Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние условий культивирования NEISSERIA MENINGITIDIS на выход и свойства липополисахарида

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние условий культивирования NEISSERIA MENINGITIDIS на выход и свойства липополисахарида"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова

Для служебного пользования Экз. № 000053 ® На правах рукописи

СТУКАЛОВА Наталья Викторовна

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ NEISSERIA MENINGITIDIS НА ВЫХОД И СВОЙСТВА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, профессор И. А. Баснакьян, кандидат биологических наук Л. И. Ванеева.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик Российской АМН, профессор А. А. Воробьев, кандидат биологических наук Н. П. Ванеева.

Ведущее учреждение, дающее отзыв о научно-практической значимости диссертации — Российский государственный медицинский университет.

00

Защита состоится « » . Ц-А^«? 1992 г. в часов на заседании специализированного совета Д001.38.01 научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова по адресу: 103064, Москва, переулок Мечникова, дом 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

Автореферат разослан « ^ » . . . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Н. Г. Кудрявцева

Введение.

Актуальность проблема. В настоящее время внимание многих исследователей напилено на создание эффективных вакцинных препаратов против менингококка серогруппн В,так как проблема борьбы с менинго-кокковой инфекцией указанной серогруппы-одна из актуальных задач здравоохранения.

Эндотоксин менингококка интересен как кандидат будущей вакцины и как антиген для разработки диагностических препаратов Дувакина В.И. с соавт, 1989 /.ЛПС meningitidia обладает широким спектром биологических и иммунологических свойств.Согласно литературным данным/Петров А.Б. с соавт.1990, Jennings H.J. с соавт. 1983, Teal С.-М. с соавт.1984/ЛПС менингококка имеет двойственный характер.С одной стороны он является протективным антигеном,так как антитела к ЛПС быстро опсонизируют клетку,активируют систему комплемента и вызывают фагоцитоз /Дмитриев Б.А. с соавт. 1990 /.С другой стороны менингококковый эндотоксин обладает высокой токсичностью и пирогенностью.Протективные свойства ЛПС ис- ' пользуются исследователями для создания вакцины на-основе данного антигена.Но наряду с созданием эффективной вакцины,перед учеными встает задача обнаружения менингококкового эндотоксина в вакцинных препаратах,как нежелательной примеси.

Для разработки менингокогасовых вакцинных препаратов на основе ЛПС-антигена необходимо глубокое изучение его количественных и качественных характеристик.Одним из аспектов этого изучения является определение свойств ЛПС при изменяющихся условиях культивирования. Ученым удалось выявить влияние аэрации,определяемой числом оборотов шейкера.фазы роста,состава питательной среды на выход препарата менингококкового ЯПС и его физико-химическую характеристику / угаасЬ С.Е. с соавт.1976, Poolman J.T. о соавт.1985, Jenninga H.JO соавт.1983,Ts»! С.-М.с соавт.1986/. Также имеются отдельные сообщения,в которых авторам удалось обнаружить как r -форму менингококкового ЛПС,так и 3 -форму ЛГО /Apicella М.А. 1979, Perry M.B. с соавт.1975, Гагг T.R. с соавт. 1984/.

Общим недостатком этих исследований является использование неуправляемого периодического процесса культивирования на плотной и в жидкой питательных средах,содержащих природные компоненты,либо в синтетических средах,состоящих из большого набора дорогостоящих

соединений.Такие методические подходи не позволяют объективно и достоверно изучить влияние условий культивирования на свойства" мвнингококкового ЛПС.В используемых авторами процессах периодического культивирования,как известно .происходят постоянные изменения как состава культуральной среды,так и свойств микробных клеток, что приводит к невоспризводимости результатов,Применение питательных сред .содержащих природные компоненты,или синтетических сред с большим набором соединений предусматривает наложение на получаемые результаты дополнительных эффектов,не связанных с исследуемым препаратом ЛИС.

В лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИВиС им.И.И.Мечникова разработаны и изучены управляемые процессы культивирования Neleseria meningitidis . в синтетической питательной среде,состоящей из небольшого количества доступных компонентов/Лопырев И.В. 1984;Карабак В.И. с соавт.1985,1986; Баснакьян H.A. 1989/.Однако такие исследования не были направлены на изучение менингококкового ЛПС.

Целью работы было изучение влияния условий управляемого культивирования Heieseria- meningitldlajepoгруппы В на выход,химический состав и физико-химическую характеристику,биологические и серологические свойства менингококкового ЛИС. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

1.Из N. meningitldls .выращенного в условиях многоциклическо-. го,сливно-доливного,непрерывного управляемого процессов культи-.

вирования,выделить препараты ЛПС с помощью метода westphel о. и Jttnn К. .

2.Изучить влияние фазы роста,содержания в среде кислорода и глюкозы, типа процесса культивирования на выход и химический состав менингококкового ЛПС.

3.Изучить физико-химическую характеристику получаемого менингококкового ЛПС.

4.Определить условия культивирования,позволяющие обнаружить высоко-молекулярную форму ЛПС.

5.Изучить биологические и серологические свойства препаратов ЛПС, имеющих отличную друг от друга физико-химическую характеристику.

6.Подобрать методы количественной и качественной оценки присутствия менингококкового ЛПС в менингококковой полисахаридно-белко-вой вакцине.

Научной новизной выполненной работы явилось установление влияния

условий культивирования на выход и физико-химические свойства менингококкового ЛПС.

Обнаружен разный выход ЛПС при изучении штаммов менингококка серогрупп А,В.С,а также у разных штаммов одной и той же серогруп-пы В.

Показано,что влияние фазы 'роста на выход ЛПС,полученного из клеток N. meningitidis штамма №125.проявляется в условиях избытка кислорода-в экспоненциальной фазе роста выход препарата наибольший.

Установлено рлияние растворенного в среде кислорода и глвдесозы на выход препарата ЛПС¡выход ЛПС больше при лимите кислорода,чем при его избытке;при содержании в среде кислорода на уровне 0% от полного насыщения выход ЛПС возрастает с увеличением содержания глюкозы в питательной среде.

Определены условия культивирования N. meningitidla .позволяющие микробным клеткам синтезировать низко-молекулярную форму ЛПС /4-7 кД/;условия,обеспечивающие синтез болев высоко-молекулярной формы ЛПС /10-15 кД/;а также совокупность условий,способствующие синтезу высоко-молекулярной формы ЛПС/2Ь-40 кД/.

Обнаружено влияние степени чистоты и молекулярной массы ЛПС на его токсичность и величину константы связывания антигена/АГ/ с антителом/АТ/ в иммуноферментном анализе /ИФА/:с увеличением молекулярной массы ЛПС значение константы связывания увеличивается на порядок.

Практическое значение выполненной работы:

Отработаны три модификации метода выделения и очистки ЛПС по ffeetphal о. и Jann к. .направленные на повышение выхода ЛПС из культуры /1-я модификация/,получение более очищенного препарата ЛПС/2-я модификация/,повышение выхода очищенного препарата ЛПС /3-я модификация/.

Установлено,что сливно-доливной процесс культивирования ппи поддержании кислорода на уровне 20% от полного насыщения и непрерывный процесс культивирования менингококка обеспечивают получение препаратов ЛПС,минимально загрязненных примесями.

Положение.выносимое на защиту; Зависимость выхода,химического состава и физико-химической характеристики препаратов ЛПС от фазы роста культурын. meningitidis, уровня растворенного кислорода,содержания глюкозы в питательной среде и типа процесса культивирования.

Аггообация работы. Диссертация апробирована на научной конференции отдела условно-патогенных микроорганизмов НИИВиС им.И,И.Мечник ва Российской АМН 18.02.1992 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы /список щ веден в конце реферата/.

Объем и структуре работы. Диссертация состоит из введения,2 глаг обзора литературы,4 глав собственных исследований,заключения,выводов и списка цитируемой литературы.Работа изложена на ^^ стр. машинописного текста,иллюстрирована 2>Ч рисунками и ■{$ таблицами.В работе использовано отечественных и ¡0$ иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1.Материалы и метода.

Объекты исследований. В работе использовали штаммы N. meningitidis серогруппы А/№132/,серогруппы В /№125,№150/ и серогруппы С /№133/, селекционированные в лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИВиС им.И.И.Мечникова.

Культивирование менингококка, Менингококк выращивали в синтетической питательной среде,разработанной Карабак В.И./1985/,в ферментерах "Анкум"/СССР/ и "Марубиши"/Япония/,оснащенных автоматическими системами контроля и управления температурой,рН и уровня кислорода,растворенного в среде/р02/.Всего было осуществлено 36 процессов культивирования.Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности культуры с помощью фотоэлектроколориметра-не-фелометра ФЭК-Н-56 при длине волны 540 нм в кюветах с оптическим путам 10 мм.

Методы получения ЛПС и сывороток. Менингококковий ЛПС выделяли и очищали по трем отработанным нами модификациям метода Weatphal с и jann'K. /1965/,описанных в разделе 2 данного автореферата. Кроличьи антименингококковыа сыворотки получали иммунизацией кроликов замороженными культурами менингококка,выращенными в ферментере. Иммунизацию кроликов осуществляли по 9-ти кратной схеме /Боровкова В.М. с соавт.1985/ и 6-ти кратной/Трушникова А.Г.1983/. Сыворотки были любезно предоставлены Боровковой В.М. и Колеико В.М

Химические методы анализа. Содержание белка определяли по методу Lowry о.Н. /1951/,сиаловые кислоты по методуSvennerhoim /195?/ нуклеиновые кислоты по методу Спирина д.с. /1958/,кетодезоксиоктон'

вую кислоту /КДО/ ПО методу Anacker R.L. /1966/.

Физико-химические методы. Осуществляли электрофорез в полиакрил-амидном геле при 3% концентрирующем геле и 12% разделяющем геле по системе Laemmil и. к. /1970/.Окрашивание геля проводили нитратом серебра по методике,изложенной в работе Tsai с.-М. /1986/.Ультрафиолетовые спектры /УФ-спектры/ получали на спектрофотометре при длинах волн в диапазоне 200-300 нм.Инфракрасные спектры /ИК-спект-ры/ снимали на базе химического факультета МГУ совместно с сотрудницей Жужликовой С.Т. по методике,представленной в работе Ростовцевой H.A. /1974/.Сухой вес клеток определяли по сухожаровому методу, изложенному в работе Чаленко В.Г. /1970/.Использовали метод гель-фильтрации с носителем Sephakril s-зоо и S-400 в буфере с 1% дезоксихолатом натрия /ДОХ- Na/ на кол'онках СЮ/16 и СЮ/20.Электродиализ препаратов ЛПС осуществляли по методике,представленной в работе Речменского С.С. /1939/. .

Биологические методы. Токсичность препаратов ЛПС определяли по методу ?ieroni p.e. /1970 / с использованием актиномици-на Д /Аполлонин A.B. с соавт.,1989/.Использовали в опытах белых мышей весом 18-20 г.Вводимые дозы препаратов ЛПС составляли:1мкг; 0,1мкг;0,01мкг;0,001мкг на мышь.Концентрация актиномицина Д 25 мкг на мышь.Количество мышей на дозу-5штук.

Серологические методы, Метод иммуноферментного анализа /ЙФА/ и расчет констант связывания Дев./ проводили по методике.представленной в работе Сорокиной П.В. /1989/.Этот этап исследований осуществляли совместно с сотрудницей НИИВиС им.И.И.Мечникова лаборатории ИФА Шкуриной Е.А.

Статистическую обработку данных проводили по формулам,рекомендованным Ашмариным И.П. и Воробьевым A.A. /1962/.

-2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Нами было проведено 36 процессов культивирования и получено 54 препарата менингококкового ЛПС.Осуществлены следующие процессы культивирования: периодический на плотной и в жидкой средах,многоциклический, сливно-доливной и непрерывный.Все типы процессов культивирования проводили при поддержании кислорода и pH культуральной среды на разных уровнях,при разном содержании глюкозы в питательной среде и при воспроизведении разных фаз роста культуры менингококка.

2.1.Модификации метода Westphal о. и Jann К. для получения менингококкового ЛПС.

Первым шагом в проведении исследований явилась разработка оптимального метода выделения и очистки ЛПС.Существует традиционный метод экстракции менингококкового ЛПС - метод Westph8l ци .гапа ] /Роо1тап л Т. с соавт.,1985; Зеш&пев Н. ^ с соавт.,1983;гаа1 С.-1 с соавт.,1985/.Этот метод был нами взят за основу.На первых этапа; данной научной работы,когда была известна только й -форма менингококкового ЛПС,стояла задача получить как можно больше именно эт< формы препарата ЛГО,а основной метод не позволял решить поставленную задачу»поскольку был направлен на выделение б -формы ЛПС из водной фазы.Нами совместно с сотрудниками лаборатории препаративнс биохимии Львовым В.Л. и Вернер И.К. института Иммунологии была ра; работала первая модификация основного метода.Она состояла в испол! зовании влажных клеток,а не сухих,и выделении ЛПС не только из во/ ной фазы,но и из фенольной,а также было расширено число используег. ферментов,то есть помимо РНК-азы,как в основном методе,использовав ДНК-азу и протеиназу К.

Однако в ходе исследований,когда стали известны данные литера^ ры об з -форме менингококкового ЛПС,возникла необходимость разработать вторую модификацию метода 1Кеа1рЬа1 о. и к. .Эта потребность была также обусловлена тем,что препараты ЛПС,получении е по первой модификации,были загрязнены примесями:белком от А% л 9%,нуклеиновыми кислотами от 1% до 5#,сиаловыми кислотами от до 10%.Вторая модификация отличалась от первой тем,что был изменен набор ферментов,вместо ДНК-азы,использовали РНК-азу,и после фермен тативной обработки была введена дополнительная стадия ультрацентрифугирование и центрифугирование при 15000 об/мин. /Захарова И.Я. Косенко Л.В. 1982/,а также электродиализ.

С целью получения большего выхода очищенного препарата ЛПС была разработана третья модификация основного метода совместно с Львовым В.Л. и Вернер И.К.Третья модификация состояла в том,что выделяли ЛПС как из клеток,так и из культуральной жидкости,а также была исключена стадия ферментативной обработки и заменена на очист ку объединенных супернатантов и осадков,полученных после трехкратного ультрацентрифугирования,путем осаждения цетавлоном и гель-фил рации.

В диссертационной работе все разработанные нами три модификации основного метода выделения и очистки менингококкового ЛПС наглядно представлены тремя схемами соотвественно.

Согласно трем модификациям метода Weatphal И Jann наш были получены препараты ЛПС и охарактеризованы по химическому составу с помощью УФ-спектров и биохимических методов анализа/определение белка,нуклеиновых и сиаловых кислот/.В табл.1 представлен сравнительный анализ степени чистоты препаратов менингококкового ЛПС,полученных по 1-ой,2-ой,и 3-ей модификациям /схемам/ из клеток н.

meningitidla штамма №125,выращенных сливно-доливным методом

культивирования при поддержании растворенного кислорода на уровне 2055 от полного насыщения в синтетической питательной среде,Из табл.1 видно,что препараты ЛПС,полученные по 2-ой и 3-ей модификациям, имеют минимальное количество, примесей:белка-от 1$ до ^.нуклеиновых кислот-от 0,08$ до 0,9$;сиаловых кислот-от 0,95? до 1,8$ при содержании относительно чистого ЛОС от 81,4$ до 95,6$.Таким образом нами были выбраны 2-ая и 3-ья модификации /схемы/.

Согласно результатам изучения химического состава полупродукта препарата ЛПС на основных стадиях первой модификации /схема 1/ и второй модификации /схема 2/ с помощью УФ- и ИК-спектров ,а также биохимических методов анализа можно заключить,что по мере перехода от одной стадии к другой происходит снижение .содержания примесей и увеличение содержания относительно чистого ЛОС.Так по схеме 1 полупродукт ЛПС,полученный после водно-фенольной экстракции,характеризовался содержанием белка 10,1$,нуклеиновых кислот 9,71!?,а на последней стадии очистки,то есть после ферментативной обработки и центрифугирования,имел содержание примесей 3% и 2,27$ соответственно.На рис.1 представлены УФ-спектры полупродуктов препарата ЛПС на основных стадиях выделения и очистки по схеме 2 /модификация 2/. Из рис.1 видно,что в процессе очистки полупродукта происходит снижение и исчезновение пика с максимумом 260 нм,характеризующего поглощение нуклеиновых кислот и белка.Согласно результатам,полученным с помощью биохимических методов анализа,можно заключить,что снижается содержание белка от 18% до 1$,нуклеиновых кислот от 10,4$ до 0,4$,сиаловых кислот от 16$ до 1,5$,при увеличении КДО от 3,2$ до 10,5$.Такие данные согласуются с результатами,полученными с помощью УФ-спектров.

2.2.Влияние условий культивирования N.meningitidla на выход и химический состав ЛПС.

Следующей задачей исследований было изучение влияния условий

Сравнительный анализ степени чистоты препаратов Ж, полученных по 1 -ой, 2-ой и 3-ей схемам С модификациям) из клеток Neisseria meningitidi* штамма № 125, выращенных в синтетической питательной среде сливно-доливным методом при. поддержании растворенного в среде кислорода на уровне 20« от полного насыщения.

