Микробиологические и молекулярно-генетические аспекты диагностики внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста

Скрыль, Сергей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробиологические и молекулярно-генетические аспекты диагностики внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические и молекулярно-генетические аспекты диагностики внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста"

На правах рукописи

СКРЫЛЬ Сергей Владимирович

Микробиологические и молекулярно-генетические аспекты диагностики внебольничиых пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 ОКГ 2013

ЕЮ? |\п \,1

Владивосток 2013 005535498

005535498

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доцент, доктор медицинских наук Мартынова Алина Викторовна

Официальные оппоненты:

1. Зайцева Елена Александровна, доктор медицинских наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО "Тихоокеанского государственного медицинского университета" Министерства здравоохранения РФ

2. Холодок Галина Николаевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Хабаровского филиала ФГБУ "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" СО РАМН-НИИ охраны материнства и детства (г. Хабаровск).

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России, г.Самара.

2013 года в ¿2

_часов

на заседании Диссертационного совета Д.208.007.02 , в Тихоокеанском государственном медицинском университете по адресу: 690650 г. Владивосток, проспект Острякова,2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тихоокеанского государственного медицинского университета по адресу: 690650 г. Владивосток, проспект Острякова,2.

Автореферат разослан « $ » 2013

года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доцент, доктор медицинских наук / Скляр Л. Ф.

Во многом это связано с микробиологическими особенностями этиологического спектра возбудителей внебольничной пневмонии, определяющих ее различия [Зубков М.Н., 2004]. При этом, пневмококковые внебольничные пневмонии занимают фактически лидирующее место среди внебольничных пневмоний другой этиологии и составляют по мнению российских [Синопальников А.И, 2004, Огарков П.И., 2006] и зарубежных специалистов [Muehlmann К, 2009] практически 30% в этиологической структуре. Особенную значимость проблеме внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии придает тот факт, что при достаточно длительной истории изучения Streptococcus pneumoniae как микроорганизма, микробиологическое подтверждение получают всего 3% всех пневмоний бактериальной природы ( согласно МУ 3.1.2.3047-13 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями», 10.01.2013). К объективным причинам данного явления можно отнести сложность выделения такого прихотливого возбудителя в чистой культуре как пневмококк, а также несистемагизированность (и зачастую отсутствие) данных об анти-биотикорезистентности штаммов пневмокококков с учетом региональных особенностей, что наиболее актуально для региона ДВФО. Не изучены и микробиологические свойства штаммов, определяющих циркуляцию вирулентных штаммов, с учетом фактора колонизации дыхательных путей несколькими изолятами пневмококка, в том числе и штаммами нескольких различных серотипов. Основными проблемами, наиболее значимыми в практическом здравоохранении и требующими научно-практической доработки, в отношении пневмококковой инфекции являются организация слежения и контроля за распространением антибиотикорезистентных изолятов, а также микробиологический мониторинг выделяемых штаммов, основанный на ге-нотипировании, так как именно он позволит получить упорядоченную информацию

о распространении того или иного изолята, что позволит сравнивать полученную информацию о характере выявляемых штаммов Б.рпеитотае, и соответственно, планировать профилактические мероприятия в отношении внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии. Все вышесказанное обозначает актуальность проблемы, определяет необходимость дальнейшего совершенствования методов клинической микробиологической диагностики, а также микробиологического мониторинга с применением генетического маркирования штаммов для решения задач эпидемиологического надзора за внебольничными пневмониями, и обосновывает цель, проведенного нами исследования.

ЦЕЛЬ: изучить микробиологические свойства штаммов пневмококка, выделенных у лиц молодого возраста из закрытых коллективов с внебольничными пневмониями, с применением молекулярно-генетических методов для проведения микробиологического мониторинга и планирования мероприятий эпидемиологического надзора

ЗАДАЧИ:

1) Определить роль штаммов Б.рпеитотае в этиологической структуре внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста, а также выявить особенности факторов патогенности штаммов пневмококка, выделенных у лиц молодого возраста в закрытых коллективах при внебольничных пневмониях и у носителей.

2) Изучить особенности эпидемического процесса по внебольничным пневмониям пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста с учетом региональных особенностей в ДВФО регионе на примере субъекта (г. Петропавловск-Камчатский).

3) Оценить антибиотикорезистентность штаммов пневмококка, выделенных среди лиц молодого возраста при внебольничных пневмониях и от носителей, а также с учетом распространения основных генетических детерминант.

4) Провести молекулярно-генетический мониторинг выделенных штаммов Б.рпе-итотае с применением методики мультилокусного сиквенстипирования в ДВФО регионе на примере субъекта (г. Петропавловск-Камчатский) для клональ-ной характеристики циркулирующих при внебольничных пневмониях штаммов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

1. Впервые комплексно оценена эпидемиологическая ситуация по заболеваемости внебольничными пневмониями пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста из закрытых коллективов с учетом региональных особенностей ДВФО региона на примере г.Петропавловска-Камчатского.

2. Оценена роль фактора пребывания в закрытом коллективе для развития внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста.

3. Изучены особенности популяционной струюуры штаммов пневмококка, вызвавших различные формы пневмококковых инфекций у лиц молодого возраста из закрытых коллективов, идентифицирован клон, циркулирующий в популяции пневмококков, выделенных при внебольничных пневмониях у лиц молодого возраста.

4. Выявлены микробиологические и молекулярно-генетические особенности факторов вирулентности штаммов пневмококка, приводящие к формированию высокопатогенных штаммов S.pneumoniae, оценена консервативность генов таких факторов вирулентности как ply и lytA.

5. Охарактеризовано состояние чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам штаммов S.pneumoniae, выделенных у пациентов молодого возраста с внебольничными пневмониями.

6. Определены генотипические особенности формирования антибиоти-корезистентности штаммов пневмококка, вызвавших внебольничные пневмонии у лиц молодого возраста.

7. Учитывая генотипические механизмы формирования устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам штаммов пневмококка у лиц молодого возраста, предложены рекомендации по коррекции регионального стандарта лечения внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Данные о распространении эпидемиологической ситуации по внеболь-ничным пневмониям пневмококковой этиологии позволили получить представление об эпидемической ситуации по заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста в регионах ДВФО.

2. Охарактеризована эпидемиологическая ситуация по заболеваемости внебольничными пневмониями среди лиц молодого возраста, показан фактор влияния закрытого коллектива на формирование заболеваемости пневмококковыми пневмониями у лиц молодого возраста.

3. Характеристика микробиологических особенностей, а также выявленные различия в штаммах, выделенных при внебольничных пневмониях и от носителей, позволили оценить динамику формирования эпидемического варианта в закрытом коллективе среди лиц молодого возраста.

4. Изучение микробиологических свойств штаммов S.pneumoniae., позволило выявить такие особенности вирулентности как увеличение экспрессии факторов адгезии и инвазии, что будет обусловливать возможность формирования госпитальных изолятов.

5. Проведенное изучение антибиотикорезистентности выделенных штаммов пневмококка позволило получить представление об эффективности общеприня-

той и проводимой антибиотикотерапии, а также, учитывая механизм формирования устойчивости к антибактериальным средствам, определить возможность коррекции фармакологического списка препаратов для лечения пневмококковых инфекций у лиц молодого возраста.

6. Изучив популяционную структуру возбудителей внебольничных пневмоний, а также выделив видовой, серотиповой состав штаммов пневмококка стало возможным планировать противоэпидемические мероприятия в отношении вне-больничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста в закрытых коллективах.

ВНЕДРЕНИЯ

По материалам диссертации изданы методические рекомендации «Молекуляр-но-диагностические аспекты идентификации S.pneumoniae, C.pneumoniae. Mpneumoniae», информационные письма «Об эпидемиологических аспектах диагностики возбудителей внебольничных типичных и атипичных пневмоний», подготовлена информационная справка «О заболеваемости и диагностике внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста». Результаты исследования использованы в создании формуляров антибиотикотерапии пульмонологического отделения Главного Госпиталя ТОФ и его филиалов, организации мероприятий эпидемиологического надзора в частях и учреждениях ТОФ. Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке врачей на кафедре эпидемиологии Владивостокского государственного медицинского университета, на кафедре микробиологии Академии экологии, морской биологии и биотехнологии (АЭМББТ), на кафедре общей экологии Дальневосточного Федерального Университета.

АПРОБАЦИЯ

Материалы научно-исследовательской работы изложены на: постоянно действующих семинарах «Актуальные вопросы госпитальной эпидемиологии» (2008 год), на заседании Приморского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, на 10-й Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (апрель, Владивосток, 2010 г), на VI-ой Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), на конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (28-30 сентября, Москва 2009 года), на III международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN

(Пекин, июль 2009), на IV международной конференции по инфекционным заболеваниям DIT AN (Пекин, 2010), на Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия, 2009), на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (ноябрь, 2009,ДВГУ, Владивосток), на V-ой научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (19-20 мая 2010 года, Владивосток), на 11-й Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (апрель, Владивосток, 2010), на Международном симпозиуме по изучению пневмококков и пневмококковых инфекций (ISPPD 7, Tel-Aviv, Israel, 2010), на Европейском Респираторном Конгрессе (сентябрь, 2010, Барселона), на Третьем Съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил РФ «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия ВС РФ» (декабрь, 2010), на первом Евроазиатском конгрессе «Инфекционные болезни: проблемы, достижения и перспективы» (декабрь, 2010, Санкт-Петербург), в работе 16 Азиатско-Тихоокеанского международного симпозиума по изучению проблем респирологии (Манила, Филиппины, февраль, 2011).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ (в журналах, рекомендованных ВАК - 2), из них в центральной печати 12, в зарубежной 3.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами, 86 рисунками, 10 схемами. Список литературы содержит 168 источников, из них 90 принадлежит отечественным, 78 зарубежным авторам. Номер государственной регистрации 01.20.03.02174. Исследование одобрено Этическим комитетом ВГМУ (протокол №1 от 26.03.2012).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Внебольничные пневмонии пневмококковой этиологии являются актуальной проблемой у лиц молодого возраста на примере г.Петропавловска-

Камчатского. Заболеваемость внебольничными пневмониями пневмококковой этиологии составляет в структуре заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста 26%.

2. В этиологической структуре внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии Б.рпеитотае составляет по данным бактериологического исследования 41,3% в монокультуре и до 55% в ассоциациях с различными микроорганизмами.

3. Полирезистентность связана со снижением чувствительности к пенициллину и отмечается прежде всего в отношении штаммов, нечувствительных к макролидам. При изучении генетических детерминант резистентности отмечается преобладание таких генов как те/Е и егтВ, являющихся маркерами устойчивости к макролидам.

4. Анализ клонального родства выделенных штаммов пневмококка методом мультилокусного сиквенстипирования показал, что среди изолятов Б.рпеитотае, вызвавших внебольничную пневмонию, преобладает штамм Бра'т23Р, а среди носителей штамм Яб, что говорит о возможности импорта изучаемых геновариантов в популяцию лиц молодого возраста из закрытых коллективов г.Петропавловска-Камчатского.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Контингент, объем, материалы и методы исследования

Контингент, при обследовании которого, были получены наши результаты составили 300 больных, находящихся на стационарном лечении с диагнозом "внеболь-ничная пневмония" в филиале Главного Военно-морского госпиталя г.Петропавловска-Камчатского в период

с 2010 по 2012 годы, средний возраст контингента составил 21±5,7 лет. Пневмококковая этиология была подтверждена у 78 пациентов, штаммы у которых и составили 1 группу. Для изучения микробиологических свойств штаммов пневмококка, выделенных при бронхитах, мы провели обследование 560 военнослужащих, находящихся на лечении с диагнозом «острый бронхит» (согласно МКБ-10-140), «простой и слизи-сто-гнойный бронхит» (1 41), «Смешанный, простой и слизисто-гнойный хронический бронхит» (1 41.1, ] 41.8). Штаммы Б.рпеитотае, составившие затем 2-ю группу, были идентифицированы в монокультуре у 48 человек, при этом, у 512 человек были выявлены ассоциации различных микроорганизмов. С целью исследования роли носитель-ства штаммов пневмококков в формировании заболеваемости у лиц молодого возраста пневмококковыми пневмониями, мы провели обследование 100 военнослужащих первого и второго года службы (по 50 человек). Носительство штаммов Б.рпеитотае было выявлено у 19 человек. Штаммы, выделенные от носителей составили 3 группу. На основе системы эпидемиологической диагностики была создана методическая основа

нашей работы. Ретроспективный анализ был проведен по установленной схеме и включал изучение динамики заболеваемости, структуры популяции по полу, возрасту. Проведенное исследование позволило оценить заболеваемость внебольничными пневмониями пневмококковой этиологии,

Материалы и методы и представлены в таблице 1.

Таблица 1

Материалы и методы

№ п/п Направления исследований Методы исследования Объем исследований

1. Эпидемиологические исследования 1. Изучение амбулаторных карт больных пневмококковыми внебольничными пневмониями, бронхитами, обследуемых на носительство 2. Ведете журнала микробиологических исследований. 3. Опрос и обследование носителей 8.рпеитоп\ае\ 960 960 100

2. Микробиологи ческие исследования Микробиологическое исследование мокроты, лаважа: бактериоскопия, бактериология, серо-типирование 960 145

3. Молекулярно-микробиологичес кие исследования 1. ПЦР с праймерами к основным генетическим детерминантам к факторам патогенно-сти: 145

4. Молекулярно- эпидемиологические исследования 1. Мультилокусное сиквенстипирование (МЬ8Т) 2. Графическая оценка формирования эпидемического клона, дендрограммы 3. Эпид. анализ данных об устойчивости к антимикробным химиопрепаратам. 26 26 26 26

5. Исследование устойчивости к антибиотикам Исследование чувствительности к антибиотикам: 1.Диско-диффузионный метод; 2.Методом подавляющих концентраций (МПК) 3.Гибридизация с праймерами к генам, анти-биотикоустойчивости 145 145 13 13

6. Статистические исследования 1.Методы вариационной статистики: /Герасимов А.Н., 2007;Петри А.,2009/, 2.Построение и анализ дендрограмм программным пакетом Вюпитепсз Все цифровые показатели

Результаты исследования

Для обоснования первого положения, выносимого на защиту, можно отметить, что: в Дальневосточном Федеральном округе отмечается высокий уровень заболеваемости пневмониями: так, в 2005 году он составил 523,1 на 100 тысяч населения, а в 2010 году составил 600,8 случаев на 100 тысяч населения (рис.1). Лидирующие позиции по заболеваемости пневмониями занимают такие регионы Дальневосточного Федерального округа как Приморский край ( в 2005 году- 640,2 на 100 тысяч населения, в 2010 году- 661,4 случая на 100 тысяч населения), а также Амурская область, где в 2005 году заболеваемость пневмониями составила 464,1 на 100 тысяч населения, а в 2010 году- 895,4 тысяч населения. Камчатский край так же занимает ведущее место по заболеваемости пневмониями: в 2005 году она составила 305,4 случаев на 100 тысяч населения, а в 2010 году составила 441,3 случая на 100 тысяч населения.

-КГ

+ у у у у / / ух у

> ^ ^ ^ ^ ^ ^ V

Рис.1. Заболеваемость пневмониями в Дальневосточном Федеральном округе (на 100 тыс. населения) в 2005 и 2010 годах

Учитывая роль в демографической структуре населения Камчатского края населения такой группы как лица молодого возраста: в 2005 году составляла 69,4 %, а в 2010 году- 67%, актуальность заболеваемости внебольничных пневмоний несомненна. Учитывая особую актуальность состояния здоровья взрослых лиц молодого возраста (18-35 лет) как наиболее активной в социальном плане групп, анализ за-

болеваемости внебольничными пневмониями среди них представляется чрезвычайно важным. При этом, нельзя не учитывать возможность пребывания лиц молодого возраста в закрытом коллективе, что также будет оказывать влияние на уровень заболеваемости внебольничными пневмониями (рис.2). Именно учет этиологического спектра возбудителей, определяемых при внебольничных пневмониях у лиц молодого возраста, позволяет организовать как рациональную антимикробную химиотерапию, так и профилактические мероприятия. При анализе этиологического спектра возбудителей, выделенных при внебольничных пневмониях, нами получены данные, представленные в таблице 2, показывающие что основным возбудителем внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста является Б.рпеитотае, и что подтверждает тот факт, что 26% внебольничных пневмоний у ли молодого возраста являются пневмококковыми.

I —•— призыв. —контракт. -Линейная (призыв.) -Линейная (контракт.) I

Рис.2.3аболеваемость внебольничными пневмониями призывников и контрактников

Второе положение, выносимое на защиту, подтверждается тем, что в общей структуре микробного пейзажа штаммы пневмококка, выделенные в монокультуре составляют 26%. При этом среди всей монокультуры, идентифицированной при пневмониях у лиц молодого возраста, штаммы пневмококка составляют практически треть- 41,3%. Рассматривая состав ассоциаций микроорганизмов, выделенных в обследуемой группе, можно утверждать, что значение пневмококка здесь так же достаточно велико (табл. 2). Ассоциации в составе

S.pneumoniae+S.pyogenes встречаются в 12,3%, ассоциации в составе S.pneumoniae+S.aureus встречаются в составе 4%, ассоциации в составе Streptococcus spp.^.pneumoniae - 20,9%, S.pneumoniae+r(-) флора- 13,3%. В целом, более половины ассоциаций представлено ассоциациями с участием пневмококка. Это позволяет сделать вывод о том, что идентификация S.pneumoniae даже в ассоциации с другими микроорганизмами имеет более важное значение с диагностической точки зрения, чем это рассматривалось ранее.

Таблица 2

Монокультура и ассоциации микроорганизмов, выделенных при внеболь-

ничных пневмониях у лиц молодого возраста (всего 300 пациентов с внебольничной пневмонией)

Моноинфекция 186 (62%)

Коли- % в % в мо-

чество структуре нокультуре

S.pneumoniae 78 26 41,93

Н. influenzae 13 4,3 6,9

S.pyogenes 17 5,6 9,1

Streptococcsus spp. 15 5 8,06

S. aureus 17 5,6 9,1

Kpneumoniae 22 7,3 11,82

A.baumannii 6 2 3,2

Другая (Г-) 18 6 9,67

Ассоциации 105(35%)

S.pneumoniae+S.pyogenes 14 4,6 12,3

S.pneumoniae+ S.aureus 12 4 4

Streptococcus 22 7,3 20,9

spp.+S.pneumoniae

S.pneumoniae+T(-) флора 14 4,6 13,3

Candida spp. 4 1,3 3,8

Г(-)ассоциации 39 13 37,5

He выделен 9 (16%) 3 0

Третье положение, выносимое на защиту можем обосновать тем. что в популяции штаммов Б.рпеитотае выделялись устойчивые к пенициллину

штаммы во всех трех группах: у пациентов первой группы (с внебольничными пневмониями) устойчиво всего 4,40±1,2%, а умеренно устойчиво — 7,02±1,3%; у пациентов второй группы (с бронхитами)- устойчиво к пенициллину (2,4±2,5%), умеренно устойчиво - 4,1 ±2,2, при этом, у носителей- устойчивых в пенициллину штаммов не было, умеренно-устойчивые штаммы составляли 10,5±1,2% (рис.3, рис.4). По отношению к эритромицину также наблюдается формирование устойчивости- в первой группе устойчиво 16,8±2,1%, умеренно -устойчиво 6,7±1,4, среди штаммов второй группы - устойчиво 16,6±1,3%, умеренно-устойчиво 12,7±1,3%. Штаммы, выделенные у носителей, были устойчивы к эритромицину в 5,3±1,3%, умеренно-устойчивы - 15,8±0,9. При анализе устойчивости к тетрациклину было выявлено умеренно-устойчивых штаммов у пациентов с внебольничными пневмониями 34,73±2,1%, устойчивых штаммов 24,3±3,2%.

Пен Эри Тет Цил

Рис.3. Удельный вес устойчивых к антибиотикам шатммов S.pneumoniae, выделенных у пациентов молодого возраста ( 1 группа- пациенты с внебольнич-ной пневмонией, 2 группа- пациенты с бронхитом, 3 группа- носители)

При этом, у пациентов с бронхитами- устойчивых штаммов 8,4±1,1%, умеренно-устойчивых штаммов- 22,9±1,1%. У штаммов, выделенных у носителей -устойчивых штаммов 15,8±2,7%, умеренно-устойчивых штаммов- 31,57±1% к тетрациклину. По отношению к ципрофлоксацину: среди штаммов первой группы- устойчиво 1,3±0,7%, умеренно-устойчиво - 23,08 ±1,1%; среди штаммов, выделенных у пациентов с бронхитами - 12,7±1,3%, умеренно-устойчиво -8,3±1,1%. В штаммах, выделенных у носителей, устойчивых штаммов не было, умеренно- устойчивых штаммов было 10,5± 0,9%. Помимо характеристики ус-

гру ппа щр группе ■Ь групп»

тойчивости штаммов пневмококка к антибиотикам, интересным представляется и тот факт, что количество штаммов, устойчивых к тетрациклину уменьшается во второй группе, при этом- увеличивается соответствующее количество умеренно-устойчивых штаммов.

Пей Эрм тет Цип

Рис.4. Удельный вес умеренно-устойчивых к антибиотикам шатммов Б.рпеитотае, выделенных у пациентов молодого возраста 1 группа- пациенты с внебольничной пневмонией, 2 группа- пациенты с бронхитом, 3 группа- носители)

Количество и устойчивых и умеренно-устойчивых штаммов и в первой и в третьей группах ( носители) увеличивается, что дает возможность предполагать отличия в частоте встречаемости генетических детерминант, опосредующих ан-тибиотикоустойчивости, и определяющих полирезистентность. При этом, следует отметить явление полирезистентности, связанное со_снижением чувствительности к пенициллину отмечаемое, прежде всего в отношении штаммов, нечувствительных к эритромицину. Так из 28 эритромициненчувствительных штаммов, выделенных у больных с внебольничными пневмониями, нечувствительными к пенициллину были 7 штаммов. Среди штаммов, выделенных у пациентов с об-структивным бронхитом и нечувствительных к пенициллину (4 штамма), нечувствительными к эритромицину были 4 штамма. Среди штаммов, выделенных от носителей и нечувствительных к эритромицину (2 штамма), было выделено всего 2 штамма, нечувствительных к пенициллину (табл.3). Таким образом, можно предположить, что явление полирезистентности среди изучаемых нами штаммов обусловлено, прежде всего процессами, способствующими формированию устойчивости к препаратам ряда бета-лактамов и макролидов.

Таблица 3

Чувствительность штаммов S.pneumoniae к

пенициллину и к эритромицину, р<0,05

Пенициллин Эритромицин Полирезистентные

Штаммы 1 группы (ВП)

Ч (90) УР (13) р (15)

Ц* (106) 85 9 12

УР*(8) 4 2 2

Р*(4) 1 2 1 7 5,9±1,2 %

Штаммы 2 группы (бронхиты)

4(24 ) УР( 2) Р(2)

4(24) 24 0 0

УР(3) 0 'it® 2 1

Р(1) 0 0 1 5,1±2,8 %

Штаммы 3 группы (носители)

4(27 ) УР( 1) Р(1)

4(27) 27 0 0

УР(2) 0 1 1

Р(0) 0 0 0 6,9±1,5 %

При проведении молекулярно-генетического мониторинга по изучению распространенности основных генетических детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, отвечающим за устойчивость к макролидов (те^Е, егтВ, Тп917, Тп1545), фторхинолонам (яугА, рагС, рпггА), тетрациклину (1е1М), пенициллину (рЬр1а, рЬр2Ь, рЬр2х) мы получили следующие данные (таблица 4). Очевидно, что основные процессы формирования устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам обусловаливает экспрессия таких генов как те/Е, егтВ (в отношении к макролидам), и белков класса рЪр (по отношению к беталактамам).Популяция штаммов пневмококка также характеризуется

особенностями и в паттерне устойчивости к антибактериальным химиопрепара-там, что позволяет рекомендовать в качестве наиболее приемлемых препаратов для лечения внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии остаются препараты класса бета-лактамов.

Таблица 4

Распространение генетических детерминант устойчивости в

полирезистентных штаммах S.pneumoniae

Генетические детерминанты Штаммы 1 группы ( 7 ) Штаммы 2 группы (4) Штаммы 3 группы (2) Р<0,05

Vfr/A 6 (SV' » П50) и 001 ■>

Тп917 1 (14,2) 0 0 0,001

Тп1545 2 (28,5) 0 0 0,03

gyrA 3 (42,8) 1(25) 0 0,02

рагС 2 (28,5) 2(50) 0 0,0014

pmrA 1 (14,2) 1(25) 1(50) 0,0000 023

tetM 5 (71,4) 0,002

pbpla 3 (42,8) 3(75) 0 0,001

pbp2b 4(57,1) 1(25) 1(50) 0,01

pbp2x 2 (28,5) 2(50) 1(50) 0,04

Четвертое положение, выносимое на защиту, обосновано нами тем, что анализ генетического разнообразия штаммов Streptococcus pneumoniae показал, что среди изученных нами 26 чувствительных и нечувствительных (т.е. умеренно-устойчивых и устойчивых) к пенициллину и эритромицину штаммов было выделено 23 (см. колонку табл.5 «MLST типа») различных сиквенстипа и 4 клональных комплекса. При этом, 2 комплекса были представлены более, чем одним изолятом (комплексы STP-l,STP-4), а также STP-2, STH-8,STH-11 (см.рис.5). Необходимо отметить (табл.5), что из 14 штаммов, выделенных у лиц молодого возраста с внебольничной пневмонией, 6 относились к профилю Spain23F (указаны как штаммы с MLST типом 423,440,81), из которых четыре штамма имели схожий профиль устойчивости и были устойчивыми или умеренно-устойчивыми по отношению к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и клиндамицину. Кроме того, необходимо отметить,

что проанализированные штаммы обладали также схожими, однородными в высокой степени, генотипическими характеристиками и практически все штаммы обладали детерминантами устойчивости к макролидам, то есть практически все штаммы имели гены те/Е и егтВ, что также было согласовано с фенотипическими проявлениями антибиотикорезистентносги.

Таблица 5

Молекулярно-эпидемиологическая характеристика полирезистентных к антибиотикам штаммов Б.рпеитотае (представлено 13 штаммов)

Результаты MLST Резистентность Штаммы

о о. U и % «о й- £ н и и и С эриг клин МИК (мг/м л)

Штаммы, выделенные в 1 группе ( внебольничная пневмония)

23 F 1 5Ж;, j4 ; 12 5 ■3 ............ 8 .423,,,;; Ч 5МЩ

6В 20 28 i 1 15 14 14 315 ч У 0,2 20

231- 4: '4 2 Am-' л 81 ; :4|i УУ: ■: ■У;:;' ■ 0,2

231; 7' Г 1 1 13 31 14 440 ч Щй,: Ш:, :23gr

14 1 5 4 5 5 1 8 9 ч УУ У 0,3 1

н/т 1 5 4 5 5 1 8 9 У У У 0,5 2

14 7 5 1 8 14 11 14 124 У УУ У 0,2 8

Штаммы, вьщеленные в 1 группе (ХОБЛ)

14 2 7 4 10 10 1 27 65 У У У 1 4

23F 8 9 6 4 6 311 0.7 2 , 19

18С 1-у: г ,1 10 ь,. 113 •У.:; У 7

23 F 13 8 l 10 •272'» УУ у 0,6 18

Штаммы, выделенные в 3 ipyne (от носителей)

6В ШВ 9 - 29 2 : 53 344 г."' ж;: У;»; 0,02

6А 2 13 9 1 6 19 14 490 У 0,04 5

* Жирным шрифтом указаны штаммы клона R6, ** серым цветом- клопы R6, Spain 23F

Основной характеристикой штаммов Б.рпгитотае генотипа 8рат23Г является то, что независимо от географической области выделения, эти микроорганизмы являются полирезистентными прежде всего по отношению бета-лактамов и макролидов. Данный сиквенстип распространен в основном в южной части Европы и регионах Ближнего Востока. Среди штаммов, вызвавших у лиц молодого возраста обструктивный бронхит, методом мультилокусного сиквенстипирова-ния было идентифицировано 2 различных сиквенстипа, при этом каждый из них был представлен 5 и 3 изолятами.

ЭТР-Э

ЭТН-Ёв

ЭТС-12

ЭТС-13

ЭТР-7

БТР-2

5ТН-0

ЭТИ-!1

втр-з

5ТР-6 ЗТН-9

Рис.5. Результаты мультилокусного сиквенстипироания полирезистентных штаммов пневмококка, выделенных в 1, 2 и 3 группах (всего 13 штаммов). ( БТР-обозначение штаммов, выделенных при пневмониях, БТН- выделенных при бронхитах, БТС- выделенных при носительстве).

Несмотря на небольшую выборку, штаммы, выделенные от носителей, оказались фенотипически неоднородными: 2 штамма были умеренно-устйочивы к пенициллину и 2 штаммы чувствительны. При этом, все 4 штамма были нечувствительными к эритромицину. В исследуемой группе при этом, оба штамма принадлежали к сиквенстипу, идентичному штамму Я6, который является авирулентным штаммом, и может рассматриваться как условно-патогенная микрофлора.

Таким образом, в настоящее время мультилокусное сиквенстипирования является одним из наиболее точных и высокодискриминирующих методов для микробиологического мониторинга штаммов пневмококка, что позволяет провести типирование и дать прогноз относительно появления штаммов с новыми свойствами, которые в перспективе могут стать госпитальными изолятами и потребовать совершенно новых мероприятий в отношении эпидемиологического надзора.

ВЫВОДЫ

1) Ведущим возбудителем в этиологии внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста является Streptococcus pneumoniae, который выделяется в качестве клинически значимого возбудителя как в монокультуре (41,3%), так и в ассоциациях (55%).

2) В Дальневосточном регионе наблюдается высокий уровень заболеваемости внебольничными пневмониями среди лиц молодого возраста. Заболеваемость внебольничными пневмониями пневмококковой этиологии составляет 26% у лиц молодого возраста.

3) Мониторинг антибиотикорезистентности штаммов пневмококка выявил высокий уровень чувствительности к бета-лактамам, цефалоспоринам, хло-рамфениколу, клиндамицину и фторхинолонам нового поколения; отсутствие ванкомицинрезистентных штаммов; высокий уровень устойчивости к тетрациклину. Такая же тенденция выявлена и в популяции пневмококков, выделенных от здоровых носителей, свидетельствуя об единых процессах формирования устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам.

4) Выявлено увеличение количества поли- и перекрестнорезистентных штаммов, маркером которых были егт гены, а также высокие темпы формирования устойчивости к макролидам, опосредованное mef генами (М-фенотипом).

5) Молекулярно-генетический мониторинг с применением мультило-кусного сиквенстипирования позволил идентифицровать штаммы пневмококка клона Spain23F, наиболее частые в популяции штаммов, вызвавших внебольнич-ную пневмонию у лиц молодого возраста, характеризующиеся полирезистентностью и повышенной активностью факторов патогенности, что свидетельствует о формировании эпидемического геноварианта.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

1. Необходимо организовать микробиологический мониторинг за штаммами пневмококка, выделенными при инфекциях нижних дыхательных путей, у лиц молодого возраста с применением метода мультилокусного сиквен-

стипирования с целью возможностей использования полученной информации для организации эпидемиологического надзора.

2. Учитывая характер формирования устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, в проводимой терапии необходимо использовать бета-лактамы.

3. Для молекулярно-генетической идентификации штаммов пневмококка необходимо использовать сочетание праймеров к гену ply и гену lytA.

4. Необходимо организовывать мониторинг штаммов пневмококка с применением метода мультилокусного сиквенстипирования для организации и своевременного выявления завозных штаммов и организации надзорных мероприятий.

5. Поскольку большинство множественно-устойчивых штаммов S. pneumoniae, циркулирующих на территории России, относятся к «вакцинным», антипневмококковую вакцинацию следует рассматривать как действенный и перспективный путь сдерживания распространения антибактериальной резистентности среди этих бактерий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Скрыль, C.B. Этиологическая структура внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах/ C.B. Скрыль, Е.С.Носач, Н.В.Кулакова, А.В.Мартынова // Вестник Российской академии медицинских наук.- 2012.- № 7.- С. 35-38.

2) Скрыль, C.B. Молекулярно-генетический мониторинг основных возбудителей внебольничных пневмоний/ C.B. Скрыль, Е.С. Носач, A.A. Шепарев, A.B. Мартыновой// Вестник новых медицинских технологий.-2012-№4.-С.8-10.

3)Скрыль, C.B. Эпидемиологические аспекты заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста/С.В. Скрыль, Е.С Носач., А.В.Мартынова // Журнал инфектологии,-2010. -Т. 2, №4-. С.95.

4)Скрыль, C.B. Результаты молекулярно-генетического мониторинга антибиоти-корезистентности штаммов S.pmeunoniae, C.pneumoniae, M. pneumoniae, выделенных при внебольничных пневмониях у лиц молодого возраста/С.В. Скрыль, Е.С.Носач, А.В.Мартынова//Журнал инфектологии,- 2012.- Т.4, №3 (приложение)-С.77.

5)Skril, SV. Epidemiology of pneumococcal community-acquired pneumonias in different age groups on data of the Far East of Russia/ A. Martynova, E. Nosach, O. Chulakova, A. Pruschinskyi, S. Skril/ The Programm and Abstract Book of ISPPD-7 (Tel-Aviv, Israel, March 16-18, 2010)- P.44.

6)Скрыль, C.B. Эпидемиологический анализ заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста/ А.Мартынова, Е.Носач, С. Скрыль// Тезисы

Третьего съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных Сил Российской Федерации» (декабрь 2010, Санкт-Петербург)-С.67.

7)Скрыль, C.B. Микробиологические аспекты изучения этиологического спектра возбудителей внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста./ А.В.Мартынова, C.B. Скрыль// Тезисы конференции «Инфекционная патология в Приморском крае», май 2010, Владивосток,- С.78-79.

8)Скрыль, C.B. Микробиологические особенности диагностики внебольничных пневмоний, вызванных атипичными возбудителями у лиц молодого возраста в закрытых коллективах/ А.В.Мартынова, C.B. Скрыль// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов X Тихоокеанской науч-практич конф студентов и молодых ученых с международным участием (21 апреля 2010.).- Владивосток: Медицина ДВ, 2010.-С.228.

9)Skryl, SV. Epidemiology aspects of community-acquired pneumonia morbidity in young adults/ SV Skryl, ES Nosuch, AV Martynova// Proceedings of the Asian Pacific Respirology Congress, 2010 (November, Manila, Phillipines).-P.45.

10)Skryl, SV. Etiology of community-acquired pneumoniae in young adults/SV Skryl, A. Martynova, E. Nosuch//The proceedings of the ISAAR 2011 Congress (October, 2011, Seoul, South Korea).-P.97.

11)Скрыль, C.B, Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта/С.В. Скрыль, A.B. Мартынова, Е.С. Носач, O.A. Чулакова//Материалы всерос науч школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии»/ Дальневост. Федер. Ун-т.-Владивосток, 2010.С.70-72. Рус. Деп. В ВИНИТИ.

12)Скрыль, С.В.Устойчивость штаммов Streptococcus pneumoniae к антибактериальным химиопрепаратам, выделенных у лиц молодого возраста/ C.B. Скрыль, A.A. Шепарев, O.A. Чулакова// Вестник РГМУ- 2012, Специальный выпуск №1-С. 323.

13)Скрыль, C.B. Результаты молекулярно-генетического мониторинга штаммов S.pneumoniae, выделенных у пожилых/ C.B. Скрыль, A.A. Шепарев, Е.С. Носач, A.B. Мартынова// Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2013-Т.70, №3.-С. 42-47.

14)Скрыль, C.B. Этиологический спектр возбудителей внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста/ Е.С. Носач, C.B. Скрыль// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов 12-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием ( 14-15 апреля 2011 гг)- Владивосток: Медицина ДВ, 2011. С.246

СКРЫЛЬ Сергей Владимирович

Микробиологические и молекулярно-генетические аспекты диагностики внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 03.10.2013. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №356

Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, 31В e-mail: litera_v@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Скрыль, Сергей Владимирович, Владивосток

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ТИХООКЕАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ МИНЗДРАВА РОССИИ

04201363837 Правах рукописи

СКРЫЛЬ Сергей Владимирович

Микробиологические и молекулярно-генетические аспекты диагностики

внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста

03.02.03 - микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент Мартынова А.В.

Владивосток 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 8

1 ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. 17

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭТИОЛОГИИ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ПНЕВМОКОККОВЫХ ПНЕВМОНИЙ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА

1.1 Эпидемиология внебольничных пневмоний у лиц молодого 17 возраста

1.2. Этиология внебольничных пневмоний лиц молодого 22 возраста: современное состояние проблемы.

1.3. Современные представления о микробном пейзаже при 24 внебольничных пневмониях

1.3.1 Streptococcus pneumoniae 24

1.3.2. Haemophilus influenzae 27

1.3.3. Moraxella catarrhalis 2 7

1.3.4. Стрептококковая инфекция 28

1.3.5 Другие микроорганизмы 28

2. Устойчивость к антимикробным химиопрепаратам 29 пневмококков: характерные особенности

3. Результаты изучения носительства штаммов S.pneumoniae у 35 лиц молодого возраста.

3.1. Факторы риска по носителъству S.pneumoniae 3 5

4. Современные методы микробиологического контроля за 38 распространением штаммов S.pneumoniae

5. Микробиологический мониторинг за пневмококковыми 41 пневмониями

5.1. Способы оценки риска распространения эпидемического 42 геноварианта пневмококка и система микробиологического мониторинга

5.1.1 Значение серотипирования штаммов Б.рпеитотае: 43

5.1.2. Генетические методы микробиологического мониторинга 436 пневмококковых пневмоний

6. Молекулярно-микробиологические исследования 48 внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии

при планировании противоэпидемических мероприятий

2. ГЛАВА II. НАПРАВЛЕНИЯ, КОНТИНГЕНТ, 53

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Направления исследований 53

2.2 Контингент исследования 59

2.3 Материал для исследования 60

2.3.1 Клинический лабораторный материал 60

2.3.2 Тест-культуры (эталонные штаммы) 61

2.4 Методы исследования 62 2.4.1 Выделение, идентификация и дальнейшее изучение 63

биологических свойств культур

2.5 Изучение факторов патогенности 64

2.5.1 Оценка нейраминидазной активности 64

2.5.2 Изучение фибринокиназной активности 65

2.5.3 Изучение гиалуронидазной активности 65

2.5.4 Изучение адгезивной активности 66

2.6 Молекулярно- биологические исследования по 67 исследованию вирулентности

2.6.1 Подготовка клинических образцов для исследования 68

2.6.2 Выделение ДНК микроорганизмов из исследуемых образцов 68

2.6.3 Идентификация штаммов пневмококка полимеразной 69 цепной реакцией.

2.7. Определение чувствительности к антибиотикам 71

2.7.1 Диско-диффузионный метод 72

2.7.2 Изучение устойчивости к антибактериальным 72 химиопрепаратам методом серийных разведений

2.7.3 Молекулярно-генетическая оценка детерминант 73 устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам методом ПНР

2.8. Серотипирование штаммов 75

2.9. Мультилокусное сиквенстипирование МЬБТ 16

3. Статистическая обработка 77

3.1. Статистическая обработка цифровых показателей 77

3.1.1 Средняя арифметическая (взвешенная) и ошибка средней 78 арифметической

3.1.2 Достоверность (Т) различий между двумя средними 78 величинами

3.1.3 Корреляционный анализ 79

3 ГЛАВА III. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ 80 И АНАЛИЗ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ СТРУКТРЫ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ПНЕВМОНИЙ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА

3.1 Эпидемиологический анализ заболеваемости 80

внебольничными пневмониями лиц молодого возраста

3.2. Этиология внебольничных пневмоний у лиц молодого 89 возраста. Роль штаммов пневмококка в развитии внебольничных пневмоний

3.3 Результаты изучения носительства основных возбудителей 92 внебольничных пневмоний в закрытых коллективах

4. ГЛАВА IV. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 100 ШТАММОВ S.PNEUMONIAE, ВЫДЕЛЕННЫХ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОГЕННОСТИ.

4.1 Факторы патогенности S.pneumoniae 101

4.1.1 Исследование адгезивной способность штаммов 101 S.pneumoniae

4.1.2 Исследование фибринокиназной активности штаммов 103 пневмококка

4.1.3 Исследование нейраминидазной активности 105

4.1.4. Гиалуронидазная активность 107

4.1.5 Генотиповая характеристика штаммов S.pneumoniae, 108

выделенных у пациентов молодого возраста

5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ 118 К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА

5.1. Результаты исследования резистентности 118

к антибактериальным химиопрепаратам штаммов S.pneumoniae, выделенных у пациентов внебольничными пневмониями, бронхитами и у носителей

5.2 Изучение полирезистентности в штаммах, выделенных от 124 больных внебольничными пневмониями и от носителей

6. ГЛАВА VI. РЕЗУЛЬТАТЫ МОЛЕКУЛЯРНО- 129 ГЕНЕТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ШТАММОВ БШЕиМОМАЕ, ВЫДЕЛЕННЫХ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА, МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО СИКВЕНСТИПИРОВАНИЯ

7 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 139

8 ВЫВОДЫ 147

9 РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ 148 В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

10 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 149

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а\б- антибактериальные химиопрепараты ДВФО- Дальневосточный Федеральный Округ

МКБ-10- Международная классификация болезней 10-го пересмотра

МИК-минимальная ингибирующая концентрация

МПК- минимальная подавляющая концентрация

ПЦР-полимеразная цепная реакция

ТОФ-Тихоокеанский флот

ЭДТА- этилендиаминтетрауксусная кислота

CLSI- Clinical Laboratory International Stanards

ISPPD- International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases MLST- multilocus sequence typing

NCCLS- National Committee Clinical Laboratory Standards NCBI- National Center for Biotechnology Information PFGE- pulse-field gel electrophoresis

Актуальность: Несмотря на достижения в диагностике и постоянной разработке новых схем антибактериальной терапии, внебольничная пневмония продолжает оставаться одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. По данным Федерального медико-биологического агентства России (2013 год), при заболеваемости пределах 25-44%о в старших возрастных группах (> 65 лет), заболеваемость лиц молодого возраста таюке является значимой проблемой и составляет 11,6-16%о. Учитывая социальную и экономическую активность такой демографической группы населения как лица молодого возраста, проблема лечения внебольничных пневмоний представляется более, чем актуальной. Особую актуальность эта проблема приобретает в регионах Дальневосточного Федерального округа, где заболеваемость органов дыхательных путей особенно высока по сравнению с центральными регионами Российской Федерации и превышает общероссийский более, чем на 30% [12,15]. Во многом это связано с микробиологическими особенностями этиологического спектра возбудителей внебольничной пневмонии, определяющих ее различия [1,2]. При этом, пневмококковые внебольничные пневмонии занимают фактически лидирующее место среди внебольничных пневмоний другой этиологии и составляют по мнению российских [16-23] и зарубежных специалистов [134,145] практически 30% в этиологической структуре. Особенную значимость проблеме внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии придает тот факт, что при достаточно длительной истории изучения Streptococcus pneumoniae как микроорганизма, микробиологическое подтверждение получают всего 3% всех пневмоний бактериальной природы ( согласно МУ 3.1.2.3047-13 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями», 10.01.2013). К объективным причинам данного явления можно отнести и сложность выделения такого прихотливого возбудителя в чистой культуре как пневмококк, распространенность носительства среди населения, особенно из закрытых коллективов, а также зачастую недооценке значимости клинической

микробиологической диагностики в целом, что приводит к отсутствию информации о заболеваемости и не позволяет оценивать эпидемиологическую ситуацию по внебольничным пневмониям в целом. Действительно, не систематизированы, а, зачастую, и отсутствуют данные об антибиотикорезистентности штаммов пневмокококков с учетом региональных особенностей, что наиболее актуально для ДВФО региона. Не изучены и микробиологические свойства штаммов, определяющих циркуляцию вирулентных штаммов, с учетом фактора колонизации дыхательных путей несколькими изолятами пневмококка, в том числе и штаммами нескольких различных серотипов. Последствия интересующего явления ощутимы прежде всего для таких наиболее уязвимых в эпидемиологическом плане групп как закрытые коллективы, члены которых наиболее часто подвержены распространению инфекционных заболеваний с аэрозольным механизмом передачи. Основными проблемами, наиболее значимыми в практическом здравоохранении и требующими научно-практической доработки, в отношении пневмококковой инфекции являются организация слежения и контроля за распространением антибиотикорезистентных изолятов, а также молекулярно-эпидемиологический мониторинг выделяемых штаммов, основанный на генотипировании, так как именно он позволит получить упорядоченную информацию о распространении того или иного изолята, что позволит сравнивать полученную информацию о характере выявляемых штаммов Б.рпеитотае, и соответственно, планировать профилактические мероприятия в отношении внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии. Все вышесказанное обозначает актуальность проблемы, определяет необходимость дальнейшего совершенствования методов клинической микробиологической диагностики, а также микробиологического мониторинга с применением генетического маркирования штаммов для решения задач эпидемиологического надзора за внебольничными пневмониями, и обосновывает цель, проведенного нами исследования.

ЦЕЛЬ: изучить микробиологические свойства штаммов пневмококка, выделенных у лиц молодого возраста из закрытых коллективов с внебольничными пневмониями, с применением молекулярно-генетических методов с целью проведения микробиологического мониторинга и планирования мероприятий эпидемиологического надзора..

ЗАДАЧИ:

1) Определить роль штаммов Б.рпеитотае в этиологической структуре внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста, а также выявить особенности факторов вирулентности штаммов пневмококка, выделенных у лиц молодого возраста в закрытых коллективах при внебольничных пневмониях и у носителей.

4) Провести молекулярно-генетический мониторинг выделенных штаммов с применением методики мультилокусного сиквенстипирования в ДВФО регионе на примере субъекта (г. Петропавловск-Камчатский) для клональной характеристики циркулирующих при внебольничных пневмониях штаммов Б.рпеитотае.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

3. Изучены особенности популяционной структуры штаммов пневмококка, вызвавших различные формы пневмококковых инфекций у лиц молодого возраста из закрытых коллективов, идентифицирован клон, циркулирующий в популяции пневмококков, выделенных при внебольничных пневмониях у лиц молодого возраста.

6. Определены генотипические особенности формирования антибиотикорезистентности штаммов пневмококка, вызвавших внебольничные пневмонии у лиц молодого возраста.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Данные о распространении эпидемиологической ситуации по внебольничным пневмониям пневмококковой этиологии позволили получить представление об эпидемической ситуации по заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста в регионах ДВФО.

4. Изучение микробиологических свойств штаммов Б.рпеитотае., позволило выявить такие особенности вирулентности как увеличение экспрессии факторов адгезии и инвазии, что будет обусловливать возможность формирования госпитальных изолятов.

5. Проведенное изучение антибиотикорезистентности выделенных штаммов пневмококка позволило получить представление об эффективности общепринятой и проводимой антибиотикотерапии, а также, учитывая механизм формирования устойчивости к антибактериальным средствам, определить возможность коррекции фармакологического списка препаратов для лечения пневмококковых инфекций у лиц молодого возраста.

6. Изучив популяционную структуру возбудителей внебольничных пневмоний, а также выделив видовой, серотиповой состав штаммов пневмококка стало возможным планировать противоэпидемические мероприятия в отношении внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста в закрытых коллективах.

ВНЕДРЕНИЯ

По материалам диссертации выпущены методические рекомендации «Молекулярно-диагностические аспекты идентификации S.pneumoniae, С.pneumoniae. M.pneumoniae», информационные письма «Об эпидемиологических аспектах диагностики возбудителей внебольничных типичных и атипичных пневмоний», «О микробиологических аспектах диагностики возбудителей астипичных пневмоний» подготовлена информационная справка «О заболеваемости и диагностике внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста».Результаты исследования использованы в создании формуляров антибиотикотерапии пульмонологического отделения Главного Госпиталя ТОФ и его филиалов, организации мероприятий эпидемиологического надзора в частях и учреждениях ТОФ.Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке врачей на кафедре эпидемиологии Владивостокского государственного медицинского университета, на кафедре микробиологии Академии экологии, морской биологии и биотехнологии (АЭМББТ), на кафедре общей экологии ДВФУ.

АПРОБАЦИЯ

конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (28-30 сентября, Москва 2009 года), на III международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль 2009), на IV международной конференции по инфекционным заболеваниям DIT AN (Пекин, 2010), на Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия, 2009), на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (ноябрь, 2009,ДВГУ, Владивосток), на V-ой научно-практической конфе�

Информация о работе

Скрыль, Сергей Владимирович
кандидата медицинских наук
Владивосток, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Микробиологические и молекулярно-генетические аспекты диагностики внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы