной микробиологии для оптимизации синтеза эндонуклеаз NucSma и NucA рекомбинантными штаммами. Встраивание под сильный промотор гена клонируемого белка в одну плазмиду с геном исходного варианта эндонуклеазы NucSma в результате их совместной транскрипции в рекомбинант-ном штамме E.coli TGE900 даст возможность получать данный белок в промышленных масштабах. Сконструированная в данной работе референс-плазмида может использоваться для косвенного определения количества генов Ыа в клетках микроорганизмов, а, следовательно, и количества копий плазмид, содержащих эти гены. Результаты исследования и примененные в работе методические приемы можно использовать при проведении практических и лекционных занятий по микробиологии и генетике микроорганизмов для студентов-биологов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к ампициллину.

2. С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов увеличивается количество плазмид pHisNucSma и pHisNucA в клетках рекомбинантных штаммов Е. coli LKUtt и Е. coli TGE900.

3. Экспрессия генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на базальном уровне оказывает положительное влияние на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LKlllk и Е. coli TGE900.

4. С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов в рекомбинантных штаммах Е. coli LKlllk и Е. coli TGE900 плазмиды pHisNucSma и pHisNucA наследуются более стабильно.

5. Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LKlllk и Е. coli TGE900 к налвдиксовой кислоте.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007); II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); First Interuniversity Conference on Modern Biology «Building the Future in Biology «Bio-News»» (Kazan, 2008); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); V съезде вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (Казань, 2009); 2-ой Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-2» (Москва, 2010); конференции «Наука в информационном пространстве» (Днепропетровск, 2010)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи, из которых 2 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 35 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 168 источников, из них 135 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили плазмиды pHisNucA (содержат ген исходного или мутантных вариантов эндонуклеазы NucA, обладающих следующими нуклеазными активностями: 0% при мутации Hisl24Ala, 1% - TrpJ59Ala, 10% -Argl22Ala и 100% - wt) [Meiss et al., 2000] и pHisNucSma (содержат ген исходного или мутантных вариантов эндонуклеазы NucSma, обладающих следующими нуклеазными активностями: 0% при мутации His89Ala, 35% - Arg57Ala и 100% - v/t) [Friedhoffet al., 1994b]. В качестве клеток-хозяев для данных плазмид использовали штаммы Е. coli LK11IX {rk'mk\ thi-1, thr-1, leuBö, tonA21, supE44, lacPYZAM15, Hfr, Amps, X+) [Friedhoff et al., 1994a], в хромосоме которого находится ген С1-репрессора фага X, и Е. coli TGE900 (su-1, ilv-1, Amp, bio\lcl857ABamAHl\) [Friedhoff et al., 1994a], содержащий в хромосоме мутантный ген термочувствительного С/ит-репрессора фага X [Remaut et al., 1981; Valdez-Gruz et al., 2010]. В результате клонирования гена Ыа в плазмиду рЕТсосоСт (lacI-pT7lacO-MCS-tT7, RecA , EndÄ~, Г, Amps) [Sektas et al., 2002] была получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт. Ген Ыа был получен с помощью ПЦР-реакции из плазмиды pBlueScript SK+ (lacPOZAmp") фирмы Stratagene [McEvoy et al., 1990]. Хозяином для референс-плазмиды служил штамм Е. coli DH5a (<p80d, lacZAM15, endAl, recAI, hsdRl7, supE44, thi-1, gyrA, relAl, Amp, FA [lacZYA-argF]) [Gibertet al., 1990].

Клетки рекомбинантных штаммов E. coli LK1UX и E. coli TGE900 выращивали на среде LB при температуре культивирования 30°С. Для создания селективных условий в среду добавляли ампициллин в концентрации 100 мкг/мл [Sam-brook et al., 1989]. Рекомбинантный штамм E.coli DH5a рЕТсосоАтрСт выращивали на среде LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл и 0,2% D-глюкозы (или 0,01% ¿-арабинозы). Активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA определяли с помощью индикаторного агара, содержащего толуидиновый голубой и высокомолекулярную ДНК [Meiss et al., 2001].

Трансформацию компетентных клеток плазмидной ДНК проводили методом теплового шока. Плазмиды из рекомбинантных штаммов выделяли методом щелочного лизиса. Содержание плазмидной ДНК в рекомбинантных штаммах оценивалось с помощью электрофореза в агарозном геле. Содержание эндонуклеаз в рекомбинантных штаммах определялось с помощью электрофореза в полиакрила-

мидном геле [Sambrook et al., 1989]. Оптическую плотность суспензии клеток измеряли на ФЭК при длине волны 590 нм. Клетки разрушали на УЗДИ (5 повторно-стей по 15 с с интервалом 10 с). Концентрацию плазмидной ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop-1000.

Клонирование гена bla из плазмиды pBluescriptSK+ в плазмиду рЕТсосоСт проводилось по сайту BstZ171 с помощью ПЦР с использованием праймеров, имеющих на концах сайты рестрикции BstZ171. ПЦР-реакцию проводили на приборе «Тэрцик» (ТР4 - ПЦР01) фирмы «ДНК-технология» согласно протоколу фирмы Promega. Фрагменты гена bla очищались с помощью набора Promega Wizard8 SV Gel and PCR Clean-Up System, анализировались методом электрофореза в 1% TBE-буфере и затем выделялись из реакционной смеси методом препаративного электрофореза. Рестрикция плазмиды рЕТсосоСт проводилась по сайту BstZl 71 согласно протоколу фирмы «Fermentas». Лигирование гена bla с линейной формой рЕТсосоСт проводилось по сайтам BstZ171 с помощью набора «DNA Ligation Kit» согласно протоколу фирмы Sigma. Скрининг плазмиды рЕТсосоАтрСт на наличие гена bla проводился с помощью ПЦР среди устойчивых к ампициллину клонов E.coli DH5a рЕТсосоАтрСт.

Индукцию экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA в рекомбинантных штаммах E.coli TGE900 проводили посредством 4-часового культивирования при 37°С клеток, достигших А590 = 0,5 при температуре выращивания 30°С [Friedhoff et al., 1994а]. Концентрацию жизнеспособных клеток в 1 мл культуры вычисляли по числу выросших на чашках колоний [Белов, 1985]. Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков проводилось на градиентных средах по стандартной методике [Barth et al., 1978]. Определение количества ß-лактамазы в рекомбинантных штаммах проводилось методом йодометрического титрования [Perret, 1954]. Элиминацию плазмид из рекомбинантных штаммов осуществляли при отсутствии ампициллина в среде [Mike-sell et al., 1983]. Частоту элиминации рассчитывали по числу колоний, утративших способность расти на средах с ампициллином.

Статистический анализ данных проводился с использованием стандартных математических методов в программах «.Statgraphics Plus» и «Microsoft Excel».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Экспрессия генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз в ре-комбинантных штаммах E.colL Для получения рекомбинантных штаммов, содержащих гены исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA, проводилась трансформация чувствительных к ампициллину штаммов E.coli LK11IX и E.coli TGE900 плазмидами pHisNucSma и pHisNucA. После трансформации наличие плазмид в рекомбинантных штаммах E.coli LK11IX и E.coli TGE900 было подтверждено с помощью электрофореза плазмидной ДНК, выделенной из приобретших устойчивость к ампициллину клонов.

В дальнейших экспериментах было доказано, что синтез эндонуклеаз NucSma и NucA в рекомбинантных штаммах E.coli TGE900 значительно увеличивается после 4 часов культивирования при 37°С клеток, достигших экспоненциальной фазы роста (рис. 1). В свою очередь, синтез нуклеаз рекомбинантными штаммами E.coli LK111Х не индуцировался посредством температуры, так как исходная форма С7-репрессора в данных штаммах, в отличие от мутанта C1S57 в клетках E.coli TGE900, не является температурочувствительной.

kDa

б! г.:? U; г 4 U • • г; ! : г* • Li ' ~ г

" %"""% ж Ъ % ' * F 'I *

43 « i— Ы ~ „ *»4 ~

я*»« «MtiMMi *Ва«м» Ыщ^ ***** «tesSMfe

30 ттт ,,„ _______,

___ _ _ _ | — I -г -3 9 10 ......~Т 12 Тз U ш

Рис. 1. Электрофоррограмма белков, выделенных из рекомбинантных штаммов E.coli TGE900: четные полосы - без индукции; нечетные полосы - после индукции (показано по 1 результату для каждого рекомбинантного штамма). 1 - маркерные белки фирмы "Merck IV"; 2,2- NucSma His89Ala; 4, 5 - NucSma Arg57Ala; 6, 7 - NucSma wt; 8, 9 - NucA Hisl24Ala; 10,11 -NucA Trpl59Ala; 12,13 -NucA Argl22Ala; 14, IS-NucA wt.

Для доказательства наличия базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA в гетерологичных клетках E.coli методом индикаторных сред определяли нуклеазную активность рекомбинантных штаммов E.coli LK111X и E.coli TGE900, не подвергшихся температурной индук-

ции. Одинаковое количество культур клеток рекомбинантных штаммов E.coli LK11IX и E.coli TGE900, предварительно разрушенных ультразвуком, точечно наносили на индикаторный агар и оставляли на сутки. Контролем в эксперименте служили бесплазмидные штаммы E.coli LK111X и E.coli TGE900, не проявляющие на индикаторном агаре нуклеазной активности. В результате эксперимента было установлено, что чем выше активность мутантной нуклеазы, тем большая зона с измененной окраской образуется на индикаторной среде в месте нанесения пробы. Поскольку зоны обесцвечивания наибольшего размера на индикаторной среде образовывали исходные формы эндонуклеаз NucSma и NucA, то активности этих нук-леаз принимали за 100% (рис. 2).

■ бесплазмидный (контроль) □ His89Ala (нукл. акт. 0%) а Агд57А!а (нукл. акт. 35%) El уЛ(нукл. акт. 100%)

■ бесплазмидный (контроль) □ His89Ala (нукл. акт. 0%) И Arg57Ala (нукл. акт. 35%) И wt(Hyiui. акт. 100%)

г 16 ¡14

S1Z

ш Ю

ю 8 о

2 б х

1 *

1 2 Я

5 о

/ я

/ 1

/ ~ 1

/ ASk

/f ij

■ бесплазмидный (контроль) Q His124Ala(Hyim. акт. 0%) Н Тгр159А1а(нукл. акт. 1%) □ Arg122A!a (нукл. акт. 10%) В wt(Hymi. акт. 100%)

£ 30 ш

I 25

Ф D

0 20 о>

£ 15 л

8 10 а

1 5

га х

1 О

/ Ж

■ бесплазмидный (контроль) О His124Ala (нукл. акт. 0%) ® Тгр159А1а (нукл. акт. 1%) □ Агд122А1а(нукл. акт. 10%) В wtfHyiui. акт. 100%)

Рис. 2. Размеры зон обесцвечивания, образуемые на индикаторной среде исходными и мутантными вариантами эндонуклеаз при базальном уровне экспрессии их генов: а) NucSma в Е. coli LK11IX; б) NucSma в Е. coli TGE900; в) NucA в Е. coli LK11IX; г) NucA в Е. coli TGE900.

Таким образом, основываясь на полученных результатах, можно заключить, что в гетерологичных клетках E.coli гены исходных и мутантных вариантов эндо-нуклеаз NucSma и NucA экспрессируются на базальном уровне.

2. Влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз на выживаемость клеток-хозяев. Как известно, введение клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку может оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на свойства клетки-хозяина и самого вектора. С одной стороны, векторная ДНК сообщает клетке новые свойства, дающие ей селективные преимущества, но, с другой стороны, сверхсинтез продукта чужеродного гена оказывает негативное влияние на скорость роста и деление микробной клетки вследствие увеличения метаболической нагрузки из-за синтеза нового продукта [Goldwin et al., 1979; Su et al., 1990]. Поэтому необходимо было изучить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на выживаемость рекомбинантных штаммов E.coli LK111X и E.coli TGE900. Выживаемость рассчитывалась как количество жизнеспособных клеток (способных образовывать колонии) в 1 мл культуры рекомби-нантного штамма относительно количества жизнеспособных клеток соответствующего бесплазмидного штамма (контроль, выживаемость которого принималась за 100%).

В результате проведенных экспериментов было установлено, что при базальном уровне экспрессии гена исходной формы эндонуклеазы NucSma и гена мутант-ного варианта эндонуклеазы NucSma с 35% нуклеазной активностью (мутация Arg57Ala) количество жизнеспособных клеток в культурах рекомбинантных штаммов E.coli LK111X и E.coli TGE900 увеличивается относительно соответствующих бесплазмидных штаммов, т.е. экспрессия данных генов на базальном уровне оказывает положительный эффект на выживаемость рекомбинантных штаммов (рис. 3). Было показано, что базальный уровень экспрессии генов мутантных эндонуклеаз NucA с 1% и 10% нуклеазной активностью (Тгр159А1а и Argl22Ala) также оказывает положительный эффект на выживаемость рекомбинантных штаммов, увеличивая количество жизнеспособных клеток в культуре относительно контроля. В отличие от описанных выше мутантных вариантов NucA, базальный уровень экспрессии гена эндонуклеазы NucA дикого типа отрицательно сказывается на

время, часы

1 - бесплазмидный (контроль); 2 - HisSöAla (нукл. акт. О%); 3 - Arg 5 7AI а < нукл. акт. 35%); 4 - wt (нукл. акт. 100%)

время, часы

1 - бесплазмидный (контроль); 2 - His89Ala (нукл. акт. 0%); 3 - Arg57Ala (нукл. акт. 35%); 4 - wt (нукл. акт. 100%)

1 • бесплазмидный (контроль); 2 - Hi»124Ala (нукл. акт. 0%); 3 -Тгр159А1в (нукл. икт. 1%); 4 - Arg122Aia (нукл. акт. Ю%); 5 - wt ( нукл. акт. 100%)

8 Ю 12 14 16 18 20 22

время, часы 1 - бесплазмидный (контроль); 2 - His124Ala (нукл. акт. 0%); 3 - Trp159AJa (нукл. акт. 1%); 4 - Arg122Ala (нукл. акт. 10%); 5 - wt (нукл, акт. 100%)

Рис. 3. Изменение количества жизнеспособных клеток при базальном уровне экспрессии генов эндонуклеаз: а) NucSma в Е. coli LK11IX; б) NucSma в К coli TGE900; в) NucA в Е. coli LKI Ш; г) NucA в Е. coli TGE900.

выживаемости рекомбинантных штаммов Е.соИ LK.HH и Е.соН ТСЕ900, что выражается в снижении количества жизнеспособных клеток в культуре относительно контроля на протяжении всего времени культивирования. Подобный эффект, скорее всего, объясняется высокой токсичностью исходной формы эндонуклеазы МисЛ для синтезирующих ее бактерий [М^бб е! а1., 1998]. В свою очередь, наблюдаемое снижение количества жизнеспособных клеток в культурах рекомбинантных штаммов Е.соИ LK1Ш и Е.соИ ЮЕ900 относительно контроля при базальном уровне экспрессии генов мутантных вариантов эндонуклеаз ЫисБта и КисЛ, не обладающих нуклеазной активностью (мутации Ш$89А1а и Ш$124А1а соответственно), может объясняться негативным последствием дополнительной метаболической нагрузки, оказываемой на клетку при синтезе чужеродного белка [Оо1сЫп е1 а1., 1979; Би е1 а1., 1990]

Таким образом, исходя из полученных результатов экспериментов, можно сделать предположение, что наблюдаемое увеличение количества жизнеспособных клеток в культурах рекомбинантных штаммов Е.соН ЬК11IX и Е.соИ ТСЕ900 при базальном уровне экспрессии генов исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы ЫисБта и мутантных вариантов эндонуклеазы ШсА может свидетельствовать о том, что данные нуклеазы стимулируют деление клеток рекомбинантных штаммов, что, скорее всего, связано с возможным участием эндонуклеаз ЫисБта и ЫисА в репликации ДНК в бактериальной клетке.

3. Определение количества генов Ыа в рекомбинантных штаммах. Поскольку все используемые в работе плазмиды в качестве селектирующего маркера содержат ген (3-лактамазы, то необходимо было определить, различаются ли уровни устойчивости к ампициллину у рекомбинантных штаммов Е.соН LK111X и Е.соИ ТСЕ900 в зависимости от того, какой ген - исходного или мутантных вариантов эндонуклеаз КисЗта или ЫисА - экспрессируется в данных клетках на базальном уровне. Результаты экспериментов показали, что с увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз ИисБта при базальном уровне экспрессии их генов происходит увеличение уровня устойчивости к ампициллину рекомбинат-ных штаммов Е.соН 1К1Ш и Е.соН ТСЕ900. Увеличение активности мутантных вариантов эндонуклеазы ИисА при базальном уровне экспрессии их генов, в свою очередь, также приводит к увеличению уровня устойчивости к ампициллину, но

лишь для рекомбинатных штаммов E.coli LKl 1IX. Тогда как для рекомбинантных штаммов E.coli LKl111 при базальтом уровне экспрессии гена исходной формы эндонуклеазы NucA и E.coli TGE900 при базальном уровне экспрессии генов исходной формы эндонуклеазы NucA и ее мутантных вариантов, обладающих нук-леазной активностью, наоборот, было показано снижение уровня устойчивости к ампициллину по сравнению с соответствующими рекомбинантными штаммами при базальном уровне экспрессии гена мутантного варианта эндонуклеазы NucA с нулевой активностью. Данный эффект, вероятно, объясняется высокой токсичностью эндонуклеазы NucA для клеток-хозяев [Meiss et al., 1998].

Так как в ряде работ было показано, что существует прямая зависимость между дозой (количеством копий) гена Ыа, обуславливающего устойчивость к ампициллину, и количеством синтезируемого фермента Р-лактамазы [Uhlin et al., 1977; Бергквист с соав., 1989], а уровень устойчивости клетки к ампициллину зависит от числа копий плазмид, содержащих ген Ыа [Ely et al., 1981], то обнаруженные различия в уровнях устойчивости к ампициллину у рекомбинантных штаммов E.coli LKl ИХ и E.coli TGE900 при базальном уровне экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma или NucA могут служить косвенным доказательством изменения количества кодирующих эту устойчивость генов Ыа.

Вследствие вышесказанного, для определения количества синтезируемой рекомбинантными штаммами E.coli LKl ИХ и E.coli TGE900 Р-лактамазы, а значит, и косвенного определения количества копий генов Ыа, необходимо было получить референс-плазмиду, число копий которой можно было бы контролировать. Введение гена Ыа в плазмиду рЕТсосоСт позволило решить данную задачу, поскольку количество копий этого вектора можно точно контролировать за счет добавления в среду глюкозы или арабинозы [Friehs, 2004]. Так, при наличии в питательной среде глюкозы репликация плазмиды, которая содержится в клетке в количестве одной копии, инициируется с конститутивной oriS, в то же время репликация с факультативной oriV блокируется репрессором АгаС. Добавление в среду арабинозы инак-тивирует белок-репрессор АгаС, в результате чего открывается репликации с oriVvi количество копий вектора увеличивается до 35-40 на клетку за счет экспрессии гена-репликатора trfA [Novy et al., 2002].

Для получения рекомбинантного штамма Е. coli, содержащего референс-плазмиду, вначале из плазмиды pBluescriptSK+ был получен ген Ыа, который затем был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием 5'- и З'-праймеров, имеющих на концах сайты рестрикции BstZ171. Далее полученную плазмиду рЕТсосоЛтрСт вводили методом трансформации в клетки Е. coli DH5a, после чего устойчивые к ампициллину клоны проверяли на наличие гена Ыа с помощью ПЦР и последующего электрофореза.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что при наличии в среде 0,01% L-арабинозы количество синтезируемой ß-лактамазы и уровень устойчивости к ампициллину у рекомбинантного штамма Е. coli DH5a рЕТсосоАтрСт выше в среднем в 37 раз (соответствует 37 плазмидным копиям), чем при выращивании данного штамма на среде с 0,2% D-глюкозой, когда в клетке содержится одна копия плазмиды. Для подтверждения полученных результатов методом электрофореза и с помощью спектрофотометра NanoDrop определяли количество плазмидной ДНК в клетках данного рекомбинантного штамма. При последующем расчете количества плазмид в рекомбинантных штаммах E.coli LK11IX и E.coli TGE900 за одну копию гена Ыа, а, следовательно, и одну плазмидную копию, принималось то значение количества ß-лактамазы, которое было определено для рекомбинантного штамма Е. coli DH5a рЕТсосоАтрСт при выращивании на среде с глюкозой. Дополнительным контролем в эксперименте служили бесплаз-мидные штаммы E.coli LK11IX и E.coli TGE900, чувствительные к ампициллину и не синтезирующие ß-лактамазу.

Впоследствии для рекомбинантных штаммов E.coli LK111X и E.coli TGE900 было установлено увеличение количества синтезируемой клетками ß-лактамазы и соответственное увеличение уровня устойчивости к ампициллину при повышении нуклеазной активности исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucSma при базальном уровне экспрессии их генов.

Для рекомбинантных штаммов E.coli LK11IX также было установлено увеличение количества синтезируемой ß-лактамазы и уровня устойчивости к ампициллину с повышением нуклеазной активности мутантных вариантов эндонуклеазы NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Однако, у рекомбинантного штамма E.coli LK11IX при базальном уровне экспрессии гена исходной формы

200

'1160

¡160

3 140

f 120

§100

о 80 ш

0 60 а;

1 40 § 20

+ глюкоза E.coli DHSa рЕТссссАтсСт

нет (контроль)

His69A!a

(0%)

Агд57А1а (35%)

I V [

у ■■1-7'

т •

поза

25000 с

20000 i

10000°

wt ¡100%)

Активность исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucSma. %

" нет (контроль) HisS9Ala

EcoliDHie 1 '

pETcocaAiKpCm

Активность исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucSma, %

140-

'I 120

S юо

1 80

| 60

g 40

1 20 О

Ж И

+ глюкоза нет His124Ala Тгр159А1а Arg 122AI а E.coii DH5a (КОНТРОЛЬ) ,0o/<J) (1%) (10%)

рЕ TcoccAmpCm

(100%)

Активность исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucA, %

нет (контроль) His124Ala Trp159Ala Arg122Ala wt E.со!: PH Sa (0%) (1%) (10%) (100%)

сЕТссссА/прС.'П

Активность исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucA. %

Рис. 4. Зависимость устойчивости рекомбинантных штаммов к ампициллину от количества плазмидных копий: а) pHisNucSma в Е. coli LK11IX; б) pHisNucSma в Е. coli TGE900; в) pHisNucA в Е. coli LK11IX; г) pHisNucA в Е. coli TGE900.