Схема получения препарата. № препарата. Белок, Нуклеиновш кислоты, Сиаловые кислоты, КДО. Содержание относительно чистого ЛОС.

+ „ ± m + m X* ± 01

X* + гт,

« ±. d. 2. 3. 8,30 9,40 4,30 2,40 1.Б5 4.88 3.92 1.43 9,00 5.80 9.75 1,59 3,90 4,94 5,60 ' 0,61 43,30 45,00 57.00 5,70

2. 1. г. 3. 1,04 1,00 2,50 0,65 0,26 0,36 0,70 0,17 1,60 1,80 1.Б0 0,09 12,20 10,50 7,55 1,68 95,50 93,20 81,40 5. ВО

1. 1,50 0,80 0,90 10,20 85,00

3. 2. 1.04 2,18 0,08 0,34 1,40 0,20 11,40 0,63 92,40' 3,51

3. 4,00 0.90 1.00 11.90 93.30

*-содержание белка,нуклеиновых и сиаловых кислот,КДО,относительно чистого Ж)С в ~ по сухому весу препарата Ж.

Рис.1.Ультрафиолетовые спектры полупродуктов менингококкового препарата ЛПС на основных стадиях выделения и очистки схемы 2 /модификация 2/.Ось абсцисс-длина волны /у! /в нм, ось ординат-единицы оптической плотности /Et /.

1-Зкстракт после удаления фенола- -х-

2-Супернатант 1 после ультрацентрифугирования---4--

3-Супернатант 2 после обработки протеиназой К и ультрацентрифугирования--------

4-Осадок после последнего ультрацентрифугирования- —0—

культивирования:типа процесса культивирования,уровня растворенного кислорода и содержания глюкозы в питательной среде,а также штамма neisseria meningitidis и фазы роста культуры-на выход и химичес кий состав препарата ЛПС.

Результатов изучения влияния штамма на выход препарата менинго-коккового ЛПС в доступной нам'литературе не обнаружено.Поэтому мы осуществили периодические процессы культивирования менингококка серогрупп А,В и С штаммов №132,№125,№133 соответственно на плотной и в жидкой синтетической питательных средах.Из культуры,выращенной в таких условиях ,были получены препараты ЛПС .Выход препаратов ЛПС штамма №133 оказался наибольшим/22,7 мкг/млрд.кл.,6,1$ по с.в. кл./,препаратов ЛПС штамма №132-промежут о чным/9,4мкг/млрд. кл., 4,8£ по с.в.кл./,препаратов ЛПС штамма #125-наименьшим/5,8 мкг/млр; кл.,1,7# по с.в.кл./.Эти результаты можно вероятно объяснить некоторыми различиями в строении клеточной стенки каждого изучаемого штамма.Необходимо отметить,что при сравнении штаммов №125 и М50 одной и той же серогруппы В выявлен более высокий выход препарата ЛПС,полученного из клеток штамма №125,выращенных при многоциклическом процессе культивирования при поддержании кислорода на уровне 0% от полного насыщения /8,83мкг/млрд.кл.,2,41% по с.в.кл./, чем из клеток штамма №150, выращенных в тех же условиях/2,А2мнг/шрх кл.,0,655? по с.в.кл.'/.

Из литературных данных известно,что фаза роста влияет на физико-химическую характеристику менингококкового ЛПС / Pooiman jr. т. с соавт.,1985/.Однако авторы не могли точно определить фазу роста, так как проводили культивирование на плотной среде.Кроме того в этой работе отсутствуют данные о.влиянии фазы роста на выход препарата ЛПС.Поэтому нашей задачей явилось изучение влияния фазы роста культуры на выход ЛПС.Фазы роста наш были определены в глубинных периодических процессах культивирования, в жидкой синтетической питательной среде в соответствии. с методическими рекомендациями / Баснакьян И.А..Запорожцев Л.Н. и соавт.,1978/.Затем эти фазы роста были длительно воспроизведены в управляемых процессах культивирования:многоциклическом и сливно-доливном.Выход препаратов ЛПС,полученных из клеток менингококка серогруппы С штамма №133 в фазе отмирания был незначительно выше,чем выход препаратов ЛПС,полученных из клеток в экспоненциальной фазе роста /6,1% по о.в.кл.,4,7$ по с.в.кл. соответственно/.Выход препа-

ратов ЛПС,полученных из клеток менингококка серогрупга А штамма №132 в экспоненциальной фазе роста,был выше,чем из клеток в фазе отмирания/4,по с.в.кл.,1,7% по с.в.кл. соответственно/.Выход препаратов ЛПС,полученных из клеток серогрулпы В штамма №125,составлял примерно одинаковые -значения,как в экспоненциальной фазе роста,так и в фазе отмирания/1,Ъ% по с.в.кл.,1,7!? по с.в.кл. соответственно/. Из полученных данных следует ,что влияние фазы роста культуры на выход препарата менингококкового-ЛПС,проявляется у разных штаммов по разному.

Для более детального изучения зависимости выхода препарата ЛПС от фазы роста мы осуществили длительные управляемые процессы культивирования .воспроизводящие ту или иную фазу роста одного и того же штамма серогрулпы В №125.В табл.2 представлены результаты выхода препаратов ЛПС,полученных из клеток Neisseria meningitidie серогрулпы В штамма №125 разных фаз роста,воспроизведенных в разных процессах культивирования в синтетической питательной среде в ферментере.Как видно из табл.2,выход препаратов ЛПС,полученных из клеток в экспоненциальной фазе роста,выращенных при многоциклическом или сливно-доливном процессах культивирования,при поддержании кислорода на уровне 20% от полного насыщения,был значительно выше,чем выход препаратов ЛПС в максимальной стационарной фазе роста.Однако выход препаратов ЛПС,полученных из клеток как экспоненциальной, так и максимальной стационарной фаз роста,воспроизведенных при тех же управляемых процессах культивирования,но при поддержании кислорода на уровне 0% от полного насыщения',был примерно одинаковым.На основании полученных результатов можно заключить следующее.Фаза роста оказывает влияние на выход менинго-кокковых препаратов ЛПС,полученных из клеток,выращенных1 при управляемых процессах культивирования,при поддержании кислорода на уровне 20% от полного насыщения.Таким образом влияние фазы роста культуры менингококка на выход ЛПС зависит от уровня кислорода в культуральной среде.Причину такой взаимосвязи следует изучать в дальнейшем.

Известны единичные исследования,посвященные изучению влияния растворенного в среде кислорода на выход менингококкового ЛПС/

Frasch С,Б. с соавт.,1976; Tsal С.-М. с соавт.,1983/. Для проведения подобных исследований нами были проведены управляемые процессы многоциклического,сливно-доливного,непрерывного

Влияние фазы роста клеток Neisseria men ingit id is серогруппы В штамма N°125 , выращенных при разных процессах культивирования в синтетической питательной среде,на выход препарата ЛПС.полученного из клеток по схеме 2.

Процесс Фаза роста. • рОр. Выход, Выход, *

культивирования. У., MKT''МЛРД. кл. у- по с. в.

1. Периодический. Экспоненциальная 0 5,44+0.92 1,45+0,73

Макс, стационарная О 4,82+0.71 1,30+0.65

Фаза отмирания 80 ■5,80±1,20 1,74+0.73

2. Многоцикличес- Экспоненциальная 0 :. 8,83+Г, 97 1,41+0,61

кий. Макс, стационарная 0 6,75+2,58 1,20+0,23

Экспоненциальная 20 Б,70+3,81 1,79+0,59

Макс.стационарная 20 2,80+1,02 1,46+0,45

Экспоненциальная 50 12,7Б±1,Б5 3,40±0,Б5

Макс.стационарная 50 15,60+2,01 4,20+0,83

■ 3.Сливно-долив- Экспоненциальная 0 7.20+3,41 2,32+1,07

ной. Макс.стационарная 0 7,90+2,57 2,24+1,25

Экспоненциальная ■¿D ■ 4.У4+1.Ё1 1.33+0.41

Макс.стационарная 20 2,80+1.01 0,75+0,28

*-выход препарата ЛПС в процентах по сухому весу клеток.

культивирования в синтетической питательной среде.Проведение многоциклических процессов культивирования Neisseria meningitidis штаммов №125 и №150 при поддержании кислорода на различных уровнях показало следующее.Выход препаратов ЛПС,полученных из клеток, выращенных при поддержании кислорода на уровне 0%,6ил значительно выше,чем выход препаратов JH1C при поддержании кислорода на уровне 20!? от полного насыщения,а именно;для шшамма №125-8,83мкг/млрд.кл., 6,7мкг/млрд.кл. соответственно;для штамма №150-2,42мкг/млрд.кл., 1,55мкг/млрд.кл. соответственно.Аналогичные результаты были получены при осуществлении сливно-доливного процесса культивирования Neisseria meningitidis штамма №125 при поддержании кислорода на уровнях 055 и 20$ от полного насыщения.При проведении непрерывного процесса культивирования выход препаратов ЛПС при 0% кислорода был в несколько раз выше,чем при 20% от полного насыщения /14 мкг/млрд.кл.,2мкг/млрд.кл. соответственно,при содержании относительно чистого ДОС 93,2$ и 92,3$ соответственно/.

Согласно изложенному в работе Баснакьян И.А. с соавт./1990/ следует,что при лимите кислорода клетки Neisseria meningitidis в процессе своего роста активно потребляют глюкозу,являющуюся лимитирующим рост фактором,а при избытке кислорода в среде наблюдается активное потребление аминокислот-цистеина и глютамино-вой кислоты.Поэтому можно сделать предположение,что при лимите кислорода создаются более благоприятные условия для формирования клетками менингококка молекул ЛПС,так как глюкоза входит в состав ЖС.Эти данные согласуются с результатами работы Jennings H.J. /1983/ о наличии, глюкозы в коровой части молекулы ЛПС.

Полученные нами данные о влиянии кислорода на выход менингокок-кового ЛПС на первый взгляд противоречат результатам TSai с.-м. /1983/,так как ими установлено,что при повышенной аэрации выход ЛПС увеличивается по сравнению с выходом ЛПС при низкой аэрации. Однако при детальном рассмотрении их исследований обнаруживается несоответствие уровня организации процессов культивирования и состава среды с условиями,используемыми в наших исследованиях, что приводит к неправомерности сопоставления результатов.В работе Tsai с.-м, ,как известно,культивирование велось в триптиказо--соевом бульоне в колбах,установленных на шейкере.о содержании кислорода авторы судили по числу оборотов,что говорит об использовании неуправляемого периодического процесса культивирования в

питательной среде,содержащей неконтролируемые высокомолекулярные природные примеси.Мы в своих исследованиях использовали управляемые по рН,кислороду.скорости разбавления и др. процессы культивирования в синтетической питательной среде определенного химического состава,как это было.описано выше.

Одним из возможных вариантов объяснения расхождения результате может быть зависимость выхода ЛПС не только от кислорода,но и от содержания глюкозы в питательной среде.Поэтому следующей задачей наших исследований было изучение влияния глюкозы на выход менинго коккового ЛПС,поскольку в литературе такие исследования нам не встретились.Учитывая результаты,описанные в работе Баснакьян И.А. с соавт. /1990/,о том,что в условиях лимита кислорода глюкоза является лимитирующим рост фактором,мы выбрали управляемые процессы культивирования при содержании растворенного в среде кислорода на уровне от полного насыщения,Нами.были осуществлены сливно-долк ные процессы культивирования при содержании глюкозы в среде 1,6г/, и Юг/лнепрерывные процессы культивирования при содержании глюко зы в среде 1,6г/л,5г/л и Юг/л.Выход препаратов ЛПС,полученных из клеток,выращенных сливно-доливным методом культивирования при различном содержании глюкозы в среде,был,примерно одинаковым / 0,20 мкг/млрд.кл.,0,14 мкг/млрд.кл. соответственно/.Однако выход препаратов ЛПС,полученных из клеток,выращенных непрерывным способом культивирования,увеличивался по мере увеличения содержания глюкозы в питательной среде /0,22 мкг/млрд.кл.,0,35 мкг/млрд.кл., 0,53 мкг/млрд.кл. соответственно/.Следует заметить,ч этих данных не следует принимать во внимание из-за потерь на стадии электродиализа по модификации 2.

В ходе получения препаратов менингококкового ЛПС были использованы биохимические методы анализа и метод ИК-спектроскопии для оценки их химического состава.Результаты изучения химического состава препаратов ЛПС,полученные с помощью ИК-спектров,согласовались с данными,полученными с помощью биохимических методов анализа.

При сопоставлении химического состава получаемых препаратов ЛПС возникла необходимость изучить влияние типа процесса культивирования на химический состав препаратов ЛПС.Такие исследования в литературе мы не встретили.В табл.3 представлены результаты изучения влияния типа процесса культивирования N. теп1пеИ;1<118

Влияние типа процесса культивирования мвивепд «вп^д^иив серогрупгш В штамма №125 в синтетической питательной среде в экспоненциальной фазе роста на химический состав препаратов ЛПС.

Процесс культивирования. р02 % . РН Схема получения препарата. ■ ■ Белок, ^ У- по C.B. Нуклеиновые кислоты, * * по C.B. Сиалозьв кислоты, # ПС C.B. ВД. ** * ПО C.B. Содержание ■ относительно чисздго ЛОС,

1. Многоциклический. 0 20 5,9 7,5 2 2 1,24+1,31 0,85+0,71 0.06+0,07 0.20+0,08 7,31 ±1,07 7,71+1.35 5.31+1.26 7.73+2.30 61,8+3,40 70,3±5,Б1

2.Сливно-долив-ной. 0 20 , 6,2-6,5 7,6 2 2 3,0711,62 1,25+1,34 1,31+0.81 0,53+0,25 1,80±0,40 1,70+0,20 5,23+1,27. 9,03+2,68 ' 48,1+5.98 93,2+1.54

3. Непрерывный. 0 20 6,0-6,2 7,4-7,7 2 3 0,50+0,38 1,50+2,01 0,01+0,06 0,08+0,05 0,60+0,52 1.40+0,63 10,20+0,95 11,50+0,52 81,4+3,58 92.3+1,67

*-содержание белка,нуклеиновых и опаловых кислот в х по сухому весу препарата ЛПС. **-содержание КДО,относительно чистого ЛОС в по сухому весу препарата ЛПС.

I

чя I

серогруппы В штамма №125,воспроизводящего экспоненциальную фазу роста,на химический состав препаратов ЛПС.Сопоставление проводили с учетом уровня растворенного в среде кислорода.Оказалось, что оптимальными процессами культивирования.позволяющими получать препараты ЛПС,минимально загрязненные примесями,являются: сливно-доливной процесс культивирования при поддержании кислорода на уровне 20$,а также непрерывный процесс культивирования при поддержании растворенного в среде кислорода на уровне 0% и 20%.

Метод ИК-спектроскопии был использован нами для оценки состояния ЛПС в процессе хранения.Было установлено,что в результате хранения ЛПС не происходит изменения его физико-химической характеристики ,но уменьшается содержание примесей белка и нуклеиновых кислот.Ж-спектроскопия была использована нами также для обнаружения ЛПС в менингококковой полисахаридно-белковой вакцине, а именно в сериях с №6 по №12.Результаты исследования показали, что в вакцине присутствует липидная компонента молекулы ЛПС.Лактоза, являющаяся наполнителем данной вакцины,была использована нами как контроль.Метод ИК-спектроскопии дал качественную оценку присутствия ЛПС,а метод определения КДО по Апаскег н.г/1966/ дополнил полученную картину результатами,отражающими количественную оценку присутствия ЛПС в вакцине.

2.3.Физико-химическая характеристика менингококкового 1 ЛПС,полученного при различных условиях культивирования.Изучение биологических и серологических свойств ЛПС.

Следующим этапом исследований явилось изучение физико-химической характеристики ЛПС с помощью следующих методов:ИК-спектроскопии, электрофореза в полиакриламидном геле и гель-фильтрации.

Согласно предварительным результатам,полученным с помощью ИК--спектроскопии,можно заключить,что менингококковые препараты ЛПС, полученные из клеток,выращенных в различных условиях культивирования,имеют разные физико-химические характеристики.Это было установлено по их липидной компоненте /2830-2920 см-1/ и полисаха-ридной компоненте /1000-1100 см-1/.

С целью установления наиболее полной физико-химической характеристики препаратов ЛПС нами были использованы методы электрофю-

-17-

реза в s Д 3 /РА g Е и гель-фильтрация.

Из литературных данных известно,что большие по молекулярному весу молекулы ЛПС были обнаружены у клеток Neisseria meningitidis в максимальной стационарной фазе роста по сравнению с ЛПС,полученным из клеток в экспоненциальной фазе роста. Этот факт был установлен Poolman J.T. /1985/ с помощью S Д3 /РА а Е-электрофоре-за.Аналогичные результаты были получены нами при изучении ЛПС из клеток следующих фаз роста:экспоненциальной,максимальной стационарной и фазы отмирания,выращенных при периодическом процессе культивирования в жидкой среде в ферментере.Результаты электрофореза показали различные электрофоретические картины препаратов ЛПС клеток разных фаз роста.Так препарат ЛПС клеток экспоненциальной и максимальной стационарной фаз роста характеризовался одним низко-молекулярным пятном,а фазы отмирания-двумя низко-молекулярными фрагментами.

Препараты ЛПС из клеток,выращенных при многоциклическом,слив-но-доливном и непрерывном процессах культивирования при поддержании кислорода на уровне 0% в среде,дали по результатам 3 Дэ /РАа Е--электрофореза один низко-молекулярный фрагмент с молекулярной массой 4-7 кД и по результатам гель-фильтрации один пик с Kav =0,55. Однако препараты ЛПС,полученные из клеток,выращенных при тех же управляемых процессах культивирования,но при поддержании кислорода в среде на уровне 20?,имели на электрофоретической картине два низко-молекулярных фрагмента с молекулярной массЬй 4-7 кД и по результатам гель-фильтрации один пик с Kav =0,75.Таким образом данные препараты ЛПС являются R-формой.Эти результаты согласуются с данными литературы / Tsal С.-м. о соавт.,1983/.

На рис.2 отражены результаты электрофореза препаратов ЛПС,полученных из клеток экспоненциальной фазы роста /1/ и фазы отмирания /2 и 3/ Neisseria meningitidis .выращенных при многоциклическом процессе культивирования при поддержании кислорода на уровне 0% и рН=5,8-6,0 /1/,рН=7,3-7,4 /2 и З/.Как видно из рис.2,препарат 1 характеризуется одним низко-молекулярным фрагментом,а препарат 2 и 3,обработанный и необработанный протеиназой К соответственно, имеет помимо низко-молекулярного фрагмента область с высоко-молекулярными правильно чередующимися полосами углеводородной природа с молекулярной массой 20-40 кЯ.На основании полученных данных можно заключить,что нам удалось обнаружить присутствие но только

Рис.2.Электрофоретические картины препаратов ЛПС,полученных

из клеток Neisseria meningi-tidi£eP°rPynira в штамма №125, выращенных при многоциклическом процессе культивирования при поддержании кислорода на уровне 0% в синтетической питательной среде в ферментере.

1-препарат ЛПС,полученный из клеток экспоненциальной фазы роста, выращенных при поддержании рН=5,8-6,0;

2-3-препарат ЛПС,полученный из клеток фазы отмирания,выращенных при поддержании рН=7,3-7,4,обработанный и необработанный протеиназой К соответственно;

4-препарат ЛПС Shigella b.oydii .

R -формы,но и высоко-молекулярной формы менингококкового ЛПС.Эти полученные нами данные согласуются с результатами исследований ряда авторов.которые отмечают наряду с низко-молекулярной формой ЛПС наличие высоко-молекулярной формы менингококкового ЛПС. / Apicella М.А, 1979, Parr T.R. 1984, Perry М.В, С соавт., 1975/.Однако исследователи в своих работах не могли охарактеризовать совокупность условий необходимых для получения высоко-молекулярной формы ЛПС,так как использовали неуправляемое культивирование в среде,содержащей природные компоненты.Поэтому следующим шагом наших исследований явилось воспроизведение выше описанных результатов при использовании управляемого непрерывного культивирования.Этот процесс,как известно,является оптимальным для изучения ьлияния условий культивирования ка выход и химический состав антигенов.Результаты изучения показали,что препарат,полученный при таких условиях культивирования /см.рис.3/,характеризовался по данным S Д s/PA GЕ-электрофореза присутствием одного низко-молекулярного фрагмента и правильно чередующихся полос углеводородной природы, расположенных почти от начала разделяющего геля и до низко-молекулярного фрагмента.Этот препарат имел молекулярную массу 20-40 кД.По результатам гель-фильтрации он имел два пика с Kav^=0 и Кау 2=0.75.Таким образом при повторном воспроизведении условий культивирования,направленных на обнаружение высоко-молекулярной Зорми ЛПС,нами получены положительные результаты.Более того.элект-рофоретическая картина была более полной х.При дальнейшем подтверждении этих результатов открываются перспективы получения высоко-молекулярного менингококкового ЛПС в большем количестве и изучения его химической структуры.

Кроме того нами была получена промежуточная форма менингококкового ЛПС,обозначенная как sr ^-форма.Эта форма ЛПС была получена из клеток менингококка серогруппы В в экспоненциальной фазе роста,воспроизведенной непрерывным методом культивирования при поддержании кислорода на уровне и рН=5,8-6,0 при содержании глюкозы Юг/л в питательной среде¿Препарат имел по результатам электрофореза один низко-молекулярный фрагмент и 6-7 правильно чередующихся полос,расположенных над ним.Этот препарат характе-ризовачся молекулярной массой 10-15 кД.По результатам гель-фильтрации препарат имел три пика с Kav 1=0,Kav 2=0,2,Kav 3=0,9.Таким

Х-Эти данные получены совместно с Львовым ВД. и Вернер И.К.

а/.

О в 16 24 32 40 48 58 64 72 80 88 ©6

\8

7.5 7.4 7.3 7.2 7.1

А

б/.

7 <-

О в. 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96

100 во во

40

о

в/.

О В 15 24 32 40 485664 72 80 88 96

Рис.3.Зависимость накопления биомассы 1« 100 ЕЪ /а/,изменения ¡Я среда /б/ и содержания растворенного в среде кислорода в % от полного насыщения /в/ /оси ординат/ от времени ъ ,ч. /оси абсцисс/ непрерывного культивирования Я ш«п1п£И;141а серогруппы В штамма №125 при скорости разбавления Д=0,2 ч-1 в синтетической питательной среде в ферментере. Стрелкой указано начало непрерывного процесса культивирования.

образом более высоко-молекулярная форма ЛПС представляет собой вероятно липид А-кор-6-7 повторяющихся звеньев полимерной цепи. В литературе такие данные нами не обнаружены.

Следующим этапом исследований явилось изучение биологических и серологических свойств препаратов ЛПС.имеющих различную физико-химическую характеристику: R -формы ЛПС,полученные из клеток,выращенных при поддержании кислорода на уровне 0% и 205? ; sr х-фор-ма ЖС и высоко-молекулярная форма ЛПС.Исследования показали,что препараты отличаются по значениям L Д^:препарат в r-форме при поддержании кислорода в среде 20% оказался наиболее токсичным ЬДзд=0,02 мкг/мл; R -форма;ЛПС при поддержании кислорода на уровне 0^-менее токсична L Д^=0Д2 мкг/мл;высоко-молекулярная форма ЛПС-еще менее токсична l Дзд=0,27 мкг/мл¡препарат в sr х-форме имел наименьшую токсичность .LflgQ=0,85 мкг/мл.

Серологические свойства изучали с помощью метода ИФА и на его основании расчета константы связывания Ксв. АГ с AT по методике, изложенной в работе Сорокиной Н.В. /1989/.Полученные результаты показали,что значения Ксв. увеличиваются при переходе от r - к gR х- ,а затем к высоко-молекулярной форме менингококкового ЛПС на целый порядок :0,53'105 моль"*;0,68*106 моль-1;0,39*107моль-1 соответственно.

Объяснение полученных нами результатов,об изменении биологических и серологических свойств препаратов ЛПС,имеющих различную физико-химическую характеристику,может быть представлено в дальнейших исследованиях,посвященных детальному изучению химической структуры липидной и коровой компоненты ЛПС.

ВЫВОДЫ.

1.Установлено,что для повышения выхода менингококкового ЛПС из культуры N. meningitidis следует осуществлять модификацию метода Weatphal О. и Jann к. .заключающуюся в проведении водно-фе-нольной экстракции из влажных клеток и использовании как водного, так и фенольного слоев,а также ферментов ДНК-азы и протеиназы К /1 модификация/;дяя получения более очищенного препарата необходимо после ферментативной обработки проводить очистку ЛПС с помощью ультрацентрифугирования /2 модификация/;для повышения выхода очищенного препарата ЛПС целесообразно использовать не только микроб-

ные клетки,но и культуральную жидкость,а также проводить очистку, используя цетавлон и гель-фильтрацию.

2.Обнаружен разный выход препарата ЛПС при использовании различных штаммов менингококка серогрупп А,В,С:максимальныН-из клеток штамма серогруппы С №133.минимальный-из клеток штамма оерогруп-пы В №125.При сравнении штаммов №125 и №150 одной и той же серогруппы В выявлен более высокий выход препарата ЛПС из клеток штамма №125.

3.Показано,что влияние фазы роста на выход препарата ЛПС,полученного из клеток N. meningitidis штамма №125,проявляется в условиях избытка кислорода-в экспоненциальной фазе роста выход препарата наибольший.

4.Установлено влияние растворенного в среде кжслорода и глюкозы на выход препарата ЛПС:при одном и том же содержании в среде глюкозы выход ЛПС выше при лимите кислорода,чем при его избытке;при одном и том же содержании в среде кислорода,близком к 0% от полного насыщения,выход ЛПС увеличивается с увеличением содержания

в среде глюкозы.

5.Выявлена следующая совокупность условий,обеспечивающих получение препаратов ЛПС минимально загрязненных примесями:

1-сливно-доливной экспоненциальный способ культивирования при поддержании растворенного в среде кислорода на уровне 20% от полного насыщения,2 модификация способа выделения;

2-непрерывный процесс культивирования при скорости разбавления Д=0,2 ч-^ при поддержании растворенного в среде кислорода на уровне 0^,2 модификация,а на уровне 20$,3 модификация способа получения.

6.Установлено влияние условий культивирования на физико-химические свойства препарата ЛПС:

-многоциклический,сливно-доливной,непрерывный процессы культивирования при лимите кислорода и рН=5,8-6,0;при избытке кислорода и рН=7,2-7,4,способствуют синтезу низко-молекулярной формы ЛПС/4--7 кД/;

-непрерывный процесс культивирования при скорости разбавления Д=0,2 ч-1 и рН=5,8-6,0 при лимите кислорода^при содержании глюкозы в среде 10 г/л обеспечивает синтез более высоко-молекулярной формы ЛПС /10-15 кД/;

-непрерывный процесс культивирования при скорости разбавления

Д=0,2 ч-1 при лимите кислорода и при рН=7,3-7,4,способствует синтезу высокомолекулярной формы ЛПС /20-40 кД/.

7.Обнаружено влияние степени чистоты и молекулярной массы ЛПС на его токсичность и величину константы связывании антигена с антителом в иммуноферментном анализе:с увеличением молекулярной массы ЛПС значение константы связывания увеличивается на порядок.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Изучение липополисахарида N. meningitidis с использованием ИК-спектроскопии;/соавт.Алексахина Н.Н..Баснакьян И.А././/Ж.микро-биол.-1989.1.-с.117-118.Автореферат.

2. Общие и специфические свойства липополисахарида N. meningitidis

в сравнении с липополисахаридами других грамотрицательных бактерий; /соавт.Алексахина Н.Н..Баснакьян И.А././/Ж.микробиол.-1989.-№12,--с.81-87.

3.Приготовление В-менингококкового липополисахаридного эритроци-тарного диагностикума;/соавт.Баснакьян И.А..Алексахина Н.Н.,Боров-кова В.М..Ванеева Л.И./. Сборник трудов У1 Всероссийского съезда МЭП.-Москва.-1991 г.-т.1.-с.47-48.

4.Антигенная активность корпускулярной менингококковой серогруппы В вакцины при перроральной иммунизации животных;/соавт.Алексахина Н.Н..Баснакьян И.А..Боровкова В.М..Сараева Л.В..Карабак В.И.-/. Сборник трудов У1 Всероссийского съезда МЭП.-Москва.-1991 г.-т.2,--с.160-161.

Соискатель: