Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нативный белково-полисахаридный комплекс как основа менингококковой вакцины серогруппы В

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Нативный белково-полисахаридный комплекс как основа менингококковой вакцины серогруппы В"

Госкомитет санэпиднадзора РФ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ __pyeflH Г. ^.ДГАБРИЧЕВСКОГО_

У /1

ЛИТ "iw п »

.. -I и il ! j

t fji i.JôJ На правах рукописи

АРТЮХОВА Ирина Игоревна

НАТИВНЫЙ БЕЛКОВО-ПОЛИСАХАРИДНЫЙ КОМПЛЕКС КАК ОСНОВА МЕНИНГОКОККОВОЙ ВАКЦИНЫ СЕРОГРУППЫ В

03.00.07 — Микробиология

Автореферат диссертации на сонскание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского Госкомитета санэпиднадзора РФ.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

Доктор биологических наук В. И. КУВАКИНА. Доктор биологических наук, проф. И. А. БАСНАКЬЯН.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор биологических наук, проф. В. Ф. РУНОВА. Доктор медицинских наук Н. Б. ЕГОРОВА.

Ведущее учреждение — Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Госкомитета санэпиднадзора РФ.

Защита состоится » Ж/71 _ 1993 г.

в Ю_ час. на заседании специализированного совета

Д 084.18.01 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Госкомитета санэпиднадзора РФ по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат разослан ¿'Я'/УЛ^Л—. Г-

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

3. Н. ЕРМОЛЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность ггроблет. В настоящее время для профилактики ■ менингококковой инфекции ДЛИ/ разработаны эффективные полисаха-раднне /tIC/ вавдшш соротрупп А, С, У и 135 ( С.т.д. БОЗ Ш58, 1983; В.И.Кувакипа, 1939; Qotachlich et al 1969;Farquhar et el., 197?; Griffiss ct al 1981). Однако полного контроля за заболеваемостью Ш осуществить пока не удается из-за того, что отсутствует эффективная вакцина против менингококков серогруппн В. Между тем, на долю этой инфекции во многих странах мира, включая и нашу страну, приходится более половины всех случаев заболеваемости Ш ( В.И.Покровский, А.А.Демина, 1987; П.В.Мартинов, 1991; Predrlksen et al ., 1991 ). Решение этой проблемы осложняется сом, что капсулъньй В-ПС оказался неиммуноганнш для людей (Brandt et al.,1972; W/le et al ., 1972 ). В качества антигенов, пригодных для конструирования Е-вакцинн, наиболее вероятными рассматри -ваются белки наружной мембраны / ЕНМ / и липополисахарид / ЖС /, антитела к которым обладают бактерицидной активностью ( Frasch et al ., 1972 /17/; Zollinger et al., 1972, 1974 ).

Можно выделить два основных направления исследований, определивших поиск оптимального варианта В-вакцинн в течение послед -mix 20 лет. Первое направление включало разработка вакцинного препарата на основе БНМ, выделенных из штаммов определенных серотипов, с преимущественным содержанием серотиловых белков. Вакцина такого типа били приготовлены в США, Норвегии и на Кубе ( Zollinger et al i987;Campa et al 1990; Frasch et al ., IS90; Fredriksen et al., 1991 ). Изучение их эффективности в условиях эпидемии показало, что ЕНМ-вакщшы формируют слабую и непродолжительную защиту строго серотиловой специфичности, а это требует постоянного слежения за потенциально эпидемическими штаммами менингококка (Rosenqvlst

' et al., 1988, 1991: Boslego et al ., 1990; Costa et al., 1991 ; Sierra et al., 3991).

Второе направление исследований базировалось на представлении, что включение в состав мешшгококковой вакцины серогрупгш В общего для всей серогрулпц антигена,. каким является капсульный В-ПС, придаст вакцине болео широкий диапазон иммунологической защиты ( Moreno et al., 1985, 1986; Lifely я Wang , 1988). Сообщалось, что слабая ишуноген. ость очищенного В-ПС вызвана тем, что дртарыинаята иммунологической специфичности В-ПС является информационной и сохраняется в таком виде лишь в микробной клетке, где

В-ПС находится в, комплексе с другими биологически активными соединениями наружной мембраны (Llndou et al., I984;Lifely et al 1984, 1987). Вакцина на основе белково-ПС комплекса, пригогоплон-ная Moreno et al. (1985), обладала выраженной иммунологической ■активностью в эксперименте на мылах и в ограниченном испытании у добровольцев, однако изучение этого вида вакцины не получило дальнейшего развития и не вшило за рамки лабораторных исследований.

В исследованиях сотрудников МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского и НЖВС им.И.И.Мечникова било показано, • что промежуточный продукт очистки В-ПС - "сырой" В-ПС - безвреден для лабораторных животных и, в отличие от полностью очищенного В-ПС, обладает выраженной иммунологической активностью в эксперименте на нишах (А.П.Аллилуев и соавт., 1986). Эти результата, а также ранее полученные данные ■ о корреляции идауногонности микробных ПС для мышей и людей (ЛШск-ренко, I98D), позволили рассматривать "сырой" В-ПС как перспоктшз-1шй антиген для конструирования В-вакцины.

Цель настоящей работы заключалась в разработке технологически простого метода выделения из менингококков серогруппы В имыуноло-. гически активного и нетоксичного антигена белково-ПС природу в со. стоянии, близком к естественному существованию антигена в микробной клетке - нативного белково-БС комплекса /ННШ/ и в приготовлении на его основе менкнгококковой вакцины серогруппы В.

Основные задачи исследования:

1. Выделение ПЫЖ из жидкой микробной культуры с помощью цо-тавлонового метода Gotschlich et al. (1969) и выяснение его химических, физико-химических и биологических свойств (иммуногошгости и токсичности).

2. Определенно оптимальных условии выделения НЕПК.

3. Разработка способа изготовления лиофилизированной вакцины на основе НЕПК.

4. Изучение химического состава КБПК и В-вакцины, состава белковых компонентов, молекулярной формы В-ПС в НЕПК и определение физико-химических критериев, пригодных для стандартизации НЕПК и готовой В-вакцины.

5. Изучение антигенной активности белковых компонентов В-вак-цины методом иммуноблоттанга.

Научная новизна работа.

Разработан метод получения, из менингококков сорагруппн В гемуио-логически активного и нетоксичного комплексного балково-ПС антигена. Ыегод основан, на использовании ряда цадяоцих препаративных приемов и позволяет сохранить нативную структуру,антигена, о чем свидетельствуют высокие молекулярные параметры /мол.параметры/ В-Г1С и составе комплекса и выраженная активность белковых кошонентов в иммуноблоттинго.

Разработанный метод получения НШК прост и технологичен и может служить основой производственного метода изготовления коммерческого препарата менингококковой вакцины серогруппи В. Получены авторские свидетельства на "Штамм бактерий. ГГё1воег1а иеп1пе1-ий1а серогруппи В - продуцент капсульного полисахарида и полисахарвдно-белкового кошлекса" М708846 от I октября 1991 г. и на "Способ получения полисахаридно-белковой вакцинц, против Ио1азег1а теп1пбИ;1~ ¿1а серогрупщ ЕГ'М750639 от I апреля 1992 г.

На основа изучения химического состава и белкового спектра обоснованы критерии, стандартизации менингококковой вакцины серог^зун-пи В и отработаны методы контроля ее качества.

Впервые установлена прямая коррелятивная связь между иммунологической активностью НШК и молекулярной формой В-ПС в составе комплекса, а также между иммунологической активностью НШК и количественным соотношением белок/НС в комплексе.

Лолучены новые данные по иммунохимической характеристике бел-ковше кошонентов разработанного варианта, менингококковой вакцины серогруппи В при исследовании сывороток привитых в иммуноблоттинге.

Практическая значимость' работа состоит в разработке на основе НШК менингококков серогруппи В-вакцинного препарат для профилактики Щ серогруппи В.

Внедрение результатов исследования в практику.

На основе получанных данных составлены:

1. Инструкция по изготовлению и контролю менингококковой вакцины серогруппи В, утверждена Ученым сбветом МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского (протокол ^ от 20 октября 1986 г.). л. Ученым советом ЦНИИВС им.И.И.Мечникова О.^отокол И4 от 31 октября 1986 г.).

2. Отчет о проведении испытания,менингококковой вакцины серогруппи В на добровольцах для оценки раактогенности а иммунологичес-

кой эффективности препарата.

Материалы исследований' использованы такке при составлении проектов нормативно-технической документации на менингокогасовую вакшшу серогруппы В: ВФС, ЗПР, инструкции по применению вакцины.

Апробация работ;; и публикации. Материалы диссертации доложены на УШ-ой иаучн о -практической хсопфсроиции молодых специалистов Ленинградского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Пастора (г.Ленинград, I9S6), рабочем совещании участников комплексной республиканской программы "Бактериальная вакцина" (г.Оренбург, 1987), конференции молодых ученых МКЖЭМ ид.Г.Н.Габричевского (г.Москва, 1988) 1У-ОЙ Всесоюзной конференции по ыешшгококковой инфекции и гнойным менингитам (г.Новосибирск, 1990).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета "Иммунология и медицинская биотехнология" МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского 20 июля 1993 г.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 2 авторских свидетельства.

Структура и объем работы. Работа написана но обычному HJiaiiy и включает следующие разделы: "Введение", "Обзор литературы" (3 главы); "Собственные исследования" (4 главы); "Заключение", "Выводы" (8), "Список литературы" (16S источника^). Работа иллюстрирована /? рисунками и ff таблицами. Общий осЗъеы диссертации страницу/ .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТ0.ЦЫ

Материалы работы. В работе были исследованы НЕПК менингококков серогруппы В, полученные как в период разработки оптимального метода их выделения из микробной культуры, так и в процессе наработки препаратов для приготовления вакцин, а такяо ¡ленингококковые вакцины сорогрушш В, приготовленные при отработке метода их изготовления и в ходе дальнейших исследований но изучении иммунологической активности вакцин в эксперименте на гивотных и при испытании у людей.

Всего бняо получено 44 серии КШК. На основе НШК были приготовлены I серия жидкой и 14 серий лиофзшизированяой В-вакцини. Все перечисленные препараты были изучены по химическому составу, серо-

логической активности, специфичности, дшмуногепн.юти б экснерамон-то на ишах и безвредности для лабораторных животных (мышей, морс-глх свинок л кроликов). Кромэ того, псе серии ШЗЖ били охарактори-оованц по мол. параметрам В-ПС. Проведен сравнительный злектрофоретичзыаШ анализ НШК, полученных в ходе оптимизации способа выделения препаратов, а такжо ННЖ и В-вакцил, приготовленных на их основа.

При изучонии иммунного ответа на белковые компонептц ШШ у добровольцев, привитых В-вакциноЙ, <5ыло использовано 9> парных си-вороток, отобранных до вакцинации и через 4 недели после повторного введения вакцины.

Метотщ исследования. В работе били использованы следующие методы:

препарат!!В1ше - осаждение цотавлоиом, фракционирование зтаио-лом, экстракция солевыми растворами, прнтрифугирование, стерилизующая фильтрация на фильтрах "Миллипор" и лиофилизация;

хроматографические - гольфильгратш на софарозе 4В и сефадек-со £¡-50;

химические - определение сиалозоЛ кислоты по методу ЗуепиигЬоМ (1957), бежа по методу Ьоу/гу е* а1. (1951), нуклеиновых кислот /НК/ по методу А.С.Спирина (3958), мол. параметров по методу, предложенному БОЗ (С.т.д. ВОЗ №594, 1978; ^658, 1983), остаточной влажности в соответствии с ."Методическими указаниями по применению фи-зшю- 'чмических и химических методов контроля медицинских и биологических препаратов" (1982);

фиэико-хишчосзио-ЭФ в ПААГ с ДСН по ЬаетаИ (1970);

иммунохимические - иммуноблоттанг- выполняли в соответствии с рекомендациями В.К.В.Тсанг а соавт. (1988);

серологические - РПГА и РИ1ГА, в которых в качестве гемосен-ентпнов использовали формалинизироваюше бараньи или человеческие эритроциты О (I) группы, нагруженнь'в очищенным ПС по методу, предложенному А.П.Аллилуевым и соавт. (1978);

иммунологические - оценка иммунологической активности НШК и В~вакцшш проводилась, по определению в РПГА уровня антител к В-ПО в сыворотках иммунных мышек. .

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятыми методами (И.П.Аишарин и А.А.Воробьев, 1962).

СОДЕРЖАНИЕ.РАБОТЫ .

I. Получение HHIK менингококков свгюгруппн В.

Для выделения ННЖ использовали шнфобную, культуру îfeisseria . nenlngitidia. .серогругаш В ртаыма 125 серотнпа 2, выращенную па синтетической питательно! среде в' услозиях .ферментера и отобранную в экспоненциальной фазе роста (М.А.Коркыасова и соавт., 1985;' В.И.Карабак'- а, соавт.., IS86; В.И.Кувак^ша и соавт.', 1986).

Получение НШК проводилось,по методу, предложенному Gotnchlich. et al . (1969) для выделения группоспецифических ПС менингококка,' В своей работе мы использовали только'ту часть метода, которая ка- ' , салась получения частично очищенного,' так называемого "сырого" ПС.

На рис Л представлена предлагаемая наш схема получения НШК, которая включает осакцегаю НШК из жидкой микробной культуры цетав-лоном з концентрации 0,1$, экстракций цетавлоц-ПС кошлекса IM раствором хлористого кальция, .ступенчатое фракщшшрование этанолом при 2Ъ% и 80$ концентрата и высушвание выделенного НШК до постоянного веса. ' ;

Особое внимание' било обращено на процедуру отделения балластного осадка после добавления к экстракту 2Ъ% этанола, поскольку, как было показано ранее (В. И. Пушкина, 1989), именно эта стадия определяет получение меншггококковьсс группоспецпфичсских ПС, максимально очищенных от примесей НК п ЛПС. ■ '

При подборе рекимов центрифугирования для отделения балластного осадка било установлено, что наиболее элективным является двукратное центрифугирование вначале при 3000 об/мин. 30 шш., а затем при 16000 об/шш. 30 мин. При этом достигалось значительное удаление из НШК примесей пкрогенного материала. Испытание ШЖ в тосте оценки пирогена на кроликах показало, что пирогешшо реакции отсутствовали на дозу препарата 0,01 мкг, которая в 2 раза превышает дозу, рекомендованную ВОЗ для ПС вакцин (С.т.д. ВОЗ /¡'594,1978 ).

Химический анализ показал, что ННЖ' содержит около 1% НК, 30-4(Ж сиаловой кислоты (группоспецифического В-ЛС) п 45-60^ белка. По данным ЭФ в ШШ? с ДСН в препаратах присутствовал белок с молекулярной массой /пол.кассой/ 41 кД(белок саротшха 2), который, наряду с группоспецифическим ПС, относится к протективннм антигенам менингококков сэрогрупш В ( Gotcchlich et al 1969 /1У/; Mu et al ., 1971 /1,11/; Роо1вал et-al 1991). Соотношение белок/

Рис Л. Схема получения ÍLQIK

ПС в составе НШК в весовых едишшах колебалось по серит! от 1:0,43 до 1:1,53, а суммарное содержание В-ПС с мол. массой выше 300 кД варьировало от 15 до $2%. Это диктовало необходимость оптимизации способа получения НЫШ. Поскольку выделение препаратов проводилось в достаточно стандартных условиях, осойое внимание било обращено на условия выращивания исходной микробной культуры.

В ходе исследовании било обнаружено, что величина мол.параметров В-ПС зависит от изменения рН среди в процессо культивирования. В тех случаях, когда воллчина рН в процессе выращивания поддерживалась на уровне 7,4-7,8, то 79-9055 В-БС имело мол.массу выше 300 кД. Если не показатель рН снижался до значений 5,7-6,2, количество полимеров с такой мол.массой составляло всего 16-3-1/2. Било очевидно, что при низких значениях рН происходит значительная деполимеризация В-ПС. 4

Исходя из данных литературы об особенностях метаболизма мл/лп-гококка при ого глубинном культивировании (И.Л.Баснакьян и 'соавг., 1990; гтазсЛ ct а1 1975), мы провели сравнительное кзучашш зависимости изменения рН культуральноп среды в условиях лимита кислорода (0;?) и при 20$5 насыщении. Из рис.2 видно, что в условия/; лимита кислорода, когда происходит усиленное потребление менингококком глюкозы, наблюдается снижение рл культуральной среды с 7,4 до 6,2. Напротив, культивирование менингококка при избытке растворенного в среде кислорода (20% насыщения), сопровоздавшеося интенсивным избиратачьнкм потреблением из питательно;"! среды аминокислот, приводит к тому, что показатель рН в течение всего процесса выравнивания остается в пределах 7,4-7,8. Вахно отметить, что концентрация в среде кислорода не влияла на выход биомассы - в обоих случаях шь центрагня микробных «леток в конце процесса культивирования достигала одной и той ж величины порядка 2-х оптических единиц.

Сравнительное изучение с помощью ЭФ в ПЛАТ с ДСН белкового со-стаза НШК, выделенных из культур со степенью аэрации 0% и 20$ (ННЖ-0 и НШК-20, соответственно), показало, (рис.3), что эти препараты содержат все основные БНМ 1,2,4 и 5 классов (мол.масса 45 кД, 41 кД, 35 кД и 30 кД, соответственно) ( Роо1пап et а1 .,1982, 1983). Различия мезду белковыми спектрами КШК-0 и НШК-20 проявлялись, в основном, в высокомолекулярной области. НН1Х-20 содержал наиболее полный набор белковых компонентов.

Культивирование менингококка при различных условиях аэрации

a ó

IglOOJJt 2,4

12,2 2,0

1,8

___

8 t ,ч

O t

.4

Рис.2, Изменение pll и оптической плотности ( lgioos-t ) иультуралъной жидкости в процессе периодического культивировании Heiuacria BienJngltiüJa сорогруи-iiu В штамма Н25 t а - pC^O/S »

а - ро2=2с#

Л- W ' ' «œs%;» gs» eso

tifié

CO tiTíf*« «

^ STvuefiVb дезч л™»* «Ц '

Vf i ' ,i U - ¿ w •

У fe

<S> >a» —•

V '

■ V.../Í, it'-i bg

es» 't; ■''.*

sa srr r—•

-1- КЛ . ■2 кл.

-4 кл. -5 кл.

«wâ m

..ca .¿M» %

GEDGD Pb ¿ai» ».л c">

12 345 678910 II

Рис.З. ЭФ в НААГ с ДСП препаратов ННЖ-0 и КШК-20.

Обозначения: а - HHIK-0 в котдащшдаи от 1,5 мг/мл до 3,5 ыг/ил с шагом разведения 0,5 кг/мл (ряда с I по 5);

б ■ - ННШ-20 в той же концентрации (ряды с 7 по II) ;

6 - белки-маркеры (мол.масса 29 кД, 45 яД, 67 КД и 92,5 кД).

Изменяло молокулярно-массовую характеристику В-ПС в НШК, Так выход В-ПС в объемо элюата до Ы =0,25 (мол.масса вито 300 кД) составил 74,0-93,7?» для препаратов НШК-20, тогда как для препаратов ПШК-0 этот.'показатель составил только 15,2-25,0$. Уменьшение величины мол.параметров В-ПС сопровождалось понижением иммунологической активности НШК для мышей. Ой этом свидетельствуют показатели индекса эффективности сравниваемых препаратов ШЖ по отношению к высокоиымуногешгому рофероис-антигану (табл,1).

Таблица I

Иммунологичоская активность образцов 11ШК с раэли>шыми мол.параметрами В-ПС

Мол.пара- Иммунный ответ мышей линии СВА

метры В-ПС —:-:-

Препарат й серии (выход ПС Ти^р В-анта- Индекс эффектив-до ка-0,25) тел в ности в % к рефо-

% £ ренс-антигену

129 83,0 7,20±0,58

¡ШЖ-20 142 143 93,7 74,0 6,80-0,80 6,25-0,63 83,0±2,6

147 92,5 -7,20±0,95

НШК-0 138 139 15,2 24,9 5,60-0,68 . 6,20*0,58 71,5±3,5

Референс-антиген 97,9 8,25±0,75 100

Таким образом, на основании полученных результатов оптимальном методом выращивания исходной биомассы было признано выращившш менингококка в режима окси-стата при 20",?- нал содркании растворентш в среда кислорода,

2. Изготовление й-вакцннц на основе НШК.

Результаты физико-химического анализа препаратов НШК, полученных по оптимизированному методу, представлены в табл.2. "

Таблица 2

Физико-химическая характеристика препаратов ННЖ (средние данные по 8 сериям)

цц Показатели

1. Степень связывания В-ПС с белком,

выход ПС в % до Кй =0,25А 85,0±2,8

2. Мол.параметры В-ПС, _ , выход ПС в /Ь до Ка =0,5 96,8±0,9

3. Белок {%) 55,7-0,7

4. Сиаловал кислота (.%) 32,3*1,0

5. НК (Я 1,08±0,П С. Сумма компонентов {%) 89,0±0,7

7. Соотношению белок/ПС 1:0,58*0,02

8. Остаточная влажность {%) 11—1

по данным гольфкльтсапли на колонке с сефарозой 4В в С^Ы трис-ЯС1 буфера с 0,21.! НаС1, рН 7,2-7,4

Изученио характера связи ЕНМ и В-ПС в составе ННЖ проводилось с помощью гельфильтрации препарата на колонке с сефарозои 4В в присутствии детергента Тритона Х-100 или без него (рис.4). При отсутствии в злюирушцзм буфере Тритона 1-300 основная часть белка выходила с колонки также как и В-ПС - в свободном объеме. При наличии детергента белок и В-ПС элюировались с колонки отдельными пиками• Это указывает на то, что белок и В-ПС образуют комплекс, но связь ме;.,ду компонентами не являзтея ковалентной.

По данным ЭЗ? в ПААГ с ДСН в НН1К присутствовало по крайней мерз 17 отдельных белков или полилептидов с мол.массой от 21 до 160 кД. В количественном отношении преобладал белок с мол.массой 41 кД, ответственный за серотиповую специфичность штаммов. Все изученные препараты были-достаточно стандартны по набору белкошхкш-

а)

б)

Рис. 4. Гэльфлльтрация ШЖ на сефарозо 4В

а) боз детергента

б) в присутствии детергента

По оси абсцисс - объем элката (мл)

До оси ординат: слева - содорлзние опаловой кислота во фракциях элгоата (мкг/мл)----;

справа - оптическая плотность пои 280 нм --

Стрелками указан свободный ( 70 ) и общий ( 7^ ) объем колонки.

ноноитоб, хотя и отмечались по серия:.! небольшие колебания в количественном отношении некоторых высоко- и низкомолекулярных белков. Однако во всех препаратах были обнаружены все .основные ЕНМ, относящиеся к классам I, 2, 4 и .5 с мол.массой 46 кД, 41 кД, 35-кД и 30 кД, соответственно (Роо1шап еЬ а1., 1982, 1983).

Отмеченные различия. между.,препаратами НШК в количественном содержании отдельных белков ^подтвердились результатами химического анализа, по данным которопэ соотношение белок/ПС для разных серий составляло от 1:0,51 до 1:1,29.

Чтобы оценить, влияет ли соотношение бедок/ПС на иммунологическую активность Н.ЕПК. было проведено в эксперименте на мышах изучение иммуногенности препаратов ШШ, различающихся между собой по этому показателю (табл.3).

Таблива 3

Иммунологическая активность ПЫЖ для мышей линии СВА

Серия препарата

3-90 163 2 -90

4-90 1-9ÜJ I-9U.) 16-1 162 165

Рефе-ренс

Соотношение бьлок/ ПС

Степень связывания В-Г1С с белком,

Мол.па- Уровень В-антитол в сыворотках мп-рш.штрЫ' шей по данным Л1ГА ( log2 )

(выход -—----

ПС до Средний Досто-

Kd =0,5} титр вер-

Х± ш

Р

1:0,55 1:0,51 1:0,65 I :iJ,i>V 1:0,67 1: W,70 I:1,29 1:1,U9 1:1,1)5

100,0

92.5 97,? 97,7 16,3

9,0 82,'

60.6 94,2

l'OO, U 6,6±0,3

100,0 6,2*0,4

100,0 .5,9*0,3

100,0 5,0 ±0,2

70,0 56,0 97,4 95,0 99,4

4,2-0,3 4,9*0,2 4,5*0,2 4,4*0,3 3,8*0,3

20

17

18 19 18 10

19

20 17

ность различия

1,50 >0,05

0,54 >0,05

0 >0,05

2,01 >0,05

3,59 <0,005

2,47 <0,05

3,32 «J.0Ü5

3,36 <0,005

4,84 <0,001

нет

есть

И ,1

I:и,4 3 U3,.

97,9 ¿,9*0,3 17

п

¡а

j;ot:iujK4.a,ocTi. различии между ьиссжоиммуиогонним рефоренс-гeiihpti.TWJ и сорной испытуемого образш.

Препараты, в которых на одну весовую единицу В-ПС приходилось около двух весовых единиц белка (соотношение белок/ПС 1:0,51-1:0,65) бшш наиболее активны а индукции иммунного ответа у мышей при в/в введении им дозы препарата, равной 2 мкг по В-ПС. Титр специфических сывороточных В-антител в этой группе яивотных не отличался от уровня антител в сыворотках мышей, привитых референс-препгратом. При увеличении в ШЖ доли ПС отмечалось статистически значимое снижение их иммунологической активности.

По-видимому, для интенсивности иммунного ответа животных имеет значение не только соотношение белокД[С в препарате, но и степень полимерности ПС компонента. Так для серий 1-902 и 1-902 с наиболее благоприятным соотношением белок/ПС, но полученных из биомассы, выращенной в условиях лимита кислорода, и содержащих вследствие этого дополимеризованный В-ПС, отмечено статистически значимое сни-.•кенпо иммунологической активности.

Полученные нами результаты иэучения физико-химических и иммунологических свойств НШК позволяют рекомендовать в качестве критериев физико-химической стандартизации полуфабриката следующие показатели: степень связывания В-ПС с белком - не менее 80,0$; мол. параметры В-ПС - не менее 90,0$; содержание белка - 55,0-56,4$; сналовой кислоты - 31,3-33,3$; НК - 0,97-1,19? и соотношение белок/ ПС - 1:0,56-1:0,60 при остаточной влажности полуфабриката 10-12$.

Эксперименты на животных четко показали, что дозирование НШК по содержанию В-ПС позволяет выявить различия в иммуногенности препаратов. Это послужило основанием для стандартизации иммунизирующей дозы В-вакцины по количеству В-ПС.

Вакцина представляла собой раствор НИЖ в 1$-ном растворе апи-рогенной лактозы. Раствор готовился таким образом, чтобы в одной человеческой дозе в объеме 0,5 мл содержалось но менее 50 мкг груп-поспецифического ПС. Вакцину подвергали стерилизующей фильтрации на установке "Миллипор", используя мембраны с размером пор 0,22 -0,45 мгал, разливали по ампулам я лиофиллзировали по резшлу, ранее разработанному доя лиофшшзации меникгококковых вчкцпн серогрупп Л и А+С (И.Л.Гофман и соавт., 1978).

Анализ 8 серий вакцины показал, что серии были достаточно стандартны по химическому составу. В одной иммунизирующей дозе содержалось 89,5^2,6 мкг белкан 55,7-2,2 мкг сиаловой кислоты при соотношении белок/ПС равном 1:0,6-0,03.

Получении« дишша позволяет считать, что критериями физико-химической стандартизации вакцины должны быть показатели остаточной влажности (не более 2,53>), содержания в одной иммунизирующей дозе белка (80-100 щг), опаловой кислота (50-60 шп?) и соотношения белок/ПС (1:0,5-1:0,7).

Следует отмотать, что в процессо приготовления вакцины но наб-лвдалось иотери активного начала препарата за счет какой-либо адсорбции ЕНМ или Б-ПС. По данным ЭФ в ПААГ с ДСП белковый спектр готовой вакцины включал то же белки, калош были обнаружены в полуфабрикате. Валковые спектры вакцины п .полуфабриката б или аналогичны но только по набору белков, но а по количеству каждого из компонентов (рис.5).

12 3

«аз» шал ■

<=3 — 92,5 КД'

67 кД

е»•'

Рио.Ь. Уа и- 11ААГ с ДСП белковых компонентов НЕМ и мещшгококковой вакцины серогрунпы В

Обозначен...!: 1 - НЬ.к

2 - В-вакцина

3 - белки-маркеры

3. Изучение антигенной активности белковых: компонентов В-вак-цины методом шлмуноблоттинщ.

Белковая часть вакшшы была представлена белками с мол.массой 21-160 кД, среди которых били обнаружены осногашо ЕШ imacca I (46 кД), класса 2 (41 кД), класса 5 (30 кД), а таете высокомолекулярные белки с мол.массой 144 кД, ICO кД и 72 хсД. Перечисленные болки относятся к протективным аптигенагл менингококка (l'Vaocli erfcal., 1991; l'oolmaii et al., 1991; Tícdege ct al.,1991), в связи с чем представлялось целесообразны!.! оцепить с помощью метода иммуноблог-тиига иммунный отвот людей, привитых В-вакниной, па эти бежовыо компоненты вакцины.

Оценивал результаты кммуноблоттинга (рис.6), следует отметить, что антительное связывание с указанными белками варьировало у отдельных индивидуумов. Однако выявлялись и общио закономерности. Так антитела к белку серотиповой специфичности (белок класса 2, мол.касса 41 кД) присутствовали только в сыворотках привитых вакциной и по были выявлены ни в одной из сывороток, взятых до вакцинации. Точно таюко обстояло дело и с антитеда.пквысокомолекулярноыу белку с мол. массой 100 кД. G другими белками антительное связываний давали как сыворотки, отобракннс до взкшшашга, так и поствагацшальнио сыворотки, но с сыворотками привитых вакшшой двукратно эти реакции заметно усиливались. Наиболоэ сильное антительное связывание наблюдалось с белком мол.массы 144 кД.

Таким образом, мешшгококковал вакцина серогруппы В, приготовленная на основе НЕЛ, наряду с белком серотипа 2 содержит целый ряд других антигенно активных Ш.1. Крема того, в состав вэхщшн входит и протективный антиген серогрупповой специфичностп-капсулъпый В-ПС. Все ото, по-видимому, расширит потенциальные возмозаюсти разработанного варианта В-вакпиш в отношении профилактики МИ серогруппы В.

ВЫВОДЫ

1. Разработан оригинальный метод выделения НЕЖ - основы мо-шшгококковой вакцины серогруппы В.

2. Показано, что в состав НЕПК входят капсульный группоспеци-фдческий ПС и ШМ, среди которых обнаружены все основные ЕНМ, относящиеся к классу I (46 кД), классу 2/3 (41 кД), классу 4 (35 кД) и классу 5 (30 кД). Доминирующим был белок класса 2 (41 кД), ответственный за серотиловув специфичность вакцинного штгкма.

v <

Юй к.. — I-fe 7¿ *¿>—

Ri. . h--

on on on

r,_ m

; -

¿ M.- ¡ t—

¥ м-

SfAr

: Гр ît£! r

: Г ï

r

OE ОП 0П

0П

ХМкЗ—

/та—

f хл-Якаг-

: Ь_

on on

Рис.6. Иммуноблоттинг сывороток добровольцев, привитых В-вакпикой.

Обозначения: 0 -П -

сыворотка до вакцинации поствакпинальная сыворотка

3. Установлено, что группоспецнфический В-ПС в составе комплекса находится в высокомолекулярной форма и связан с белками по типу нековаленгной связи: степень связывания В-ПС с белком составляет 85,0±2,8#.

4. Разработан способ изготовлстш лпофилизированной менипгокок-ковой вакцины серогруппы В на основа 1ПШ с добавлением лактозы в качостве наполнителя. Вакцина дозирована по активному началу - груп-поспецифическому ПО. Одна иммунизирующая доза вакцины содержит

50 мкг В-ПС.

5. Охарактеризованы физико-химические свойства НЖК и В-вакци~ ны. Определены критерии стандартизации качества гак полуфабриката, так и готовой вакцины (мол.параметры В-ПС в составо комплекса, содержание белка, опаловой кислоты, НК, соотношение белок/ПС, суммарное содержание компонентов и остаточная влажность).

6. В эксперименте на лабораторной модели шпей обнаружена зависимость иммунологической активности НШК от мол.массы группоспе-цпфичоского В-ПС и количественного соотношения белок/ПС в комплексе.

7. Методом иммуноблоттинга показано, что в сыворотках добровольцев, привитых двукратно монпнгококковоЛ вакциной сорогрупшВ в дозо 50 мкг по В-ПС, формируются антитела к значительной части белков, присутствующих в вакцине. Ответ добровольцев на белковые антигены характеризовался значительной гетерогенностью. Антительное связывание с балком серотиповой специфичности (41 кД) и с высокомолекулярным белком 100 кД обнаружено только в сыворотках привитых. Наиболее интенсивное антительное связывание отмечено с высокомолекулярны!.! белком 144 кД.

8. Экспериментальные серии мешшгококковои вакцины серструшш В из НШК, изготовлешшо в полупроизводственгшх условиях и отконтроли-ровашше в ГИСК им.Л.А,Тарасовича в соответствии с требованиями к их качеству, показали низкую реактогенность я выраженную иммунологическую активность при испытании вакцины у добровольцев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ ■

I. Выделение и характеристика специфического полисахарида менингококков группы В /В.И.Куванша, Л.П.Аллилуев, И.А.Еаснакьян, К.И.Ва-лериус, О.В.Котельннкова, В.К.Карабак, Н.Н.Алексахина, В.М.Боровко-ва//2урнл,шкробиол. .опидемиол. и иммунобиол. -1936. -Ив. -С. 3-7.

i:. Иммунологические свойства очищенных и комплексных препаратов полисахарида менингококков группы В./А.П.Аллилуев, О.В.Котелышкова,

B.И.Кувакина, И.А.Еаснакьян, И.И.Валориус, Н.Н.Алексахина, В.М.Боров-кова//Там жо.-C.V-II.

3. Диагностические тест-системы на основе очищенного специфического полисахарида Meisseria meningi-tidis группы В при менингококко-вой инфекции /В.И.Кувакина, А.П.Аллилуев, И.И.Валериус, О.В.Котелыш-кова, Н.Н.Алексахина, А.М.Пономарева, Б.М.Боровкова, В.И.Карабак, И.Л.Гофман, Д.И.Плаксщ//Тез .докл. 3 Всесоюзн.конф. по мешшгококко-вой инфекции и гнойнш менингитам (Архангельск,1986>-М,1986.-С.95--97.

4. Вакцинный вариант менингококкового В-полисахарида /А.П.Аллилуев, О.В.Котелышкова, В.И.Кувакина, И.А.Еаснакьян, И.И.Валериус// Там же.-С. 100-102. '

5. Определение физико-химических критериев для стандартизации менингококковой вакцины группы В /И.И.Валериус, В.И.Кувакина,А.П.Аллилуев, И.А.Еаснакьян, О.В.Котельникова, В.И.Карабак, В.М.Боровкова// Современные аспекты изучения иммунологической .безвредности и эффективности вакцин. Сб.трудов МНЮШ им.Г.Н.Габричевского.-М.,1988,-

C.149-160. ■ '

6. Влияние фазы роста культуры менингококка серогруппы В на выход и активность антигонов /Н.Н.Алексахина, И.А.Еаснакьян, А.П.Аллилуев, В.И.Кувакина, Т.А.Артемьева, В.М.Боровкова, В.И.Карабак,О.В.Котельникова, И.И.Еадериус//Иммунобиологпческие препараты. Сб.трудов ШШоМ им.Г.Н.Габричевского.-М., 1989. -С.94-98.

7. Еазвредность и антигенная активность менингококковой полиса-ларищю-белковой В-вакцшш /И.А.Васнакьш, В.И.Кувакина, Л.Л.Левина, А.М.МордьипкиИ, В.М.Боровкова, В.И.Карабак, Н.Н.Алексахина, И.И.Валериус, II.Л.Гофман, Р.П.Чупринина и др.//Тез.докл. 4 Всесоюзн.конф. по мшшнгококь.овой инфекции и гнойнш менингитам (Новосибирск, 1990).-¡.I., [U9U.-I.I.-С.С8-70.

Ü. Иммунный итвот лвдей на белковые компоненты монингококковой кишины группы В /Ii.lt.йувакина, И.И.Валериус, Е.Б.Лапина, В.И.Карабак, A.Ü.Аллилуйи, И.А.Еаснакьян//'Гам же.-С.72-73.

9. 'oftKToi'OHiiucTb и антигенная активность вакцины менингококко-uoll гр.ушш В из природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной шыОраны /И.А.Еаснакьян, А.П.Аллилуев, В.И.Кувакина, Л.А.Леы iu, Л.И.Краснопрошина, О.В.Котелышкова, В.И.Карабак,

A.М.Мордвицкий, В.М.Боровкова, Н.Н.Алексахина, И.И.Валериус.И.Л.Гофман, Р.П.Чупршшна п др.//2урн.эпидемиол.г.щкробиол. и иммунобиол.-1990.-И2.-С.50-55.

10. Иммунологическая активность белково-полнсахаридпой менииго-кокковой вакцшш серогруппы В при .сорбции .на гицроксидо алюминия/ Л.В.Бугаев, К.В.Мачульская, Ю.П.Вартанян, И.И.Вадериус, В.И.Кувакц-на, В.И.Карабак, И.А.Баснакьян//В ш. "Проблемн медицинской иммуно-биотехнологии". Мате риалы Всесоюзной научной концэренщш (октябрь 1988 г.).-Л., 1990.-С.107-108. »

11. Штамм бактерий ПехввегХа. сарогрутш В - продуцент каясульного полисахарида и полмсахарцщю-белкового кошлек-са /И.А.Баснакьян, Н.Н.Алсксахяпа, В.И.Карабак, Т.А.Артемьова,

B.М.Боровкова, Л.Н.Решилов, В.Й.Куваюша, А.П.Аллилуев, О.В.Котель-никова, И.И.Ваперпус//Авт.свид. №17038-16 от I октября 1991 г.

12. Способ получения полисахарвдно-белковой вакцины против 1Ге1звег1а теп1пб1-ые1в серогруппы В/И.А.Баснакьян, В.И.Кувакина, А.П.Аллллуев, О.В.Котельишсова, И.И.Валерпус, И.Л.Гофман// Авт. свид. Й1750689 от I апреля 1992 г.

СПИСОК СОКРА1ДШИЙ

Ш - машшгококковал инфекция

ПС - полисахарид

Ш1 - балки наружной мембраны

ЛИС -лил ополи сахарад

НШК - нагивный белково-лолдсахаридный комплекс

1Ж . - нуклеиновые кислоты

ЭФ в ПААГ - электрофорез в полиакршгашдном гало

с ДСН . с додецнлсулъфатош натрия

РИГА - реакция пассивной гемагглюгинации

Р'ШГА - реакция торможения пассивной гешгглшшшдаи

мол.параметры - молекулярные параметры

мол.масса - молекулярная масса

За». 36 V* (мп. «подрав» И« Тир. /ОО