эндонуклеазы NucA наблюдалось резкое снижение количества синтезируемой ß-лактамазы и уровня устойчивости к ампициллину относительно всех рекомбинант-ных штаммов E.coli LK111X, экспрессирующих на базальном уровне гены мутант-ных вариантов эндонуклеазы NucA. В то же время, для рекомбинантных штаммов E.coli TGE900 было установлено снижение количества синтезируемой ß-лактамазы и уровня устойчивости к ампициллину с увеличением активности исходного и му-тантных вариантов эндонуклеазы NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Подобный эффект, скорее всего, также является следствием высокой токсичности для микробной клетки ферментативно активных форм эндонуклеазы NucA [Meiss et al„ 1998].

Поскольку количество синтезируемой клеткой ß-лактамазы и, соответственно, уровень ее устойчивости к ампициллину зависит от количества генов Ыа, которые в рекомбинантных штаммах E.coli LK1UX и E.coli TGE900 находятся в плазмидах в количестве одного гена на плазмиду (подтверждается результатами электрофореза), то увеличение количества генов Ыа в клетках может происходить только за счет увеличения количества плазмидных копий (рис. 4). Так как увеличение количества плазмид в исследуемых штаммах происходит с повышением нуклеазной активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов, то данная зависимость, скорее всего, связана с возможным участием эндонуклеаз NucSma и NucA в увеличении количества плазмидной ДНК. Поскольку известно, что oriC E.coli, которая также является точкой ori для плазмид данного микроорганизма, имеет в левой части богатый Л Татарами повтор в 13 п.н., а эндонуклеазы NucSma и NucA предпочтительнее расщепляют А-форму ДНК [Meiss et al., 1995], которая характерна для AT-богатых последовательностей, то проявление эндонуклеазами NucSma и NucA активности в этом участке oriC могло привести к инициации цикла репликации ДНК. Таким образом, экспрессируясь в гетерологичной клетке Е. coli на базальном уровне, эндонуклеазы NucSma и NucA могли сменить свою биологическую функцию и вместо выполнения трофической функции [Franke et al., 1999] стали принимать участие в репликации. Возможность изменения биологической функции нуклеазы в гетерологичной системе клетки уже была отмечена в некоторых работах [Куприянова-Ашина, 1991; Xiao et al., 2007; Balasundaram et al., 2009].

4. Определение стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах. Как говорилось ранее, введение клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку оказывает негативное влияние на ее физиологические и метаболические процессы, из-за чего излишний генетический материал в процессе деления клетки неминуемо утрачивается [Gold-win et al, 1979]. Поэтому необходимо было определить, насколько стабильно наследуются плазмиды pHisNucSma и pHisNucA в ряду клеточных поколений в отсутствие селективных условий (так называемая спонтанная элиминация). Так как процесс элиминации затрагивает распределение плазмид из родительской клетки в дочерние, то чем больше плазмидных копий содержится в клетке, тем медленнее они будут элиминировать, т.е. стабильнее наследоваться [Миллер, 1976].

, юо -

активность эндонуклеазы NucSma, %

■ His89Ala (0%) BArg57Ala (35%) BWt (100%)

100 п 90 80 70 60 50 40 30 20 10

активность эндонуклеазы NucSma, % »His89Ala (0%) aArgS7Ala (35%) в wi (100%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

активность эндонуклеазы NuoA, %

a His124Ala (0%) ■ Trp159Ala (1%) пАгд122А1а (10%) в wt (100%)

100

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

активность эндонуклеазы NucA, %

sHis124A!a (0%) а Тгр159А1а (1 %) aArg122Ata (10%) и wt (100%)

Рис. 5. Частота элиминации плазмид из клеток рекомбинантных штаммов: а) pHisNucSma из Е. coli LK111X; б) pHisNucSma из Е. coli TGE900; в) pHisNucA из Е. coli LK1111; г) pHisNucA из Е. coli TGE900.

Изучение спонтанной элиминации плазмид pHisNucSma и pHisNucA показало увеличение стабильности их наследования в клетках Е. coli LK1HX и Е. coli TGE900 с повышением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов (рис. 5). Низкая стабильность наследования плазмид с геном исходной формы эндонуклеазы NucA, вероятнее всего, также связана с высоким токсическим эффектом, который данная нуклеаза оказывает на клетку-хозяина [Meiss et al., 1998]. Отсутствие плазмидной ДНК в клетках, утративших устойчивость к ампициллину в процессе элиминации, было доказано с помощью электрофореза. Утрата устойчивости клеток к ампициллину подтверждает отсутствие транспозиции гена Ыа из плазмиды в хромосому, а выявленное посредством электрофореза отсутствие изменений в размерах плазмид при выращивании рекомбинантных штаммов в селективных условиях доказывает отсутствие амплификации гена Ыа внутри этих плазмид.

Таким образом, обнаруженное в ходе выполнения работы увеличение стабильности наследования плазмид в рекомбинантных штаммах E.coli LK111X и E.coli TGE900 с повышением нуклеазной активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеазы NucSma и мутантных вариантов эндонуклеазы NucA при базальном уровне экспрессии их генов согласуется с ранее выдвинутым предположением о возможном участии данных эндонуклеаз в увеличении количества плазмид-ных копий в клетке, а, следовательно, и в репликации ДНК.

5. Определение устойчивости рекомбинантных штаммов к антибиотикам - ингибиторам репликации ДНК. Поскольку ранее было выдвинуто предположение о возможном участии эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации ДНК в гетерологичных клетках Е. coli, то необходимо было изучить влияние ингибиторов репликации ДНК на рекомбинантные штаммы Е. coli LK111X и Е. coli TGE900. В качестве ингибиторов ферментов, участвующих в репликации, использовали нали-диксовую кислоту и новобиоцин. Контролем служили бесплазмидные штаммы Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900, не синтезирующие эндонуклеазы NucSma и NucA.

Как известно, налидиксовая кислота ингибирует Л-субъединицу ДНК-гиразы, ответственную за связывание фермента с ДНК и образование разрывов (так называемых «ников»), в результате чего блокируется продвижение репликационно вилки [Hiasa et al., 1996; Fong et al., 2008]. Связывание налидиксовой кислоты с ДНК

30 25 20

Ш JJ-

E.coli LK111\ pHisNucSma E.coli TGE900 pHisNucSma В бесплазмидный (контроль) ■ His89Ala (нукл. акт. 0%) □ ArgS7Ala (нукл. акт. 35%) 0 wt (нукл. акт. 100%)

I ^

Е. coli LK111X pHisNucA

В бесплазмидный (контроль) Ш1 Тгр159А1а (нукл. акт.1%) □ wt (нукл. акт. 100%)

E.coli TGE900 pHisNucA

®His124A/a (нукл. акт. 0%) ■ Arg122Ala (нукл. акт. 10%)

Рис. 6. Устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте при базальном уровне экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз: а) NucSma; б) NucA.

coli LK111K pHisNucSma Е. coli TGE900 pHisNucSma

0 бесплазмидный (контроль) №Arg57Ala (нукл. акт. 35%)

mHis89Ala (нукл. акт. 0%) Eavvf (нукл. акт. 100%)

E.coli LK111Х pHisNucA

ЕЗ бесплазмидный (контроль) ЕШТгр159А1а (нукл. акт. 1%) □ wt (нукл. акт. 100%)

E.coli TGEQOO pHisNucA

№His124Ala (нукл. акт. 0%) ЯАгд122А1а (нукл. акт. 10%)

Рис. 7. Устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к новобиоцину при базальном уровне экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз: а) NucSma; б) NucA.

приводит к формированию тройного комплекса «налидиксовая кислота-топоизомераза-ДНК» [Hiasa et al., 1996], что происходит до появления разрыва в ДНК [Hooper, 1999]. В результате проведенных экспериментов было установлено, что чем выше нуклеазная активность исходных и мутантных вариантов эндонуклаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов, тем выше устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK1J1). и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте (рис. 6). Известно, что при прикреплении фермента, в частности топоизомеразы, к ДНК ее локальная конформация соответствует Л-форме ДНК [Lipps et al., 1983], которую предпочтительнее распознают эндонуклеазы NucSma и NucA [Meiss et al., 1995]. Вероятно, при ингибировании топоизомеразной активности ДНК-гиразы эндонуклеазы NucSma и NucA инициируют в области ori образование «ников» неподалеку от тройного комплекса, что ведет к его удалению и восстановлению репликации.

Новобиоцин, как известно, ингибирует АТФ-зависимую ß-субъединицу ДНК-гиразы, которая участвует в восстановлении конформации фермента [Geliert et al., 1976]. При экспрессии рекомбинантными штаммами Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на базальном уровне статистически значимых различий в устойчивости клеток-хозяев к новобиоцину не было выявлено (рис. 7), поскольку участие нуклеаз в восстановлении исходной конформации фермента невозможно.

Таким образом, представленные в данной работе результаты дают возможность предположить, что эндонуклеазы NucSma и NucA могут принимать участие в репликации ДНК в рекомбинантных штаммах Е. coli.

ВЫВОДЫ:

1. Рекомбинантные штаммы Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 обладают способностью к экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на базальном уровне.

2. Получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт со строгим контролем количества копий, которая может использоваться для определения количества копий плаз-мид, содержащих ген bla.

3. Установлена зависимость между количеством плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LKI 1IX и Е. coli TGE900, количеством синтезируемой Р-лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов.

4. Показано, что базальный уровень экспрессии генов эндонуклеаз NucSma и NucA (за исключением токсичной эндонуклеазы NucA дикого типа) оказывает положительное воздействие на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LKI1IX и Е. coli TGE900.

5. Установлена обратная зависимость между активностью исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucSma при базальном уровне экспрессии их генов и стабильностью наследования плазмид pHisNucSma. Среди плазмид pHisNucA наиболее стабильно наследуются плазмиды, содержащие гены мутантных вариантов эндонуклеазы NucA с 1% и 10% нуклеазными активностями.

6. Установлена зависимость между уровнем устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LKI 1IX и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Статистически значимых отличий в уровне устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LKI 1IX и Е. coli TGE900 к новобиоци-ну в зависимости от активности эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов не было выявлено.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гимадутдинов, О.А. Влияние базального уровня экспрессии эндонуклеазы Ser-ratia marcescens на стабильность и копийность плазмид pHisNucSma в рекомбинантных штаммах Escherichia coli / О.А. Гимадутдинов, Е.В. Крякунова, Р.Г. Хамидуллина, Б.И. Барабанщиков // Ученые записки Казанского государственного университета. - 2008. - Т. 150.-кн. 1.-С. 106-119.

2. Крякунова, Е.В. Референс-плазмида для определения копийности плазмид, содержащих Ыа-ген / Е.В. Крякунова, Р.Г. Хамидуллина, Б.И. Барабанщиков, О.А. Гимадутдинов // Ученые записки Казанского государственного университета.-2010.-Т. 152.-кн. 1. -С. 127-135.

3. Крякунова, E.B. Поведение плазмид pHisNucSma в рекомбинантных штаммах Escherichia coli / E.B. Крякунова, Р.Г. Хамидуллина, Б.И. Барабанщиков, O.A. Гимадутдинов II Альманах современной науки и образования. - 2008. - № 5. -С. 76-78.

4. Gimadutdinow, О. Effects of basal level Serratia marcescens endonuclease on the stability and pHisNucSma plasmid copy number in Escherichia coli recombinant strains / O. Gimadutdinow, R. Gudino, E. Kryakounova, M. Malisheni, R. Khami-dullina II American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sei. - 2009. - Vol. 6. - P. 294297.

5. Крякунова, E.B. Стабильность плазмид pHisNucSma в рекомбинантных штаммах Escherichia coli / E.B. Крякунова // XII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине». - Казань: изд-во КГМУ, 2007 -С. 106.

6. Крякунова, Е.В. Участие эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. в репликации плазмидной ДНК / Е.В. Крякунова, P.M. Гудино-Каррило, М. Мали-шени, E.H. Макулова, Р.Г. Хамидуллина, O.A. Гимадутдинов // II Международная научно-практическая конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». - Казань, изд-во КГУ, 2008 - С. 216-217.

7. Malisheni, М. Dose variation of bla gene in relation to the activity of S. marcescens endonuclease / M. Malisheni, E.V. Kryakounova, R. Gudino, E.N. Makulova, R.G. Khamidullina // I Interuniversity Conference on Modern Biology «Building the Future in Biology «Bio-News»». - Казань, изд-во КГУ, 2008. - С. 52-53.

8. Kryakounova, E.V. Variation of pHisNucSma plasmid copy number under the influence of Serratia marcescens endonuclease / E.V. Kryakounova, R. Gudino, E.N. Makulova, M. Malisheni, O.A. Gimadutdinow, R.G. Khamidullina // II Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009». - Пермь, изд-во ПГУ, 2009 - С. 160-161.

9. Крякунова, Е.В. Изменение копийности плазмид pHisNucSma в зависимости от активности эндонуклеазы Serratia marcescesns / Е.В. Крякунова, Р.Г. Хамидуллина, O.A. Гимадутдинов // V съезд вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва, изд-во МГУ, 2009. - Часть 1. - С. 31.

10. Крякунова, E.B. Конструирование референс-плазмиды для определения копий-ности плазмид, содержащих Ыа-ген / Е.В. Крякунова // Научно-практическая конференция «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета». - Казань, изд-во КГУ, 2009. - С. 68-70.

11. Kryakounova, E.V. Functional comparison of mitochondrial endonuclease EndoG and prokaryotic Serratia marcescens and Anabaena sp. endonucleases / E.V. Kryakounova, R.G. Khamidullina, O.A. Gimadutdinow // 2-ая Московская международная конференция «Молекулярная филогенетика MolPhy-2». - Москва, изд-во Университета им. М.В. Ломоносова, 2010. - С. 153.

12. Крякунова, Е.В. Поведение эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp. в гетеро-логичных системах E.coli / Е.В. Крякунова, Р.Г. Хамидуллина, O.A. Гимадут-динов // VI Международная научно-практическая конференция «Наука в ¡нформащйному npocTopi». - Днепропетровск, изд-во Видавець Бша К.О., 2010. -Т. 1.-С. 13-16.

Бумага офсетная. Печать - ризография. Тираж 80 экз., 28 стр. Заказ №22

"Первый печатный двор" 420111, г.Казань, Ул.Униаерситетская, 11/46

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крякунова, Елена Вячеславовна

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12 1.1.Нуклеазы

1.1.1. Нуклеаза Serratia marees cens

1.1.2. Нуклеаза Anabaena sp. 19 , 1.2. Ферменты, участвующие в структурной организации ДНК топоизомеразы)

• 1.2.1. ДНК-гираза

1.3. Клонирование генов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.2. Получение компетентных клеток

2.3. Трансформация компетентных клеток методом теплового шока

2.4. Выделение плазмидной ДНК

2.5. Электрофорез в агарозном геле

2.6. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и Nue А

2.7. Жб'-электрофорез в полиакриламидном геле

2.8. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA с помощью индикаторного агара

2.9. Определение динамики роста рекомбинантных штаммов

E.coli LK111A и E.coli TGE

2.10. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт Al

2.11. Реакция рестрикции

2.12. ДНК-лигазная реакция

2.13. Амплификация фрагментов гена bla с помощью ПНР

2.14. Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика '

2.15. Определение количества ß-лактамазы

2.16. Определение частоты спонтанной элиминации плазмид

2.17. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение рекомбинантных штаммов Е. coli LK111À и Е. coli TGE

3.2. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp.

3.3. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S.marcescens и Anabaena sp. с помощью индикаторного агара

3.4. Влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на выживаемость рекомбинантных штаммов

Е. coli LK11IX и Е. coli TGE

3.5. Определение уровня устойчивости к ампициллину для рекомбинантных штаммов Е. coli LK111Ä и Е. coli TGE

3.6. Получение референс-плазмидырЕТсосоАтрСт

3.6.1. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт на основе плазмиды рЕТсосоСт

3.6.2. Определение дозы гена Ыа в рекомбинантном штамме

Е. coli DH5a рЕТсосоАтрСт

ЪП. Определение количества генов Ыа в рекомбинантных штаммах

E.coli LK111Á и E.coli TGE

3.8. Определение стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах

Е. coli LK1 ИХ и Е. coli TGE

3.9. Определение устойчивости рекомбинантных штаммов E.coli LK11IX и Е. coli TGE900 к антибиотикам — ингибиторам репликации ДНК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli"

Актуальность проблемы. В настоящее время методы генетической инженерии применяются для решения широкого круга задач в области микробиологии, биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии [Глик и др., 2002]. Одной из таких задач является создание на основе технологии реком-бинантной ДНК штаммов, обладающих способностью синтезировать в большом количестве необходимый белок. Такой сверхсинтез может осуществляться как в результате повышения количества копий гена в клетке, так и в результате повышения интенсивности его транскрипции [Щелкунов, 2004].

Введение клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку может оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на ее физиологические процессы. С одной стороны, векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества. С другой стороны, сверхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт могут оказывать негативное влияние на скорость роста и деления клеток [Su et al., 1990]. Поэтому необходимо контролировать процесс транскрипции для того, чтобы клонированный ген экспрессировался только на определенной стадии жизненного цикла клетки-хозяина и в определенный промежуток времени [Herman-Antosiewicz et al., 2001].

Для регуляции транскрипции клонированных генов часто применяют сильные промоторы, такие, как триптофановый [Стручкова И.В. и др., 2010], лактозный [Kalodimos et al., 2002], промоторы бактериофагов X [Valdez-Gruz et al., 2010], T7 [Du et al., 2009] для грамотрицательных, промоторы SPAC [Chen X. et al., 2009] и degQ [Nishito et al., 2010] для грамположительных микроорганизмов. Контроль за работой таких промоторов осуществляется с помощью специфических белков-репрессоров [Palomares et al., 2004], которые в случае trp- и /яс-оперонов действуют в операторном участке. Однако большинство используемых в настоящее время промоторов, транскрипция которых контролируется с помощью репрессора, допускают слабую экспрессию клонированного гена даже в присутствии репрессора в клетке, в результате чего происходит синтез репрессируемого белка в небольших количествах — так называемый базальный уровень экспрессии гена [Herman-Antosiewicz et al.,,2001; Bahar et al., 2011].

В последние годы эндонуклеазы Serratia marcescens {NucSma) и Anabaena sp. (NucA) находят широкое применение в биохимии, молекулярной биологии, медицине и сельском хозяйстве [Аликин и др., 1998]. Эти ферменты принадлежат к одному семейству родственных эндонуклеаз, активные сайты которых имеют одинаковую высококонсервативную аминокислотную последовательность, так называемый DRGH-мотив [Pingoud et al., 1999; Ghosh et al., 2007]. Для некоторых представителей семейства родственных нуклеаз показано участие в процессах, включающих размножение прай-меров для репликации митохондриальной ДНК в случае бычьей нуклеазы EndoG [Ruiz-Carillo et al., 1993], репарации и рекомбинации ДНК в случае Nucl [Dake et al., 1988; Rangarajan et al., 2001]. Для других представителей этого семейства и внеклеточных эндонуклеаз NucSma и NucA показана трофическая функция.

К настоящему времени гены эндонуклеаз NucSma и NucA проклонирова-ны в клетках Escherichia coli [Ball et al., 1987; Гимадутдинов и др., 1993; Meiss et al., 1998], но до сих пор не имеется достаточно данных о влиянии этих эндонуклеаз на клетки-хозяев и о влиянии клеток-реципиентов на свойства плазмид, содержащих эти гены. Ранее было показано, что экзогенные ДНКаза 1 и эндонуклеаза NucSma в малых дозах усиливают пролиферативные процессы в микробной клетке, а именно синтез ДНК, рост и деление клеток [Куприянова-Ашина, 1991], но до настоящего времени мало что известно о влиянии эндонуклеаз NucSma и NucA на гетерологичные клетки, в которых они экспрессируются на базальном уровне.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - определить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens (NucSma) и Anabaena sp. {NucA) на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli.

В соответствие с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить наличие базального уровня экспрессии генов исходных и му-тантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. в ре-комбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

2. Сконструировать референс-плазмиду с известным числом копий для косвенного определения количества содержащихся в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 генов Ыа по количеству синтезируемой клетками ß-лактамазы.

3. Установить зависимость между количеством генов Ыа в плазмидах, количеством синтезируемой ß-лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. при базальном уровне экспрессии их генов в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

4. Изучить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

5. Установить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на стабильность наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

6. Установить зависимость уровня устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к ингибиторам репликации ДНК от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. при базальном уровне экспрессии их генов.

Положения, выносимые на защиту:

4. С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов,в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 плазмиды pHisNucSma и pHisNucA наследуются более стабильно.

5. Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте.

Научная новизна. Впервые показано, что величина базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA зависит как от клетки-хозяина, так и от плазмиды. Установлено, что ба-зальный уровень экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA оказывает положительное воздействие на выживаемость бактерий. Получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт для косвенного определения количества генов Ыа по количеству синтезируемой бактериальной клеткой ß-лактамазы. Установлено, что в клетках рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 количество генов Ыа в плазмидах pHisNucSma и pHisNucA зависит от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Впервые показана возможность участия эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации плаз-мидной ДНК в рекомбинантных штаммах Е. coli.

Сконструированная в данной работе референс-плазмида может использо

• 1 ваться для косвенного определения количества генов Ыа в клетках микроорганизмов, а, следовательно, и количества копий плазмид, содержащих эти гены. Результаты исследования и примененные в работе методические приемы можно использовать при проведении практических и лекционных занятий по микробиологии и генетике микроорганизмов для студентов-биологов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007); II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); First Inteuniversity Conference on Modern Biology «Building the Future in Biology «Bio-News»» (Kazan, 2008); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); V съезде вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (Казань, 2009); 2-ой Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-2» (Москва, 2010); конференции «Наука в информационном пространстве» (Днепропетровск, 2010).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Нуклеазы

Нуклеазы представляют собой обширную группу ферментов, расщепляющих фосфодиэфирные связи в молекулах нуклеиновых кислот и обладающих определенной специфичностью к химической природе оснований, углеводному компоненту и вторичной структуре субстрата. Нуклеиновые кислоты являются крайне устойчивыми к гидролизу биополимерами и при оптимальных для большинства клеток температурах (30°-40°С) гидролизуются крайне медленно, тогда как нуклеазы позволяют ускорить эту реакцию на величину порядка 1016 [Кнорре и др., 2000].

