Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологические основы патогенеза пневмококковой инфекции у детей

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические основы патогенеза пневмококковой инфекции у детей"

А

^ Министерство обороны российской федерации ч. гу. научно-исследовательский институт

военной медицины

На правах рукописи

КВЕТНАЯ Ася Степановна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

санкт-петербург

1995

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте детских инфекций.

Научный консультант — доктор медицинских наук, профессор Н. Н. Костюкова

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор А. А. Тотолян;

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В. В. Тец;

доктор медицинских наук, профессор Е. П. Сиволодский.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургская государственная медицинская академия.

Защита диссертации состоится « » среЛ^^^А 1995 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 106.05.01 в НИИ военной медицины МО РФ по адресу: 195043, Санкт-Петербург, ул. Лесопарковая, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «Д^^/Н?_ 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, профессор Р. Б. Гольдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пневмококковая инфекция (ПИ) продолжает оставаться актуальной проблемой детской инфекционной патологии в связи с повсеместным распространением, разнообразием клинических форм, частотой регистрации и тяжестью течения пневмоний, отитов, септицемий и ряда других клинических форм. Существенными являются высокие показатели летальности при пневмококковом менингите (25-50%), частота неврологических осложнений и последующая инвалидизация детей (Жданова Л.Г., 1981; Костюкова H.H., 1981; Baylet et al., 1982; Michalcu et at., 1983; Pedersen et al„ 1983; Shclech et al., 1984; Velimirovic, 1984; Bolan et al., 1985; Burman et at., 1985; Покровский В.И. и соавт., 1986; Покровская Н.Я. и соавт., 1986, 1987; Beinert, 1988; Finch, 1988; Rotta, 1988; Shen, 1989; Катосова Л.К., 1990; Shann, 1990; Berga, 1991; Gratten et al., 1991; Вишнякова Л.А., 1992; Сорокина М.Н., 1992: Волкова М.О., 1993; Qugliarello et al., 1993).

К настоящему времени наиболее исследованы вопросы таксономии, морфолорш и антигенной структуры пневмококков (Костюкова H.H., 1981).

В последние годы благодаря успехам иммунологии, генетики, молекулярной биологии установлено, что пневмококки, как и многие другие микроорганизмы, обладают всеми тремя группами факторов патогенности, обеспечивающими им колонизационную, инвазивную и токсическую функции (Езепчук Ю.В., 1977, 1985; Костюкова H.H., 1989; Boulnois, 1992). Развитие ПИ связывают с адгезивностью штаммов, с их способностью вырабатывать инвазивные факторы (нейраминидазу и гиалуронидазу) и токсический фактор - пневмолизин (Езепчук Ю.В., 1977, 1985; Вишнякова Л.А. и соавтор., 1990; Резцова Ю.В., 1990; Boulnois, 1992; Волкова М.О., 1993). Экспериментально доказана роль степени гаалуронидазной активности в преодолении штаммами пневмококка гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) (Волкова М.О., 1993). Обсуждается значение протеазы пневмококка, способной расщеплять иммуноглобулины Ig Ai, как фактора колонизации (Mulks et al., 1980; Wilson et al., 1981; Kornfeld et al., 1981; LaMarco at al., 1984, Courtney et al., 1987; Костюкова H.H., 1989; Bolnois, 1982), и пневмококкового поверхностного белка А, обеспечивающего ему устойчивость к действию комплемента (Yother et al., 1987; Briles et al., 1988; Crain et al., 1990). Доказана роль капсулы пневмококка в защите его от фагоцитоза (Davis et al., 1968; Briies et al., 1992; Езепчук Ю.В., 1977). Высказываются предположения, что, помимо пневмолизина, токсическими свойствами обладают поверхностный протеин

A (Davis et al., 1988, 1992) и продукты энзимного распада клеточной стенки пневмококка (Tuomanen et al., 1985; Garsia-Bustos er al., 1989; Thomasz et al., 1989).

Однако результаты изучения патогенных потенций пневмококка не позволяют комплексно оценить их совместное воздействие на организм. До настоящего времени все еще распространенной является оценка патогенности пневмококков по ЛД50 для белых мышей при внутрибрюшинном введении определенных доз возбудителя (Вишнякова JI.A. и соавт„ 1988; Резцова Ю.В., 1990). Между тем эта аппликация исключает воспроизведение начального этапа взаимодействия возбудителя с клетками хозяина.

Оценка инвазивных свойств в сочетании с характеристикой адгезивной и токсической функций совершенно необходима для получения объективных представлений о патогенных потенциях пневмококка и природе механизмов взаимодействия возбудителя с макроорганизмом в системе "паразит-хозяин".

Широкое использование антибиотических и других антибактериальных препаратов существенным образом изменило течение пневмококковых заболеваний, нередко принимающих затяжное течение и рецидивирующий характер (Покровская Н.Я. и соавт., 1987; Сорокина М.Н., 1992). Механизмы формирования затяжных, рецидивирующих форм, в частности гнойных менингитов, менингоэнцефалитов и отитов, активно обсуждаются в современной литературе, однако в большинстве работ эта проблема рассматривается без учета возможности индукции в организме атипичных форм возбудителя, способных к длительной персистекции.

В начале 80-х годов появилась перспектива улучшения микробиологической диагностики ПИ благодаря усовершенствованию и внедрению количественных методов, а также иммунологических тестов обнаружения бактериальных антигенов и антител к ним. Вместе с тем диагностика ПИ все еще не налажена в полной мере в связи с питательными потребностями возбудителя, его изменчивостью, появлением устойчивых штаммов к пенициллину и другим антибиотикам, разнообразием клинических форм заболеваний, недостатком диагностических препаратов и отсутствием питательных сред отечественного производства.

Следовательно, назрела необходимость комплексного изучения вопросов, касающихся микробиологических и патогенетических аспектов ПИ у детей. Поиск и идентификация биомолекулярных функций патогенности пневмококка, разработка критериев их оценки, системный подход к изучению природы и характера взаимодействия пневмококка и

макроорганизма (в системе "паразит-хозяин") составили основу научных исследований в этом направлении.

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте детских инфекций и связана с НИР института.

Цель исследования. Выявить ведущие факторы патогенности и определить фенотипический профиль изменчивости пневмококков на основе разработки новых и совершенствования существующих методов выделения, идентификации и определения патогенных потенций возбудителя для оценки их значимости в формировании инфекционного процесса.

Задачи исследования. 1. Дать сравнительную характеристику патогенных потенций штаммов пневмококка, выделенных при различных формах ПИ у детей.

2. Изучить основные биологические свойства К-, Ь- и форм несбалансированного роста (ФНР) штаммов пневмококка, выделенных от больных и носителей.

3. Провести комплексную оценку значимости факторов патогенности пневмококков (адгезивных, инвазивных и токсических свойств) при различных формах инфекционного процесса (на клиническом материале и в эксперименте на животных).

4. Изучить особенности взаимодействия пневмококков с организмом хозяина на стадии формирования первичного инфекционного очага.

5. Определить динамику формирования антибиотикорезистснтности клинических изолятов, изучить их толерантность к бензилпенициллину.

6. Усовершенствовать методы лабораторной диагностики ПИ.

Научная новизна работы. Установлено, что исход взаимодействия в

системе "паразит-хозяин" определяется не столько показателями адгезивности штаммов пневмококка, сколько их инвазивными и токсическими свойствами. Показатели вирулентности для мышей, гиалуронидазной активности и адгезивности штаммов пневмококка не бывают выражены одновременно в одинаковой степени. Особенности вызываемого ими процесса определяются степенью активности того или иного фактора.

Феномен инвазии является ведущим в патогенезе генерализованных форм ПИ. Он обуславливается либо определенным уровнем гиалуронидазной активности, либо еще неизвестным фактором, которым характеризуются штаммы сероваров 1,2 и 3. Пневмолизин выполняет токсическую функцию при всех формах ПИ, реализуя патологические изменения в организме, степень выраженности которых определяется адгезивной или гиалуронидазной активностью штаммов пневмококка.

Установлено, что степень адгезивной активности пневмококка зависит от штаммовых особенностей возбудителя и наиболее выражена у бескапсульных вариантов пневмококка, выделенных от больных пневмонией и носителей. Капсула пневмококка создает экранирующий эффект в механизме лиганд-рецепторного взаимодействия в системе "паразит-хозяин".

Впервые на клиническом и экспериментальном материале доказана способность авирулентных для мышей штаммов (R-форм), обладающихj3 -гемолитической активностью и высокой адгезивностью, вызывать локализованные формы ПИ (например, пневмонию). Полученные данные могут явиться основанием для создания нового поколения пневмококковой вакцины, при конструировании которой целесообразно введение не только капсульных антигенов наиболее распространенных сероваров/серогрупп, но и других антигенных детерминант, например, пневмолизина.

Впервые в эксперименте in vitro показана возможность получения стабильных R-форм пневмококка под действием поверхностно-активных веществ (ПАВ) - 0,5% желчи крупного рогатого скота и 1% дезоксихолата натрия, что имеет значение для объяснения условий R -трансформации пневмококка в организме.

Установлена персистенция атипичных форм возбудителя (в виде L -форм и ФНР) при затяжном и рецидивирующем течении ПИ (менингите и отите), что указывает на их патогенетическую роль в развитии и поддержании инфекционного процесса в организме больного.

Впервые на основе изучения стимулирующего влияния лецитина на рост пневмококка обоснованы предпосылки к раскрытию механизма вторичной колонизации пневмококка в тканях органов (легких и мозга), богатых фосфолипидами, в частности лецитином.

Впервые в стране выявлены штаммы пневмококка, толерантные к бактерицидному действию пенициллина, а также хлорам-фениколрезистентные культуры, инактивирующие хлорамфеникол.

Практическая значимость работы. На основе антипневмококковой сыворотки отечественного производства использована реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) для экспресс-диагностики ПИ.

На принципе ингибиции роста клеток пневмококка препаратом - хинином предложен способ видовой идентификации Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae) (Приоритетная справка №5060421 от 08.10.92).

На основе коммерческого питательного бульона с лецитином создана бессывороточная питательная среда для выделения и культивирования пневмококков (A.c. №1622390 от 22.09.90).

В результате использования методов (цитобактериоскопии и РНИФ), позволяющих выявлять варианты пневмококка, утратившие способность к репродукции на искусственных питательных средах, а также специальных сред для выделения Ь-форм и ФНР возбудителя расширены возможности установления этиологической роли пневмококка в развитии различных форм

Обоснована тактика рациональной этиотропной терапии затяжных и рецидивирующих форм ПИ (менингитов, отитов) с учетом выявления атипичных (L-форм и ФНР) и толерантных к пенициллину штаммов возбудителя.

Реализация результатов исследования. По представленным результатам исследований получено 2 авторских свидетельства СССР на изобретения: "Питательная среда для культивирования Streptococcus pneumoniae" (№1622390 от 15.10.87), "Способ моделирования пневмококковой инфекции" (№1807515 от 10.10.92) (в соавт. с Л.В.Говоровой, М.О.Волковой и Р.А.Насыровым) и 1 приоритетная справка на изобретение "Способ идентификации пневмококков" (№5060421 от 08.10.92), на которую истребован патент.

В процессе выполнения работы подано и признано 12 рационализаторских предложений, в том числе 3 - отраслевого значения.

- методические рекомендации "Метод непрямой иммунофлюоресценции в ранней диагностике пневмококковой инфекции у детей". - J1., 1989, утверждены заместителем министра Минздрава РСФСР (в соавт. с А.П.Батуро, В.В.Ивановой, Г.П.Курбатовой, М.О.Волковой и др.);

- методические рекомендации "Диагностика и особенности терапии тяжелых форм острых респираторных заболеваний у детей". - Санкт-Петербург, 1992, утверждены заместителем министра Минздрава РФ (в соавт. с В.В.Ивановой, О.А.Аксеновым, Г.П.Курбатовой, Э.Г.Камальдиновой и др.);

- методические рекомендации "Современные методические подходы к микробиологической диагностике гемофильной инфекции". - Санкт-Петербург, 1992, утверждены заместителем министра Минздрава РФ (в соавт. с E.H.Ореховой, Н.Г.Лоскутовой, Л.И.Железовой и др.);

- информационное письмо ."Методы выделения и идентификации пневмококков, выделенных от больных и носителей". - Санкт-Петербург, 1994 (в соавт. с М.О.Волковой, Н.Н.Костюковой, Н.ГЛоскутовой, Н.А.Ивановым и др.).

ПИ.

Диссертационные материалы реализованы в отраслевой научно-техничекой программе в области медицины С. 14 (02.01.24 подпрограмма 02 "Стрептококковые заболевания", 1986-1988 гг.).

Результаты исследований используются в процессе обучения студентов на кафедрах микробиологии Военно-медицинской академии и Санкт-Петербургской государственной медицинской академий, а также в практической работе бактериологических лабораторий института Педиатрии (София, Болгария) и учреждений саннадзора Санкт-Петербурга.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на всесоюзных научных конференциях: "Биология возбудителей инфекционных заболеваний и их экспресс-диагностика" (г.Горький, 1986), "Менингококковая инфекция и гнойные менингиты (диагностика, профилактика и лечение)"(г.Архангельск, 1986, г.Новоснбирск, 1990); Всесоюзном съезде врачей-ифекционистов (г.Суздаль, 1992); Межрегиональной научно-практической конференции "Бактериальные инфекции у детей" (Санкт-Петербург, 1992);III Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 1992); Объединенном пленуме проблемных комиссий - "Медицинская микробиология" и "Теоретическая и прикладная инфекционная иммуноло -гня, посвященная вопросам персистенции и смешанным инфекциям" (Санкт-Петербург, 1990); XII Lancefield International symposium on Streptococci and Streptococcal diseases (Санкт-Петербург, 1993); заседаниях Всероссийского научного общества эпидемиологов и микробиологов Санкт-Петербурга (1985, 1988, 1990 гг.) и Москвы (1994г.); итоговых научно-практических конференциях НИИ детских инфекций МЗ и МП РФ (Санкт-Петербурга, 1986, 1987, 1988, 1989, 1990, 1992, 1993 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ.

Основные положения, выноснмые на защиту. 1. Фенотипический профиль изменчивости пневмококков (R-, L-формы и ФНР, устойчивые и толерантные к бензилпенициллину штаммы) влияет на течение и исход инфекционного процесса у детей. Отмеченный факт существования атипичных форм пневмококка в организме больного свидетельствует о функциональной мобильности и пластичности возбудителя, характеризует закономерную и своеобразную форму его адаптации к изменившимся условиям и указывает на необходимость коррекции терапевтической тактики.

2. Исход взаимодействия в системе "паразит-хозяин" определяется не столько показателями адгезивности штамма, сколько его инвазивными и токсическими свойствами. Показатели вирулентности для мышей,

гиалуронидазной активности и адгезивности штаммов пневмококка не бывают выражены одновременно в одинаковой степени. Особенности вызываемого ими процесса определяются степенью активности того или иного фактора.

3. Степень адгезивной активности пневмококка зависит от штаммо-вых особенностей возбудителя и наиболее выражена у бескапсульных вариантов. Капсула пневмококка создает экранирующий эффект в механизме лиганд-рецепторного взаимодействия в системе "паразит-хозяин".

4. Разработанные - РНИФ на основе сывороток отечественного производства, питательная среда с лецитином и хинин-тест для видовой идентификации S.pneumoniae, а также внедрение питательных сред на PPLO- основе позволяют существенно улучшить диагностику ПИ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 316 страницах машинописного текста, включая 66 таблиц, 21 рисунок; состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список литературы включат 211 отечественных и 283 иностранных источника,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В диссертационную работу вошел материал исследований, проведенных в лаборатории этиологических методов диагностики НИИ детских инфекций МЗ и МП РФ (Санкт-Петербург) в период с 1985 по 1993 гг. Всего обследовано 2278 детей в возрасте от 1 мес. до 14 лет, в том числе: 187 детей-с острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), 1296 - с острой нейроинфекцией, 317 - с острым гнойным отитом и 478 практически здоровых детей.

Материалом для исследования служили: у больных острой нейроинфекцией - кровь, спинно-мозговая жидкость (СМЖ); у больных ОРВИ - ларингеальные смывы, кровь, сыворотка крови; у больных острым гнойным отитом - гнойное отделяемое из среднего уха; у погибших от острой нейроинфекции - кровь, СМЖ, воспалительные участки ткани мозга; у здоровых детей - отделяемое слизистой оболочки носоглотки. Всего исследовано 3888 проб, в том числе: СМЖ - 1354, ларингеальных смывов -306, смывов из носоглотки - 206, крови - 304, гноя из среднего уха - 598.

Расшифровка вирусной этиологии ОРВИ у детей осуществлялась в вирусологической лаборатории института (руководитель - д.м.н., профессор О.А.Аксенов) общепринятыми методами с наборами антигенов вирусов гриппа A (HjNj, H3N2), гриппа В и С, аденовирусов, вирусов

парагриппа серотипов 1, 2 и 3, респираторно-синцитиального вируса, микоплазмы пневмонии, хламидий и простого герпеса.

Установление роли пневмококка и другой аэробной и факультативно-анаэробной микрофлоры в развитии острых пневмоний при ОРВИ у детей проводили в соответствии с Методическими рекомендациями ("Микробиологические и иммунологические методы диагностики инфекционного процесса при неспецифических заболеваниях легких'.' - JL, 1990).

Ранний этиологический диагноз острых пневмоний устанавливался на основании комплексной оценки результатов цитобактериоскопического и иммунофлюоресиентного (реакции непрямой нммунофлюоресценции -РНИФ) методов исследования. Постановку РНИФ осуществляли на основе отечественных поливалентных сывороток, содержащих антитела к 32 основным сероварам пневмококка для выявления капсульного антигена в клетках пневмококка, находящегося в ларингеальных смывах. Сыворотки изготовлены и любезно предоставлены доктором биологических наук А.П.Батуро (НИИВС им. И.И.Мечникова, РАМН, Москва).

Для ретроспективной серологической диагностики использовались парные сыворотки, полученные от больных на 5-7 и, повторно, на 10-14 дни болезни, у которых из бронхолегочного содержимого были выделены микроорганизмы в этиологически значимых концентрациях - не менее 10^ м.кл/мл ларингеальных смывов (Dixon, 1965). Уровень специфического иммунного ответа определяли с помощью линейной реакции агглютинации (микрометодом) с аутоштаммом; к пневмококку - в РНГА с использованием эритроцитарных диагностикумов, приготовленных на основе поливалентного полисахаридного антигена, представляющего собой лизат суточной бактериальной массы пневмококка наиболее распространенных сероваров (Походзей И.В., 1981), и коммерческих сенситинов-аллергенов (НИИЭМ, г.Казань) (Сниминская О.С., 1989).

Этиология гнойных менингитов и отитов устанавливалась на основании выделения возбудителей или обнаружения их антигенов в исследуемом материале (СМЖ и гнойном отделяемом из среднего уха). В СМЖ капсульные антигены Neisseria meningitidis серогрупп А, В и С, а также Haemophilus influenzae типа b обнаруживали в реакции латекс-агглютинации (PJTA). Выявление капсульного антигена пневмококка осуществляли в РНИФ. В РЛА использовали латексный антительный диагностикум (НИИЭМ им.Г.Н.Габричевского, Москва), в РНИФ - вышеупомянутые пневмококковые сыворотки НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН (Москва). В

этих исследованиях принимали участие кандидаты медицинских наук Н.А.Коржуева и М.О.Волкова.

Взятие и подготовку материала для выявления чистых культур от больных гнойными менингитами осуществляли согласно Приложению №2 к Приказу МЗ СССР №858 от 01.12.86 "О мерах по совершенствованию лечебно-диагностических и профилактических мероприятий по борьбе с менингококковой инфекцией и внедрению эпидемиологического надзора", от больных шойными отитами - согласно Приказу МЗ СССР №535 от 22.04.85 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений".

ФНР и L-формы пневмококка выделяли на PPLO-arape с 10% лошадиной сыворотки и 10% дрожжевого экстракта. Добавление к основе среды пенициллина (1000 ЕД/мл) и осмотического стабилизатора (2,6% NaCl) обеспечивало оптимальные условия для выделения этих форм. Одновременный посев исследуемого материала на среду с пенициллином и без него позволял объективно оценивать полученные результаты. Обнаружение L-форм или ФНР S.pneumoniae на средах без пенициллина давало основание предположить их образование непосредственно в организме.

Прочие этиологически значимые аэробные и факультативно-анаэробные бактерии выделяли и изучали унифицированными методами, изложенными в вышеупомянутом Приказе МЗ СССР №535 от 22.04:85 и в Руководстве "Bergey's manual of systematic bacteriology" (1984).

Дополнительно стрептококки дифференцировались с помощью дисков с бацитрацином (BBL) и с 20% желчи, а также по С AMP-тесту (Булгакова Т.Н., 1986).

Идентификацию бактерий семейства Enterobacteriaceae осуществляли на основе их ферментативной активности с использованием микрообъемного метода Е.П.Сиволодского с соавт. (1985).

Объектом исследования служили 592 штамма пневмококка. 93 культуры были выделены от детей с гнойным менингитом, 156 - от 'детей с пневмонией, 130 - от детей с гнойным отитом и 213 - от здоровых детей. В экспериментальных исследованиях использовались 3 референс-штамма сероваров 1, 2 и 3 (ГИСК им.Л.А.Тарасевича, Москва).

Идентификацию капсульных форм пневмококка проводили на основании морфологических и культурных свойств, а также чувствительности к оптохину и способности лизироваться желчью в соответствии с Методическими рекомендациями ("Микробиологические и

иммунологические методы диагностики инфекционного процесса при j неспецифических заболеваниях легких" - Л.,1990). !

Серовар/серогруппу 178 штаммов пневмококка устанавливали в реакции агглютинации на стекле с использованием отечественных поливалентных групповых и типовых сывороток, содержащих антитела к 32 сероварам пневмококка (Батуро А.П. и соавт.,1985). |

Параллельно 32 штамма, вызвавших менингит (17 культур) и отит (15 культур), были типированы в Копенгагене в Serum Institute в лаборатории доктораHenrichsen4а. Серогруппа пневмококка не совпала только в одном случае. Наряду с серогруппой у этих 32 штаммов был определен тип по белковому антигену. Серогруппу и серотип обозначали как серовар пневмококка.

В процессе изучения атипичных штаммов были использованы основные критерии их оценки. Для R-форм - спонтанная агглютинация в изотоническом растворе NaCl с трнпафлавином и окрашивание R-колоний кристаллическим фиолетовым (1:2000) в винно-красный цвет (Браун, 1968). Принадлежность R-форм к виду S.pneumoniae устанавливалась на основании обнаружения "дефектного" капсульного полисахарида в РНИФ с кроличьей сывороткой к R-формам пневмококка, приготовленной по методу Л.А.Вишняковой с соавт. (1985). К L-формам относили культуры, выросшие только на PPLO средах в виде L-колоний с характерной микроструктурой; к ФНР - культуры, выросшие также только на PPLO средах, но в виде колоний, ничем не отличающихся от обычных бактериальных форм пневмококка. Принадлежность ФНР и L-форм к виду S.pneumoniae определялась на основании специфического свечения отдельных структурных элементов в РНИФ. с использованием кроличьей сыворотки к "лизату" пневмококка.

Вирулентность тестировали на белых мышах массой 14-16 г путем внутрибрюшинного введения различных доз суточной культуры жизнеспособных клеток пневмококка. Уровень вирулентности для мышей устанавливали в соответствии с критериями Ю.В.Резцовой (1988) по ЛД50 (а£ 3 lg КОЕ/мл - высокая; > 3 < 6 lg КОЕ/мл - средняя; > 6 lg КОЕ/мл -низкая).

Адгезивная активность изучена у 425 штаммов пневмококка на клетках фарингеального'Эпителия по методу, в основе которого заложены способы, описанные Gibbons et al. (1975), К.Б.Грабовской и А.А.Тотоляном (1977). Донорами эпителия служили взрослые люди от 25 до 40 лет. Соскоб эпителия для получения эпителиоцитов получали способом, предложенным нами (с помощью щеточки от эндоскопа).

О степени адгезивности штамма судили по индексу адгезивности (ИА) микроорганизма - среднему количеству микробных клеток на 1 эпителиоцит, - учитывая 50 участвующих в адгезивном процессе эпителиальных клеток. Колонизационная активность оценивалась по индексу инфицирования (ИИ) - % эпителиоцитов с адгезированными клетками пневмококка.

Для изучения факторов адгезии пневмококка использовали разные способы обработки бактерий (Булгакова Т.Н., 1986): прогревание и обработку трипсином ("Serva") в концентрации 0,5-2,0 мг/мл. В качестве факторов, блокирующих адгезивный процесс, использовали липотейхоевую кислоту (ЛТК), фибронектин (Предприятие по производству бактерийных препаратов, Харьков) и антипневмококковые сыворотки (НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН, Москва).

Для определения роли полисахаридной капсулы пневмококка в проявлении его адгезивности были получены бескапсульные варианты микроба разработанным нами способом под действием ПАВ - 1% раствора дезоксихолата натрия.

Гиалуронидазу определяли по методу Мс Clean (1941) в модификациях Л.Г.Смирновой с соавт. (1946) и М.О.Волковой (1993) с использованием лиофилизированного препарата, что обеспечивало стандартные результаты. Гиалуронидазную активность выражали в титрах-максимальных разведениях исходной суспензии, в которых еще предотвращалось выпадение сгустка гиалуроната при добавлении 3-х капель 15% уксусной кислоты.

JJ - гемолизин (пневмолизин) определяли, используя метод Johnson (1972) в модификации М.О.Волковой (1993). Вместо ультразвуковой обработки клеток использовали их аутолизат после 24 ч культивирования в бульоне с лецитином.

С целью комплексной оценки адгезивности, гиалуронидазной и токсической функций штаммов пневмококка в развитии ПИ проведено экспериментальное исследование на 130 крысах.

Чувствительность к антибиотикам определяли двумя методами: серийных разведений в агаровой и бульонной срезах (в соответствии с Приказом Минздрава СССР №250 от 13.03.75 "Об унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам") и диффузии в агар с использованием стандартных дисков (в соответствии с инструкцией и рекомендацияшН.И.Гивенталя с соавт., 1984).

Толерантность штаммов к пенициллину устанавливалась на основании определения соотношения минимальной бактерицидной концентрации

(МБцК) и минимальной иншбирующей концентрации (МИК), равного или превышающего 32.

Способность устойчивых и умеренно устойчивых штаммов пневмококка инактивировать антибиотики (пенициллин' и хлорамфеникол) определялась с помощью усовершенствованных нами методов Gots (1945), Kanazawa (1966) и B.B. Лисина (1966).

Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с правилами, изложенными в пособии И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева (1962). Оценка статистической значимости показателей и различий рассматриваемых выборок производилась по критерию Стьюдента при уровне значимости р не выше 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Применительно к экспресс-диагностике ПИ разработан метод, чснованный на комплексной оценке цитобактериоскопии и РНИФ с использованием пневмококковых сывороток отечественного производства (НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН, Москва). Испытания РНИФ проведено на 2258 пробах (ларингеальных смывов, СМЖ, гнойного отделяемого из среднего уха), полученных от 1765 больных. Только с помощью РНИФ и цитобактериоскопического методов пневмококковая природа гнойного менингита установлена у 54 (43,6%) больных из 124 случаев, гнойного отита - у 23 (19,3%) из 119 и острой пневмонии - у 7 (5,6%) из 124 (табл.1). '

Полученные результаты свидетельствуют о высокой диагностической чувствительности и специфичности РНИФ - выявляются пневмококки, даже утратившие способность к репродукции на 5% кровяном агаре, и наблюдается специфическое свечение только полисахаридной капсулы пневмококка. Кроме того, метод (цитобактериоскопии и РНИФ) отличается быстротой (1,5-2 ч} и информативностью, так как позволяет иметь ценную информацию о характере и динамике воспалительного процесса в разные периоды болезни. Наряду с этим с помощью РНИФ возможной определение серовара клеток пневмококка.

Учитывая биологическую потребность пневмококков в холине, разработан способ приготовления среды, основанный на замене нативной сыворотки животного стандартным препаратом - лецитином (Lecitin-' Standard), производным холина. Добавление лецитина к питательному бульону в пределах 0,1-0,01 г/л оказывало стимулирующий эффект на размножение пневмококков, стабилизацию популяций in vitro. Четырех-

Таблица 1

Диагностическая ценность методов выявления S. pneumoniae

Диагноз (исследуемый материал) Количество обследованных больных (проб) В том числе больных с положительным результатом Методы выявления пневмококка

РНИФ + цитобакте- риоскошш только высев цитобакте-риоскопия -+ РНИФ + высев

абс. г абс. 7.* абс. Xх абс. % <

Гнойный менингит (СМЖ) 1296 (1354) 124 9.6 54 43.5 2 1.6 68 54.8

Гнойный отит (отделяемое из среднего уха) 317 (598) 119 37.5 23 19,3 - - 96 80.6

Острая пневмония (ларингеальные смывы) 152 (ЗОЙ) 124 81.5 7 5,6 - - 117 94,4

1765 (2258) 367 20.7 84 23.0 2 0.5 281 76.5

Примечание. £ - процент от числа положительных результатов.

пятикратное пассирование на данной среде (в отличие от широко используемого 20% сывороточного бульона) приводило к усилению капсулообразования, повышению вирулентности (ЛД^д) для белых мышеи (на 2-3 lg) и более выраженной f -гемолитической активности.

Полученные результаты позволяют расценивать лецитин как "поставщика" холима, основного структурного компонента тейхоевой кислоты и ЛТК, составляющих клеточную стенку пневмококка (Briles et al., 1973; Tomasz, 1981). Предложенный способ для культивирования пневмококков явился предметом изобретения.

Известный способ видовой идентификации пневмококков, основанный на ингнбиции роста клеток пневмококка импортным препаратом оптохнном, был заменен тестом ингибиции роста клеток этого микроорганизма отечественным препаратом-хинином - алкалоидом, содержащимся в коре различных видов хинного дерева. Как показали проведенные на 156 штаммах вида S.pneumoniae ипытания теста, пневмококки, в отличие от других испытанных Л -стрептококков (124 штамма), обладают видовой чувствительностью к 0,6-0,8 мкг/мл хинина, при этом отмечена полная корреляция показателей чувствительности пневмококков к хинину и оптохину. Разработанный способ видовой ¡щентификации пневмококков не уступает общепризнанному и рекомендованному ВОЗ оптохиновому тесту. Разработка теста с хинином явилась предметом изобретения (истребован патент).'

Преобладание положительных результатов исследования, полученных цитобактериоскопическим методом и РНИФ, над результатами высева возбудителя (общепринятым культуральным методом) при исследовании СМЖ и гнойного отделяемого из среднего уха (на фоне интенсивной антибактериальной терапии), явилось основанием для проведения целенаправленных исследований на атипичные формы пневмококка (ФНР и L-формы). Один из возможных вариантов решения проблемы выделения атипичных штаммов пневмококка был найден за счет включения питательных сред на PPLO - основе в общепринятую схему бактериологического материала от больных.

Таким образом, сочетанное применение общепринятых и разработанных нами методологических подходов при проведении лабораторного 'диагноза ПИ позволило подтвердить, что в этиологической структуре бактериальных менингитов у детей пневмококки занимают второе место после менингококка, и доля их участия в среднем за последние 10 Лет в Санкт-Петербурге составляет 13,4% (от 5% до 19%). Установлена доминирующая роль пневмококка (66,4%) и его ассоциаций с палочкой

гемофилюс инфлюэнце, золотистым стафилококком и клебсиеллой пневмонии (22,9%) в развитии острых пневмоний, осложняющих течение ОРВИ у детей. Определена основная роль этого возбудителя в возникновении острого отита (46,8%).

На основании данных анализа клинических наблюдений (анализ 152 историй болезни) и лабораторных исследований представилось возможным выделить два варианта вирусно-бактериального поражения легких при гриппе и других ОРВИ у детей. Первый - характеризуется наслоением монопневмококковой инфекции на вирусную в 1-3-й дни болезни и составляет 42%. При втором варианте на вирусную инфекцию наслаивается ПИ, вторично - другая бактериальная инфекция, преимущественно "грамотрицательная" (19%), в которой основная роль принадлежит палочке гемофилюс инфлюэнце.

Анализ частоты распространенности отдельных сероваров пневмококков, выделенных от больных и носителей, подтвердил данные других авторов о преимущественном распространении среди детей сероваров/серогрупп 19;6;1 и 15, составивших 74,2% всех типируемых культур (р < 0,01) (Kalin et al., 1980; Трещинский А.И. и соавт., 1986; Покровская Н.Я. и соавт., 1987; Austrian, 1989; Катосова JI.K., 1990). При этом обращает на себя внимание выявление от больных пневмококковым менингитом серовара 2, редко регистрируемого в Европе (Kalin et al., 1980; Austrian, 1989).

Полученные результаты свидетельствуют о преобладающем значении у больных пневмококковым, менингитом (19,2%) и пневмококковым отитом (32,1%) сероваров/серогрупп 19, 1 и 3, серовара 3 -у носителей (38,0%) и серовара 6 -у больных пневмонией (34,5%).

Среди штаммов серологической группы 19 превалировал тип 19F, который выявлялся как у носителей, так и у больных менингитом и отитом. Не исключено, что носители штаммов пневмококка серовара 19F могли быть источниками штаммов, вызвавших эти заболевания.

Внедрение современных методических подходов при проведении лабораторного диагноза открыло возможность констатировать факт существования различных форм пневмококка в организме больного и носителя: S-, R-, ФНР и L-форм.

В процессе обследования 276 больных ПИ из крови и ликвора 70 детей с гнойным менингитом, ларингеальных смывов 110 детей с острой пневмонией, отделяемого из среднего уха 96 детей с острым гнойным

отитом, а также из носоглоточных смывов 213 условно здоровых детей были выделены и изучены как бактериальные формы (S- и R- формы), так и варианты пневмококка с дефектом клеточной стенки (ФНР и L-формы).

Соотношение выделенных S-, R- форм, ФНР и L- форм пневмококка при различных клинических формах ПИ было неравнозначным (табл.2, рис.1). Наиболее часто капсульные штаммы выделялись у больных менингитом и отитом (соответственно 90,0 ± 3,0 и 66,7 ± 4,8%) и реже - у больных пневмонией и носителей (соответственно 27,2 + 4,2% и 9,9 ± 2,0%). Обращает на себя внимание высокая частота выявления R- форм у больных пневмонией и носителей (72,8 + 4,2% и 90,1 + 2,0%). Выделение L-форм и ФНР наблюдалось только у больных менингитом и отитом, соответственно: L-форм - у 2 (2,9 + 2,0%) и у 10 (10,4 + 3,1%) ; ФНР - у 3 (4,2 + 2,3%) и у 12 (12,5 ± 3,3%). В ряде случаев при анализе первичных посевов (СМЖ, крови и гнойного отделяемого из среднего уха) на среде для культивирования L-форм бактерий наблюдался рост типичных L-колонин, состоящих из длинных нитей и крупных шаровидных форм, которые при дальнейшем пассировании оказывались нежизнеспособными. Специфическое свечение отдельных структурных элементов клеток в РНИФ, с использованием пневмококковой сыворотки к "лизату" клеток пневмококка, было основанием полагать, что это были нежизнеспособные варианты L-форм пневмококка. В данном' случае понятие "нежизнеспособность" представляется в достаточной мере условным. Возможно, эти штаммы нежизнеспособны лишь применительно к пассированию на используемой нами среде. Не исключено, что на других средах (более адаптированных к выделению L-форм), в других условиях культивирования они были бы способны к репродукции и реверсии в исходное для данного вида состояние. Их "нежизнеспособность" свидетельствует лишь о' более высоком уровне паразитизма таких культур, претерпевших глубокую фенотипическую изменчивость, а поэтому адаптировавшихся к существованию в строго определенных условиях (Коптелова Е.И. с соавт., 1973; Прозоровский C.B. и соавт., 1981).

Результаты ретроспективного анализа клинического материала (28 историй болезни больных менингитом и отитом с затяжным течением) свидетельствуют1 о возможном влиянии интенсивной антибактериальной терапии на формирование в организме атипичных штаммов пневмококка -L-форм и ФНР.

Данные табл. 3 характеризуют результаты бактериологического исследования материала от больных до и в процессе проведения

Таблица 2

Обобщенные результаты бактериологического обследования детей с ПИ

Клиническая форма Ш Исследуемый материал Количество больных и здоровых детей с высевом В том числе выделявших:

S - R - ФНР L -

менингит ликвор, кровь 70 03) 63 2 3 2 2,9 + 2,0% (2; 4,3+2,17.)

90,0 + 3,0% (68; 73,1+4,67.) 2,9 + 2,07. (14; 15,0±3,7%) 4,2 + 2,37. (7; 7,6+2,77.)

отит отделяемое из уха 96 (130) 64 10 12 10 10,4 + 3,1% (10; 7,7+2,37.)

66,7 + 4,87. (81; 62,3+4,22) 10,4 + 3,17. (22; 16,9+3,3%) 12,5 + 3,37. (17; 13,1+2,9%)

пневмония Ларингеаль-ныи смыв 110 (156) 30 27,2 + 4,27. (45; 28,8+3,6%) 80 72,8 + 4,27. (Ill; 71,2+3,6% - -

здоровое носитель- ство Смыв из носоглотки 213 (213) 21 9,9 + 2,0% (21; 9,9+2,07.) 192 90,1 + 2,07. (192; 90,1+2,07. - ... ..... -

Примечание.

Б - бактериальная капсульная форма; И - бактериальная бескапсульная форма; Ь - Ь - форма; ФНР - форма несбалансированного роста; в скобках указано количество выделенных культур.

^ \

Ь-формы 90 %

'с? >

р-ФОРМЫ

66,7%

менингит

отит

О -

Б -формы

И ь -формы и ФНР

З'-ФОРМЫ4

пневмония

носительство

РисЛ. Частота выявления типичных и атипичных штаммов пневмококка от детей с ПИ

Таблица з

Характеристика штаммов Б.рпешпогпае, выявленных у детей с ПИ ( с учетом предшествующей антибактериальной терапии)

1 ¡Клиническая I форма Ш I .......... 1 1 Источник | Всего выделения | штаммов | 1 Количество выделенных штаммов пневмококка

до лечения на фоне лечения |

1 1 5 - | I? |ФНР 1 | 1 1-\ Б - 1 I? - ФНР 1-

I менингит 1 |абс. ликвор, | кровь | 7. 1 93 1 1 54 | 7 | 1 14 7 7х 4х

79,4+3,8 | 50,0 | | 20,5+3,8 50,0 100, о" 100, о"

¡отит 1 |або. отделяемое | из уха | 7. 1 130 62 | 12 | | 19 10 17 * . — X 10

76,5+4,7 |54,5+10,6| 1 123,5+4,7 45,5+10,6 100,0* 100, о'

{пневмония 1 1 |або. ларингеаль- | ный смыв | 7. 156 ... 25 | 56 | | 20 55

55,5+7,4 (50,5+4,7 ( 1 . ( ¡44,4+7,4 49,5+4,7 , ..

Примечание. 3 -капсульная форма; I? -Сескапсульная бактериальная форма; ФНР - форма несбалансированного роста; НЛ - нестабильная Ьформа; числитель- абсолютное число штаммов; знаменатель - процент; х - различия достоверны ( р ¿-0,01).

антибактериальной терапии. Именно в группе больных (у 28 из 115, 24,3%), получавших интенсивную пенициллинотерапию, при последующих бактериологических исследованиях выделялись атипичные штаммы в виде ФНР н L-форм. У 5 больных с затяжным течением пневмококкового менингита одновременно выявлялись как капСульные (сероваров/серогрулп 2, 6 и 15), так и атипичные варианты пневмококка в виде L-форм и ФНР. У этих больных развивачись тяжелые осложнения, такие, как дислокационный синдром (2 случая) и субдуральнын выпот (3 случая). Возможно, что при этих обстоятельствах создаются условия, способствующие длительному сохранению возбудителя в организме в формах, способных к длительной персистенции.

Обнаружение L-форм и ФНР только в группе больных, получавших пенициллинотерапию (до бактериологического обследования), предполагает L-трансформируюшее действие пенициллина на возбудитель.

Показатели частоты выявления R- вариантов пневмококка в сравниваемых группах практически не отличались между собой и были равны соответственно 50,0%, 54,5% и 50,5% - до лечения и 50,0%, 45,57с и 49,5% - на фоне антибактериальной терапии (р>0,5).

Отсутствие разницы в частоте выделения R- форм пневмококка из организма больных до лечения и на фоне интенсивной антибактериальной терапии в сравниваемых группах позволяет предположить, что процесс диссоциации возбудителя в организме менее всего связан с антибактериальной терапией.

В опытах in vitro под действием ПАВ (0,1% раствора дезоксихолата натрия и 0,5% раствора желчи крупного рогатого скота) с последующей селекцией получены стабильные бескапсульные варианты пневмококка, которые идентичны R- мутантам, выявляемым у больных пневмонией и носителей. Процесс диссоциации пневмококка под действием ПАВ сопровождался усилением адгезивной и сохранением JJ - гемолитической его активности, но утратой гналуронидазной способности и вирулентности для мышей.

Выявленная нами относительная легкость получения стабильных R-форм под действием ПАВ и высокая частота выделения R- мутантов у больных пневмонией и носителей предполагает механизм образования таких форм в бронхолегочной системе, например, под действием муцина, также относящегося к группе ПАВ (Degand et al., 1973).

' Частота регистрации у детей с ПИ штаммов, резистентных к 1 - 6 антибиотикам, составила 44,6%, в том числе к 5 - 6 - в 3,5% случаев.

Заслуживает внимания появление резистентных культур к пенициллин частота выявления которых в период 1985 по 1991 гг. находилась

пределах 1,6-4,1%.

Обнаружение полирезистентных культур пневмококка обусловь интерес к изучению у -таких штаммов инактивирующей способное

у всех изученных штаммов ( культур), устойчивых к хлорамфениколу, обнаружена способнос инактивировать этот антибиотик. О способности резистентных кулы пневмококка инактивировать хлорамфеникол имеются сообщения толь в '"рубежной печати (Matthews et al.,1988).

Публикации, свидетельствующие о существовании одновремен резистентных и толерантных к пенициллину клинических изолят пневмококка. (Liu, 1986), явились основанием для выявления толерантных этому алтбиотнку штаммов.

Как показали результаты проведенных исследований, толерантные пенициллину штаммы выделялись из крови и ликвора только больш менингитом (13,2%). В этой связи наиважнейшее значение для эффекта ной терапии имеет тот факт, что МБцК в отношении толерантных шта мов не может быть предсказана на основании определения только МИ (табл.4).

Таким образом, выявленные формы фенотипической и генотипиче кой изменчивости возбудителя (R-, L-формы, Ф Iff*, толерантные полирезистентные культуры) расцениваются как результат закономерно и неизбежного процесса адаптации пневмококка в условш антибактериальной терапии и под действием элиминирующих модифицирующих факторов макроорганизма. В свою очередь, измененнь формы возбудителя в условиях развивающегося инфекционного процесс определяют течение и исход ПИ у детей, а также указывают v необходимость коррекции терапевтической тактики.

Обнаруженные штаммовые особенности пневмококков при различны формах и характере течения ПИ у детей явились основанием дл проведения сравнительной оценки их патогенных свойств.

Оказалось, что ПИ у детей вызывают преимущественно (р < 0,01 низковирулентные (lg ЛЦзд > 6) и авируленгные для мышей изоляты. Tai среди 39 изученных штаммов, вызвавших менингит, только 12 (30,8 + 7,37с были высоковирулентными для мышей (lg ЛДэд < 3). Всего 7 (27,0 ± 8,7% культур из 26, обусловивших отит, и 10 (33,3 + 8,6%) культур из 30,

Таблица 4

Изучение толерантности к бензилпенициллину у штаммов пневмококка, выявленных у детей с ПИ

-,-1----,

циническая | Число | В том числе штаммов, устойчивых эрма Ш I штаммов | к бактерицидному действию бензил-источник вы- I пневмо- I пенициллина (соотношение МЗцК/МИК) эления) I кокка |-1-1-1-1-1-

энингит | | 29 I 6 I 13 | 11 | б | 3

ликвор,кровь) j 68 1-'-1---1-1-

I I 59; 86,87. | 9; 13,2%

-!-1-1-1--1-1-1-

невмония I I I I I I !

ларингеальные | 96 | 91 | 5 | - I - I - I

смывы) I I 11 ! ! !

отит I I I I I I I

(отделяемое | 64 1 3 1 10 j 51 | - ¡ - 1

из уха) I 111111

_|-1-1—I-1—I—I—

здоровое но- | 111111

сительство i | 1 II j j j

Ссмыв из но- | 56 I 41 I 15 I - - -

соглотки) I ! 1 I * I_

Всего....... I 284 | 275; 96,8% I 9; 3,2%

вызвавших пневмонию, оказались высоковирулентными для мышей ЛД50 4 3).

