Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах"

На правах рукописи

НОСАЧ Екатерина Сергеевна

Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых

коллективах.

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

17 АПР 20П

Владивосток 2014

005547278

Диссертация выполнена в государственном бюджетном образовательном

учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Мартынова Алнна Викторовна Официальные оппоненты:

Паньков Александр Сергеевич, доктор медицинских наук, доцент кафедры эпидемиологии и инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Оренбург).

Чубенко Галина Ивановна, доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Амурской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Благовещенск).

Ведущая организации: Федеральное бюджетное учреждение науки «Ростовский научно исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора (г. Ростов на Дону).

Защита состоится 03 июня 2014 г. в % часов на заседании диссергационного совета ДКМ208.007.02 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 690002, г. Владивосток, ГСП, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Автореферат разослан

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного света, Д.м.н, доцент

Общая характеристика работы Актуальность темы: Заболеваемость внебольничными пневмониями - одна из лидирующих проблем современной медицины. Заболеваемость внебольничными пневмониями (ВП) увеличивается как в мире, так и на территории Российской Федерации. Заболеваемость внебольничными пневмониями любой этиологии у лиц молодого возраста в Российской Федерации составляет 14-15%о, что составляет более 1,5 млн человек ежегодно (А.И Синопалышков,2006, Жестков A.B., 2010). Актуальна проблема внебольничных пневмоний и в других странах: более 4 миллионов человек заболевает внебольничной пневмонией в США, а в странах Евросоюза - более 3 миллионов человек (Benson RE, 2012, Graninger W., 2013). Минздравсоцразвития РФ приводит данные о смертности в нашей стране по причине пневмонии на уровне 31 случая на 100 тысяч населения (что в абсолютных цифрах выражается как 44438 человек). Это также определяет актуальность внебольничных пневмоний как проблемы и в нашей стране. Объективно, противоречивость информации об эпидемиологических аспектах данной нозологии, учет различных факторов риска, данные о микробиологическом спектре этиологически значимых возбудителей, низкая оценка региональных особенностей устойчивости к антибактериальным препаратам, а также отсутствие современных методов лабораторной диагностики определяют основные причины, из-за которых внебольничные пневмонии занимают лидирующую позицию в структуре заболеваемости и смертности. При этом, заболеваемость внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста (18-35 лет) является особенно актуальной, что связано с особой экономической и социальной активностью людей этой возрастной группы. Еще более актуальна проблема заболеваемости внебольничными пневмониями у молодых лиц из организованных военных коллективов, где отмечается тенденция к росту заболеваемости (Огарков П.И., 2006, Жоголев С.Д., 2008). Согласно данным ежегодных отчетов медицинской службы МО РФ, заболеваемость внебольничными пневмониями у военнослужащих срочной службы в период с 2000 по 2006 годы колебалась от 35,3%о до 45,5%о (Редько Н.М., 2009). Очевидно и то, что молодые люди заболевали внебольничными пневмониями в течение первого месяца после прибытия в учебный отряд, когда организм молодого человека проходил период адаптации к новым условиям жизни, преодолевал психологический и физический стресс, подвергался снижению общей иммунорезистентности при активации механизма передачи инфекционного агента.

По данным ряда авторов, заболеваемость внебольничными пневмониями лиц молодого возраста еще в течение первых двух месяцев после призыва достигает 250-300%о (Мельниченко П.И., 2003, Жоголев С.Д., 2006).

Действительно, при достаточно подробно изученных микробиологических свойствах основных этиологически значимых возбудителей при внебольничной пневмонии, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и др., до сих пор остаются не ясными особенности формирования эпидемически значимых вариантов возбудителей, большинство из которых является условно-патогенными возбудителями, не изучена их молекулярно-генетическая структура. Особенно спорными остаются вопросы об этиологической значимости выделения при атипичной внебольничной пневмонии таких сложнокультивируемых возбудителей как (Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumohilla, Chlamydophila pneumoniae), не определено значение выделения их в ассоциации с такими возбудителями как S.pneumoniae и H.influenzae.

Не выявлены особенности формирования антибактериальной резистентности у наиболее значимых сложнокультивируемых возбудителей внебольничной пневмонии, таких как M.pneumoniae, C.pneumoniae, не определены молекулярно-генетические особенности их распространения, что не позволяет обосновать рациональную антибактериальную терапию. Также не выявлена и молекулярно-эпидемиологическая структура этиологически значимой популяции микроорганизмов, не определена их внутривидовая вариабельность, что не позволяет организовывать рациональные противоэпидемические мероприятия в отношении внебольничной пневмонии.

Цель исследования: изучить особенности микробиологической диагностики возбудителей внебольничных пневмоний хламидийной и микоплазменной этиологии и оценить их значимость в этиологической структуре пневмоний у лиц молодого возраста для разработки рекомендаций по оптимизации диагностики, рационализации антимикробной химиотерапии и обоснования профилактических мероприятий.

Задачи исследования:

1) Изучить этиологическую структуру и оценить роль выявления штаммов C.pneumoniae и M.pneumoniae в развитии внебольничной пневмонии у лиц молодого возраста.

2) Выявить генетические особенности формирования антибиотикорезистентности и патогенности штаммов С.рпеитотае и М.рпеитотае, идентифицируемых в структуре этиологически значимых возбудителей внебольничных пневмоний

3) Изучить эпидемиологические особенности заболеваемости внебольничными пневмониями среди лиц молодого возраста в закрытых коллективах.

4) Оценить влияние фактора нахождения в закрытом коллективе на особенности формирования микробиоценоза дыхательных путей с участием С.рпеитотае и М.рпеитотае и развития внебольничных пневмоний хламидийной и микоплазменной этиологии у лиц молодого возраста.

Научная новизна. Впервые комплексно оценена микробиологическая структура этиологически значимых возбудителей внебольничной пневмонии у лиц молодого возраста с идентификацией как бактериальных, так и вирусных возбудителей. Определена роль в микробиологической диагностике идентификации хламидийных и микоплазменных возбудителей, в том числе и при выделении их в ассоциации с другими бактериальными возбудителями.

Оценена роль фактора пребывания в закрытом коллективе для развития атипичных внебольничных пневмоний, вызванных штаммами С.рпеитотае и М.рпеитотае, у лиц молодого возраста.

Изучены особенности популяционной структуры микроорганизмов, входящих в микробиоценоз дыхательных путей у пациентов молодого возраста с внебольничной пневмонией.

Учитывая генотипические особенности различия в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам у штаммов, доминирующих в структуре внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста, предложены рекомендации по коррекции стандарта диагностики и организации эпидемиологического надзора.

Полученные данные об этиологической структуре внебольничных пневмоний хламидийной и микоплазменной этиологии определяют дальнейшие направления изучения проблемы инфекций дыхательных путей, а также предлагают решение теоретических проблем в области медицинской микробиологии, в том числе, в исследованиях, направленных изучение механизмов действия факторов патогенности микроорганизмов, что обусловливает характер микробиоценоза дыхательных путей у пациентов молодого возраста.

Практическая значимость исследований. Результаты изучения структуры этиологически значимых возбудителей внебольничных пневмоний у молодых лиц позволили получить представление об эпидемической ситуации по заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста.

Охарактеризованы эпидемиологические аспекты заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста, выявлен фактор влияния закрытого коллектива на формирование заболеваемости.

Анализ спектра этиологически значимых микроорганизмов, идентифицированных в лабораторном материале от больных внебольничными пневмониями, позволил выявить значимость идентификации штаммов C.pneumoniae и M.pneumoniae, а также определил превалирование в микробиологической структуре этиологически значимых возбудителей такого микроорганизма как S.pneumoniae.

Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов, доминирующих в структуре внебольничных пневмоний, позволил получить представление об эффективности антимикробной химиотерапии, а также, учитывая механизм формирования устойчивости к антибактериальным средствам, определить возможность рационализации антибиотикотерапии инфекций дыхательных путей у лиц молодого возраста.

Изучив популяционную структуру возбудителей внебольничных пневмоний, а также определив видовой состав штаммов, выделенных в качестве доминирующих, в микробиоценозе дыхательных путей у лиц молодого возраста, возбудителеля - стало возможным корригировать противоэпидемические мероприятия в отношении внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста.

Внедрения: По материалам диссертации изданы методические рекомендации, информационные письма, подготовлена информационная справка.

Результаты исследования использованы в создании рекомендаций по коррекции формуляров антибиотикотерапии и при организации мероприятий эпидемиологического надзора.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс при подготовке врачей на кафедре эпидемиологии и военной эпидемиологии ГОУ ВПО ТГМУ, на кафедре биохимии и микробиологии Дальневосточного Федерального Университета, в работе пульмонологического отделения Военно-морского клинического госпиталя ТОФ.

Апробация: Материалы научно-исследовательской работы доложены на: постоянно действующих семинарах «Актуальные вопросы госпитальной эпидемиологии» (Главный Госпиталь ТОФ, 2008г), на 10-й , 11-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (апрель, 2010 г., апрель, 2011 г, Владивосток), на VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009г), на конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 28-30 сентября, 2009 г), на III международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль 2009г), на IV международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль, 2010), на Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия, 2009 г), на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (Владивосток, ноябрь, ДВГУ, 2009 г), на V-й научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 19-20 мая 2010 г), на Международном симпозиуме по изучению пневмококковых инфекций (Israel, ISPPD 7, Tel-Aviv, 2010), на Европейском Респираторном Конгрессе (Барселона, сентябрь, 20 Юг), на Третьем Съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил РФ «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия ВС РФ» (декабрь, 20 Юг), на Первом Евроазиатском конгрессе «Инфекционные болезни: проблемы, достижения и перспективы» (Санкт-Петербург, декабрь, 20 Юг), в работе 16 Азиатско-Тихоокеанского международного симпозиума по изучению проблем респирологии (Филиппины, Манила, февраль, 2011 г).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ (в журналах, рекомендованных ВАК- 2 статьи), из них в центральной печати 5, в зарубежной - 6.

Личный вклад автора: Анализ данных литературы по теме диссертации, бактериологическое обследование, анализ эпидемиологической информации, молекулярно-генетические исследования (80%), статистическая обработка полученных результатов и их анализ, написание диссертации выполнены лично автором.

Объем и структура диссертации традиционная. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 23 рисунками, 8 схемами. Список литературы содержит 237 источников, из них 113 принадлежит отечественным, 124 зарубежным авторам.

Исследование одобрено Этическим комитетом ВГМУ (протокол №5, дело №35 от 19 апреля 20 Юг).

Положения выносимые на защиту:

1)Заболеваемость внебольничными пневмониями является значимой в структуре заболеваемости лиц молодого возраста в закрытых коллективах и составляет от 2,26%о до 6,77%о с умеренным темпом прироста. Фактор пребывания в закрытом коллективе более двух месяцев увеличивает вероятность заболевания внебольничной пневмонией бактериальной и вирусно-бактериальной этиологии.

2)Этиологическая структура характеризуется преобладанием таких возбудителей как S.pneumoniae (26%), Н. influenzae (18%), при этом, такие сложнокультивируемые возбудители как C.pneumoniae, M.pneumoniae, L.pneumophila являются единственными идентифицируемыми возбудителями в 39%, что подтверждает их значимость в развитии внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста.

3)Для идентификации этиологически значимого возбудителя в случае диагностики внебольничных пневмоний, молекулярно-диагностические методы на основе полимеразной цепной реакции представляются наиболее перспективными: чувствительность ПЦР идентификации M.pneumoniae и C.pneumoniae в лабораторном материале составляет 94%, специфичность 86%.

4)Распространенность в геноме маркеров антибиотикорезистентности и патогенное™ подтверждает возможность формирования моноклональности.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАЛИ РАБОТЫ Объем, материалы и методы исследования

Исследуемая популяция (всего 200 пациентов), средний возраст которой составил 19±1,9 лет - мужчины в возрасте от 18 до 34 лет. Все они являлись военнослужащими по призыву, поступившими в пульмонологическое отделение Главного Госпиталя ТОФ с диагнозом внебольничная пневмония в период с 2008 г. по 2010 г. Для оценки

распространенности носительства бактериальных возбудителей инфекций респираторного тракта, в том числе и вызывающих атипичные пневмонии, были обследованы на носительство 200 военнослужащих, проходящих подготовку в одном из учебных отрядов.

Микробиологические исследования проводились в течение всего периода исследования (с сентября 2008 по март 2010гг.) на базе клинической лаборатории Военно-морского клинического госпиталя (заведующий - доктор медицинских наук Андрюков Б.Г). Все экспериментальные и клинические исследования одобрены Этическим комитетом ГОУ ВПО ВГМУ Росздрава (протокол № 5, дело 35 от 19 апреля 2010г.), а при проведении исследования было получено информированное согласие пациентов и обследуемых на проведение исследования. Основными материалами для проводимых исследований у пациентов и обследуемых являлись мокрота, оро- и назофарингеальный мазок, жидкость бронхоальвеолярного лаважа. Исследуемый клинический материал в первые сутки поступления больного в стационар до проведения лечения доставляли в лабораторию. Дальнейшие исследования проводили с учетом рекомендаций Приказа № 535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно - профилактических учреждений" от 22 апреля 1985 года. Материал для иде1ггификации возбудителей атипичных пневмоний (М.рпеитотае, С.рпеитотае, Ь.рпеиторЫИа) собирался согласно методическим рекомендациям «Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекции методом цепной полимеразной реакции - №95-106», утв. Минздравмедпромом РФ 08.08.1995. Для проведения исследования мы использовали эталонные тестовые штаммы культур и препараты ДНК, полученные кафедрой эпидемиологии Тихоокеанского государственного медицинского университета и кафедрой биохимии и микробиологии Дальневосточного Федерального Университета в Государственном Контрольном институте биологических препаратов им. В.Г. Тарасевича В данном исследовании для подтверждения видовой принадлежности выделенных штаммов, исследования генетических детерминант факторов их вирулентности, а также проведения серотипирования, была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) [МиШэ 1986; 8айа 1988]. Исследование проводилось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (кандидат биологических наук, руководитель проекта грант РФФИ, н.с. Балабанова Л.А.).

Таблица 1

Материалы и методы

№п/п Направления исследований Методы исследования Объем исследов аний

1. Клинико- анамнестический анализ 1.Анализ данных заболеваемости 2.Изучение амбулаторных карт больных внебольничными пневмониями и пациентов соматического стационара; З.Опрос и обследование обследуемых на носительство 400 200 200

2. Микробиологические исследования 1.Микробиологическое исследование назо- и орофарингеального мазка: 1.1 Экспресс-диагностика по Белобородовой микроскопия мазка с окраской по Граму 1.2 Выделение культур этиологически значимых возбудителей и их идентификация, серотипирование: «Унифицированные микробиологические методы, применяемые в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ» МЗ СССР №535 от 22.04.1985 2.Ид«ггификация C.pneumoniae,M.pneumoniae, L.pneumophiila .[Тартаковский И.С.,2000], а также Методические рекомендации «Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекции методом цепной полимеразной реакции - №95-106 200 200 78

3. Иммунологические исследования 1. Идентификация С.pneumoniae,M.pneumoniae, L.pneumophiila (ИФА) 78

4. Молекулярно- эпидемиологические исследования 1.ПЦР с праймерами к основным генам факторов вирулентности и антибиотикоусгойчивости (23SPHK, pl, lexA.ftsH) 2.Сравнительный геномный анализ штаммов C.pneumoniae, M.pneumoniae, L.pneumophiila с учетом базы данных NCBI 3. Ресгрикционный анализ (23SPHKpl, отр2) 35 5 34

5. Статистические исследования 1.Методы вариационной статистики: /Герасимов А.Н., 2007;Петри А.,2009/, 2.Посгроение и анализ дендрограмм программным пакетом Bionumerics Все цифровые показатели

Результаты исследования и их обсуждение. При анализе данных о заболеваемости внебольничными пневмониями по Дальневосточному Федеральному округу (информация предоставлена Военно-морским клиническим госпиталем, заведующей отделом сбора и обработки информации — Белимовой С.Г.),

мы получили данные, согласно которым, помимо увеличения в летний период заболеваемости внебольничными пневмониями легкой и средней степени тяжести, имеется увеличение удельного веса случаев с отрицательным микробиологическим подтверждением диагноза внебольничной пневмонии в период первого осеннего подъема заболеваемости (с августа по сентябрь), что также подтверждает необходимость совершенствования диагностического процесса на уровне рутинной работы клинической микробиологической лаборатории (табл. 2).

Таблица 2

Результаты микробиологической диагностики внебольничных пневмоний

(ретроспективно, п=400).*

Результаты бактериологических исследований август-сентябрь ноябрь-декабрь апрель-июнь Всего

Монокультура 42(21,6%) 126 (51,8%) 65 (39,8%) 233 (38,8%)

Ассоциация микроорганизмов 53 (27,3%) 82 (33,7%) 36 (22,08%) 171(28,5%)

Отрицательный результат 99 (51,03%) 35(14,4%) 62(38,03%) 196 (32,6%)

Всего 194 243 163 600 (100%)

*р<0,05 ** Данные получены при выкопировке данных о результатах микробиологических

исследований в период с 2005 по 2008 годы

Таким образом, очевидно, что, несмотря на определенные недостатки в организации диагностического процесса на уровне клинической микробиологической лаборатории, имеются статистически значимые различия в показателях заболеваемости внебольничными пневмониями, что, скорее всего, обусловлено разнообразной микробиологической структурой этиологически значимых возбудителей.

Для доказательства первого положения, выносимого на защиту, мы приводим наши данные по изучению многолетней динамики заболеваемости внебольничными пневмониями. При этом было определено, что за исследованные 8 лет, заболеваемость колебалась в пределах определённых показателей, верхней границей которых является так называемый эпидемический порог. При этом уровень заболеваемости до 2004 года, и уровень заболеваемости после 2006 года превышает эпидемический порог, что позволяет предполагать эпидемический (вспышечный) характер заболеваемости внебольничными пневмониями в данный период времени. Анализ помесячной динамики заболеваемости показывает, что заболеваемость характеризуется типичной осеннее-зимней и весеннее-летней сезонностью с общей продолжительность сезонных подъёмов по 3 месяца (рис. 1), при этом, заболеваемость достигает средне-максимального значения 6,77%о при средне-минимальном значении заболеваемости в 2,26 %о с умеренным темпом прироста 4,9% в год.

Рис.1. Типовая кривая заболеваемости внебольничной пневмонией (2000-2008гг.)

При анализе эпидемиологических данных об этиологических вариантах внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста с различным сроком пребывания в закрытом коллективе, мы получили следующие данные (таб. 3):

Таблица 3

Этиологические варианты внебольничной пневмонии в группах больных с _различным сроком службы (< и > 2 месяцев) __

Этиология Срок службы <2 месяцев Срок службы > 2 месяцев Всего Р<0,05

М. pneumoniae 7 % (14) 2,5% (5) 19 (9,5%) 0,001

C.pneumoniae 3,5% (7) 2% (4) 11 (5,5%) 0,014

M.pneumoniae+ C.pneumoniae 8%(16) 10%(20) 36(18%) 0,01

H. influenzae 6%(12) 12%(24) 18% (36) 0,03

S.pneumoniae 11%(22) 15%(30) 52 (26%) 0,02

Бактериально-вирусные ассоциации 1,5%(3) 3,5%(7) 10(5%) 0,2383

Всего 37%(74) 45%(90)

Таким образом, очевидно, что для внебольничных пневмоний, где основными возбудителями будут являться микоплазмы и хламидии, чрезвычайно важным является пребывание в закрытом коллективе, так как больший удельный вес по развитию случаев внебольничных пневмоний представлен в группе пациентов,

заболевших внебольничной пневмонией, находившихся в закрытом коллективе менее 2 месяцев 50% (37 случаев из 74) по сравнению с 32,2% (29 случаев из 90) среди тех лиц, которые находились в закрытом коллективе более 2 месяцев).

Для обоснования второго положения, выносимого на защиту, можно привести сравнительные данные об изменениях (табл.3) микробиологической структуры этиологически значимых возбудителей, идентифицированных при атипичной внебольничной пневмонии по результатам мониторинга возбудителей М. pneumoniae, С. pneumoniae, а также их ко-инфекции, S. pneumoniae.

Согласно представленным данным, пневмококк занимает так же значимую позицию в этиологической структуре возбудителей внебольничных пневмоний. При этом, идентификация M.pneumoniae, C.pneumoniae, L.pneumophila представляется более значимой в эпидемиологическом плане, что подтверждается стабильностью идентификации данных возбудителей, как в периоды сезонного подъема, так и в период снижения заболеваемости.

Таблица 4

Этиологическая структура внебольничной пневмонии по данным мониторинга возбудителей (М pneumoniae, C.pneumoniae, ко-инфекция атипичных возбудителей, _S. pneumoniae) в течение года по месяцам (п=200).__

Месяц исследования Количество обследованных больных Mycoplasma Е "t pneumoniae ; Chlamydophila ; pneumoniae \ L.pneumophila I Ко-инфекция Атип. + пневмокока ; jt « 111 ¥ 1 1 OS,» * Si ü Всего возбуди телей атипичных пневмоний Streptococcus pneumoniae

VI 11 1 1 0,5 1 0,5

VII 7 2 2 1 2 1

VIII 3 2 2 1 - 0

IX 3 3 3 1,5 1 00,5

X 7 1 1 0,5 1 0,5

XI 8 1 2 3 6 3 4 2

XII 19 2 1 4 6 13 6,5 10 6,5

I 35 3 3 2 14 22 11 13 4,5

II 49 3 3 2 8 16 8 9 3,5

III 31 4 2 3 9 0,5 7 1

IV 24 1 1 2 1 2 1

V 3 1 - - 1 0,5 2 1

200 19 9,5% 11 5,5% 2 1% 10 5% 36 18% 78 39 % 52 22,0 %

Анализ выявления возбудителей атипичных внебольничных пневмоний в течение года по месяцам свидетельствует об их преобладании у больных внебольничной пневмонией с ноября по март включительно. В этот период они

обнаружены у 57 человек, что составляет 73,0 % от всех положительных результатов, полученных в течение года (78 человек). Проведенные исследования позволили обнаружить возбудителей атипичных внебольничных пневмоний у 78 (39% от всех обследованных пациентов). В том числе ко-инфекция (Мpneumoniae и C.pneumoniae) выявлена у 36 чел. (18 %), изолировано М. pneumoniae - у 19 (9,5%), а С. pneumoniae — у 11 (5, 5 %) больных. Кроме того, в двух случаях была идентифицирована ¿.pneumophila 2 пациента (1%).

Для обоснования третьего положения, выносимого на защиту, мы можем отметить, что во всех исследуемых образцах лабораторного материала был идентифицирован какой-либо условно-патогенный или облигатно-патогенный возбудитель, клиническая значимость которого, безусловно, должна быть оценена при оценке клинического процесса. Тем не менее, очевидно, что преобладающими сложнокультивируемыми микроорганизмами, и, соответственно, представляющими наибольшую сложность в диагностике для врача-бактериолога и для врача-терапевта, являются бактериальные возбудители атипичных пневмоний, к которым относится C.pneumoniae, М. pneumoniae, L. pneumophila.

Проблема становится еще более объективной, когда мы оценили чувствительность и специфичность серологических методов исследования (табл.5), которые, тем не менее, так же не входят в общепринятый протокол рутинной диагностику пневмоний. При идентификации этиологически значимого возбудителя в случае диагностики внебольничных пневмоний, молекулярно-диагностические методы на основе полимеразной цепной реакции представляются наиболее перспективными, так как чувствительность ПЦР в диагностике возбудителей атипичных внебольничных пневмоний составляет 94% (47 случаев из 50), а специфичность 86% ( 119 из 150).

Таблица 5

Чувствительность и специфичность методов диагностики возбудителей атипичных внебольничных пневмоний (п=200 пациентов)

Результаты ПЦР диагностики Результаты серологической диагностики

Позитивный Негативный Всего

Положительные результаты 47 31 78

Отрицательные результаты 3 119 122

Всего 50 150 200

Следовательно, становится очевидной актуальность изучения этиологического спектра именно бактериальных возбудителей атипичных внебольничных пневмоний, равно как и методов, их диагностики, а также внедрения этих методов в рутинную диагностику (табл.6).

Таблица 6

Бактериальные и вирусные возбудители внебольничных пневмоний (п=200)

Возбудитель ПЦР Рутинные методы диагностики (бактериология ИФА)

Абс % Абс %

Возбудители атипичных пневмоний 78 39 50 25

В т.ч. атпичные возбудители в ассоциации с 5.рпеитотае 10 5 4 2

В.рпеитотае 52 26 29 14,5

Н.тЦиетае 36 18 14 7

Бактериальные ассоциации 10 5 10 5

Вирусно-бактериальные ассоциации 16 8 - -

Возбудитель не выявлен 8 4 - 46,5

Четвертое положение, выносимое на защиту, можно обосновать следующим образом: несмотря на внутривидовое разнообразие как среди штаммов С.рпеитота, так и среди штаммов М.рпеитотае, имеется общая тенденция в распространении генов устойчивости к антибиотикам среди штаммов, выделенных от пациентов с внебольничными пневмониями и у носителей (таблица 7). Генетические детерминанты устойчивости к макролидам {238гКЫЛ, Ь4, Ь22) распространены в 60% среди штаммов микоплазм, и 80% всех штаммов хламидий. При этом у носителей, генетические детерминанты устойчивости к макролидам также распространены среди штаммов М.рпеитотае в 50%, а в С.рпеитотае -80%, что подтверждает общую тенденцию в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам.

Таблица 7

Распространенность детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в

штаммах, выделенных у пациентов с атипичными ВП и у носителей

детерминанты макролиды

23ЯгтА | Ь4 | 122 КугА | кугВ \ рагС | рагЕ

Пациенты с ВП (25)

М.рпеитотае (15) 6 (40%) 2 (13,3%) 1(6,6%) 100% 100% 100% 100%

С.рпеитотае, (10) 5(50%) 2(20%) 1(10%) 0 100% 100% 100%

Т=4,4; 7,04, р=0,04, 0,018 р>0,05

Носители

М.рпеитотае (10) 5(50%) 0(0%) 0 100% 100% 100% 100%

С.рпеитотае (5) 2(20%) 1(10%) 1(10%) 0 100% 100% 100%

Р=0,4, р=0,02 р>0,05

Таким образом, нами выявлено, что ген, кодирующий синтез метилтрансфераз, которые способны изменять сайты распознавания антибиотиков — 23Э рибосомальную РНК, является определяющим в развитии устойчивости к макролидам, что снижает, в свою очередь аффинность к макролидам, и ухудшает, соответственно, терапевтическую эффективность схем лечения микоплазменных

и хламидийных пневмоний. У исследованных 25 образцов ДНК штаммов бактерий, вызвавших атипичные внебольничные пневмонии данный ген был выделен в 40% ДНК микоплазм (6 из 15 образцов) и 50% (5 из 10 образцов ) хламидий. Это же нашло и подтверждение и в ДНК штаммов, идентифицированных у носителей — у микоплазм он был выделен у 50%, у С.рпеитотае - в 20%. В целом, можно ожидать распространенность данной генетической детерминанты антибиотикорезистентности в 61,7±13,1%. Мутации в генах, кодирующих рибосомальные белки Ь4 и Ь22, встречаются несколько реже: у пациентов с внебольничной пневмонией - 24,0±15,1% (причем при микоплазменных пневмониях- 20,0±2,06%, при хламидийных пневмониях- 30,0±2,45%).

Мониторинг устойчивости к фторхинолонам, по нашему мнению, представляет более сложную задачу и должен решаться методами молекулярно-эпидемиологического анализа с исследованием полиморфизма рестрикционных фргаментов, так как большинство генов, кодирующих устойчивость к данным антибиотикам являются конститутивными. Для изучения возможности поиска единой генетической детерминанты, определяющих первый этап инфицирования макроорганизма хламидиями и микоплазмами, мы провели анализ распространения детерминант адгезии в штаммах микоплазм и хламидий (табл.8) и выяснили, что основной генетической детерминантой факторов адгезии у штаммов М.рпеитотае является белок Р1 (выявлен в 46,6% ДНК, выделенной от пациентов и в 30% ДНК, выделенной от носителей).

Таблица 8

Распространенность генетических детерминант факторов вирулентности, выделенных в штаммах - возбудителях атипичных пневмоний

Генетические детерминанты Гены адгезии Гены белков-факторов

патогенноети деления клетки

Пациенты с ВП

М.рпеитотае (п=15) Р1 АзН 1ехА

4(26,6%) 7 (46,6%) 8 (53,3%) 6(40%)

С.рпеитотае (п=10) орт! 4 (40%) отр2 3(30%) Не уст Не уст

Р<0,05 Р<0,05

Носители

М.рпеитотае (п=10) Итм*! Р1 1ехА

0% 3(30%) не уст 1(10%)

С.рпеитотае (п=5) орт! отр2 1ехА 1ехА

4 (80%) 3(60%) не уст не уст

Р<0,05 Р<0,05

Молекулярно-генетический мониторинг детерминант патогенноети на примере факторов, определяющих адгезию, показал, что как в штаммах M.pneumoniae, так и в штаммах C.pneumoniae, несмотря на видовые различия, имеется также общая тенденция к распространенности аллелей генов определяющих адгезию.

Проанализировав вариабельность генетических детерминант устойчивости к макролидам среди выделенных штаммов M.pneumoniae и С. pneumoniae на примере гена 23S rRNA при проведении рестрикционного анализа мы получили следующие данные (рис.2).

PhyIog#n*t1 с

-СР-1

CP—4

CP—2

СР-Э

-СР-5

-СР-1.1

-СР-1 . 2

Рис.2. Результаты рестрикционного анализа (А1и1) гена 238гРНК ДНК С.рпеитотае, выделенных от пациентов ВП (СР-1,СР-4,СР-2,СР-3, СР-5) и от носителей (СР-1.1 и от СР-1.2).

Таким образом, очевидно формирование среди выделенных штаммов микроорганизмов с клональными характеристиками (штаммы С.рпеитотае, выделенные от пациентов с ВП принадлежат к двум клональным группам), выделенные от носителей - к генетически не связанным изолятам.

При проведении рестрикции гена 238гРНК штаммов М.рпеитотае выделено 2 клональных комплекса (из 6 штаммов, выделенных от пациентов), и отсутствие клонального родства в ДНК микоплазм, идентифицированных от носителей.

MM

MP-6

-MP-4

-MP-1,5

МР-2 MP-3

_ __MP-S

- MP-1.3

-MP-1.4

-MP-l.l

- МР-1.2

Рис.З.Результаты рестрикционного анализа (Mnll) гена 23SPHK ДНК M.pneumoniae, выделенных от пациентов ВП (МР-1,МР-4,МР-2,МР-3, МР-5, МР-6) и от носителей (MP-1.1,MP-1.2, MP-1.3, MP-1.4, MP-1.5).

При проведении рестрикционного анализа генетических детерминант, определяющих адгезию у M.pneumoniae и С. pneumoniae, мы также получили подтверждение формированию клонапьности (клональное родство у штаммов, выделенных отпациентов), так как в штаммах, идентифицированных у пациентов, нами были выявлены общие закномерности в распространении генетически детерминант, определяющих основные факторы патогенности, гомологичных по функции: гены 23SPHK, генов, кодирующих адгезию (отр2, ompl- у С.pneumoniae). Более того, в генах 23SPHK методом рестрикционного анализа была подтверждена генетическая идентичность изучаемых участков в образцах ДНК, идентифицированных от пациентов, что объясняет формирование высокой патогенности у микоплазм и хламидий, проявившейся в развитии патогенетического процесса в легочной ткани (рис.3), что также говорит о формировании моноклональности и о возможном появлении эпидемически значимого геноварианта возбудителя.

Выводы

1) Микробиологический мониторинг возбудителей внебольничных пневмоний с применением молекулярно-биологических методов исследования, в частности, ПЦР, позволяет установить их роль в развитии заболевания. В структуре внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста, хламидийные и микоплазменные пневмонии сотавляют до 39%., удельный вес других бактериальных возбудителей составляет 26% (S.pneumoniae), 18% (Я. influenzae).

2) Ген, кодирующий синтез метштгрансфераз, которые способны изменять сайты распознавания антибиотиков — 23 S рибосомальную РНК, является определяющим в развитии устойчивости к макролидам штаммов хламидий и микоплазм, выделенных у пациентов с внебольничными пневмониями и у носителей.

3) Заболеваемость внебольничной пневмонией в течение анализируемого периода (2000-2008г.) регистрируется постоянно, с неравномерным уровнем в отдельные годы и колебаниями в пределах от 2,26%о до 6,77%о. Наблюдается умеренная тенденция к повышению заболеваемости внебольничной пневмонией со средним темпом прироста 4,9% в год. Рост заболеваемости в анализируемый период обусловлен, скорее всего, снижением эффективности проводимых противоэпидемических мероприятий.

4) Высокий удельный вес в микробиоценозе дыхательных путей штаммов C.pneumoniae и M.pneumoniae у лиц молодого возраста, пребывающих в закрытом коллективе в течение первых 2х месяцев, является прогностически значимым фактором в развитии пневмоний преимущетвенно легкого течения. При этом снижение в микробиоценозе штаммов M.pneumoniae со временем пребывания в закрытом коллективе, можно объяснить образованием ассоциаций данного возбудителя с другим бактериальным возбудителем внебольничных пневмоний- Chlamydophila pneumonaie.

Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практическое здравоохранение

1. Необходимо проводить мониторинг сложнокультивируемых возбудителей -C.pneumoniae, M.pneumoniae, L.pneumophilla — атипичных пневмоний при изучении эпидемиологии внебольничных пневмоний.

2. Генетические последовательности 23SPHK и PI могут служить генетическими детерминантами при проведении молекулярно-эпидемиологического мониторинга при изучении устойчивости микоплазменных и хламидийных пневмоний.

3. При идентификации этиологически значимого возбудителя в случае диагностики внебольничных пневмоний, молекулярно-диагностические методы на основе полимеразной цепной реакции представляются наиболее перспективными.

4. Полимеразная цепная реакция применяемая при идентифировании C.pneumoniae, M.pneumoniae, L.pneumophilla позволяет контролировать распространение генетических детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Этиологическая структура внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах/ C.B. Скрыль, Е.С.Носач, Н.В.Кулакова, А.В.Мартынова // Вестник Российской академии медицинских наук. 2012. №7. С. 35-38.

2. Молекулярно-генетический мониторинг основных возбудителей внебольничных пневмоний/ C.B. Скрыль, Е.С. Носач, A.A. Шепарев, A.B. Мартыновой// Вестник новых медицинских техиологий.-2012-№4.-С.8-10.

3. Epidemiology of pneumococcal community-acquired pneumonias in different age groups on data of the Far East of Russia/ A. Martynova, E. Nosach, O. Chulakova, A. Pruschinskyi, S. Skril/ The Programm and Abstract Book of ISPPD-7 (Tel-Aviv, Israel, March 16-18, 2010)- P.44. (abstract's).

4. Эпидемиологический анализ заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста/ А.Мартынова, Е.Носач, С. Скрыль// Тезисы Третьего съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных Сил Российской Федерации» (декабрь 2010, Санкт-Петербург) - С.67.

5. Микробиологические аспекты изучения этиологического спектра возбудителей внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста./ А.В.Мартынова, Е.С.Носач, C.B. Скрыль// Тезисы конференции «Инфекционная патология в Приморском крае», май 2010, Владивосток.- С.78-79.

6. Микробиологические особенности диагностики внебольничных пневмоний, вызванных атипичными возбудителями у лиц молодого возраста в закрытых коллективах/ А.В.Мартынова, Е.С.Носач, C.B. Скрыль// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов X Тихоокеанской науч-практич конф студентов и молодых ученых

с международным участием (21 апреля 2010.).- Владивосток: Медицина ДВ, 2010.-С.228.

7. Epidemiology aspects of community-acquired pneumonia morbidity in young adults/ SV Skryl, ES Nosuch, AV Martynova// Proceedings of the Asian Pacific Respirology Congress, 2010 (November, Manila, Phillipines).-P.45.

8. Etiology of community-acquired pneumonia in young adults/ A. Martynova, E. Nosuch//International Journal of Infectious Diseases.-2010.-Vol.14, Suppl.2.-P.7.

9. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта/С.В. Скрыль, A.B. Мартынова, Е.С. Носач, O.A. Чулакова//Материалы всерос. науч. школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии»/ Дальневост. Федер. Ун-т,-Владивосток, 2010.С.70-72. Рус. Деп. В ВИНИТИ.

10. Эпидемиологические аспекты заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста/С.В. Скрыль, Е.С Носач., А.В.Мартынова // Журнал инфектологии,2010. -Т. 2, №4-, С.95-96.

11. Результаты мультилокусного сиквенстипирования штаммов S.pneumoniae, выделенных у пациентов пожилого возраста на Дальнем Востоке России./ A.B. Мартынова A.A. Шепарев// Сборник Отечественная эпидемиология в 21 веке: приоритетные направления и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека: труды Юбилейной всероссийской научной конференции, посвященной 75-летию кафедры общей и военной эпидемиологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова и 90 летаю со дня рождения академика В.Д. Белякова/ под ред. П.И.Огаркова- Санкт-Петербург, 19-20 апреля, 2012 года. СПб - С.248-249.

12. Устойчивость штаммов Streptococcus pneumonia к антибактериальным химиопрепаратам, выделенных у лиц молодого возраста/ C.B. Скрыль, A.A. Шепарев, O.A. Чулакова// Вестник РГМУ, 2012, Специальный выпуск №1- С. 323.

13. Результаты молекулярно-генетического мониторинга антибиоти-корезистентнсти штаммов S.pneumonia, C.pneumonia, M. pneumonia, выделенных при внебольничных пневмониях у лиц молодого возраста/С.В. Скрыль, Е.С.Носач, А.В.Мартынова// Журнал инфектологии,-2012,- Т.4, №3-С.77.

14. Результаты молекулярно-генетического мониторинга штаммов S.pneumoniae, выделенных у пожилых/ C.B. Скрыль, A.A. Шепарев, Е.С. Носач, A.B. Мартынова// Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2013-Т.70, №3.-С. 42-47.

15. Этиологический спектр возбудителей внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста/ Е.С. Носач, С.В. Скрыль// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов 12-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием ( 14-15 апреля 2011 гт.)-Владивосток: Медицина ДВ, 2011. С.246-247.

16.Внебольничные пневмонии: проблемы современной эпидемиологии. Эпидемиологические аспекты инфекций респираторного тракта/ А.В.Мартынова, Е.С.Носач, С.В. Скрыль// LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012. 101 С.

17. Изучение распространенности гомологичных участков в геноме микроорганизмов- возбудителей атипичных пневмоний / Е.С.Носач, А.В. Захаров, А.В. Фисенко// Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов 12-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием ( 14-15 апреля 2011 гг.)- Владивосток: Медицина ДВ,- 2011- С.245-246.

18. Etiology pathogens structure in community-acquired pneumonias and COPD exacerbations / E.S. Nosuch, A.V.Martynova, A.A. Sheparyov// Eur Respir J 2011; 38: Suppl. 55-P.549.

19. Epidemiology of community-acquired pneumonias in closed collectives/ ES Nosuch, AV Martynova, SV Skryl//Internal Medicine Journal, 2010, Volume 40, Issue Suppl, SI-P.137.

20. Микробиологические особенности диагностики атипичных внебольничных пневмоний в закрытых коллективах/ Е.С. Носач, А.В. Мартынова// Тихоокеанский медицинский журнал, 2010, № 3, С.98.

21. Ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости внебольничными пневмониями в закрытых коллективах / Е.С. Носач, С.В. Громов, А.В. Мартынова// Тихоокеанский медицинский журнал, 2010, № 3, С.98.

НОСАЧ Екатерина Сергеевна

Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах.

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 25.03.2014 г. Формат 60 х 84Аб Бумага писчая. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, 31В e-mail: litera_v@mail.ru