Нуклеазы принимают участие в различных процессах, происходящих в клетке, например, репликации, рекомбинации, репарации и деградации нитей ДНК. Различают несколько типов нуклеаз в зависимости от их специфичности: экзонуклеазы и эндонуклеазы, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, рестриктазы и так далее. Нуклеазы, гидролизующие нуклеотиды на концах молекулы ДНК называются экзонуклеазами, тогда как эндонуклеазы разрезают ДНК внутри цепи [Березов и др., 1998]. Нуклеазы, одинаково хорошо гидролизующие как ДНК, так и РНК-субстраты, называют сахаронеспеци-фичными [Rangarajan et al., 2001]. Основными биологическими функциями, которые выполняют нуклеазы в живой клетке, являются [Bickle et al., 1993]:

1. гидролиз нуклеиновых кислот (трофическая функция);

2. удаление чужеродных нуклеиновых кислот (защитная функция);

3. регуляция синтеза и распада нуклеиновых кислот в клетках.

Часто ферменты представляют собой димеры, состоящие из одинаковых субъединиц, каждая из которых содержит один активный сайт [Franke et al., 1999]. Так и сахаронеспецифичная эндонуклеаза S. marcescens (NucSma) имеет два каталитических центра, которые за один каталитический цикл разрезают две нити ДНК [Filimonova et al., 1981; Friedhoff et al., 1994b; Miller et al., 1996; Chen С. et al., 2009], в то время как эндонуклеаза Anabaena sp. (NucA) является мономерным ферментом и единовременно может разрезать только одну нить ДНК [Meiss et al., 1998].

Эндонуклеазы NucSma и NucÄ относятся к одной группе родственных сахаронеспецифических нуклеаз, представители которой были обнаружены во многих прокариотических и эукариотических организмах, таких как Streptococcus pneumoniae, цианобактериях, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccha-romyces pombe, Syncephalostrum racemosum, Bos taurus, Trypanosoma brucei, Caenorhabditis elegans, Borrelia burgdorferi, Mus musculus и Homo sapiens [Franke et al., 1999; Ghosh et al., 2007; Chen C. et al., 2009]. Поскольку эндонуклеазы NucSma и NucÄ являются наиболее типичными представителями данного семейства, то именно они и стали объектами данного исследования по изучению влияния гетерологичных эндонуклеаз на свойства рекомби-нантных штаммов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Крякунова, Елена Вячеславовна

ВЫВОДЫ:

1. Рекомбинантные штаммы Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 обладают способностью к экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонук-леаз NucSma и NucA на базальном уровне.

2. Получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт со строгим контролем количества копий, которая может использоваться для определения количества копий плазмид, содержащих ген Ыа.

3. Установлена зависимость между количеством плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900, количеством синтезируемой ß-лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов.

6. Установлена зависимость между уровнем устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Статистически значимых отличий в уровне устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к новобиоцину в зависимости от активности эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов не было выявлено.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основным результатом данной работы является установление влияния базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli.

Посредством температурной индукции рекомбинантных штаммов Е. coli TGE900, содержащих температурочувствительный белок-репрессор С1$57? было установлено, что гетерологичные клетки E.coli подходят для экспрессии на базальном уровне находящихся в плазмидах генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA.

Как известно, большинство используемых в настоящее время генетических систем контролируемой транскрипции допускают слабую (базальную) экспрессию клонированного гена даже в присутствии белка-репрессора [Herman-Antosiewicz et al., 2001; Bahar et al., 2011]. Предположив существование экспрессии находящихся в плазмидах генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA даже в присутствии белка-репрессора, выполнение экспериментов было начато с определения базального уровня экспрессии генов данных нуклеаз в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900. Для этого сначала определяли нуклеазную активность не подвергшихся температурной индукции рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 с использованием метода индикаторных сред [Meiss et al., 2001]. Выбор этого метода основывался на его высокой чувствительности и относительной простоте выполнения. Проведенные эксперименты показали наличие нуклеазной активности в исследуемых штаммах, то есть результаты этих экспериментов указывают на экспрессию генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 даже в присутствии белка-репрессора из-за неполного ингибиро-вания белком-репрессором промоторов этих генов. Полученные результаты по определению нуклеазной активности рекомбинантных штаммов вполне согласуются с литературными данными [Franke et al., 1999; Friedhoff et al., 1994b; Friedhoff et al., 1996; Meiss et al., 1998].

Известно, что векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества, но сверхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт, могут оказывать негативное влияние на скорость роста и деление клеток [Goldwin et al., 1979]. Поэтому необходимо было изучить влияние плазмид pHisNucSma и pHisNucA, содержащих гены исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, на выживаемость рекомби-нантных штаммов E.coli LK11IX и E.coli TGE900. В результате проведенных экспериментов было установлено, что экспрессия клетками рекомбинантных штаммов E.coli LK11IX и E.coli TGE900 ферментативно активных вариантов NucSma и NucA (за исключением чрезвычайно токсичной NucA дикого типа) обладает положительным эффектом на выживаемость рекомбинантных штаммов. Таким образом, было сделано предположение, что данные нуклеа-зы стимулируют деление клеток рекомбинантных штаммов, что, скорее всего, связано с возможным участием эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации ДНК в бактериальной клетке.

Цикл экспериментов по выяснению характера взаимодействия плазмид, содержащих гены исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, и клеток штаммов-хозяев был начат с определения уровня устойчивости к ампициллину — агенту, селектирующему используемые в данной работе плазмиды. Для этого применяли метод градиентного агара, содержащего различные концентрации ампициллина [Barth et al., 1978]. Результаты экспериментов показали, что существуют различия в устойчивости к ампициллину в зависимости от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, гены которых экспрессируются в данных штаммах на базальном уровне. Учитывая имеющиеся в литературе данные о существовании прямой зависимости между дозой (количеством копий) гена Ыа, обуславливающего устойчивость к ампициллину, и количеством синтезируемого фермента ß-лактамазы [Uhlin et al., 1977; Бергквист с соав., 1989], было выдвинуто предположение, что выявленные различия в уровнях устойчивости к ампициллину у рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 могут служить косвенным доказательством изменения количества кодирующих эту устойчивость генов bla.

Для проверки этого предположения, используя метод йодометрического титрования [Perret, 1954], провели измерение количества синтезируемой ре-комбинантными штаммами Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 ß-лактамазы, по количеству которой косвенно судили о количестве содержащихся в клетках плазмид. В качестве референс-плазмиды с известным числом копий использовали сконструированную в данной работе плазмиду рЕТсосоАтрСт. Анализируя результаты данных исследований в сравнении с имеющимися данными о существовании прямой зависимости между количеством копий плазмид, содержащих ген bla, и уровнем устойчивости к ампициллину [Ely et al., 1981], можно заключить, что увеличение количества генов bla в клетках ре-комбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 происходит из-за увеличения количества плазмид, в которых находятся эти гены, и зависит от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Обсуждая возможные причины существования подобной зависимости между активностью нуклеаз и количеством плазмид-ных копий, мы склонны считать, что такое изменение количества копий гена bla, возможно, связано с участием NucSma и NucA в увеличении количества копий плазмид в ходе репликации в бактериальных клетках, то есть, находясь в гетерологичных клетках Е. coli, NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов сменили свою биологическую функцию, и вместо трофической функции [Franke et al., 1999] стали принимать участие в репликации. Возможность изменения биологической функции нуклеазы в гетерологичной системе клетки уже была отмечена в некоторых работах [Куприянова-Ашина, 1991; Xiao et al., 2007; Balasundaram et al., 2009].

Как уже было сказано выше, введение клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку оказывает негативное влияние на ее физиологические и метаболические процессы и генетический материал, не нужный для ее размножения, в ходе деления клетки неминуемо утрачивается. По этой причине было необходимо провести исследования стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в ряду клеточных поколений. Проведенное для выполнения этой задачи изучение спонтанной элиминации вышеперечисленных плазмид показало увеличение стабильности их наследования в клетках Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 с повышением активности исходных и мутантных вариантов NucSma и Nue А, гены которых находятся в этих плазмидах. Обнаруженная в ходе выполнения работы зависимость между активностью экспрессирующихся на базальном уровне исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA также хорошо согласуется с ранее выдвинутым предположением о возможном влиянии данных нуклеаз на репликацию плазмидной ДНК. Следует повториться, что высокий негативный эффект, оказываемый токсичным белком на жизненно важные функции клетки-хозяина, приводит к удалению нежелательного генетического материала из клетки [Goldwin et al., 1979]. Исходя из этого факта, обнаруженная нами низкая стабильность наследования плазмиды с геном NucA дикого типа, вероятнее всего, связана с высоким токсическим эффектом, который данная нуклеа-за оказывает на клетку-хозяина [Meiss et al., 1998].

Исходя из ранее выдвинутого предположения о возможном влиянии

NucSma и NucA на репликацию ДНК в гетерологичной клетке Е. coli, в заt ключительных экспериментах было изучено действие ингибиторов репликации ДНК на рекомбинантные штаммы Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900. Для решения данной задачи использовали налидиксовую кислоту и новобиоцин, которые действуют на разные субъединицы ДНК-гиразы - фермента, изменяющего топологию ДНК в процессе ее репликации [Льюин, 1987]. Действительно, если NucSma и NucA каким-то образом участвуют в репликации ДНК, то с увеличением активности синтезируемых клетками рекомбинантных штаммов эндонуклеаз будет наблюдаться увеличение устойчивости к агенту, ингибирующему репликацию ДНК. Использование метода градиентного агара с различными концентрациями антибиотиков [Barth et al., 1978], как мы и предполагали, позволило выявить зависимость между активностью исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA и устойчивостью клеток рекомби-нантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте. Известно, что налидиксовая кислота связывает А-субъединицу ДНК-гиразы, которая ответственна за образование разрывов и связывание фермента с ДНК с образованием тройного комплекса «налидиксовая кислота-ДНК-гираза-ДНК», блокирующего продвижение репликационной вилки [Fong et al, 2008]. Образование тройного комплекса происходит до появления разрыва в ДНК, создаваемого ДНК-гиразой, и последний для комплексообразования не требуется [Hooper, 1999]. Известно, что при прикреплении фермента, в частности топоизомеразы, к ДНК ее локальная конформация соответствует А-форме ДНК [Lipps et al, 1983], которую предпочтительнее распознают эндо-нуклеазы NucSma и NucA [Meiss et al, 1995]. Вероятно, при ингибировании топоизомеразной активности ДНК-гиразы эндонуклеазы NucSma и NucA инициируют в области ori образование «ников» неподалеку от тройного комплекса, что ведет к его удалению и восстановлению репликации.

В отличие от этого, выявленное в ходе выполнение работы отсутствие статистически значимых различий в устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к новобиоцину свидетельствует о невозможности NucSma и NucA компенсировать функцию 5-субъедимицы ДНК-гиразы по восстановлению нативной структуры фермента после одного раунда репликации.

Заключая обсуждение полученных результатов, следует еще раз отметить, что увеличение количества генов Ыа в клетках рекомбинантных штаммов, по-видимому, происходит за счет увеличения количества рекомбинантных плазмид, в которых содержатся данные гены, и зависит от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Таким образом, полученные в данной работе данные демонстрируют возможность участия NucSma и NucA в репликации ДНК в рекомбинантных штаммах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крякунова, Елена Вячеславовна, Казань

1. Аликин, Ю.С. Развитие технологий получения и перспективы использования эндонуклеазы Serratia marcescens текст. / Ю.С. Аликин, Л.П. Серженко, В.П. Клименко //11 Всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов»: Сб. Докл. Казань, 1998.-е. 152-163.

2. Бейли, Дж. Основы биохимической инженерии Текст. / Дж. Бейли, Д. Оллис // М.: Мир, 1989. 586 с.

3. Белов, И.С. Мутационный анализ бактерий. Методические указания для лабораторных работ по генетике микроорганизмов Текст. // Казань, изд-во Казанского государственного университета, 1985. 26 с.

4. Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия Текст. / Ю.Б. Белоусов, B.C. Моисеев, В.К. Лепахин // Изд.: Универсум Пабли-шинг, 1997.-531 с.

5. Беляева, М.И. Нуклеиновые кислоты, используемые в качестве основного источника питания бактерий Текст. / М.И. Беляева, М.Н. Капранова, М.И. Витол, И.А. Голубенко, И.Б. Лещинская // Микробиология. -1976.-№45.-с. 420-424.

6. Бергквист, П. Плазмиды. Методы Текст. / П. Бергквист, К. Харди, Б. Оудега, Н. Панайотатос, Э. Пагсли, К. Томас, Ф. Янгмен // М.: Мир, 1989.-267 с.

7. Березов, Т.Т. Биологическая химия Текст. / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коров-кин // М.: Медицина, 1998. 704 с.

8. Гимадутдинов, O.A. Синтез внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens рекомбинантными штаммами Escherichia coli Текст. / O.A. Гимадутдинов, Л.М. Анцилевич // Биотехнология. 1993. — № 5. — с. 15-18.

9. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. Текст. / Б. Глик, Дж. Пастернак // М.: Мир, 2002. 589 с.

10. Гловер, Д. (ред.) Клонирование ДНК. Методы Текст. М.: Мир, 1988. -538 с.

11. Громов, Б.В. Цианобактерии в биосфере Текст. // Соровский образовательный журнал. 1996. - № 9. - с. 33-39.

12. Гусев, М.В. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов Текст. / М.В. Гусев, JI.A. Минеева // М.:Издательский центр «Академия», 2003. 464 с.

13. Кнорре, Д.Г. Биологическая химия Текст. / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина // М.: Высш. шк., 2000. 479 с.

14. Куприянова-Ашина, Ф.Г. Влияние экзогенных дезоксирибонуклеаз на синтез ДНК, рост и деление клеток микроорганизмов: автореф. дис. на соиск. уч. степ, доктора биол. наук: 03.00.07 Текст. / Куприянова-Ашина Флера Гарифовна. Москва, 1991. - 46 с.

15. Лещниская, И.Б. Нуклеазы Serratia marcescens Текст. / И.Б. Лещин-ская, З.Ф. Богаутдинов // Микробиология. — 1963. — Т. 32, вып. 34. — с. 413-415.

16. Лещинская, И.Б. Сравнительное изучение бактериальных фосфомоно-и фосфодиэстераз, гидролизующих нуклеиновые кислоты и нуклеотиды Текст. / И.Б. Лещинская, М.И. Беляева, К.З. Гильфанова // Микробиология. 1968. - Т. 37. - с. 979-983.

17. Лещинская, И.Б. Методы определения нуклеаз и родственных ферментов Текст. / И.Б. Лещинская, Н.П. Балабан, М.Н. Капранова, И.А. Голу-бенко // в кн. «Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов». Казань, 1980. - с. 53-60.

18. Лещинская, И.Б. Нуклеазы бактерий Текст. / И.Б. Лещинская, В.П. Варламов, Б.М. Куриненко // Издательство Казанского университета. -1991.-232 с.

19. Льюин, Б. Гены. Пер. с англ. Текст. -М.: Мир, 1987. 544 е., ил.

20. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике Текст. М.: Мир. - 1976.-440 с.

21. Рыбчин, В.Н. Основы генетической инженерии Текст., 2-е изд., пере-раб. доп.: Учебник для вузов СПб: Изд-во СПб ГТУ, 2002. - 522 с.

22. Сазыкин, Ю.О. Антибиотики и оболочка бактериальной клетки Текст. / Ю.О. Сазыкин, П.С. Навашин // Итоги науки и техники. М: ВИНИТИ. -1991.-№31.-с. 111-127.

23. Сидоренко, C.B. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии Текст. Изд-во НИНАХ СГМА, 2002. - 294 с.

24. Сингер, М. Гены и геномы. Т. 1. Текст. / М. Сингер и П. Берг // Дрофа, 1998.-373с.

25. Стручкова, И.В. Регуляция биосинтеза белка. Учебно-методическое пособие Текст. / И.В. Стручкова, A.A. Брилкина, А.П. Веселов // Нижний Новгород, 2010.- 100 с.

26. Филимонова, М.Н. Получение нуклеазы Serratia marcescens в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента Текст. / М.Н. Филимонова, Н.П. Балабан, Ф.Р. Шарипова и И.Б. Лещинская // Биохимия. 1980. - Т. 45, вып. 11.-е. 2096-2104.

27. Филимонова, М.Н. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens Текст. / М.Н. Филимонова, A.A. Дементьева, И.Б. Лещинская, Г.Л. Бакулина, C.B. Шляпников // Биохимия. -1991. Т. 56, вып. 3. - с. 508-520.

28. Филимонова, М.Н. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности Текст. / М.Н. Филимонова, A.B. Гарусов, Т.А. Сметанина и др. / Биохимия. 1996. - Т. 61, выл. 10. -с. 1800-1806.

29. Филимонова, М.Н. Эндонуклеазы Serratia marcescens. Определение димеров Текст. / М.Н. Филимонова, Н.Г. Уразов // XI Всероссийская конференция «Ферменты микроорганизмов». — Казань, 1998. — с. 89-93.

30. Филимонова, М.Н. Полидисперность нуклеазы Serratia marcescens при оптимальном значении pH Текст. / М.Н. Филимонова, М.Дж. Бенедик, Н.Г. Уразов и И.Б. Лещинская // Приклад, биохим. микробиол. 1999. -Т. 35, № 1.-е. 20-24.

31. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия Текст., 2-е изд., испр. идоп.: Учебно-справочное пособие Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004.-496 с.

32. Юсупова, Д.В. Индукция синтеза внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens агентами, подавляющими репликацию ДНК Текст. / Д.В. Юсупова, Р.Б. Соколова, О.В. Порфирьева и А.З. Пономарева // Микробиология. 1991. - Т. 60, вып. 2. - с. 279-284.

33. Юсупова, Д.В. Влияние налидиксовой кислоты и митомицина С на рост и биосинтез внеклеточных белков Serratia marcescens Текст. / Д.В. Юсупова, Р.Б. Соколова, Е.В. Петухова // Антибиотики и химиотер. — 1993. Т. 3 8, № 8-9. - с. 16-21.

34. Adams, D.E. Cre-lox recombination in Escherichia coli cells. Mechanistic differences from the in vitro reaction Текст. / D.E. Adams, J.B. Bliska and N.R. Cozzarelli //J. Mol. Biol. 1992a. - Vol. 226. - p. 661-673.

35. Ali, J.A. The 43 kDa N-terminal fragment of the gyrase В protein hydrolyses ATP and binds coumarin drugs Текст. / J.A. Ali, A.P. Jackson, A.J. Howells and A. Maxwell // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - p. 2717-2724.

36. Aucken, H.M. Identification of capsular antigens in Serratia marcescens Текст. / H.M. Aucken, S.G. Wilkinson, T.L. Pitt // J. Clin. Microbiol. -1997.-Vol. 35.-p. 59-63.

37. Bahar, B. Bovaine lactoferrin (LTF) gene promoter haplotypes have different basal transcriptional activities Текст. / В. Bahar, F. O'Halloran, M.J. Calla-nan, S. McParland, L. Giblin, T. Sweeney // Anim. Genet. 2011. - Vol. 42. -p. 270-279.

38. Balasundaram, B. Step change in the efficiency of centrifugation through cell engineering: co-expression of Staphylococcal nuclease to reduce the viscosity of the bioprocess feedstock Текст. / В. Balasundaram, D. Nesbeth,

39. J.M. Ward, E. Keshavara-Moore, D.G. Bracewell // Biotechnol. Bioeng. -2009.-Vol. 104.-p. 134-142.

40. Ball, Т.К. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli Текст. / Т.К. Ball, P.N. Saurugger, M. Benedik // Gene. 1987. - Vol. 57. - p. 183-192.

41. Ball, Т.К. Expression of Serratia marcescens extracellular proteins requires RecA Текст. / Т.К. Ball, C.R. Wasmuth, S.C. Braunagel and M.J. Benedik // J. Bacterid. 1990. - Vol. 172. - p. 342-349.

42. Ball, Т.К. Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity Текст. / Т.К. Ball, Y. Suh and M.J. Benedik // Nucleic. Acids Res. -1992. Vol. 20. - p. 4971-4974.

43. Barth, P.T. Copy number of coexisting plasmids in Escherichia coli K-12 Текст. / P.T. Barth, H. Richards, N. Datta // J. Bacteriol. 1978. - Vol. 135. -p. 760-765.

44. Bentley, R. Biosynthesis of vitamin К (menaquinone) in bacteria Текст. / R. Bentley, R. Meganathan // Microbiol. Rev. 1982. - Vol. 46. - p. 241-280.

45. Bickle, T. Biology of DNA restriction Текст. / T. Bickle, D. Krüger // Microbiol. Rev. 1993. - Vol. 57. - p. 434-450.

46. Bradford, P.A. Extended-spectrum ß-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat Текст. // Clin. Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 14. - p. 933-951.

47. Bustos, S.A. Functional domains of the AraC protein Текст. / S.A. Bustos, R.F. Schleif// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - p. 5638-5642.

48. Caballero, I. Evaluation of the Serratia marcescens nuclease (NucA) as a transgenic cell ablation system in porcine Текст. /1. Caballero, J.A. Piedrahi-ta // Animal Biotechnology. 2009. - Vol. 20. - p. 177-185.

49. Caron, P. Alignment of primary sequences of DNA topoisomerases Текст. / P. Caron and J.C. Wang // Adv. Pharmacol. 1994. - Vol. 29A. - p. 271-297.

50. Chen, C. Solvent participation in Serratia marcescens endonuclease complexes Текст. // С. Chen, B.W. Beck, K. Krause, B.M. Pettitt // Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 2006. - Vol. 62. - p. 982-995.

51. Chen, C. Advantage of being a dimer for Serratia marcescens endonuclease? Текст. / С. Chen, К. Krause, B.M. Pettitt // J. Phys. Chem B. 2009. - Vol. 113.-p. 511-521.

52. Chen, X. Novel expression vector for secretion of cecropin AD in Bacillus subtilis with enhanced antimicrobial activity Текст. / X. Chen, F. Zhu, Y. Cao, S. Qiao // Antimicrob. Agents Chemother. 2009. - Vol. 53. - p. 36833689.

53. Conner, B.N. The molecular structure of d(ICpCpGpG), a fragment-of right-handed double helical A-DNA Текст. / B.N. Conner, T. Takano, S. Tanaka, K. Itakura, and R.E. Dickerson // Nature. 1982. - Vol. 295. - p. 294-299.

54. Conte, M.R. Conformational properties and thermodynamics of the RNA duplex r(CGCAAAUUUGCG)2: comparison with the DNA analogue d(CGCAAATTTGCG)2 Текст. / M.R. Conte, G.L. Conn, T. Brown, A.N. Lane // Nucl. Acids Res. 1997. - Vol. 25. - p. 2627-2643.

55. Corbett, K.D. The structural basis for substrate specificity in DNA topoiso-merase IV Текст. / K.D. Corbett, A.J. Schoeffler, N.D. Thomsen and J.M. Berger // J. Mol. Biol. 2005. - Vol. 351. - p. 545-561.

56. Crisona, N.J. Alteration of Escherichia coli topoisomerase TV conformation upon enzyme binding to positively supercoiled DNA Текст. / N.J. Crisona and N.R. Cozzarelli // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281. - p. 18927-18932.

57. Dake, E. Purification and properties of the major nuclease from mitohondria of Saccharomyces cerevisiae Текст. / E. Dake, T. Hoffman // Biol. Chem. -1988. Vol. 263.-p. 7691-7702.

58. DeBoy II, J.M. Hemolytic activity in enterotoxigenic and nonenterotoxigenic strains of Escherichia coli Текст. / J.M. DeBoy II, I.K. Wachsmuth and B.R. Davis // J. Clin. Microbiol.- 1980.-Vol. 12.-p. 193-198.

59. DiGate, R.J. Identification of a potent decatenating enzyme from Escherichia coli Текст. / R.J. DiGate and K.J. Marians // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263.-p. 13366-13373.

60. Drlica, K. Quinolone-mediated bacterial death Текст. / К. Drlica, M. Malik, R.J. Kerns and X. Zhao // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. - Vol. 52. -p. 385-392.

61. Du, L. Engineering multigene expression in vitro and in vivo with small terminators for T7 RNA polymerase Текст. / L. Du, R. Gao, A.C. Foster // Bio-technol. Bioeng. 2009. - Vol. 104. - p. 1189-1196.

62. Ely, S. Regulation of plasmid DNA synthesis: isolation and characterization of copy number mutant of mini RG-5 and mini F plasmids Текст. / S. Ely, W.L. Staudenbaner//Mol. Gen. Genet. 1981. - Vol. 181. - p. 29-35.

63. Ferrero, L. Analysis of gyrA and grlA mutations in stepwise-selected ciprof-loxacin-resistant mutant of Staphylococcus aureus Текст. / L. Ferrero, B. Cameron and J. Crouzet // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. - Vol. 39. -p. 1554-1558.

64. Filimonova, M.N. Serratia marcescens endonuclease. Properties of the enzyme Текст. / M.N. Filimonova, L.A. Baratova, N.D. Vospel'nikova, A.O. Zheltova and I.B. Leshchinskaia // Biokhimiia. 1981. - Vol. 46. - p. 16601666.

65. Filimonova, M. Action of hexaaminecobalt on the activity of Serratia mar-cescens nuclease Текст. / M. Filimonova, V. Gubskaya, I. Nuretdinov, I. Leshchinskaya // BioMetals. 2003. - Vol. 16. - p. 447-453.

66. Fong, W. Antimicrobial Resistance and Implications for the Twenty-First Century. Chapter 4: Resistance of Gram-Negative Bacilli to Antimicrobials Текст. / W. Fong and K. Drlica (eds.) // Springer. 2008. - p. 97-159.

67. Foster, T.J. Plasmid-determined resistance to antimicrobial drugs and toxic metal ions in bacteria Текст. // Microbiol. Rev. 1983. - Vol. 47. - p. 361409.

68. Fotadar, U. Growth of Escherichia coli at elevated temperatures Текст. / U. Fotadar, P. Zaveloff, L. Terracio // J. Basic Microbiol. 2005. - Vol. 45. - p. 403-404.

69. Franke, I. On the Advantage of Being a Dimer, a Case Study Using the Di-meric Serratia Nuclease and the Monomeric Nuclease from Anabaena sp. Strain PCC 7120 Текст. / I. Franke, G. Meiss and A. Pingoud // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - p. 825-832.

70. Friedhoff, P. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis Текст. / P. Friedhoff, B. Kolmes, O. Gimadutdinow, W. Wende, K.L. Krause and A. Pingoud // Nucleic. Acids Res. 1996. - Vol. 24. - p. 2632-2639.

71. Friehs, K. Plasmid copy number and plasmid stability Текст. // Adv. Bio-chem. Engin. Biotechnol. 2004. - Vol. 86. - p. 47-82.

72. Fuller, W. A molecular model for the interaction of ethidium bromide with deoxyribonuclein acid Текст. / W. Fuller, M. Waring // Phys. Chem. 1964. -Vol. 68.-p. 805-809.

73. Gellert, M. Novobiocin and coumermycin inhibit DNA supercoiling catalyzed by DNA gyrase Текст. / M. Gellert, M.H. O'Dea, T. Itoh and J.-I. To-mizawa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - Vol. 73. - p. 4474-4478.

74. Gellert, M. Nalidixic acid resistance. A second genetic character involved in DNA gyrase activity Текст. / M. Gellert, K. Mizuuchi, M.H. O'Dea, T. Itoh and J.-I. Tomizawa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - p. 4772-4776.

75. Ghosh, M. Structural insights into the mechanism of nuclease A, a 3|3a metal nuclease from Anabaena [Текст. / M. Ghosh, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London, L.C. Pedersen // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - p. 2799027997.

76. Ghosh, M. The nuclease A inhibitor complex is characterized by a novel metal ion bridge Текст. / M. Ghosh, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London, L.C. Pedersen // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - p. 5682-5690.

77. Ghuysen, J.M. Serine P-lactamases and penicillin-binding proteins,Текст. / L.N. Ornston, А. В allows and E.P. Greenberg (eds.) // Ann. Rev. Microb. -1991.-Vol. 45.-p. 37-67.

78. Gibert, I. Distribution of insertion sequence IS200 in Salmonella and Shigella Текст. / I. Gibert, J. Barbe, J. Casadesus // J. Gen. Microbiol. 1990. - Vol. 136.-p. 2555-2560.

79. Gilbert, E.J. The 24 kDa N-terminal sub-domain of the DNA gyrase В protein binds coumarin drugs Текст. / E.J. Gilbert and A. Maxwell // Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 12. - p. 365-373.

80. Goldwin, D. The influence of the grouth on the syability of a drug resistance plasmid in Escherichia coli K-12 Текст. / D. Goldwin, J.N. Stater // J. Gen. Microbiol. 1979. - Vol. 111. - p. 201-209.

81. Gootz, T.D. Chemistry and mechanism of action of the quinolone antibacte-rials Текст. / T.D. Gootz, K.E. Brightg // The Quinolones. Academic Press. San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto. 1998. -Ed. 2.-p. 29-80.

82. Gore, J. Mechanochemical analysis of DNA gyrase using rotor bead tracking Текст. // J. Gore, Z. Bryant, M.D. Stone, M. Nollmann, N.R. Cozzarelli and C. Bustamante / Nature. 2006. - Vol. 439. - p. 100-104.

83. Hacker, J. Pathogenicty islands and the evolution of Microbes Текст. / J. Hacker, J.B. Kaper // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - p. 641-679.

84. Hane, M.W. Escherichia coli K-12 mutants resistant to nalidixic acid: genetic mapping and dominance studies Текст. / M.W. Hane and Т.Н. Wood // J. Bacteriol. 1969. - Vol. 99. - p. 23 8-241.

85. Hejazi, A. Serratia marcescens Текст. / A. Hejazi, F.R. Falkiner // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 46. - p. 903-912.

86. Herman-Antosiewicz, A. A plasmid cloning vector with precisely regulatable copy number in Escherichia coli Текст. / A. Herman-Antosiewicz, M. Obu-chowski and G. Wegrzyn // Mol. Biotechnol. 2001. - Vol. 17. - p. 193-199.

87. Hiasa, H. DNA strand cleavage is required for replication fork arrest by a frozen topoisomerase-quinolone-DNA ternary complex Текст. / H. Hiasa, D.O. Yousef, and K.J. Marians // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - p. 2642426429.

88. Hooper, D.C. Mode of action of fluoroquinolones Текст. // Drugs. 1999. -Vol. 58.-p. 6-10.

89. Jones, K.L. Construction and characterization of F plasmid-based expression vectors Текст. / K.L. Jones, J.D. Keasling // Biotechnol. Bioeng. 1998. -Vol. 59.-p. 659-665.

90. Kirby, T.W. The nuclease A inhibitor represents a new variation of the rare PR-1 fold Текст. / T.W. Kirby, G.A. Mueller, E.F. DeRose, M.S. Lebetkin, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London // J. Mol. Biol. 2002. - Vol. 320. - p. 771-782.

91. Konieczny, I. Role of TrfA and DnaA proteins in origin opening during initiation of DNA replication of the broad host range plasmid RK2 Текст. / Т. Konieczny, K.S. Doran, D.R. Helinski, A. Blasina // J. Biol. Chem. 1997. -Vol. 272. - p. 20173-201787.

92. Kubitschek, H.E. Cell volume increase in Escherichia coli after shifts to richer media Текст. // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172. - p. 94-101.

93. LaemmIy, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Текст. // Nature. 1970. - Vol. 227. - p. 680-685.

94. Liu, L.F. DNA-DNA gyrase complex: the wrapping of the DNA duplex outside the enzyme Текст. / L.F. Liu and J.C. Wang // Cell. 1978. - Vol. 15. -p. 979-984.

95. Livermore, D.M. Mechanisms of resistance to (3-lactam antibiotics Текст. // Scand. J. Infect. Dis. 1991. - Vol. 78. - p. 7-16.

96. Mayers, D.L. (ed.) Antimicrobial drug resistance. Chapter 16. Fluoroquinolone resistance in bacteria Текст. // Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 2009. - p. 195-205.

97. McEvoy, J.L. Molecular cloning and characterization of an Erwinia caroto-vora subsp. carotovora pectin lyase gene that responds to DNA-damaging agents Текст. / J.L. McEvoy, H. Murata, A.K. Chatterjee // J. Bacteriol. -1990. Vol. 172. - p. 3284-3289.

98. Meiss, G. Sequence preferences in cleavage of ssDNA by the extracellular Serratia marcescens endonuclease Текст. / G. Meiss, P. Friedhoff, O. Gima-dutdinow et al. // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - p. 11979-11998.

99. Meiss, G. Biochemical characterization of Anabaena sp. strain PCC 7120 non-specific nuclease NucA and its inhibitor NuiA Текст. / G. Meiss, I. Franke, O. Gimadutdinow, C. Urbanke and A. Pingoud // Eur. J. Biochem. -1998. Vol. 251. - p. 924-934.

100. Meiss, G. The DNA/RNA non-specific Serratia nuclease prefers double-stranded A-form nucleic Acids as Substrates Текст. / G. Meiss, F.U. Gast, A. Pingoud // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 288. - p. 377-390.

101. Meiss, G. Mechanism of DNA cleavage by the DNA-RNA-non-specific Ana-baena sp. PCC 7120 endonuclease NucA and its inhibition by NuiA Текст. / G. Meiss, O. Gimadutdiniw, B. Haberland, A. Pingoud // J. Mol. Biol. 2000. -Vol. 297.-p. 521-534.

102. Meiss, G. Microtiter-plate assay and related assays for nonspecific endonuc-leases. Review. No abstract available Текст. / G. Meiss, O. Gimadutdinow, P. Friedhoff, A. Pingoud // Methods Mol. Biol. 2001. - Vol. 160. - p. 37-48.

103. Mikesell, P. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis Текст. / P. Mikesell, B.E. Ivins, J.D. Ristroph, T.M. Dreier // Infect. Immun. 1983. - Vol. 39. - p. 371-376.

104. Miller, M.D. Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implications for catalysis Текст. / M.D. Miller and K.L. Krause // Protein Sci. 1996. - Vol. 5. - p. 24-33.

105. Muro-Pastor, A.M. The mi i A gene from Anabaena sp. encoding an inhibitor of the NucA sugar-non-specific nuclease Текст. / A.M. Muro-Pastor, A. Herrero and E. Flores // J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 268. - p. 589-598.

106. Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited Текст. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - Vol. 67. - p. 593-656.

107. N611mann, M. Thirty years of Escherichia coli DNA gyrase: from in vivo function to single-molecule mechanism Текст. / M. Nollmann, N.J. Crisona and P.B. Arimondo // Biochimie. 2007. - Vol. 89. - p. 490-499.

108. Nordstrom, K. Plasmids in bacteria Текст. / Nordstrom K., Helinski, D. R.,

109. Cohen S. N., Clewell D. В., Jackson D. A., Hollaender A., et al. // Pleum Press, New York. 1985. - p. 119.

110. Nordstrom, K. Copy-number control of the Escherichia coli chromosome: a plasmidologist's view Текст. / К. Nordstrom, S. Dasgupta // EMBO reports. 2006. - Vol. 7. - p. 484-489.

111. Novy, R. Coexpression of multiple target proteins in E. coli Текст. / R. Novy, K. Yaeger, D. Held, R. Mierendorf // inNovations. 2002. - Vol. 15. -p. 2-6.

112. Palomares, L.A. Production of recombinant proteins: challenges and solutions Текст. / L.A. Palomares, S. Estrada-Mondaca, O.T. Ramirez // Methods Mol. Biol. 2004. - Vol. 267. - p. 15-52.

113. Perret, C.J. Iodometric assay of penicillinase Текст. // Nature (London). -1954.-Vol. 174.-p. 1012-1013.

114. Rangarajan, E.S. Sugar non-specific endonucleases Текст. / E.S. Rangara-jan, V. Shankar // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 25. - p. 583-613.

115. Remaut, E. Plasmid vectors for high-efficiently expression controlled by the PL promoter of coliphage lambda Текст. / E. Remaut, P. Stanssens, W. Fiers //Gene. -1981. -Vol. 15.-p. 81.

116. Rich, A. Right-handed and left-handed DNA: Conformational information in genetic material Текст. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1983. -Vol. 47.-p. 1-12.

117. Roca, J. DNA transport by a type II DNA topoisomerase: evidence in favor of a two-gate mechanism Текст. / J. Roca and J.C. Wang //Cell. 1994.-Vol. 77.-p. 609-616.

118. Ruiz-Carillo, A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by en-donuclease G Текст. / A. Ruiz-Carillo, J. Côté // Science. 1993. - Vol. 261. -p. 765-769.

119. Saïda, F. Expression of highly toxic genes in E. colv. special strategies and genetic tools Текст. // F. Saïda, M. Uzan, В. Odaert, F. Bontems // Current Protein and Peptide Science. 2006. - Vol. 7. - p. 47-56.

120. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fitsch, T. Maniatis Текст. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.-560 p.

121. Schatz, P.J. Genetic analysis of protein export in Escherichia coli i P.J. Schatz and J. Backwith Текст. // Annu. Rev. Genet. 1990. - Vol. 24. - p. 215-248.

122. Schoeffler, A.J. DNA topoisomerases: harnessing and constraining energy to govern chromosome topology Текст. / A.J. Schoeffler and J.M. Berger // Quart. Rev. Biophys. 2008. - Vol. 41. - p. 41-101.

123. Seabold, R.R. Apo-AraC actively seens to loop Текст. / R.R. Seabold, R.F. Schleif // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 278. - p. 529-538.

124. Sektas, M. Novel single-copy pETcoco™ vector with dual controls for amplification and expression Текст. / M. Sektas, W. Szybalski // inNovations. -2002.-Vol. 14.-p. 6-8.

125. Seising, E. Two contiguous conformations in a nucleic acid duplex Текст. / E. Seising, R.D. Wells, T.A. Early and D.R. Kearns // Nature. 1978. - Vol. 21.-p. 249-250.

126. Shea, M.E. Interactions between DNA helicases and frozen topoisomerase IV-quinolone-DNA ternary complexes Текст. / M.E. Shea and H. Hiasa // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - p. 22747-22754.

127. Sleigh, J.D. Antibiotic resistance in Serratia marcescens Текст. // Br. Med. J. 1983.-Vol/287.-p. 1651-1653.

128. Smarda, J. Плазмиды и клетки-хозяева Текст. // Acta virol. 1982. - Vol. 26. — p. 193-206.

129. Smith, D.H. Mode of action of novobiocin in Escherichia coli Текст. / D.H. Smith and B.D. Davis // J. Bacteriol. 1967. - Vol. 93. - p. 71-79.

130. Spratt, B.G. Penicillin-binding proteins of gram-negative bacteria Текст. / B.G. Spratt and K.D. Cromie // Rev. Infect. Dis. 1988. - Vol. 10. - p. 699711.

131. Su, T.Z. A novel phosphate-regulated expression vector in Escherichia coli Текст. / T.Z. Su, H. Schweizer, D.L. Oxender // Gene. 1990. - Vol. 90. -p. 29-33.

132. Sugino, A. Energy coupling in DNA gyrase and the mechanism of action of novobiocin Текст. / A. Sugino, N.P. Higgins, P.O. Brown, C.L. Peebles and N.R. Cozzarelli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - Vol. 75. - p. 48384842.

133. Suh, Y. Two-Step secretion of the Serratia marcescens extracellular nuclease Текст. // Y. Suh, S. Jin, Т.К. Ball and M.J. Benedik // J. Bacteriol. 1996. -Vol. 178.-No. 3.-p. 3771-3778.

134. Thayer, H.H. Contraindication for use of Serratia marcescens as tracer organisms in research Текст. // J. dent. Res. 1966. - Vol. 45. - p. 853-855.

135. Tomas, M. A simple and rapid method for the elimination of R plasmids from enteric bacteria Текст. / M. Tomas, W. Kay // Current Microb. 1984. -Vol. 11.-p. 155-158.

136. Uhlin, B. R-plasmid gene dosage effects in Escherichia coli K-12, copy mutants of the R-plasmid RI drd-19 Текст. / В. Uhlin, К. Nordstrom // Plasmid. 1977.-Vol. l.-p. 1-7.

137. Vieira, J. The pUC and M13 mp7 derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers Текст. / J. Vieira and J. Messing // Gene. 1982. - Vol. 19. - p. 259-268.

138. Vogt, R.L. Escherichia coli 0157:H7 outbreak associated with consumption of ground beef, June-July 2002 Текст. / R.L. Vogt, L. Dippold // Public Health Rep.-2005.-Vol. 120.-p. 174-178.

139. Von Hippel, P.H. From "simple" DNA-protein interactions to the macromo-lecular machines of gene expression Текст. // Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.-2007.-Vol. 36.-p. 79-105.

140. Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance Текст. // Nature. 2000. - Vol. 406. - p. 775-781.

141. Wandersman, C. Secretion across the bacterial outer membrane Текст. // Trends Genet. 1992. - Vol. 8. - p. 317-322.

142. Wang, J.C. DNA topoisomerases Текст. // Annu. Rev. Biochem. 1985. -Vol. 54. p. 665-697.

143. Wanga, Z. Classification of plasmid vectors using replication origin, selection marker and promoter as criteria Текст. / Z. Wanga, L. Jin, Z. Yuan, G. We'grzyn, A. We'grzyn // Plasmid. 2009. - Vol. 61. - p. 47-51.

144. Watson, J.D. Molecular biology of the gene Текст. / J.D. Watson, T.A. Baker, S.P. Bell, A.G. Michael, L.R. Losick // Pearson. 2004. - 5ed. - 7121. P

145. Watt, P.M. Structure and function of type II DNA topoisomerases Текст. / P.M. Watt and I.D. Hickson // Biochem. J. 1994. - Vol. 303. - p. 681-695.

146. Wigley, D.B. Crystal structure of the N-terminal domain of the DNA gyrase В protein Текст. / D.B. Wigley, G.J. Davies, E.J. Dodson, A. Maxwell and G. Dodson // Nature. 1991. - Vol. 351. - p. 624-629.

147. Wild, J. Copy-control tightly regulated expression vectors based on pBAC/oriV Текст. / J. Wild, W. Szybalski // Methods Mol. Biol. 2004. -Vol. 267.-p. 155-167.

148. Williamson, N.R. The biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines Текст. / N.R. Williamson, P.C. Fineran, F.J. Leeper and G.P. Salmond // Nat. Rev. Microbiol. 2006. - Vol. 4. - p. 887-899.

149. Willmott, C.J. The complex of DNA gyrase and quinolone drugs with DNAforms a barrier to transcription by RNA polymerase Текст. / С J. Willmott, S.E. Critchlow, I.C. Eperon and A. Maxwell // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 242.-p. 351-363.

150. Xiao, F. Engineered apoptotic nucleases for chromatin research / F. Xiao, P. Widlak, W.T. Garrard // Nucleic Acids Res. 2007. - Vol. 35. - p. 93-99.

151. Yanagida, N. Specific excretion of Serratia marcescens protease through the membrane of Escherichia coli Текст. / N. Yanagida, T. Uozumi, T. Berru // J. Bacteriol. 1986. - Vol. 166. - p. 937-944.

152. Zechiedrich, E.L. Eukaryotic topoisomerases recognize nucleic acid topology by preferentially interacting with DNA crossovers Текст. / E.L. Zechie-drich and N. Osheroff// EMBO J. 1990. - Vol. 9. - p. 4555-4562.

153. Zzaman, S. Oligomeric initiator protein-mediated DNA looping negatively regulates plasmid replication in vitro by preventing origin melting Текст. / S. Zzaman, D. Bastia // Molecular Cell. 2005. - Vol. 20. - p. 833-843.

Информация о работе

Крякунова, Елена Вячеславовна
кандидата биологических наук
Казань, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы