Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное клинико-микробиологическое обоснование новых методов диагностики пневмококковой инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное клинико-микробиологическое обоснование новых методов диагностики пневмококковой инфекции"



МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И. М. Сеченова

ВИН НИК Андрей Леонтьевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ КЛИНИКО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ НОВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.07 — Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

На правах рукописи

Москва — 1991

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова АМН СССР (директор — академик АМН СССР, профессор Б. Ф. Семенов) и Университете дружбы народов им. Патри-са Лумумбы (ректор — доктор экономических наук, профессор В. Ф. Станис).

Научный консультант — доктор медицинских наук,

профессор В. С. КИКТЕНКО

Официальные оппоненты — доктор медицинских наук,

профессор М. М. ДЫХНО

доктор медицинских наук, профессор Н. Н. КОСТЮКОВА

доктор медицинских наук, профессор С. А. ДРАТВИН

Ведущее учреждение — Второй Московский

ордена Ленина • Государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова

Защита диссертации состоится » ¿Я^Мй/1992 г.

в 14 часов на заседании Специализированного Совета (Д 074.05.010) при Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (Москва, Б. Пироговская ул., 2/6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии (Зубовская пл., 1).

Автореферат разослан «.

Ш » 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук

А. Ю. МИРОНОВ

:L'-.v'.1 иНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы. Среди задач, стоящих перед здравоохранением, особое место занимает настоятельная необходимость укрепления здоровья людей, повышение качества оказываемой медицинской помощи на основе интенсификации работы учреждений здравоохранения. Важнейшим направлением в этой области является углубление существующих способов борьбы со многими заразными болезнями и развитие новых путей и подходов в предупревдении инфекций и в том числе такой актуальной в настоящее время, как пневмококковая ( Вишнякова Л.А. и др., L984, 1987; Кагосова Л.К. I99U; Ginsburg G. et а11979; Douglas R. M. et al.,1983; Banks R.A. 1984; Baloivs А., 1986; Davies A. J.I988 ).

Пневмококк, являясь возбудителем менингитов, пневмонии, эндо-сардитов, гнойных отитов и целого ряда других заболеваний ( Костю-юва H.H., 1У81; Демина A.A. И др., 1983; Austrian Н., 1977, 1986; artlett j.О. ; 1986; Lawrenson j.B. et al., 1988 ) В настоящее |ремя, по мнению американского ученого page m.j. (. 1973 ), остает-я одной из основных причин смертности в мире, этот микроорганизм ироко распространен на всех континентах (. Kaiin м. 198и; arpuoh J. et а1.,1У83; Powderly W.G. et al., 1986; Lipsky B.A., 986;Salwen K.M. et al., 1987; Nair R., 1988 ).

В последнее время исследователи отмечают увеличение роста за-элеваемости и смертности от данного возбудителя. Обращается внима-ае на особую чувствительность к пневмококковой инфекции детей, лиц жилого возраста, а так же больных с врожденными болезнями сердца, невротическим сивдромом, хроническими заболеваниями легких, уда-¡нной селезенкой и другими заболеваниями ( Austrian R ., 1У77;

Schlech Vi.Р. et al., 1Я85( Gelli M.G. et al., 1485; Hebert J.G. et al., 1487 ).

Длительность пребывания больного в стационаре, часто с осложнённым течением, тяжелые последствия перенесенного заболевания, высокая летальность, отсутствие надежных методов диагностики, привело к талу, что данная проблема стала одной из актуальных в советском и мировом здравоохранении ( Vachon. е. et al., 1479; De вас а. et al., 1480: otart L.E. et al., 198? ; КаТОСОВЗ JI.K., 1391 ).

Несмотря на то, что пневмококк является ведущим этиологическим фактором при многочисленных заоолеваниях, в настоящее время отсутствуют высокочувствительные питательные среды для выделения и культивирования возбудителя, диагностические агглютинирующие пневмококковые антисыворотки, модель пневмококковой инфекции, что не позволяет проводить исследования на современном уровне, для совершенствования микробиологической диагностики пневмококковой инфекции необходимо располагать не только качественными питательными средами, диагностическими сыворотками, но и современными схемами и методами выделения и идентификации возбудителя. Заметим, что назначение лечащими вратами антибакториальнои терапии до взятия бииматериала на исследование, снижает высеваемость этиологических агентов. Это затрудняет получение данных о доминирующих серотипах пнешококков при большинстве заболеваний, вызванных этим возбудителем.

Острой проблемой остается отсутствие рабочего контакта лечащего врача и бактериолога, территориальная и организационная разобщенносп микробиологических лабораторий с лечебными отделениями. В итоге результаты исследований часто не выполняют своей роли при решении вопросов адекватной терапии. В результате этого отсутствует дифферен-

дированный подход в выбсре тактики исследования и квалифицированная эценка полученных данных. Все это определяет актуальность совершенствования схем и методов установления этиологического лидера при задеваниях, вызванных пневмококком.

Слезет отметить, что в литературе имеется незначительная- информация о роли и доминирующих серотипах пневмококков в структуре различных острых и хронических заболеваний. Получение подобных дан-1ых будет способствовать составлению формул вакцин и изучению отдел1 шх вопросов эпидемиологии пневмококковой инфекции.

Усовершенствовать схему диагностики пневмококковой инфекции ? целью сокращения времени получения окончательного ответа можно за счет использования новых питательных сред на основе непищевого :ырья, сбалансированных с учетом питательных потребностей пневмскок-са. Однако основным сырьем при производстве микробиологических питательных сред в настоящее время продолжает оставаться дефицитные шщевве продукты. Значительные количества мяса, рыбы, печени, яиц I других продуктов питания- используется при изготовлении диагности-¡ееких питательных сред, в производстве питательных сред дам- полу-иния вакцин, сывороток и других иммунобиологических препаратов. 3 этой связи актуальность исследований, направленных на поиск нового 5 ал ее экономичного белкового сырья, не вызывает сожений.

Решение вопросов усовершенствования существующих технологий фоизводства питательных сред на непищевых основах при крупношсштаб 1ом производстве будет способствовать созданию малоотходных и безотходных производств в ряде отраслей промышленности и утилизации отводов, создавая экологически чистые поточные линии и обеспечивая экономический эффект.

2х_622

Цель работы - совершенствование диагностики пневмококковой инфекции с учетом современных досзмкенай микробиологии и использование разработок в практическом здравоохранении.

Задачи исследования:

1. Разработать способ получения более совершенных питательных сред для выделения и культивирования пневмококка с использованием непищевого сырья и отечественных ингредиентов.

2. Получить а провести апробацию диагностических агглютинирующих пневмококковых антисывороток.

3. Создать экспериментальную лабораторную модель пневмококковой инфекции на животных.

4. Усовершенствовать схему диагностики пневмококковой инфекции.

5. Определить этиологическую роль пневмококка при острых и хронических заболеваниях органов дыхания у детей.

в. Изучить серотиповой спектр пневмококка при острых и хронических заболеваниях органов дыхания и острых гнойных отитах у детей.

Научная новизна и практическая значимость'исследования.

Разработана схема диагностики пневмококковой инфекции, предусматривающая комплексное проведение исследования с использованием бак-териоскопического, бактериологического, серологических и биологического методов исследования. Использование данной схемы позволяет получать окончательный ответ на вторые сутки с необходимой информацией об этиологическом лидере, степени его участия в патологическом процессе, количественном содержании в единице объема исследуемого материала.

предложены критерии, достаточные для идентификации пневмококка, и перечень признаков, являющихся косвенным подтвервдением этиологическое роли пневмококка в патологическом процессе.

Разработаны критерии, необходимые для получения положительного ответа в ходе анализа в соответствии с глубиной исследования, в основе которых лежит количественный посев и учет результата исследования с использованием одного или нескольких методов диагностики»

Разработаны способа получения гидролизатов из непищевого сырья ( сшишовая об роз ь и плацента человека ) для питательных сред. На основе полученных гидролизатов сконструированы жидкая, полужидкая и плотная питательные среди для выделения и культивирования пневмококка.

Применение экспериментально-аналитического метода балансирования позволило получить среды из непищевого сырья, имеющие более высокие коэффициенты использования компонентов в сравнении с исходными несбалансированными средами и более экономичные за счет уменьшения количественного содержания компонентов, а также за счет увеличения выхода биомассы.

Создание питательных сред позволило изучить биологические и физиологические свойства циркулирующих в настоящее время штаммов пневмококков в городе Москве.

Сконструированная среда на основе ферментативного гидролизата плаценты человека дала возможность впервые получить пневмококковые диагностические агглютинирующие антисыворотки не содержащие антител к балластным белкам питательной среды.

На основе полученных сывороток разработаны эритроцитарные антительные диагностикумы, которые использовались при исследовании раз-

личных бломатериалав от бальных и реакции агрегат-гемагглютияации.

Создана лабораторная модель экспериментальной пневмококковой инфекции, позволяющая проводить лабораторные эксперименты с учетом строго контролируемых параметров, использование сублетальных доз пневмококка позволило изучить динамику распределения возбудителя по органам и установить различия при изученных методах заражения.

Впервые проведено изучение патомордзологических, иммуноморфо-логических и гистохимических изменений при персистировании пневмококков в организме мышеи и морских свинок.

Впервые изучены вопросы, направленные на выявление механизма и условий перекрестного заражения морских свинок пневмококками разных серотипов на фоне оактерионосительства. Установлена зависимость степени тяжести заболевания от способа инфицирования и серо-типа возбудителя.

Показаны особенности заселения носовых ходов морских свинок пневмококками разных серотипов в условиях вивария при совместном содержании зараженных и интактных животных.

"Установлен факт длительного персистирования капсульных форм пневмококка.

предложен способ получения антигенного препарата с целью произ водства пневмококковых антисывороток с использованием пиательнои среды, свободной от балластных белков сыворотки и крови.

В результате использования комплекса бактериологического и серологического методов исследования получены новые данные об этнологической структуре острых и хронических заболевании органов дыхания у детей, острых гнойных отитов, деструктивных пневмониях. Показана доминирующая роль пневмококка в этиологии указанных заболеваний и удельный вес данного возбудителя в этиологической структуре острых

и хронических воспалительных заболеваний легких.

Установлено постоянное обновление штаммов пневмококка в процессе колонизация верхних дыхательных путей в зависимости от возраста ребенка. Определена длительность колонизации ротоглотки пневмококками, полученная при выявления серотяповой принадлежности возбудителя.

Установлены доминирующие серотигш пневмококков при острых и хронических воспалительных заболеваниях органов дыхания у детей, при острых гнойных отитах, деструктивных пневмониях, бактерионосительстве. Изучена взаимосвязь возраста больных детей и серотипов пневмококков при различных заболеваниях.

Введение количественных критериев оценки результатов позволило Золее точно судить об этиологической значимости выделенных микроорганизмов. Получение на вторые сутки данных о резистентности возбудителя к антибактериальным препаратам позволило врачу начинать целенаправленное адекватное лечение больного через день после поступления в стационар.

Выбор материала, направляемого в бактериологическую лабораторию, предварительный этиологический диагноз, дальнейшее направление а объем исследования проводится только после консультации с леча-цим врачом с учетом состояния больного, эпидемиологического анамнеза и данных бактериоскопии мазка мокроты после количественного пета микрофлоры.

Использование данной схемы, основанной на применении питательных сред на основе гидролизата плаценты человека и спилковой обре-зи, диагностических агглютинирующих пневмококковых антисывороток ;о специфическим спектром антител, реакции агрегат-гемагглютинации,

модели пневмококковой инфекции на лабораторных животных, количественных методах посева и учета, позволило увеличить число диагностируемых заболеваний пневмококковой этиологии на 2052, сократить сроки выделения возбудителя до 8-12 часов, снизить затраты на проведение исследований в 3-4 раза.

Показано, что для выявления этиологического лидера при изученной патологии, установления прогноза заболевания необходимо цриме-нение комплекса диагностических методов с использованием количественных критериев посева биоматериала и учета результатов при условии консультации бактериолога с лечащим врачом на кавдом этапе исследования.

Приведены условия, необходимые дош выделения и идентификации пневмококка из биоматериала.

Сведения о чувствительности к антибиотикам выделенных штаммов пневмококков позволили научно обосновать средства для адекватной антибиотикотерапии при острых и хронических воспалительных заболевании легких, острых гнойных отитов, деструктивных пневмоний.

Данные серотипового пейзажа пневмококков, циркулирующих у больных при изученной патологии будут способствовать созданию мобильных лечебных и профилактических препаратов.

Предложенные питательные среды апробированы с рекомендациями о целесообразности их использования в диагностике пневмококковой инфекции в ведущих специализированных лабораториях ( ЦКБ 4 Главного Управления МЗ СССР, ЦКБ 4 Главного Управления МЗ РСФСР, НИИ СП им. Склифасовского, ГОБ Л 2 им. И.В.Русакова, ГКБ * 64, Центральном ордена Ленина институте усовершенствования врачей. Клинике детских болезней I ММИ им. И.М. Сеченова, ВНИИ БП при Совете Министров СССР,

fflffl туберкулеза МЗ СССР, Противотуберкулезном диспансере №.4 ).

Основным научным достижением проведенной работы язляется комплекс новых данных в отношении пневмококковой инфекции, полученный при разработке и внедрении цели и задач данного исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная схема диагностики пневмококковой инфекции, позволяющая увеличить число диагностируемых заболеваний пненлококковой этиологии на 20%, сократить сроки выделения возбудителей до 8-12 îacoB, снизить затраты на проведение исследований в 3-4 раза.

2. Сконструированные питательные среда для выделения и культивирования пневмококка на основе гидролизатов, полученных из непищевого :ырья, заменяющие дорогостоящие питательные среды на основе мясных гидролизатов, сокращающих время получения конечного результата и [ающих значительный экономический эффект.

3. Новый способ получения диагностических агглютинирующих пнев-юкокковых антисывороток, позволяющих установить доминирующую роль шевмококка в этиологической структуре различных воспалительных задеваний легких и других заболеваний. С помощью полученных антисыво-юток установлены преобладающие серотшш пневмококков при различных аболеваяиях детей и взрослых в Москве.

4. Серологические вариации изолятов Sfîepfecoccus pn (timon in с ависят от возраста больного, времени персистированяя возбудителя в рганизме, нозологической формы заболевания, характера исследуемого атериала, сезонных колебаний, анамнестических особенностей.

5. Основным функциональным подразделением, где происходит обмен epomnoBS'heip'fococcuç, pneumomac. являются многоместные боль-ичные палаты, а основным фактором распространения - больные с разно-рофильнши диагнозами и бактерионосители.

Внедрение в практику. Министерством здравоохранения СССР утверждены методические рекомендации "Методы и особенности идентификации микрофлоры, выделенной от больных неспецифическими заболеваниями органов дыхания" ( 1991 ).

Используемый в работе метод балансирования питательных сред лег в основу "Методических рекомендаций по балансированию состава микробиологических питательных сред" ( 1987 ), позволяющий получать среды из не*-пищевого сырья, имеющие более высокие коэффициенты использования компонентов и более экономичные за счет уменьшения их количественного содержания.

На основании экспериментальных исследований разработана и утвервде на на Ученом Совете ЦЕШВС им. И.И.Мечникова "Инструкция по изготовлению и контролю питательной основы из белковых отходов кожевенного производства, сухой"( 1985 ). Инструкция позволяет наладить выпуск трипти-ческого гидролизата на основе безотходного производства предприятий кожевенной промышленности, обеспечивая экономический эффект. На предприя тии по производству бактерийных препаратов ЦНЛЛВС им. И.И.Мечникова испытан метод приготовления триптического гидролизата и получено несколько серий питательной основы с определением физико-химических параметров ( № 1329/4-Ш5 . 27 . 09. 1986 г. ).

Результаты диссертации по методам экспресс-диагностики пневмококковой инфекции, принципам микробиологической диагностики пневмококковой инфекции на фоне лечения антибиотиками, использованию питательной среды, сконструированной на основе гидролизата плаценты человека для выделения пневмококка при поражении легких у детей, использованию пневмококковых антисывороток с типоспецифическим спектром антител в диагностике легоч -ной патологии у детей внедрены в практическую деятельность кафедры детской хирургии ЦОЛИУВ ( № 03/073. 29.01.1985 г. )

Разраоотанная схема диагностики пневмококковой инфекции внедрена в практическое здравоохранение Акт внедрения № 332 от 21.09.80 г.)

Пневмококковые диагностические агглютинирующие антисыворотки и питательные среды на основе гидролизатов плаценты человека и спилково} обрези используются в лабораториях научно-исследовательских и практических учреждений ( Акт внедрения А 330 и № 331 от 21.09.89 г.)

Получено 2 авторских свидетельства на изооретения и принято 8 рационализатроских предложений.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на совместном заседании секции микробиологии и инфекционной иммунологии с научной конференцией ЦНП4ВО им. И.И.Мечникова ( Москва, 1984 на совместной конференции 1КБ И 2 им. И.В.Русакова и ЦОЛИУВ ( Москва, 1984 ), на Всесоюзной научно-практической конференции "Биотехнологические и биотехнические процессы в мясной и молочной промышленности" ( Москва, 1987), на 3-ей Всесоюзной конференции "Научные основы технологии промышленного производства биопрепаратов" ( Щелково, 1987 ), на совместной конференции ГКБ И 64 и кафедры педиатрии Университета дружоы народов игл. Патриса Лумумоы ( Москва, 1989 ), на сессии института Пульмонологии ( Москва, 1990 на совместной научной конференции кафедры микробиологии медицинского факуль тета Университета дружоы народрв им. Патриса Лумумоы и ВДШВЦ им. И.И.Мечникова 1 Москва, 1991

Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 научных раооты, из них 17 в центральной печати.

Структура и объем р°ооты. Диссертация изложена на 408 страницах машинописи и состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 9 глав собственных исследований, заключения, выводов, раздела "Практические рекомендации" и списка литературы, включающего 178 отечественных и 235 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 52 таблицами и 31 ри сунками-графиками, схемами, микрофотографиями. Приложение содержит

4х—622

перечень протоколов испытаний питательных сред, акты о внедрении результатов исследований в практическое здравоохранение, перечень принятых рационализаторских предложений.

содержание Работы

Материалы и методы исследования В работе использованы культуры пневмо.чокка, полученные из ЦДИИВС им. И.И.Мечникова, штаммы пневмококка, выделенные от больных и тест-штаммы микроорганизмов, полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасевича Объектом исследования служили мокрота, трахеальный ас.пират, содержимое бронхов, полученное при бронхолегочном исследовании, плевральный экссудат и пунктат легкого, кровь, моча, отделяемое ран и свищей, полученное от больных с острыми и хроническими заболеваниями органов дыхания, онкологических больных с септическими осложнениями, ревматизмом, септическим эндокардитом, туберкулезом легких, острыми гнойными отитами и здоровых бактерионосителей.

Проведено 1754 бактериологических исследования с выделением и идентификацией аэробной и факультативно-анаэробной мякродшоры. Иссле довано 987 образцов мокроты от больных в возрасте от I месяца до 80 лет с диагнозами острая и хроническая пневмония. Ротоглоточное носи-тельство пневмотропной флоры изучено у 168 детей в возрасте от I ме-сяиз до II лет. Исследовано отделяемое из среднего уха у 195 детей в возрасте от I года до II лет с диагнозом острый гнойный отит.

Сырьем при разработке белковых основ питательных сред служили различные виды непищевого сырья: отходы кожевенного приозводства -спилковая обрезь, полученная на Московском заводе по производству клея и плацента человека, полученная в замороженном виде из различных родильных домов г. Москвы.

В работе использованы мыши линий СВа, С3На, сР1»Р, ,

I иВА.СдуВЬ.^ и белые беспородные в количестве 180и голов, мор-

ские свинки короткошерстной породы следующих видов: голландский, агути золотистый и агути серый в количестве 120 штук и 120 кроликов породы Шиншила.

Для бактериологического исследования мокроты и грахеального аспирата применят количественный метод посева (óóixon .»ГП.Ч'СггЙ., 1965; Селина Л.Г., Дорожкова И.Р., 1980; Вишнякова Л.А., 1980 ).

Для идентификации пневмококка использовали диски, пропитанные желчью, диски с оптохином (é/c-А/е-Ь'-е^л, Франция ) и тест коагглю-тинации с коммерческим реагентом (Я/кк/е.^оct , Швеция ).

Серотип ( грушу ) пневмококков определяли в реакции агглютинации на стекле с экспериментальными пневмококковыми антисыворотками, полученными в ЦНЙ1ВС им. И.И. Мечникова, а так же с сыворотквми,выпуска емыми в Дании.

Физико-химический контроль изготовленных гидролизагов и питательных сред проводили согласно "Методическим указаниям по применению физико-химических методов контроля питательных сред" ( 1977 ). Для этого определяли следующие параметры: общий азот по Нейсслеру, аминный азот - формольным титрованием, хлориды - по способу Рушняка, рН - погенциомегрически, остаточную влажность - весовым способом, сухой остаток - высушиванием до постоянного веса, прочность агаровых сред - по Валенту.

Аминокислотный состав препаратов изучали с помощью автоматического анализатора "Биотроник" ( ФРГ ), модель ЛЦ - 600.

Качество разработанных питательных сред оценивали с помощью тест-штаммов бактерий - представителей 6 различных семейств микроорганизмов, а так же с использованием образцов различного патологического материала. Результаты оценивали в соответствии с "Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим по-

казателям ( 1980 ) и "Методическим указаниям к проведению испытаний диагностических питательных сред" ( 1982 ). Препараты изучали по чувствительности, эффективности, дифференцирующим свойствам, показателю ингибиции, скорости роста и стабильности свойств выросших микроорганизмов, а так же по параметрам их роста в процессе культивирования ( длительность лаг-фазы, фазы экспоненциального размножения и максимальной удельной скорости роста ).

Оптимизацию питательных сред проводили в соответствии с подготовленными с нашим участием "Методическими рекомендациями по балансированию состава микробиологических питательных сред" ( 1988 ).

Выделение и культивирование пневмококков проводили на сконструп рованных нами питательных средах из непищевого сырья - спилковой обрези и плаценты человека.

Величину капсулы пневмококков исследовали методом окрашивания по Бурри и оценивали по системе плюсовых символов.

Для проверки титров антипневмококковых сывороток и контроля их специфичности применяли пробирочные реакции агглютинации, реакцию агглютинации на стекле и реакцию "набухания" по Нейфельду.

Типоспецифические агглютинирующие пневмококковые антисыворотки изучали методом ВИЭФ. Реакцию проводили с использованием 1% агарозы и трис-барбитурового буфера рН 8,6. Продолжительность опыта 3 часа.

Специфически очищенные полисахариды пневмококка получали на базе лаборатории биохимии ЦИИИВС им. И.И. Мечникова из культуры

Ь>ссссц<; 1рлск/>юиГое, выращенной на плотной питательной среде, основу которой составлял сердечно-мозговой экстракт.

Электронно-микроскопическое исследование выполняли в лаборатории электронной и световой микроскопии ВДИИВС им. И.И. Мечникова на электронном микроскопеОЕМ - 100 В при инструментальном увеличе -

нии 15000-60000.

Гистологические исследования органов животных проводили на 2, б, 21 и 46-е сутки после заражения животных. Материал обрабатывали для окраски гематоксилин-эозином и по Браше. В отпечатках, мазках и средах пневмококк выделяли непрямым методом Кунса и окраской по Лейшману. Для оценки функционального состояния иммунокомпетентных клеток проводили PAS - реакцию по Мак-Манусу и определяли активность кислой и щелочной фосфатаз по Гомори.

Для выявления антигенов пневмококков применяли метод агрегат-гемагглютинации, где для поликонденсации и конъюгации поликонденси-рованных антипневмококковых сывороток применяли 25$ глюгаральдегид фирмы "Seîva " и борофторид 4,4*- бис - дифенидциазония, предложенный КЛ. Шаханиной и Н.И. Манько ( 1968 ) для получения иммуно-сорбента.

Чувствительность к антибиотикам выделенных микроорганизмов определяли методом диффузии в агар с использованием бумажных дисков, нагруженных антибиотиком и методом определения минимальной подавляющей концентрации в плотной питательной среде.

Результаты исследований обрабатывали статистически ( И.П. Ашма-рин и A.A. Воробьев , 1962 ).

РЕЗУЛЬТАТ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В соответствии с целью и задачами исследования разработаны технологии приготовления ферментативных гйдролизатов из плаценты человека и отходов кожевенного производства - спилковой обрези. Это было вызвано необходимостью изыскания новых экономичных источников сырья для производства белковых основ с целью замены дефицитного пищевого сырья непищевым при производстве питательных сред.

В результате экспериментов отработаны способы предварительной

5х—622

промывки исходного продукта, термической обработки в автоклаве, найдено количественное соотношение воды к исходному компоненту, определено время воздействия температурного фактора. Технология получения гидролизатов отработана по количественным параметрам: фермент - количество исходного субстрата - время расщепления. Ферментативные гидролизам имели цифры общего азота в пределах 640-660 мгД, амин-ного азота 220-240 мг/$, пептона - 0,7-0,Количественный состав показал наличие 19 аминокислот. Трехчасовой режим расщепления исходного материала оказался оптимальным для удовлетворения различных погреб ностей ряда микроорганизмов. Всего было приготовлено около 80 серий различных вариантов гидролизатов и 200 вариантов питательных сред на этих основах. Разработанные технологии получения гидролизатов из плаценты человека и спилковой обрези не требуют для промышленного выпуска создания новых производственных мощностей, позволяют ускорить процесс приготовления конечного продукта на 180 часов, что повышает производительность труда, позволяет исключить дорогостоящее и дефицитное пищевое сырье, сокращает расход фермента в 2 раза. Подучено авторское свидетельство № 1426083 на "Способ получения гидролизата, используемого в питательных средах для культивирования бактерий".

На основании полученных гидролизатов сконструированы жидкие, полужидкие и плотные питательные среда для выделения и культивирования пневмококка. В состав среды входили: гидролизат плаценты человека -23,8 г/л, агар-агар - 15 г/л, - цистин - 0,04 г/л, экстракт кормовых дрожжей - 3,-0 г/л, хлорид натрия - 4,0 г/л, сахароза - 10 г/л. Дистиллированная вода до I литра. Среда имела рН - 7,2 - 7,4. Среда не содержала высокомолекулярных белковых фракций. Пептидный состав был представлен фракцией, осавдаеыой 10$ ТХУ в сочетании с 1% фос-форномолибденовой кислотой. Разработанная среда на основе ферментативного гидролизата отходов кожевенного производства имела в составе

гидролизаг стыковой обрези с сухим остатком 8,2$ - 16,4 г/л, агар-агар - 15 г/л, хлорид натрия - 4,0 г/л, - цистин - 0,030 г/л, пептон семипалатинский - 5,0 г/л, глюкоза - 2,0 г/л, N0.2 НР04 ♦ 12 Н20 - 5,0 г/л. Дистиллированная вода до I литра. рН готовой среды 7,2 ± 0,2. Получено авторское свидетельство на изобретение № 1261948 на "Питательную среду для культивирования пневмококков". По материалам проведенных экспериментов подготовлена и утвервдена Ученым Советом ЦНИИВС им. И.И. Мечникова "Инструкция по изготовлению и контролю питательной основы из белковых отходов кожевенного производства, сухой".

Для обеспечения большего выхода биомассы потребовалась специальная рецептура питательной среды. Необходимы были среды, обеспечивающие максимальную утилизацию компонентов и наиболее полное нпкопление целевого продукта, т. е. конструирование сбалансированных питательных сред. Для решения этой задачи был применен экспериментально-аналитический метод балансирования, основанный на математическом расчете оптимальных соотношений компонентов в среде с учетом их удельной ростовой активности. Использование сбалансированных сред позволило увеличить выход биомассы на 10 процентов, повысить коэффициент использования компонентов среды в 4,2-16,7 раза, снизить себестоимость сред в 2,7 раза. В отличие от метода многофакторного планирования экспериментально-аналитический метод балансирования является относительно простым и более экономичным методом усовершенствования состава микробиологических питательных сред, создания рентабельных сред оптимального состава. На основании полученных данных изданы "Методические рекомендации по балансированию состава микробиологических питательных сред" ( 1987 ).

Разработанные нами среды имеют следующие преимущества перед сре-

дамп на пищевых основах:

1) сохраняют пищевые ресурсы,

2) создают оезогходный цикл производства,

3) снижают затраты на сырье,

4) сокращают продолжительность технологического процесса,

5) снижают трудоемкость и трудозатраты,

6) возможность длительного хранения сырья,

7) стандартность исходного сырья,

8) решение вопросов утилизации сырья.

При замене пищевых основ на менее дефицитные или отходы различных отраслей производств необходимо учитывать возможные изменения морфофункциокальных особенностей микроорганизмов, выращенных на экспериментальных средах. Нами проведено сравнительное электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры некоторых бактерий, выращенных на питательной среде на основе гидролизата плаценты человека и спил-ковой обрези. Б качестве тест-штаммов использовали Sbi'^cdLft^ ^texnaii , i478,Sbi9«£tn'bOnnfw бОбз.ЫарЬу^ососсих aui?u< P-209, Saß

серогип 3, fco u d с rin о na аел u Cj i гизо i 8. Контрольной средой служил 1,5% агар на переваре Хоттингера. По результатам электронно-микроскопического исследования можно заключить, что бактерии, выращенные на исследуемой и контрольной средах характеризовались сходной морфологией ( рис I, 2 ). На среде с основой из гидролизата спилковой обрези такие поверхностные структуры как капсула или жгутики отличались несколько большей выраженностью.

При испытании сконструированных сред со штаммами и культурами пневмококка, стрептококка, кишечной группой и другими микроорганизмами показано, что они хорошо удовлетворяют ростовые потребности

микроорганизмов, обеспечивают высокую скорость размножения клеток, повышенное накопление биомассы с хорошо выраженными антигенными свойствами, стабильность типичных мотологических и физиологических потребностей бактерий.

Рис 1.^Ь(2р[оСХ!СГи& рг^иггюгпче

серотипа 3, выращенный на плотной питательной среде с основой из гидролизата плаценты человека. Увеличение 20000.

гло о сессий иигеиь

Р-209, выращенный на плотной питательной среде с основой из гидролизата спилковой обрези. Увеличение 35000.

Спектр выделенной г.пкроЗлорл л .оличесгиенные соотношения на испытуемых средах и контрольных ( сердечно-мозговая среда фирмы Дифко, кровяной агар Хоттингера ) практически не отличались. Посев ассоциации микроорганизмов позволял проводить шс морфологическую дифференциацию. Скорость роста пновмококков на сконструированных средах составляла 8-12 часов.

Результат сравнительного изучения роста £3Н^р fc<"-ü<~cus pWunDofliufc на плотных питательных средах различного состава представлены в таблице I, из которой видно, что на средах с основой из непищевого сырья и среде Дифко получены сходные данные. По Количеству выросших колоний различия между этими средами были незначительными ( табл. 2 ).

Сконструированные питательные среды позволили изучить биологические, культуральные и морфологические свойства пневмококков, выделенных от больных и музейных культур. При выращивании пневмококка на жидких питательных средах был отмечен типичный рост, который выражался равномерным помутнением среды с незначительным пылевидным осадком на дне пробирки. При просматривании мазков, окрашенных по Граму можно было наблюдать грамположительные диплококки ( рис 3 ). Культура, взеденная мышам в дозе I0¿ клеток вызывала гибель животных на 2-3 сутки.

В процессе роста на плотной среде пневмококки образовывали мелкие, влажные, полупрозрачные, росиночные колонии ( рис 4 ). Через 28-72 часа колонии увеличивались в размере и достигали 1,5-2 мм в диаметре. Повышенное содержание С02 способствовало лучшему росту и развитию пневмококка.

При изучении физиологических закономерностей роста микроорганизмов в процессе их культивирования установлено, что основные показатели роста: максимальная удельная скорость роста, минимальное время генерации, длительность экспоненциальной фазы роста, определяемые при культивировании на среде из спилковой обрези не уступают таковым при выращивании на кровяном агаре Хоттингера.

Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанные среды могут с успехом заменить отечественные среды на пищевых осно-

Таблица I

Сравнительная оценка качества питательных сред, приготовленных на непищевых основах и контрольных сред на основе пищевого сырья

Наименование серотипа Среда на основе Streptococcus гидролиза та pneumoniae плаценты человека

Среда на основе гидролизата 'стыковой обре-зи

Агар Хотгингера + 10а, сызорогки крупного рогатого скота

Среда Дифко

го со

Серотип 3 9 ± I ю-7 9 ± I Ю"7 16 + о Ю-5 9 ±1 Ю-5

Серотип 6 9 ±1 ю-7 9 ± I Ю"7 16 + 2 кг5 9 ± I Ю"6

Серотип 14 10 * 2 ю-7 9 ±1 Ю"7 18 + 2 Ю"5 10 ± 2 Ю-6

Серотип 19, выделенный 9 ± I Ю"8 9 ±1 Ю-8 16 + 2 Ю-6 9 ± I Ю"6

от больного

Серотип 14, выделенный ПТ (■¡О.ТТЪНОТГ) 9 ±1 ю-7 10 ± 2 ю-7 18 + 2 Ю"5 10 ± 2 Ю-6

Обозначения: I - скорость роста в часах

2 - -чувствительность ( максимальное .разведение штамма или культуры пои котором обнаруживается рост )

вах л дорогостоящие импортные. Среды просты в изготовлении, экономичны, свободны ог балластных белков сыворотки и крови.

Таблица 2

Рост тест-штаммов на различных питательных средах

Наименование сероткпа

З^ерКхсгсис,

р г! 6 VI т О п I й й.

Серотип 3 _ 27 ± а 27 ± О 22 ± 10 II * I Сеоотип 19,

выделенный 32 ± 10 30 ± 10 30 ± 3 17 ± 3

от больного

Обозначения: I - среда на основе гидролизата епшжовой обрези

2 - среда на основе гидролизата плаценты человека

3 - среда Дифко

4 - агар Хоттингера

Согласно расчетным данным себестоимость сконструированной среды с основой из гидролизата спилковой обрези ниже себестоимости применяемой в практике среды с основой из мясного бульона Хоттингера на I р. 42 коп на I литр за счет снижения расходов на сырье, зарплату производственных рабочих и сокращения времени, затраченного на приготовление среды.

Антисыворотки животных являются широко используемым мате риалом в микробиологических исследованиях. Отсутствие диагностических агглютинирующих пневмококковых антисывороток лишало исследователей важного звена в диагностике пневмококковой инфекции. Изучение доминирующих серотипов при различных заболеваниях, этиологическая расшифровка воз-

Количесгво выросших колони! при

о

посеве 10 клеток

12 3 4

будителя, изучение серологического рейзажа и ряда других вопросов, овз которых невозможно полное представление о роли пнешококка в инфекционном процессе оставались оез ответа.

Л

»о

I» /

ъ

ё 4 • /...

(С" Лч.' •

:ц 1 \

к с

Ч

\

-

?ис. з%е^>1ожси$ рпии/пгт'ое.

серотипа 3, выращенный в жидкой питательной среде с основой из гидролизата плаценты человека

14

:>Л

Рис. 4. Рост культуры^ЦрЬсссси^ рпеито/иае. серотипа 3 на среде с основой из гидролизата спилковой обрези. На поверхности агара диски, нагруженные желчью (, I ), оптохином ( 2 ), антибиотиком цефуроксямом ( 3 ).

Для получения антипнеамококковых сывороток в предварительных экспериментах апробированы различные иммуномодуляторы С гепарин, зимозан, днтогемагглютинин, поливинилпиролидон, полиакриловая кислота и ряд других ) и схемы иммунизации кроликов.

испытание рабочих схем позволило выбрать в качестве иммуномоду-лятора гепарин фирмы "Рихтер", который животные получали до начала

7-622

иммунизации. Антигенный препарат получали в лаооратории условно-патогенных микроорганизмов ЦНШВС им» И.И.Мечникова. Схема иммунизации животных состояла из шести инъекций с интервалом в 3-4 дня в дозах 1-2 млрд. м.к. в 1-2 мл. полученные сыворотки i, IV наименовании ) имели титры 1:16и - 1:640 и несколько линии преципитации за счет оал-ластных белков гадкой питательной среды в которой выращивали культуру пневмококка для приготовления антигенного препарата.

поскольку для проведения тонких серологических и биохимических исследовании требуются сыворотки узкоспецифического спектра, мы разра^ ботали новую схему приготовления антигенного препарата и схему иммуни низации животных. Посев культуры пневмококка проводили послойно на три целлофановых диска, уложенных на плотную питательную среду с основой из гидролиза та шгацеаты человека. Схема иммунизации кроликов включала инъекцию 2 млрд клеток в подколенный лимфатический узел. Повторная инъекция - через две недели в краевую вену уха в дозе 2 млрд клеток. Третья - через неделю, внутривенно, в тех же дозах. Кровопускание через 14 дней после последней инъекции. Полученные сыворотки ( 4 наименования ) имели титры специфических антител 1:1601:640 в реакции линейной агглютинации. Так как микрооная масса для получения антигенного препарата готовилась на плотной питательной среде, свободной от крови и сыворотки крупного рогатого скота, в полученных сыворотках отсутствовали преципитируюцие антитела к компонентам питательней среды. В реакции двойной иммунодиффузии выявлена одна линия преципитации о капсульным антигеном пневмококка. Схема иммунизации имеет более короткий цикл и незначительные материальные затраты.

Полученные сыворотки со специфическим спектром антител позволили использовать их для конструирования эритроцитарных диагностикумов с целью повышения чувствительности и специфичности реакции агрегат-

гемагглютицации. Для поликонденсации сывороток и конъюгации поликондег сированяых сывороток с формалияизированяыми эритроцитами ш применили борофторид и глютаральдегид. Использование химических агентов душ поликондеясации и конъюгации позволило получать прочный комплекс, сохраняющий специфическую активность в течение одного года. Данная методика приготовления антительных диагностик углов, где использован метод направленного ориентирования молекул сенситина с целью искусственной организации необходимой специфичности, позволил повысить чувствительность реакции при индикации' пневмококковых антигенов в 25 раз и получать ответ через 1,5-2 часа.

Известно, что пневмококки не способны вызывать заболевания у животных некоторых видов, поскольку они обладают различной степенью резистентности против данного Еозбудителя. Принлмая во внимание тот факт, что серогипы пневмококков, выделенные у животных и у человека идентичны, экспериментальная модель на .животных могла в определенной степени оказаться полезной при решении вопросов, связанных с диагностикой пневмококковой инфекции.

При отработке различных вопросов экспериментальной модели пневмококковой инфекции на мышах и морских свинках бшо показано, что мыши отдельных линий были высокорезистенты к штаммам пневмококка, введенным иятраназально, или проявляли умеренную или высокую чувствительность к тем жэ штаммам, введенным интраперитонеально. Показано также,что мыши могут быть совершенно невосприимчивы к пневмококкам, проявлять резистентность к малым дозам возбудителя или становиться бактерионосителями в течении довольно длительного 'времени ( 120 дней) капсульных форм пневмококка.

В ходе эксперимента установлено,что доза ГО^клеток пневмококка серотипа 3 вызывала гибель 90-100# мышей всех линий на 2-3 сутки.

о

В дозе 10й клеток культура вызывала 50£-ный летальный исход на 2-3

о

сутки. Введение 10 клеток пневмококка не вызывало гибели мышей линии СВА и р^ на протяжении 14 дней и мышей линии С57ВЦ /6 3-х месяцев ( срок наблюдения ). Серия экспериментов«позволившая выявить мышей,

Т 9

для которых доза пневмококка 10-10 клеток являлась сублетальной &ала возможность изучить локализацию возбудителя в организме искусственно зараженных животных. Установлено, что пневмококк обнаруживался в селезенке в 85$, в печени и брыжеечных лимфатических узлах в 755?, в легких и в крови;из сердца - 15$ случаях. Мыши всех изученных линий оказались чувствительны к пневмококку серотипа 6А, однако конвенциональные животные обладали выраженной -резистентности) к заражающим до* зам пневмококка ( 10^-10®) при интраназальной аппликации.

На 70-е сутки эксперимента пневмококка оставались в селезенке и печени независимо от способа заражения, а в легких - только при ин-траназальном. Следует,однако, отметить, что к этому дню органы отдельных животных были свободны от пневмококков.

Созданная модель экспериментальной! пневмококковой инфекции позволила разработать критерии оценки чувствительности мышей и ыорч-ских свинок к пневмококкам серотипов 3 и 6А. Это дало возможность проводить эксперименты с учетом контролируемых параметров.

Установлено, что для получения стабильно! модели пневмококковой инфекции у мышей необходимо использовать вирулентный серотип пневмококка в дозе Ю^-Ю2 клеток в I мл с учетом линии животного и способа инфицирования , а у морских свинок в дозе 103 в I мл для серотипов 3 и 6А.

При изучении пневмококковой инфекции на животных исследовали вопросы передачи пневмококков на модели морских свинок с учетом способа инфицирования, этиологической роли определениях штаммов в подпер.

жании инфекционного процесса, динамики распределения микроорганизмов по органам, длительности персистирования. Заражение животных пневмококками серотипов 3, 6А и смесью этих серотипов в количестве 1200 клеток в I мл позволило установить, что развитие заболевания и степень тяжести зависела от способа инфицирования, сопутствующих заболеваний и серотипа возбудителя, который явился причиной поражения организма. Установлено также, что носоглоточное носительство и инфицирование органов не имеют прямой взаимосвязи. Совместное пребывание интактных и зараженных животных в одном помещении вивария приводило как к избирательному, так и к смешанному заселению носовых ходов свинок пневмококками различных серотипов, в то время как органы могла быть обсеменены одним или двумя штаммами одновременно.

Показано, что способ заражения морских свинок не оказывал влияния на динамику распределения пневмококков по органам. Возбудитель обнаруживался в крови из сердца, печени, селезенке, легких а почках в зависимости от времени исследования я заражающей дозы.

Результаты опытов позволили сделать заключение, что длительность персистирования возбудителя ( срок наблюдения 130 дней ) имеет важное значение в определении взаимосвязи между пневмококковым бактерионосительством и заболеванием.

Длительная персистенция пневмококка приводила к патоморфологнчес-ким изменениям во внутренних органах, складывающихся из воспалительных, дистрофических' и некротических реакций, каадая из которых имела характерное морфофункцяовальное проявление, зависящее от цикличности инфекционного процесса.

При интраназальном заражении мышей в дыхательном тракте возникали отечность и инфильтрация собственной итзстинки ткани слизистой носоглотки, а также очаговая десквамация эпителия. Патоыорфологаческие

изменения в легких имели количественные различия только в первые дни после интраназального и внутрибршшинного заражения. Они выражались в увеличении числа лимфоцитов, гистиоцитов и макрофагальных элементов в периальвеолярной, периваскулярной и перибронхиальной соединительной ткани.' Дистрофические и некротические процессы протекали и в печени. Выявлялись очаги некроза с формирующейся соединительнотканной капсулой-. К 21-44-м суткам в некоторых печеночных дольках обнаруживались гепатоциты с помутневшей и вакуолизированной цитоплазмой. Часть более мелких очагов некроза к этому времени полностью замещалась рыхлой соединительной тканью. Разработка экспериментальной модели пневмококковой инфекции необходима еще и потому, что изменившиеся биологические свойства возбудителя требуют и новых подходов к решению вопросов диагностики пневмококковой инфекции.

Разработанные питательные среды на основе непищевого сырья, диагностические агглютинирующие пневмококковые антисыворотки, экспериментальная модель пнешокскковсй инфекции дали возможность на отдельных этапах решать самостоятельные задачи, а в совокупности предложить схему диагностики пневмококковой инфекции, позволяющую получать окончательный ответ на 2-е сутки.

Схема диагностики пневмококковой инфекции включала использование бактериоскошческого, бактериологического, серологических методов и биологической пробы в первый день исследования патологического материала от больного.

Известно, что достоверным подтверждением роли пневмококка в патологии является выделение его из замкнутых полостей: спинномозговой жидкости, крови, среднего уха, а так же из легких и плевральной жидкости. Однако в силу различных причин это не всегда представляет-

ся возможным. В этом плане удобным и информативным материалом является мокрота больного. Но необходимо помнить, что пневмококки - условные патогены и поэтому выделение из мокроты больных пневмонией не всегда можно рассматривать как абсолютное доказательство их этиологической роли. В связи с этим необходимы критерии, подтверждающие этио-. логическую роль пневмококка и критерии достаточные для идентификации.

Подтверждением этиологической роли пневмококка в каждом отдельном случае считали результаты положительных культуральных исследований с одним или несколькими из следующих признаков:

1. наличие в мазках отмытой, обработанной химотрипсином, гомогенизированной мокроты, окрашенных по Граму более 10 в полях зрения клеток пневмококка,

2. положительные результаты серологических исследований в реакции агглютинации с антипневмококковыми сыворотками,

3. положительная динамика клинических симптомов при антибактериальной терапии,

4. уменьшение количества клеток пневмококка при динамическом исследовании мокроты в первичном мазке и после лечения антибиотиком по отношению к которому чувствителен выделенный из мокроты пневмо» кокк.

Критериями достаточными для идентификации пневмококка считали следующие:

1. лззирование выросших колоний пневмококка желчью и чувствительность к оптохину,

2. положительная реакция агглютинация с антипневмококковыми сыворотками,

3. положительная биологическая проба на мышах с последующим выделением чистой культуры из крови животного или нахождение возбудителя

в мазках-отпечатках»

4. типичный рост на разработанных питательных средах из нэпищево-го сырья, засеянных кровью и соскобами печени, селезенки, легкого, брыжеечных лимфатических узлов павших или забитых животных, В качестве вспомогательных служила данные патоморфологичеокпх, гистохимических и иммуноморфологаческих изменений органов животных на различных интервалах персисгирования пневмококка.

В связи с тем, что только этиологического подтверждения пневмококка в инфекционном процессе недостаточно, были введены количественные критерии посева материала и учета результатов, позволяющие установить зависимость степени тяжести заболевания от количества возбудителя.

Исследование материала начинали с бактериоскопии мазков, посева на плотные и жидкие питательные среды, постановки биологической пробы на мышах с учетом линии животного, способа инфицирования, данных бактериоскопии мазков, постановки серологических методов исследования. В случае смерти больного проводили выделение возбудителя с учетом времени персистирования с целью подтверждения этиологического диагноза и определения причин летального исхода.

Материалам для исследования может служить мокрота, гной, экссудат, отделяемое носоглотки, пунктаты, кровь и другие субстраты. При микроскопии мазков, окрашенных по Граму и Бурри проводили учет результата по морфологии клеток и состоянию капсулы возбудителя. При соблюдении условий ( выбор способа взятия материала после консультации с лечащим врачом, соблюдение правил сбора, хранения и транспортировки материала, высококвалифицированные сотрудники лаборатории ) можно решать следующие вопросы: определять качество отмывки по клеточному составу, определять пригодность материала для исследования,

определять объем и направление дальнейшего исследования. Выдача ответа возможна через I час. Это сигнально-ориенгировочный метод с определением этиологического лидера на основании количественного /чета возбудителя в мазке мокроты ( рис 5 ).

Рисунок 5

Схема микробиологической диагностики пневмококковой инфекции

Материал для исследования ( мокрота, гнсй, экссудат, отделяемое носоглотки, пунктам, кровь и др. )

БАКТЕРИОСКОДИЧЕСКОН ИССЛЕДОВАНИЕ

I день Микроскопия мазков, окрашенных по Граму и Бурри Учет по морфологии клеток и состоянию капсулы

Соблюдение I. Выбор способа взятия материала после консультации условий с лечащим врачом

2. Соблюдение правил сбора, хранения и транспортировки материала

3. Хорошо обученные сотрудники лаборатории

'ешаеше ¡опросы

I.

день

Определение качества отмывки мокроты по клеточному составу

2. Определение пригодности материала для исследования

3. Определение объема и направления дальнейшего исследования с учетом количественных значений микроорганизмов в мазке

ВЫДАЧА ОТВЕТА ЧЕРЕЗ I ЧАС

СИГНАЛЬНО-ОРИЕНТИРОВОЧНШ МЕТОД С ОПРЕДЕЛЕНИИ ЭТИОЛОГИЧЕСКОГО ЛИДЕРА НА ОСНОВАНИИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА ВОЗБУДИТЕЛЯ В МАЗКЕ МОКРОТЫ

Микроскопия мазков, скрашенных по Граму и Бурри ( культура, снятая с плотной питательна! среды, отпечатки органов животных, посевы соскобов с органов животных ).

бактериологическое исследование

I день Посев мокроты из вазведения „

на плотную питательную среду

Посев соскобов посев крови с печени, селе- иг сердца зенки, легких, животного брыжеечных лим- на штатную фатических уз- питательную лов среду

Посев неразве-денной мокроты на плотную питательную среду содержащую антибиотик

Раскладывание на поверхности агара дисков, нагруженных антибиотиками, желчью и опти-хином

Инкубация в термостате в атмосфере CO., в течение B-I2 часов при + 37° С

2 день Учет по морфологии Учет по морфологии Учет по коли-

колоний. Определе- колоний и приготов- честву колоний

ние количества пнев- ление мазков, окра- в первичном по-

мококков в I мл шенных по Храму и севе биоматериала Бурри

Соблюдение I. Посев на питательные среды на основе гидрсшизата условий плаценты человека или спилковой обрези, сбаланси-

рованных с учетом питательных потребностей пневмококка

Решаемые I. Получение возбудителя в чистой культуре вопросы

2. Определение чувствительности к антибиотикам

3. Идентиддекация пневмококка с помощью реакции растворимости в желчи и чувствительности к оптохину

4. ипределение степени участия пневмококка в инфекционном процессе ( рост единичных колоний в пределах < 2и говорит о бактерионосительстве или контаминации, рост колоний в пределах 50-70 и более, а так же сплошной рост свидетельствует об этиологической роли пневмококка )

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОБА

I день Заражение

животных

( штраназальное, внутрибрюшинное )

Взятие перитонеаль-ного экссудата через 6-8 часов

Через 6-8 часов мышь забивают или в случае смерти животного

Приготовление отпечатков органов на стекле ( печень, селезенка, легкие, брыжеечные лимфатические узлы ). Окрашивание по Граму и Бурря

Соблюдение I. Заражение животных проводили с учетом условий предварительного этиологического диаг-

ноза л количества пневмококков в мазке мокроты

2. Использование в работе изученных линий мышей с учетом способа инфицирования и дозы инфекга

3. Разведение инфекта в питательной среде на основе гидролизата плаценты человека или спилковой обрези

4. Использование данных патоморфологических изменении в органах с учетом времени персистирования возбудителя

Решаемые вопросы

1. Выявление возбудителя в чистой культуре

2. Определение чувствительности к антибиотикам '

3. Проведение дифференциальной диагностики

серологические мкгоды

I день

Реакция наоухания капсулы

Реакция агглютинации с перитояеальным экссудатом

2 день Серотипирование в

реакции агглютинации

Реакция агрегат-гемагглк тинации

Соблюдение условий

Решаемые вопросы

1. Использование в серологических реакциях полученных пневмококковых антисывороток

2. Использование в реакции агрегат-гемагглю-тинации полученных пневмококковых антисывороток со специфическим спектром антител

1. Определение серотипа пневмококка

2. Подтверждение этиологической роли пневмококка в инфекционном процессе

ВЫДАЧА ОКОНЧАТЕЛЬНОГО ОТВЕТА

Посев на плотные питательные среды материала проводили из разве дений Ю-3, Ю-5, Ю-7. На вторую чашку делали посев неразведеннои мокроты, где агар содержит антибиотик, к которому циркулирующие в настоящее время штаммы пневмококков не чувствительны. Затем на повер хности агара раскладывали диски, нагруженные антибиотиками, желчью и оптохином. После инкубации в термостате в атмосфере 00^ в течение 8- 12 часов мы получали информацию о чувствительности штаммов к антибиотикам и проводили идентификацию возбудителя с чистой культурой.

При проведении биологической пробы мышей заражали с учетом коли* чества пневмококков, содержащихся в мазке. Выбирали и способ инфицирования, ориентируясь на данные, полученные в ходе разработки экспериментальной модели пневмококковой инфекции. Данные локализации пневмококка в легких, печени, селезенке, брыжеечных лимфатических узлах и крови на различных сроках персастирования возбудителя, полученные при отработке модели инфекции, позволяли выделять возбудитель из крови и органов в известные временные интервалы. Патоморфологическиа изменения органов животных служили косвенными критериями участия пневмококка в инфекционном процессе.

Серологические методы, проводимые в первый день включала реакцию набухания капсулы и реакцию агглютинации с перитонеальным экссудатом. Во второй день исследования проводили микроскопию мазков, окрашенных по Граму и Бурри ( культура, снятая с платной питательной среды, отпечатки органов животных, посевы соскобов с органов животных ). Продолжение бактериологических исследований во второй день включало учет результатов по морфологии колоний с определением количества пневмококков в I мл материала и учет по количеству колоний в первичном посеве на чашке, где посеяна неразведеняая мокрота.

Результаты второго дня при постановке биологической пробы позволяли выявлять возбудитель в чистой культуре, определять чувствительность к антибиотикам, цроводить дифференциальную диагностику и выявлять патоморфолошческие изменения в органах.

Постановка серологических методов во второй денй включала определение серотипа пневмококка в реакции агглютинации и определени антигенов пневмококка в биомагериале с помощью реакции агрегат-гем-агглютинацаи.

Выделяя пневмококк из патологического материала, проводя диффе-ренциалъную диагностику, получая информацию о количественном содержат: нии возбудителя в биоматериале, степени участия в патологическом процессе, определяя чувствительность к антибиотикам и серотип возбудителя, используя критерии для идентификации и подтверждения этиологической роли пневмококка в инфекционном процессе мы на вторые сутки получали окончательный положительный ответ. Это позволяло врачу в кратчайше сроки начинать адекватную терапию. Окончательный отрицательный ответ может быть получен только после исследования материала при бактериоскопическны, бактериологическом, серологических методах и в биологической пробе.

Сочетание положительных данных бактериоскошческого метода, который необходимо считать обязательным при проведении работы с положительными данными бактериологического анализа с учетом глубины исследования, с определением серотипа и чувствительности к антибиотикам можно считать достаточным для постановки окончательного положительного диагноза.

Количественные критерии посева_ и учета служили ориентиром для выоора тактики и глубины исследования. На всех этапах исследования биоматериала для подтверждения этиологической роли пневмококка в патологии использовали достоверные и косвенные показатели. Критериями достаточными для идентификации пневмококка служили данные , предложенные нами с учетом изменившихся биологических свойств возбудителя. С увеличением числа признаков повышалась достоверность исследования.

Отрицательные результаты бактериоскопии не означали прекращения дальнейших исследований, поскольку количественный посев при использовании бактериологического метода и биологической пробы поз-

волял выявлять наличие пнешококка, содержащегося в исследуемом мете-риале в незначительном количестве.

Та.чим образом схема диагностики пневмококковой инфекции предусматривающая использование бактериоскопического, бактериологического, биологического и серологических методов при исследовании патологического материала в первый день, позволяет с зысокой надежностью выделять пневмококк, получать информацию о степени его участия в инфекционном процессе значительно сократить время получения окончательного ответа и, используя отечественные компоненты, сделать этот процесс экономически эффективным.

С выполнением основных задач работы"стало возможным определение роли пневмококка в этиологической структуре различных заболеваний у детей и взрослых. Было показано, что процесс динамической колонизации верхних дыхательных путей пневмотропной микрофлорой происходил при совместной госпитализации в одной палате большого количества больных ( в наших наблюдениях от 8 до II ). Отмечено, что от 3 до 5 детей становились носителями одних и тех же серотипов пнешококков одновременно. Необходимо отметить и гот факт, что дети длительное время находившиеся в тесном контакте не обязательно становились носителями доминирующих серотипов пнешококков.

Длительность носительства пнешококков, по нашим наблюдениям, непродолжительна и составляла от I до 5 месяцев.

Многократное обследование госпитализированных детей и их матерей, находившихся в палатах позволило установить перекрестный путь передачи пневмококков различных серотипов между матерью и ребенком. Приведенные выше обстоятельства ставят вопрос об обосновании ранней выписки детей из стационара с целью предупреждения развития суперинфекции

с рецидивирующим течением заболевания. Это становится особенно актуальным в связи с увеличением удельного веса полирезистентной флоры при внутриболышчном заражении.

Установлено, что при внутрибольничных пневмониях, развившихся на фоне ОРШ у детей в возрасте от 2 до 3 лет этиологическим фактором чаще всего был пневмококк.

Результаты исследования мокроты у больных при острой пневмонии, развившейся на фоне посттуберкулезных изменений показали, что этиологическим фактором при данной патологии был пневмококк, составлявший 51 процент веделенной микрофлоры. ^

составляла 5,5 процентов. Микробная флора выделялась в составе монокультуры ( 56 процентов ), либо в составе микробных ассоциаций из двух микробных видов.

Изучение микрофлоры детей в возрасте от 0 до II лет с острсй пневмонией позволило установить, что этиологическим фактором при данной патологии являлся пневмококк, который наиболее часто принадлежал к серотипам 3, 6, 9, 19, которые составляли 65 процентов от числа выделенных штаммов ( табл 3. ). Серотипы пневмококков 2, 4, 8, II,

18, 23 встречались реже. При деструктивных формах пневмонии у детей ( абсцесс, пиоторакс ) этиологическим фактором был пневмококк серо-типов 3, 6. Реже встречаслся серотип 14.

Сравнение серотипов пневмококков, выделенных от бактерионосителей и больных хроническими воспалительными процессами бронхолегочной системы позволили обнаружить, что такие серотипы, как 3, 4, 6, 9, 18,

19, 23 встречались у данных групп довольно часто. Однако при хронических заболеваниях встречался серотип 10, наряду с серотипами 6 и 23 и занимал третье место. Серотипы 12 и 14 в наших исследованиях при изучении бактерионосительства выявлены не были, в то время как

при хронических заболеваниях эти серотипы встречались.

Таблица 3

Серотипы пнашококков, выделенные от детей в возрасте до II лет с диагнозом острая пневмония

Серотиц/ Число выделен- Возраст больного группа ных штаммов

2 2 6 лет

3 35 0-2 года

4 6 8 лет

6 12 0-3 месяца

8 9 0-1,5 месяца

9 12 1,5-11 лет

II 5 0-1 месяц

18 9 1-3 месяца

19 19 0-1,5 года

23 6 0-1 месяц

Не типзрую- 6 0-1 мес

щиеся

При сравнении серотипов пневмококков, встречающихся при хроничеы ких и острых пневмониях ( в наших исследованиях больные хроническими заболеваниями в возрасте от 20 до 78 лет ) можно ответить, что такие серотипы как 3, 4, 6, 9, II, 18, 19, встречающиеся у детей при острой пневмонии, встречались у взрослых, хотя процент находок бал значитель но меньше. Исключение составлял серотип 23, который при хронических бронхитах встречался у взрослых чаще, чем щи острых пневмониях у детей.

Выявлена зависимость встречаемости отдельных серотипов пневмокок>

ков от возрастного фактора. Установлено, что наибольший процент находок пневмококка у детей в возрасте до 2 лет и наиболее часто встречающиеся серотипы - 3, 6. С увеличением возраста отмечено появление серотипов 4, 8, II, 18.

Проведенное исследование в плане изучения связи бактерионосительства и заболеваемости острым гнойным отитом показало, что у детей в возрасте от I года до II лет, госпитализированных в общих больничных палатах по 10-12 больных, наиболее часто при бактерионосительстве выделялись пневмококки серотипов 3, 6, 14, 19. Реже встречались серотипы 8 и 23. У большинства больных в выделениях из уха и носоглотки обнаружены аналогичные серотипы. В выделениях из уха при остром гнойном отите обнаружены пневмококки серотипов 2, 3, 14, 23.

Выявление доминирующих серотипов пневмококков цри различных заболеваниях имеет большое значение для составления формул вакцин, которые должны быть, вероятно, различными для взрослых и детей. Однако необходимо помнить, что серологический пейзаж меняется в зависимости от времени года, региона.,.контингента больных. Поэтому динамичное наблюдение за изменением доминирующих серотипов пневмококков чрезвычайно важно.

Изучение чувствительности выделенных штаммов пневмококков к антибиотикам показало, что внебольничные штаммы сохраняют высокую чувствительность к ампициллину, пенициллину и препаратам цефалоспори-новой группы. Однако следует отметить, что в последнее время ( 1988 -1991 гг. ) появились штаммы устойчивые или умеренно устойчивые к данным антибиотикам ( табл. 4 .). Для внутриболышчных штаммов пнешокок-ка характерна более частая встречаемость возбудителя со сниженной чувствительностью к пенициллинц. По всей видимости, это может быть

связано с длительностью колонизации респираторного тракта пневмококком различных серотипов, периодом смены серотипов и скоростью элиминации возбудителя в процессе лечения.

Таблица 4

Чувствительность к антибиотикам штаммов Streptococcus pneu men iQe, выделенных от больных острыми и хроническими заболеваниями органов дыхания

Антибиотик Число Результаты

штаммов

Чувствигель- Умеренно- Устойчивые ные устойчивые

абс. % або. % абс. %

I. Ампициллин 342 338 98,7 3 0,8 I 0,2

2. Пенициллин 398 370 92,2 10 2.4 18 4,5

3. Гентамицан 357 89 24,7 0 268 72,3

4. Амикацин 12 2 16,6 0 10 83,3

5. Линкомицян 312 292 93,2 2 0,6 18 5,7

6. Левомицитин 319 289 82,7 5 1,5 25 7,6

7. Метицидлин 112 96 85,9 4 3,5 12 10,8

8. Канамицин 96 8 8,3 9 9,3 79 83,4

9. Сизомицин 16 6 37,4 4 25,0 6 37,4

10. Тетрациклин 61 . 32 52,3 3 4,8 26 42,2

II. Рифампицин 217 217 100,0 0 0

12. Олеандомицин 70 61 97,1 7 10,0 0

13. Фузидин 210 200 95,2 10 9,5 0

14. Цефамезин 137 117 85,4 4 2,7 6 4.4

15. Цефалексин 83 78 96,3 2 2,4 3 3,6

16. Цефалотия 42 40 96,5 I 2,4 I 2,4

17. Цефуроксим 136 102 74,7 34 25 0

В свете этого положения становится актуальным динамичное исследование чувствительности к антибиотикам выделенной микрофлоры в про-

цессе лечения и индивидуальный подбор препаратов.

Пенициллин и его полусинтетические аналоги, а также цефалоспорн-ны можно считать препаратами выбора цри лечении острых пневмоний, этиологическим фактором которых является пневмококк определенных сероти-пов, циркулирующий в изученных регионах. Однако следует отметить, что назначение антибактериальной терапии до начала бактериологического исследования различных биосубстратов отражалось на результатах и сроках получения окончательного ответа. В этой связи существенно возрастает роль лабораторной службы в лечебно-диагностическом процессе. Для того чтобы лабораторные исследования стали источником информации необходимо совершенствование организационной структуры данной службы и взаимодействие клинических специалистов с микробиологической лабораторией. Это позволит обеспечить научно обоснованный комплекс лечебных и диагностических мероприятий.

В целом результаты проведенных исследований, комплекс новых данных о возбудителе, разработанные схемы и методы будут способствовать совершенствованию микробиологической диагностики пневмококковой инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема диагностики пневмококковой инфекции,заключающая комплексное проведение исследования с использованием бактериоско-пического, бактериологического, биологического и серологических методов, позволяющая получать окончательный положительный ответ на вторые сутки.

2. Применение данной схемы, основанной на использовании питательных сред на основе гидролизата плаценты человека и спилковой обрези, диагностических агглютинирующих антипневмококковых сывороток со специфическим спектром антител, реакции агрегат-гемагглютинации, модели

пневмококковой инфекции на лабораторных животных, количественных методов посева и учета, позволило увеличить число диагностируемых заболеваний пневмококковой этиологии на 20$, сократить сроки выделения возбудителя до 8-12 часов, снизить затраты на проведение исследований в 3—4 раза.

3. Использование разработанных критериев для определения этиологической роли пневмококка, достоверных и косвенных факторов участия дозбудигеля в патологическом процессе, позволило установить доминирующую роль пневмококка в структуре острых воспалительных бронхолегоч-ных заболеваний, составляющего 80-90$ выделенной микрофлоры.

4. Разработанная технология получения гидролизагов из плаценты человека и спилковой о'брези. не требует для промышленного выпуска создания новых производственных мощностей, позволяет ускорить процесс приготовления конечного продукта на 180 часов, уменьшить расход фер-мета в 2 раза.

5. Сконструированные на основе ферментативного гидролизата плаценты человека и спилковой обрези питательные среды для выделения

и культивирования пневмококка хорошо удовлетворяли ростовые потребности пневмококка и ряда других микроорганизмов, обеспечивали высокую скорость размножения клеток, интенсивное накопление биомассы и стабильность типичных морфологических и физиологических особенностей бактерий.

6. Установлено, что применение экспериментально-аналитического метода балансирования состава питательных сред для выделения и куль-тиЕНрования пневмококка позволило увеличить выход биомассы на 10 процентов, повысить коэффициент использования компонентов среды в 4,2 -16,7 раза, снизить себестоимость сред в 2,7 раза.

7. Экспериментально обоснована и разработана методика получения

антипневмококковых диагностических агглютинирующих сывороток со специфически-типовым спектром антител. Данная технология предусматривает использование антигенного препарата для иммунизации животных, полученного с плотной питательной среды на основе гидролизата плаценты человека свободной от балластных белков.

8. Впервые разработан метод агрегат-гемагглютинавди для обнаружения пневмококковых антигенов, основанный на использовании эритроцитов, сенсибилизированных поликонденсированными с помощью борофтори-да 4,4 - бис - дифенилдаазония и глютаральдегида белками иммунной сыворотки и позволяющий увеличить чувствительность реакции в 25 раз.

9. Разработана экспериментальная модель пневмококковой инфекции на мышах и морских сванках, позволяющая проводить лабораторные эксперименты с учетом контролируемых параметров. Установлено, что для

получения стабильной модели у мышей необходимо использование виру-

т ?

лентного серотипэ пневмококка в дозе не более 10х - 10 клеток с учетом линии животного и способа введения инфекта, а у морских сви-

о

нок - в дозе 10° клеток для серотипов 3 и 6А.

10. Проведенные исследования на лабораторных животных показали, что при пневмококковой инфекции пагоморфологические, гистохимические и иммуноморфологические изменения в селезенке, печени, легких и лимфатических узлах животных на 2, 6, 21 и 46-е сутки складывались из воспалительных, дистрофических и некротических реакций, имевших характерное морфофункциональное проявление, зависящее от цикличности инфекционного процесса.

11. Установлено, что совместное пребывание интактных и зараженных пневмококками серотипов 3 и 6А морских свинок в одном помещении вивария приводило как к длительному бактерионосительству капсульных форм пневмококка ( срок наблюдения - 120 дней ), так и к возникнове-

яиа различных форм заболеваний у интактяых животных.

12. Впервые установлено, что в Москве у детей в возрасте от 0 до II лет при острой пневмонии этиологическим фактором являлись пневмококки серотипов 2, 3, 4, 6, 8, 9, II, 18, 19, 23. Наиболее часто встречались серотипы 3, 6, Э, 19, составляющие у детей от 0 до 2 лет 65 процентов от числа выделенных штаммов. При хронических заболеваниях органов дыхания наиболее часто выделялись пневмококки серотппов 3, 4, 6, Э, 1С, 12, 14, 18, 19, 23. Преобладающими были серотипы

3, 6, 10, 23, сосгавлязощие 60,6 процента от числа выделенных штаммов. При деструктивных формах пневмонии у детей в возрасте от 0 до II лет этиологическим фактором являлся пневмококк серотипов 3 и 6.

13. Показано, что у больных острой пневмонией в возрасте от 20 до 80 лет, развившейся на фоне постгуберкулезных изменений, этиологическим фактором был пневмококк, выделявшийся как в монокультуре, так

.; ъ составе мжробных ассоциаций среди которых гфеобладали51"гер1ссосеи$ рпеитогнпс в сочетании сМг1ЪЧ>ег1о и Н^еторЬ enz.de .

14. Установлено, что при острых гнойных отитах у детей в возрасте от I года до II лет этиологическим фактором являлись пнеллококки серотипов 2, 3, 14, 23. Показано, что у детей, находившихся по 10-12 человек в палатах возможен обмен пневмококками разных серотипов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чувствительность различных линий мышей к 5 ^вр^ососсчс, рп<г.итол'|й€ 3-го серотипа / А.Л.Винник, Н.Г.Калина, С.И.Елкина и да. // Яурн. микробиол. - 1981. - № 12. - С. 56-59.

2. Изучение некоторых биологических свойств антигенов, выделенных из^'г.рпеитоп'ййЗ-го серологического варианта / С.И.Елкина, Н.В.Цветкова, В.В.Сергеев, Н.П.Ванеева, А.Л.Винник и др. // Там же. - й 12. - С. 60-61.

3. Персистенция пневмококка у мышей / А.Л.Винник, В.Ф.Салов, Г.С.Власов и др. // Там же. - 1982. - № II. - С. 25-29.

4. Воспроизведение пневмококковой инфекции на лабораторных животных / А.Л.Винник, С.Л.Косина, Н.Г.Калина и др. // 5 Национален, конгрес по инфекциозни и паразитен болести. - София. - 1Э82. -

С. 127-128.

5. Персистенция пневмококка у мышей различных линий / А.Л.Винник,

B.Ф.Салов, Г.С.Власов и др. // Тез. докл. I Всесоюзной конф. по теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. -М., 1982. -

C. 88.

6. Винник А.Л. Эффективность пневмококковых вакцин ( обзор литературы ) // Дурн. микробиол. - 1983. - № 6'. - С. 17-24.

7. Винник А.Л., Елкина С.И. Перекрестное заражение морских свинок пневмококком различных серотипов на фоне носительства // Там же. -1984. -» 2. - С. 32-36,

8. Изучение типоспецифических агглютинирующих пневмококковых сывороток в реакциях преципитации / Л.Н.Падюков, Е.М.Кузнецова,

А Л «Винник и др. // Там же. - 1964. - * 8. - С. 69-72.

9.Винник АЛ., Елкина С.И. Пневмококковые сыворотки со специфичео-

ким спектром антител // В сб. Препараты для диагностики и профилактики пневмококковых заболеваний. - M.t 1984. - С. 49-63.

10. Елкина С.И., Винник А.Л. Морские свинки как модель дум изучения перекрестного заражения пневмококком в условиях изолированного помещения // Там же, - С. 86-91.

11. Серотипы пневмококков при различных заболеваниях детей. / А.Л.Винник, О.И.Стенина, Т.А.Дудина и др. // Куря, микробиол. -

- 1984. -J4II. - С. 56-60.

12. Винник А.Л., Варгина А.К., Ершова З.Л. Изучение некоторых свойств пневмококка при выращивании на питательных средах различного состава // MPS. - 1984. - раздел 3. - № 12. - публ. 4359.

13. Винник АД., Варгина А.К., Ершова З.Л. Питательная среда для выделения и культивирования пнешококка // Дурн. микробиол. - 1985.

- № 8. - С. 57-63.

14. Винник А.Л. Пневмококк: серотипы и вызываемые ими формы инфекции. Обзор литературы. // МР2. - 1985. - раздел 3. - Ji 10. -

- публ. 3616.

15. Винник А.Л., Грибовская Т.Б., 1фшова З.И. Питательные среды и биологические свойства пнешококка. Обзор. // Там же. - раздел 3. -

- № II. - публ. 3835.

16. Изменение аминокислотного состава писательных сред в процессе роста\)Ьл^рЬосоайи9 pneumoniae, серотипа 3. / А.Л.Винник, А.К.Варги-на, З.И.Ершова и др. // Там же. - 1985. - раздел 3. - № 10. - публ. 3414.

17. Использование экспериментально-аналитического метода при балансировка состава сложной питательной среды для выракдования пневмококка / А.К.Варгина, З.И.Ершова, А.Л.Винник и др. // Тез. докл. Коорд. совещания по разработке и стандарт, микробиол. штат. сред. - Махачкала.

- 1985. - С. 77-78.

18. Винник A.JI,, Ершова З.И. Аминокислотный состав питательной среды из плаценты человека для выделения и культивирования пневмококка

// Там же. - С. 12-15.

19. Повышение коэфсЕвдиента использования компонентов при балансировке состава питательной среды для выращивания пневмококков / Л.Г. Иванова, А.К.Варгина, АЛ.Винник и др. // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1986. - JÈ 8. - С. 596-600.

20. Циркуляция пневмококков различных серотипов в детских больничных палатах / А.Л.Виншис, С.И.Еишна, В.А.Тимощенко и др. // Тез. докл. I Всесоюзн. конф. "Актуальные проблемы нозокомиальных инфекций и лекарственная устойчивость микроорганизмов". - Минск, 1986. - С. 27-28.

21. Винник А.Л., Ершова З.И. Отходы животноводства как сырье для микробиологических питательных сред // Тез. докл. Научно-технич. конф. "Биотехнологические и биотехнические процессы в мяснсй и молочной промышленности". - M, 1987. - С. 66-67.

22. Новые принципы конструирования питательных сред и пути повышения их эффективности / А.К.Варгина, З.И.Ершова, Д.Г.Иванова, А.Л.Винник // Тез. докл. науч. конф. "Научные основы технологии цроизводства бактерийных и иммунобиологических препаратов". - M., 1987. - № 143Ы7.

- С. 67-74.

23. Использование отходов кожевенного производства и медицинской практики для питательных сред в вакцинно-сывороточном деле / А.К.Варгина, А .Л .Винник, Г.П.Дубшшш и др, // Тез. докл. Научн. основа технологии промыш. прожзвод. вет. и биол. препаратов. - M., 1967. -

- С. 122-123.

24. Вшшик А.Л. Использование среды из непищевого сырья для диагностики острых гнойных отитов / Тез. докл. Всесоюзн. научно-практич. конф. "Вопросы антибактериальной 1ерапии инфекционных осложнений в неинфекционной клинике". - М., 1987. - С. 20.

25. Методические рекомендации по балансированию состава микробиологических питательных сред / Л.Г.Иванова, Е.И.Шмелева, В.И.Трифонов, в.П.Ненашев, В.Д.Артеменко, А.К.Варгина, З.И.Ершова, Т.Н.Токинова, А.Л.Винник и др. // Метод, рекомендации. МЗ СССР. -М., 1987. - 40 с.

26. Винник А.Л., Варгана А.К., Ершова З.И. Питательная среда для культивирования пневмококков // Авторское свидетельство № 1261948

( СССР ). - Опубл. в Ш. - 1987. - № 37.

27. Среды Гисса на основе отходов кожевенного производства для идентификации бактерий / А.К.Варгина, А.Л.Винник, З.И.Ершова и др.

// Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Актуальные проблемы прикладной иммунологии, бактериологии и производства бактерийных препаратов". Пермь. -- 1988. - С. 126.

28. Использование отходов кожевенной промышленности в качестве белковой основы микробиологических питательных сред / А.К.Варгина, З.И. Ершова, Г.П.Дубинина, А.Л.Винник // Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии". - Махачкала. - 1988. - Часть 2. - С. 233-234.

29. Винния А.Л. Среды на основе непищевого сырья для выделения некоторых энтеробактерий // Тез. докл. Всесоюзн. конф, "Актуальные проблемы прикладной иммунологии, бактериологии и производства бактерийных препаратов". - Пермь. - 1988. - С. 124-125.

30. Винник А Л., Ершова З.И. Аминокислотный состав питательной среды из плаценты человека для выращивания и культивирования пневмококка // Тез. докл. Всесоюзн, конф. "Актуальные вопросы разработки препа-

ратов меда чекой биотехнологии". - Махачкала. - 1988. - Часть 2. С. 169-170.

31. Испольь ание отходов кожевенной промышленности в качестве белковой основы агробиологических питательных сред / А.К.Варгина, З.И.Ершова, Г.П.Дубинина, А.Л.Винник // Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии''. - Махачкала. - 1988. - Часть I. - С. 26-27.

32. Использование питательной среды из отходов кожевенного производства для биотехнологии и генной инженерии / Л.П.Блинкова, В.П.Степнов, А.Л.Винник и др. // Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии" - Махачкала. -1988. - Чась 2. - С. 233-234.

33. Способ получения гидролизата, используемого для культивирования бактерий / А.Л.Винник, А.К.Варгина, Н.М.Белоусов и др. // Авторское свидетельство Л 1426083 ( СССР ). 1988.

34. Метода и особенности идентификации микрофлоры, выделенной от больных неспецифическими заболеваниями органов дыхания / Л.Г.Селина, А .Л.Винник // Методические рекомендации. МЗ СССР. - М., 1991. - 25 о.