Высоковирулентными для мышей свойствами обладали практически все (96,9 + 3,0%) штаммы, принадлежащие к сероварам 1, 2, 3 и 4, независимо от источника выделения. Штаммы сероваров/серотипов б, 15, 18 и 19, как правило, характеризовались низкой и умеренной вирулентностью для мышей, показатели ЛДзд у большинства из них (89,1 + 3,4%) находились в пределах > 3 1§ - $ 6 - > б от числа КОЕ/мл, хотя эти штаммы наиболее часто выявлялись при тяжелых и генерализованных формах ПИ (отиты, менингиты).

Установленные штаммовые характеристики возбудителя (по ЛД^д для мышей и принадлежности к определенному серовару) определяли различные варианты течения и исхода инфекционного процесса у детей. Так, штаммы пневмококка сероваров 1, 2 и 3 (1§ ЛД^д $ 3) обусловили тяжелое течение ПИ. У детей с менингитом (124 случая), вызванным пневмококками сероваров 1 и 2, в 33,3% (у 4 детей) случаев зарегистрированы летальные исходы и в 16,6% (у 2 детей) случаев -менингиты с затяжным течением. Штаммы пневмококка сероваров 1 и 3 способствовали развитию деструктивных вариантов течения пневмонии (у 7 из 11 детей, 63,6%). Летальные исходы и тяжелые осложнения зарегистрированы при ПИ, обусловленной и другими сероварами (преимущественно серогрупп 19 и 6), характеризующимися низкой вирулентностью для мышей (^ ЛДзд > 6). У 8 из 18 (44,4%) детей штаммы пневмококка этих серогрупп вызывали менингиты с летальным исходом, а у 11 из 24 (45,8%) - отогенные менингиты.

Полученные результаты еще раз подтверждают весьма часто забываемое положение, что наличие капсулы (и ее химические структуры) не является единственным фактором, определяющим вирулентность пневмококка, ибо вирулентность штамма для человека не всегда совпадает с его вирулентностью для мышей. Только штаммы сероваров 1, 2 и 3 продолжают оставаться наиболее вирулентными как для мышей, так и для человека (Резцова Ю.В., 1990; ВгПеэ е1 а1., 1992; Волкова М.О., 1993).

Таким образом, основываясь на том, что оценка патогенности штаммов пневмококка на основании ЛДзд для белых мышей не обеспечивает объективную характеристику патогенных потенций возбудителя, изучены их адгезивность, гиалуронидазная активность и способность вырабатывать пневмолизин.

Установлено, что все штаммы, выделенные от детей с различными клиническими формами ПИ, характеризуются различной степенью

адгезнвной активности по отношению к фарингеальному эпителию человека: наибольшая присуща нзолятам, выделенным от носителей и больных пневмонией, наименьшая - от больных менингитом и отитом.

Адгезивная активность как капсульных, так и бескапсульных штаммов зависит от источников выделения и клинического проявления ПИ. Так, штаммы, выделенные при менингите и отите (не только S-формы, но и R-формы), были менее адгезивны, чем штаммы, изолированные от носителей и больных пневмонией (ИА соответственно равны 22,3 + 0,8 и 19,5 + 0,3 против 64,2 + 2,1 и 65,3 + 0,3 у капсульных форм и 51,5 + 7,9 и 34,2 + 2,3 против 160,5 + 2,3 и 155,6 ± 7,5 у бескапсульных штаммов) (рис.2).

С целью выяснения причин высокой адгезивности бескапсульных культур пневмококка проведено изучение процесса адгезии на модельной системе фарингеального эпителия.

Отсутствие ингпбирующего эффекта на адгезию пневмококка к клеткам чувствительного эпителия при обработке типоспецифической сывороткой испытуемых штаммов позволяет считать, что типоспецифический полисахарид (капсула) пневмококка не является адгезином. Более того, усиление ее продукции приводит к снижению уровня адгезии штаммов. И наоборот, утрата или исчезновение капсульного вещества бактериальных клеток приводит к повышению их адгезивности. Выявленные существенные различия в адгезивной способности капсульных и бескапсульных штаммов возбудителя на модельной системе с фибронектином и JITK подтверждают впервые высказанное Seiinger et al.(1979) предположение об экранирующем эффекте капсулы в механизме лиганд-рецепторных взаимоотношений в системе "паразит-хозяин". Аналогичные закономерности обнаружены и при изучении других капсульных видов, например, у N.meningitidis (Миронова Т.К. с соавт., 1989) и у S. группы В (Тотолян A.A. с соавт., 1990).

В процессе изучения состояния естественной колонизации эпителиоцитов ротовой полости "зеленящим" стрептококком и их устойчивости к колонизации пневмококком было отмечено, что при X взаимодействии S.salivarius с низким (ИА 20 м.кл/эпителиоцит) и средним (ИА >, 20 < 50 м.кл/эпителиоцит) уровнями колонизационной активности с высокоадгезивными (ИА > 50 м.кл/эпителиоцит) штаммами пневмококка уровень естественной колонизации эпителиоцитов снижался в 2 - 10 и более раз (г = -0,79). В то же время после взаимодействия эпителиоцитов с пневмококками, обладающими низким уровнем адгезивной

ми ИНГИ т пнввтанн* отиТ наснтшатьо

Рис.2. Показатели адгезивной активности капсульных и бескапсдльных нтакмов 5.рпеимоп1ае. выявляемых от детей с ПИ

активности, показатели колонизационной активности "зеленящего" стрептококка практически не изменялись.

Полученные результаты, видимо, могут расцениваться как проявление агрессивности высокоадгезивных штаммов возбудителя.

Все 39 менингеальных штаммов продуцировали гиалуронидазу. В то же время 22 (84,6 -¿- 7,1%) штамма из 26, выделенных от больных отитом, и только 11,5 + 2,8% (15 культур из 130) и 10,6 + 2,6% (13 культур из 122), выделенных, соответственно, от носителей и больных пневмонией, способны были вырабатывать этот фактор.

Оценка уровней гиалуронидазной активности штаммов различного происхождения свидетельствовала о том, что штаммы менингеального происхождения были более активны. Средняя геометрическая титров (СГТ) гиалуронидазы у штаммов, вызвавших менингит, была достоверно выше (12,8 х 1,3), чем у штаммов, вызвавших отит и пневмонию (6,1 х 1,5 н 7,9 х 1,7 соответственно) ( р < 0,01). В то же время достоверных различий между СГТ гиалуронидазной активности у штаммов, выделенных у носителей и больных менингитом, не обнаружено. Это, вероятно, связано с незначительным числом наблюдений и большим разбросом показателей гиалуронидазной активности в группе штаммов, выделенных от здоровых носителей (коэффициент вариации в этой группе штаммов составил 55,7%). Не исключено, что носители штаммов пневмококка с высокой гиалуронидазной активностью могли быть потенциальными источниками штаммов, способных вызвать менингит.

Установлено, что все штаммы, выделенные от больных в бактериальной форме (как капсульные, так и бескапсульные), продуцировали токсический фактор - пневмолизин. Только 56,2% культур (32 из 57 штаммов), выделенных от здоровых носителей, обладало § -гемолитической активностью, 1/3 из которых составляли штаммы в бескапсульной форме. СГТ пневмолизина 4 групп штаммов (изоляты от больных менингитом, отитом, пневмонией и носителей) составляли соответственно 50,0; 46,8; 42,6 и 25,7.

Высокая адгезивная активность штаммов различного происхождения имела обратную умеренную связь с их вирулентностью для мышей (г=-0,342). Оценка полученных данных показывает, что вирулентные штаммы пневмококка могут быть как высокоадгезивными, так и обладать средним или низким уровнем адгезивности. В то же время высокой степени'Обратная связь обнаружена между уровнем адгезивности и показателями гиалуронидазной активности штаммов (г=-782). Биологический смысл выявленного факта, видимо, заключается в том, что штаммы пневмококка,

способные вызвать генерализованные формы ПИ, могут быть менее адгезивны, но при этом должны обладать другими факторами патогенности, обеспечивающими им функции инвазивности и токсичности, например, гиалуронидазной и JJ - гемолитической активностью штаммов. Установлено, что все штаммы, выделенные от больных менингитом и характеризующиеся низкой вирулентностью и низкими показателями адгезивной активности, продуцировали гиалуронидазу и пневмолизин, причем культуры пневмококка с высокими титрами гиалуронидазы и пневмолизина достоверно чаше выявлялись у этой группы больных (74,5%, р < 0,05). Выявлена обратная связь между степенью гиалуронидазной и JI -гемолитической активностью, с одной стороны, и показателями вирулентности для мышей, однако коэффициент корреляции указывает на среднюю степень этой связи (г=-0,42). Полученные результаты косвенно свидетельствуют о том, что гиалуронидаза не является единственным фактором инвазии, равно, как и пневмолизин, - не единственный фактор токсичности, и высоковирулентные для мышей штаммы, очевидно, не всегда нуждаются в этих факторах.

Подтверждением этого предположения явились результаты сопоставления показателей гиалуронидазной и j3 - гемолитической активности с показателями вирулентности для мышей. Так, штаммы сероваров 1 и 2, вызвавшие тяжелое течение мениншэнцефалита у детей, обладали низкой гиалуронидазной и f - гемолитической активностью. Вместе с тем выявленная повышенная аутолитическая активность штаммов этих сероваров предполагает действие других факторов с токсической функцией - продуктов энзимного распада клеточной стенки возбудителя (Tuomanen et al., 1985; Garcia - Bustos et al., 1989; Tomasz et al., 1989), а также пока неизвестного "мышиного" токсина.

Обнаруженные особенности - высокая адгезивная активность и способность вырабатывать пневмолизин (токсический фактор) у бескапсульных штаммов, вызвавших пневмонию и отиты,- указывают на большое значение этих факторов в развитии локализованных форм ПИ.

На модели интраназалного заражения белых беспородных мышей (совместно с М.О.Волковой) показана существенная роль гиалуронидазной активности в процессе инвазии пневмококка в мозг. Способностью преодолевать ГЭБ мышей обладали только штаммы, имеющие титр гиалуронидазной активности, равный 8 и выше. Однако, учитывая высокую чувствительность белых мышей к пневмококку, эта модель не обеспечивала условия объективной оценки всех трех факторов патогенности возбудителя. Аналогичные исследования были повторены на животных,

обладающих относительно высокой видовой устойчивостью к пневмококку. С этой целью нами (совместно с Л.В.Говоровой, М.О.Волковой и Р.А.Насыровым) разработана модель ПИ у белых крыс. Для повышения проницаемости ГЭБ применяли комплексное введение U - и -адреноблока-торов - фентоламина и обзидана.

В опытных группах животных, зараженных на фоне адреноблокато-ров, штаммы пневмококка только с высоким титром гиалуронидазы (8 и выше) смогли проникнуть со слизистой носа в головной мозг, преодолев ГЭБ. Заражение интактных крыс (без адреноблокады) приводило, как правило, к проникновению пневмококка в легкие, и у части животных - в селезенку, но в мозг никогда не приводило.

У животных, зараженных авирулентными для мышей бескапсульными штаммами, не продуцирующими гиалуронидазу ( либо продуцирующими ее в низких титрах 4), не обладающими высокой адгезивной активностью и пневмолизином, развивалась локализованная форма ПИ в легких. Авирулентные штаммы, не продуцирующие гиалуронидазу и пневмолизин, способны были только колонизовать слизистую носа после интраназаль-ного заражения.

Полученные результаты позволяют расценивать пневмолизин как фактор патогенности, выполняющий токсическую функцию в организме, степень выраженности которого во многом определяется адгезивной и гиалуронидазной активностью штаммов.

Высокая частота фенотипически измененных штаммов пневмококка, в частности, бескапсульных форм пневмококка, естественно, позволила предположить наличие факторов, усиливающих патогенные потенции возбудителя (кроме капсулы).

Поиск и идентификация подобных факторов, а также выяснение контролируемых ими функций явились вторым важным аспектом проблемы изучения патогенности пневмококков.

Например, если рассматривать потребность пневмококков в холине, то этот признак вполне можно отнести к типичному маркеру, коррелятору патогенности. Потребность в холине. хотя и не имеет непосредственного отношения к детерминантам с их выраженной потенцией к деструкции, однако, как показали наши исследования, видимо, существенна для экспрессии вирулентности в связи с обеспечением функции питания клетки, ее размножения, зашиты от фагоцитоза. И если учесть, что сурфактант легкого и мозговая ткань содержат до 80% лецитина (холинпроизводный фосфолипид) ( Романова Л.К., 1983), который оказывает стимулирующее влияние на пневмококки, то экстраполяция полученных нами данных на

процессы, происходящие в организме, предполагает развитие механизмов, способствующих проявлению вторичной колонизации возбудителем глубоко расположенных органов.

ВЫВОДЫ

1. Исход взаимодействия в системе "паразит-хозяин" определяется не столько показателями адгезивностн штаммов пневмококка, сколько их инвазивными и токсическими свойствами.

2. Показатели вирулентности для мышей, гиалуронидазной активности и адгезивности штаммов пневмококка не бывают выражены одновременно в одинаковой степени. Особенности вызываемого ими процесса определяются степенью активности того или иного фактора патогенности.

3. Штаммы пневмококка, выделенные от детей с различными клиническими проявлениями ПИ, характеризуются разной степенью адгезивной активности по отношению к фарингеальным клеткам человека: наименьшая присуща изолятам, выделенным от больных менингитами и отитами, наибольшая - от больных пневмониями и носителей.

4. Степень адгезивной активности пневмококков зависит от штаммовых особенностей возбудителя и наиболее выражена у бескапсульных вариантов. Капсула пневмококков создает экранирующий эффект в механизме лиганд-рецепторных взаимоотношений в системе "паразит-хозяин". Колонизационная активность пневмококков к чувствительному эпителию находится в обратной пропорциональной зависимости от уровня естественной колонизации слизистой.

5. Выявлены доминирующие серовары/серогруппы пневмококка, обусловившие различные клинические формы ПИ у детей Санкт-Петербурга: при менингитах - 1, 2, 6, 15 к 19, при отитах -I, 3, б, 18 и 19, при пневмониях, осложнивших течение ОРВИ, - 1, 3, 6 и 15, при носительстве - 3, 6 и 19. Среди штаммов пневмококка 19 серологической группы превалирует серовар 19F.

6. Установлена персистенция атипичных форм (в виде L -форм и и ФНР) при затяжном и рецидивирующем течении пневмококковых менингоэнцифалитов и отитов, что указывает на их патогенетическую роль в развитии и поддержании инфекционного процесса в организме больного.

7. В опытах in vitro под действием ПАВ (0,1% раствора дезоксихола-та натрия и 0,5% раствора желчи крупного рогатого скота) с последующей селекцией получены стабильные бескапсульные варианты пневмокок-

ка, которые идентичны И -мутантам, обнаруживаемым у больных пневмонией. Процесс диссоциации пневмококка под действием ПАВ сопровождается усилением его адгезивной и сохранениемгемолитической активности, но утратой шалуронидазной способности и вирулентности для мышей.

8. Выявлены штаммы пневмококка, устойчивые и толерантные к действию пенициллина, а также штаммы, инактивируюшие хлорамфеникол.

9. Разработан метод ранней диагностики ПИ, основанный на комплексной оценке цитобактериоскопии и РНИФ с использованием антипневмококковых сывороток отечественного производства. Метод отличается высокой диагностической чувствительностью, экспрессностью и информативностью.

10. Разработана бессывороточная элективная питательная среда с лецитином, обеспечивающая питательные потребности пневмококка в холине. Среда отличается высокой специфичностью, стандартностью и пригодна для выделения пневмококка из закрытых полостей организма.

11. На основе чувствительности пневмококка к препаратам хинного дерева впервые разработан таксономический тест с хинином - препаратом отечественного производства. Тест может быть использован в практических лабораториях для идентификации штаммов Б.рпеитошае.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Применительно к экспресс-диагностике ПИ разработан метод, основанный на комплексной оценке цитобактериоскопии и РНИФ с использованием антипневмококковых сывороток отечественного производства (НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН, Москва). Использование этих методов позволяет выявлять варианты пневмококка, утратившие способность к репродукции на искусственных питательных средах.

2. На основе питательного бульона с лецитином создана бессывороточная среда, которая может быть использована для выделения пневмококка при исследовании материала из закрытых полостей (СМЖ, отделяемого из среднего уха, плевральной жидкости, крови) и накопления чистых культур.

3. Разработан способ видовой идентификации пневмококков,

основанный на нншбищш роста микробных клеток пневмококка препаратом хинином. Предложенный способ не уступает общепризнанному и рекомендованному ВОЗ оптохиновому тесту.

4. Для повышения результативности микробиологического метода диагностики ПИ необходимы параллельные исследования СМЖ, крови и гнойного отделяемого из среднего уха на L -формы и ФНР пневмококка.

5. Тактика рациональной этиотропной терапии затяжных и рецидивирующих форм пневмококковых менингитов должна основываться с учетом выявления атипичных форм (L - и ФНР) и толерантных к пенициллину штаммов возбудителя.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бронхолегочные поражения при гриппе у детей // Клиника и лечение гриппа и других ОРЗ: Сб. трудов ВНИИ гриппа. -Л., 1982. -С. 146-155 (соавт. Л.В.Осидак, Н.Б.Румель, В.А.Волкова).

2. Острые респираторные вирусные инфекции и пневмококковая инфекция // II Украинский съезд инфекционистов УССР: Тез. докладов (Донецк, 15-17 сентября, 1983). -Киев, 1983. -С.24 (соавт. Л.А.Вишнякова, Е.А.Кристаллинская, Н.В.Яковлева).

3. Этиология острых пневмоний, осложняющих грипп и другие ОРЗ // II Украинский съезд ннфекционистов УССР: Тез. докладов (Донецк, 15-17 сентября, 1983). - Киев, 1983. - С. 106-107 (соавт. П.Д.Старшов, Л.А.Вишнякова, И.В.Походзей, М.Г.Шаманова, Л.Я.Кирилов).

4. Некоторые вопросы диссоциации штаммов Streptococcus pneumoniae // Журн. микробиол. - 1984. - №2. - С.28-32 (соавт. Л.А.Вишнякова, Ю.В.Резцова, М.В.Шкирмантова).

5. Выявление Streptococcus pneumoniae в браш -биоптатах слизистой оболочки полости рта методом непрямой иммунофлюоресненини с отечественными антипневмококковыми сыворотками II Лаб. дело. -1986. -№7. -С.444-445 (соавт. П.П.Горбенко, А.Н.Александров, Л.А.Зимина,

A.П.Батуро, М.БЛифшиц).

6. Пневмококковый менннгоэнцефалит у детей // Всесоюз. конф. "Менннгтжокковая инфекция н гнойные менингиты (диагностика, профилактика и лечение)": Тез. докладов (Архангельск, 24 - 25 сентября, 1986). - Архангельск, 1986. -С.142 - 145 (соавт. М.Н.Сорокина,

B.А.Цинзерлинг, Р.Л.Басс, М.В.Горячкина).

7. Тактика лабораторного этиологического диагноза пневмококкового менингита у детей // Всесоюз. конф. "Менингококковая инфекция и гнойные менингиты (диагностика, профилактика и лечение)": Тез. докладов (Архангельск, 24-25 сентября, 1986). - Архангельск, 1986. -С.47-50 (соавт. М.О.Волкова).

8. Этиология острых пневмоний, осложняющих грипп и другие ОРЗ // Этиология и диагностика гриппа и ОРЗ: Сб.трудов ВНИИ гриппа. -Л., 1986. -С. 133-139 (соавт. М.Г.Шаманова, Е.Б.Чепик, Н.Б.Румель, Р.Н.Насорина).

9. Выявление роли пневмококка при бронхолегочиых поражениях у детей с помощью РИГА // Актуальные проблемы сельского здравоохранения: Тез.докладов/Н съезд сельских врачей Молдавской ССР (Кишинев, 1987). -Кишинев, "ТИМПУЛ", 1987. -4.2. -С.119-120 (соавт. Н.Б.Румель, Н.А.Радченко, Л.В.Осидак).

10. Лабораторный этнологический диагноз генерализованных форм менингококковой инфекции, других бактериальных менингитов и менингоэнцефалитов у детей // Реанимация и интенсивная терапия при острых инфекционных болезнях у детей: Сб.трудов НИИ детских инфекции. -Л., 1988. -C.8I-85 (соавт. Н.А.Коржуева, М.О.Волкова, Г.С.Кашкин).

11. Ускоренный метод диагностики и целенаправленная терапия пневмококковых пневмоний у детей Н ВДНХ СССР: Пристендовая литература. -Л., 1988 (соавт. В.В.Иванова, Г.П.Курбатова).

12. Биологическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных при пневмококковых заболеваниях у детей // Журн. микро-биол. -1989. -№4. -С.25-30 (соавт. Ю.В.Чистякова, Н.В.Абрамова, М.О.Волкова).

13. Клиника и некоторые патогенетические особенности гриппа и других ОРВИ у детей первого года жизни // Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ: Сб.трудов ВНИИ гриппа. -Л., 1989. -С.75-82 (соавт. В.В.Иванова, Г.П.Курбатова, Л.В.Говорова, О.А.Аксенов, Э.Г.Камальдинова, З.А.Осипова).

14. Метод непрямой иммунофлюоресценции в ранней диагностике пневмококковой инфекции у детей: Методические рекомендации МЗ РСФСР. -Л., 1989. -С.11 (соавт. А.П.Батуро, В.В.Иванова, Г.П.Курбатова, М.О.Волкова, к.В.Абрамова, Е.Н.Орехова, М.Н.Сорокина).

15. Диагностика, особенности течения и лечения пневмококковых пневмоний у детей // Вопросы терапии инфекционных болезней у детей: Сб.трудов МОНИКИ. -М„ 1990. -С. 168-174 (соавт. В.В.Иванова, Г.П.Курбатова, Л.В.Говорова, Э.Г.Камальдинова, З.А.Осипова).

16. Диагностика пневмококкового отита у детей // Лабдело. -1,990. -№8. -С.74-75 (соавт. А.П.Батуро, Е.Н.Орехова, Н.В.Абрамова).

17. Клиника, диагностика и лечение тяжелых форм острых респираторных вирусных инфекций у детей //Детские инфекции: Сб.трудов НИИЭМ им.Пастера и НИИ детских инфекций. -Л., 1990. -Вып. 2. -С.23-28 (соавт. В.Арнаудова, Г.Симеонова, Э.Г.Камальдинова, З.А.Осипова, В.Давыдова, О.А.Аксенов, Г.П.Курбатова, С.Клайн, И.Галева, П.Переновска, С.Бурова).

18. Особенности течения острых респираторных вирусных инфекций и их осложнений у детей первого года жизни // Вопр. охр. мат. -1990. -№6. -С.3-7 (соавт. В.В.Иванова, Э.Г.Камальдинова, Г.П.Курбатова, О.А.Аксенов, З.А.Осипова).

19. Питательная среда для культивирования Streptococcus pneumoniae // А.с.№ 1622390 СССР МКИ4 Aj С12 - №4318563/13., заявл. 15.10.87, опубл. 23.01.91. Бюл. №3. - 85с.

20. Пневмококковый менингоэнцефалит у детей // Детские инфекции: Сб. трудов НИИЭМ им.Пастера и НИИ детских инфекций. -Л., 1990. -Вып.

2. -С.73 - 83 (соавт. М.Н.Сорокина. РЛ.Басс, Л.А.Алексеева, М.О.Волкова, А.М.Андрусенко, И.В.Титова, И.С.Жадовская).

21. Этиология, клинические особенности и терапевтическая тактика острой пневмонии у детей // Острые респираторно - вирусные инфекции у детей (клиника, диагностика, лечение): Сб.трудов НИИ детских инфекций. - СПб, 1991. -С.73-79 (соавт. В.В.Иванова, Г.П.Курбатова,

3.Г.Камальдинова, З.А.Осипова).

22. Вирусно - бактериальные ассоциации и их роль в формировании бронхолегочных заболеваний у детей // Педиатрия. - 1992. -№4 - 6. -С.8-12 (соавт. В.В.Иванова, Г.П.Курбатова, О.А.Аксенов, Л.Н.Буловская, Э.Г.Камальдинова, Л.В.Говорова, З.А.Осипова, Г.С.Благословенский)

23. Диагностика и особенности терапии тяжелых форм острых респираторных заболеваний у детей // Методические рекомендации МЗ РФ . -СПб, 1992, - 21с. (соавт. В.В.Иванова, О.А.Аксенов, Г.П.Курбатова, Э.Г.Камальдинова, В.Арнаудова, Т.Симеонова, П.Переновска)

24. Современные методические подходы к микробиологической диагностике гемофильной инфекции // Методические рекомендации МЗ РФ. -СПб, 1992. -23с. (соавт. Е.Н.Орехова, Н.ГЛоскутова, Л.И.Железова, Н.А.Коржуева).

25. Терапевтическая тактика при тяжелых формах ОРВИ и пневмониях у детей // Съезд врачей - ифекционистов (Суздаль, сентябрь, 1992): Тездокладов. - Москва -Киров, 1992.—Т. 2. -С. 18-20 (соавт. В.В.Иванова, Г.П.Курбатова, Э.Г.Камальдинова, О.А.Аксенов, Л.Н.Буловская, З.АДробаченко, Л.В.Говорова).

26. Этиология, клинические особенности бронхолегочных осложнений респираторно - вирусных инфекций у детей II III Национальный конгресс по болезням органов дыхания (СПб, 1-5 декабря, 1992): Тез.докладов. -СПб, 1992. -С.460 (соавт. В.В.Иванова, Г.П.Курбатова, Э.Г.Камальдинова, О.А.Аксенов, Л.Н.Буловская, Л.В.Говорова).

27. Способ моделирования пневмококковой инфекции II A.c. №1807515 СССР МКИ 5 - №4808948/14, Заявл. 02.04.90; Опубл. 07.04.93., Бюл. №13. -168 с. (соавт. Л.Г.Говорова, М.О.Волкова, Р.А.Насыров).

28. Оценка морфофункционального состояния слизистой носоглотки и общей иммунологической реактивности у больных при применении галстерапии // 1У Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сб. трудов. -М., 1994. -Приложение (Сборник - резюме). -№614 (соавт.

A.В.Червинская, Л.И.Железова).

29. Роль гиалуронидазы в возникновении ' генерализованной пневмококковой инфекции И Журн.микробиол. -1994. -№5. -Приложение (август -сентябрь). -С. 118-122 (соавт. М.О.Волкова, Н.Н.Костюкова,

B.В.Иванова).

30. Invasive and Toxigenic Properties of Streptococcus pneumoniae Strains Caused Keningitie // Pathogenic stteptococci: present and future / Proc.XII lancefield Intern.Symp.Strept. Dis. St.Petersburg,Russia,Sept.6-10,1993/ Edit.A.Totolian.r Lancer Publications.St,.Petersburg.Russia. ,1994.-P.448-44-9 ( 17.N.Kostyukova,U.O.Volkova,V.V.Ivanova).

В печати;

1. Адгезия Streptococcus pneumoniae // Журн.микробиол. -(принята в 1994 г. ) (соавт. Н.Н.Костюкова, М.О.Волкова, В.В.Иванова).

2. A study of pathogenic factors of Streptococcus pneumoniae status causing meningitis // FEMS Immunology and Medical Microbiology, -(принята в 1994 г.) (N.N.Kostyukova, M.O.Volkova, V.V.Ivanova).