Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутривидовая идентификация менингококков по капсульным антигенам и внеклеточным белкам

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Внутривидовая идентификация менингококков по капсульным антигенам и внеклеточным белкам"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ Г Б ОД ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

• 5 ДЕ11

МОСКОВСКАЯ. МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ яиени „СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

.ФИЛИМОНОВА Ирина Николаевна

ВНУТРИВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ШИНГОКОККОВ ПО ХАЛСУЛЬНЫ« АНТИГЕНАМ И ВНЕКЛЕТОЧНЫМ БЕЛКАМ.

03.00,0?. - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических назк

Москва - 199^ г.

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов ии. Л.А.Тарасевича.,

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Г.К. ДЕГГЕВА

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор A.C. БЫКОВ

кандидат медицинских наук О.С. ДАРБЕЕВА

Ведущее учреждение: Российская Академия постдипломного

образования

Защита диссергации состоится п УЗ " 1994 т.

в .jj^ часов на заседании Специализированного Совета

Д. 074.05.10 в Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова С II988I, Москва, Г-435, Б.Пироговскея ул., 2-6 ).

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова по адресу: II9042, ¡¿оекза. Зубовский бульвар, 37/1.

Автореферат разослан UQvtfjx 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук

адаенг А.Ю.Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Успешная борьба с манйнгококковоЯ нфекцпей тесно связана с усовершенствованием ее лабораторной иагностлхя, что позволяет быстро, на высоком методологическом ровне проводить выделение а идентификацию возбудителя заболе-ания. Определение групповой принадлежности выделяемых штампов пособствузт установлении эпидемиологической значимости дозбу-ателя и обусловливает тактику в проведения .промвоэлидешче-:'ЛХ мэроприятий.

Ведувдм методом серогруппирования менингококков остается гакция агглютинации на стекле, с использованием коммерческих '-нангококкозых агглютинирущих сызороток серогрупп а. > В, С, В,

. У, г, И-135, 292. ..

Качеству этих препаратов - юс специфичности, уровню окгав-юти, способности выязлять в штаммах минимальное количество ецифического антигена - придается большое значение.-

Агглютинирующие сыворотки - основной компонент раанообраз-х иммунологических реакций и от их качества во многом зависит спроизводигасть и надемость полученных результатов. Несмотря это, стандартные образцы, а такзсе научно обоснованные подхо-к создании таких препаратов до настоящего времзки не разра-ганы. В то время как опыт работы контролирующих организаций называет, что создание и применение стандартных образцов раз-с уровней: международных, национальных, стандартных образцов ¡дприятяй, позволяет проводить не только сравнительное дзуче-; определенных параметров диагностических препаратов, но а :рызает дополнительные пути унификации и улучшения качества с.юрческой продукции.

Развитие лабораторной диагностика невозизано без изучения биологических свойств возбудителя. В сообщениях'ряда авторов (Андреева З.М. и соазт., 1975;,Трущникова А.Г., 1985; Баснакьян И.А., 1989, 1990) ;.:азывается, что существенное влияние на.до-' стоверность результатов серогруппирования оказывает вариабельность антигенного состава менингококковых.культур. Бааное значение имеет качество и оптимальность питательных сред, условия культивирования, стабильность культур при пересевах'и длительна сроках хранения. Шталаш, ввделеняке из спинномозговой жидкости и крови в период острого течения заболевания, как правило, иыеэт полноценный набор специфических антигенов и определение серогруппы с помощью агглютинирующих сывороток в реакции агглютинация на стекле не вызывает затруднений. Среди культур, выделенных при других формах мзнингококковой инфекции-'и от бактерионосителей, обнаруживают от 15 до 50 % полиагглютинабельных или ннагглютинабельяых штаммов. В этом случае необходимо привлечение более чувствительных методов и высокоактивных диагностических препаратов.

Нестабильность антигенных свойств.менингококков создает определенные трудности внутривидовой идентификации возбудителя. Для решения проблем целесообразно привлечение новых критериев, основанных на достижениях, связанных с изучением антигенов белковой природы. В последние годы нашли широкое применение методы элекгрофоретического анализа протешограмм различных белков клетки. Так по рисунку спектра внеклеточных белков значительно различаются бактерии, относящиеся к различным-родам, видам и даке биотипам (Дегтеза Г.К. и соавт., 1990; Болчкеввч Т.А. и соавт., X99I; Eutenener В., loose M.I985). Однако исследований, направленных на изучение внеклеточных белков с целью использования их

>и идентийкации менингококков, согласно литературным данным,

Про ВОДИЛОСЬ.

Де.чь работы

1. Стандартизация качества менингококкозых агглютинирующих вороток серогрупп А, В, С путем создания первых серий референс-агентов.

2. Разработка нового метода идентификации менингококковых льтур, находящихся яа разных стадиях диссоциации.

Для достижения поставленной цели были определены следующие дачи:

1. Провести анализ качества производственных серий мзнинго-кковкх агглютинирующих сывороток серогрупп А, В, С, выпускае-

х НИИ вакцин и сывороток г. Санкт-Петербурга; подтвердить опти-льность утвержденных в НЕД методов контроля.

2. Разработать критерии оценки сывороток, отвечающих требо-ниям, предъявляемым к стандартный образцам.

3. Подтвердить рациональность методов направленного отбора ai.ii.50b, применяемых при контроле менингококковых агглютинврукь-к сывороток.

се ' '

4. Научно обосновать и экспериментально доказать лригод-сть применения метода электрофореза в полиакралаьадаом геле я изучения внеклеточных белков менингококков.

Научная новизна работы

Впервые разработан "Способ внутривидовой идентификации яингококков на основе внеклеточных белков" с использованием года электрофореза в полдакриламидном геле. Способ защищен горским свидетельством № 1693051.

Впервые получены первые серии стандартных образцов сыворо-< менингококковых агглютинирующих серогрупп А, В, С согласно

общим Требованиям, предъявляемым ВОЗ к референс-реагентам, и требования?«, разработанным а РИСК им. Л.А.Тарасевича.

Обоснована методы Отбора штаммов, • используемых для контроля качества коммерческих г.;ешягококковых агглютинирующих сывороток.

Практическая значиьость

Подготовлены в утверждены Свидетельства и Инструкции по пршлэнешш стандартных образцов сывороток менингококковых агглютинирующих серогруда А» Вь С» Показана .возшаноста использования указанных сьшороток при контроле качества различных антигенных и антителъкых диагностических препаратов.

Разработан сертификат качества .сывороток менингококковых агглютинирующих серогрупп Д,В ,С.

Материалы внутривидового группирования менингококков по протеинограммам внеклетоадых белков вошли в утвержденные Кома- ■ тетом санитарно-эпидемиологического надзора 23 марта 1993 г. методические рекомендации "Злзктрофоретичёские методы дифференциаций возбудителей.гнойно-воспалительных заболеваний", разработанные совместно с НИИ эпидемиологии и микробиологии г. Нижний Новгород^

Предложен набор штамдаэ каждой серогруппы менингококков (в качестве контрольных) для проведения сравнительного анализа при изучении электрофореграмм внеклеточных белков.

Апробация работы. Результаты работы доложены- и обсуздены на заседаниях Ученого Совета и научных конференциях ИСК им. I „АЛарасевача (1986, 1987» 1992), на проблемной, конференции в х-* Перш (1988)„ на научно-практическом семинаре в НКИЭМ ' 1\. Нижний Новгород (1993).

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

- ? -

Объем в структура диссертации. Диссертационная работа сото ит из введения, семя глав, заключения, выводов, общим объе-ом ^^зтраниц шцашописи.'Работа иллюстрирована 20TaÖJHi~ am и: jq рисунками в тексте. Библиография состоит из 95 общественных и JQ3 зарубежных названий литературных источников.

СОБСТВЕННЫЕ PK СЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использованы эталонные и свежеввделенные штаммы ешшгококков серогрупп А, в, с, D, X, г, z, w-135* 29Е. 5 серотиповых шташов" группы 3, а также 45 штамшв непатоген-ых видов нейссернй, хранящиеся в коллекции микроорганизмов ИСК им. Д.А.Тарасеаича. Для создания адекватных условий при остановке экспериментов использовали набор штамюв одного аре-ени сушки, применяли одинаковые способы культивирования микро-рганизмов. При оценке качества производственных серий меяинго-окковых агглютинирующих сыворотокс разработке отраслевых стан-ар т них образцов (рефереяс-реагентов) был использован 61 музей-ый шташ. Для подтверждения выявленных закономерностей при равнительном изучении Слектрофореграш белковых антигенов менин-ококка изучался набор из 116 музейных штаммов, с определенной ерологической принадлежностью, а также 25 лоли- и -инагглюти-абельных штаммов, полученных из Центрального кожно-венерологи-вского института.

Изучено и охарактеризовано по специфичности и активности 7 серий агглютинирующие менингококковых сывороток серогруппы А, 3 - серогруппы В, 30 - серогруппы С. Для проведения экслеримэн-альных исследований использовано 12 серий сывороток серогрупп , х, y, z, w-135, 29Е производства НКИВС г. Санкт-Петербурга,

10 серий прецшштарувдих сывороток серогругш А, с, D, х, y, z, V7-155 t 29Е , выпускаемых Ставропольским НПО "Биошд", 6 серий менингококкового эритроцитаркого диагностику!®, изготовленных на производственном предприятии НКИЭМ им. Г.Н.1^бричевского

Подготовлены и изучены 5 серий ме никто кокковых агглютинирующих сывороток серогрудп А, В, С, кандидатов в отраслевой стандартный образец.

Специфичность и активность диагностических сывороток изучали с пошщью реакции агглютинации на стекле, ищунодрецЕлитациа в геле по Оухтердоня, развернутой реакции агглютинации по Ноблю » ВИЗ® (Никитин В.М., 1982).

Для электрофоретиче ского разделения растворимых внеклеточных белков использовали метод, предложенный Devis В» и Огп-stein М„ (1964) в модификации Молодовской Э.В., Дегтевой Г.К. (1969). Количественное содержание белка в препаратах определяли стандартным методом Lowry О. . Степень сходства лротеинограш оценивали по методу Дегтевой Г.К., Блохиной И.Н. (1972) на основе »¿числения коэффициентов подобая электрофореграмм с учетом общих белковых фракций.

Статвстйческую обработку материалов проводили согласно общепринятым методикам (Ашарин И.П., Воробьев A.A., 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разнообразие и неоднозначность возбудителей менннгококковой .шфеяцаа s эпидемиологическом процессе, при единых шрфологыче-сш,, бюхтялеокт. и культуралькых свойствах потребовали разра-' rtoifae меч oavrn,- дозволяющие осуществлять их дифференциаций внутри

Б аасяияжде .время внутривидовая идентификация шниягококков

базируется на различиях в их антигенной структуре и осуществляется с помощью ряда диагностических препаратов, среди которых наиболее широкое применение наали агглютинирующие сыворотки к групп о сп ецифиче скому капсульному антигену.

Проведя сравнительный анализ данных, характеризующих качество менингококковых агглютинирующих сывороток серогрупп А,В,С за 5 лет их выпуска, пришли к выводу, что более высокая оценка специфической активности отмечалась в производственном отделе и ОБК предприятия-изготовителя и не совпадала с результатами контроля, полученными в Й5СК им. Л.А.Тарасевича. Различаться результаты рбусловлены как качеством агглютинирующих сывороток,, га,к и неадекватным антигенным составом тест-штаймов, используемых для контроля.

Для получения унифицированных данных контроля выпускаемых герий агглютинирующих сывороток требовалось располагать постоянной единицей сравнения, то есть референс-реагентом для параллельного испытания производственных серий препарата. ■

. Первоначально были сформулированы требования к предлагаемым з качестве референс-реагентов менингококковым агглютинирующим зывороткам серогрупп А,. В, С, как наиболее эпидемиологически зна-ш.шм и часто выявляемым при серогруппированш менингококковых {ультур. В работе использовали опыт, накопленный при создании эеференс-реагентов сальыонеллезншс, эшерихаозных сывороток, а гак&е некоторых бактериальных' вакцин, с учетом общих требований, разработанных ВОЗ.

Референс-реагенты менингококковых агглютинирующих сывороток (олхны удовлетворять следующим требованиям:

- препарат должен быть сухим, иметь показатель массовой доли >лаги не более 3 % и определенную точность розлива;

- иметь вакуум в ампулах;

- быть специфичным, вызывать реакцию агглютинации ка стекле с гомологичными втаммами на "4 креста" в течение I кинуты;

- высокоактивным. Средний титр в реакции агглютинации по Ноблю не нихе 1:70 (серогруппы А и С) и 1:20 - для сывороток серогруппы В;

- стабильным, сохраняя исходные свойства при хранении при температуре +8 °С в течение 5 лет.

Разработку критериев оценки качества и диагностической значимости сывороток, каядидатоз в референс-реагеяты, осуществляли на модели сывороток серогруппы А. В дальнейшем эти .данные были использованы при разработке рефе ре нс-реагентов агглютинирующих сывороток серогрупп В и С.

Согласно ЕЩ, качество сывороток определяется по интенсивности реакции агглютинации на стекле и по определению титра з развернутой реакции агглютинации по Ноблю с помощью трех конт-ролъиьа италглов. Отобрав и изучив несколько производственных серий сывороток серогруппы А, остановили свой выбор ка трех сериях О 3?, 42с 43). Для аттестации сывороток, предназначенных в качества референс-реагеятов, помимо тест-шташов, указанных в НТД, окй использовав набор из 10 штампов, различающихся по содержанию капсюльного полясахаридного антигена. Проведено комплексное исследование, выходящее за.рамки, предусмотренные в НТД и позволяв щое располагать дополнительным материалом, подтверждающим высоко! качество испытуемого препарата.

Специфичность агглютинирующих сывороток серогруппы А серий А 37, 42Р 43 определяли в реакций шлмуяодреципйтации по Оухтер-пот и ВЮФ. Дли определения активности использовала метод В£ЭФ,

более чувствительный, чем реакция агглютинации по Ноблю. В качестве антигена примешь микробную взвесь (густотой 60 ед.) гомо-лог::чннх отшагав (таблица I).

Таблица I

Определение специфической активности аггллтинирутзцнх сывороток, предлагаемых в качестве резеоенс-рзагэнта (в двух иммунологических реакциях)*

штаммы | Средние ти гры антител в екзороткзх сершГ*

пп еерогрупды А \ 37 ! .о ! ^ 43 I 37 ! 42 | 43

1 ¡з реак ;ции по дки агглютияа-Ноблю ВИЭФ к»

I. 203 160 160 240 1280 1280 1280

2. 13077 "80 120 240 '640 "640 1280

3. Ь-1 80 95 128 640 640 1280

4. Ь-Чг 80 80 120 640 640 1280

5. 1.-8 40 56 120 320 320 640

6. а I 40 40 95 320 320 640

7. м-то 40 40 80 256 256 640

8. 785 40 40 60 256 256 256

9. 97 40 40 60 255 256 320

10. 537 36 36 56 128 128 160

11 * т 63.6 69.8 • ±2,ьЗ ±2,об 120,0 ± 2,62 472,7 +19,5 472,7 ±19,5 776,6 ±37,1

к Титры даны в реципрокных показателях.

"" За татр скзоротки приникали то наибольшее разведение антигенного препаоата, когооое вызывало'образование линий пре-цшитации.

Наиболее достоверные показатели специфической активности получены при создании эквивалентного соотношения антител (сыворотки еерогрупды А - кандидаты в референс-реагенты) и антигена (поли- ' сахарпдная менингококковая вакцина еерогрупды А, содеряадая 375 мкг очищенного полисахарида) лри постановке реакции ВИЭФ (таблица 2).

Таблица 2

Эквивалентное соотношение специфических антигенов и антител, в сыворотках, рекомендуемым в качестве раэерейс-реагентов

Сыворотки серогруппы' • —г. -- — 1 — .! Титр антител ¡Количество поли-[Сахарвдного антигена

Серия й 37... 1:8 375 нг

А Серая й 4'2 1:8 375 нг

Серия Л 43 1:64 375 нг

С Серия $ 43 . 1:8 2500 нг

Суммируя полученные данные пришли к следующему заключению: из трех отобранных серий менингококковых агглютинирующих сывороток серогруппы А ~ все соответствовали требованиям НТД, но только одна удовлетворяла требованиям, предъявляемым к кандидатам в референс-реагенхы - серия № 43. Эта сыворотка после растворенья 0,9 % раствором натрия хлорида не агглютинировала с гетеро-логичными культура!® менингококка, тогда как с гомологичными штаммами возникала.реакция агглютинации, оцениваемая на "4 крес- ■ та". Используя реакции по Ноблю и ВИЭФ для определения специфической активности сыворотки серил й 43, было показано, что она имела параметры (1:120 и 1:776 соответственно), значительно превышающие показатели специфической активности сывороток серий а 37 в й 42* Введение дополнительного критерия оценки активности сывороток путем подбора эквивалентного соотношения антигена и антител подтвердило, что сыворотка серии & 43 содержит большее количество антител и может быть рекомендована в качестве референс-реагента

Таким образом,,данный этап исследования показал, что разработанные требования позволяют охарактеризовать сыворотки, предна-значешше в качестве референс-реагентов.

Следующий комплекс экспериментов позволял подготовить рефе-реяс-реагенты агглютинирующих сызороток серогрусд 3 к С. Дяя этой цели были отобраны производственные серии предаратоз. Обе сызо-роткк (серогрулпа В серия И 29 и серогругшы С серия И 43) были аттестованы по схема, применяемой при разработке референс-реагек-та агглютинирующей сыворотки сэрогруплы А.

Сызоротка серогрушты С четло под петлей вызывала четырех-крестозую реакцию агглютинации ка стекле с 10-ю го:,-олог;:чнымл штаммами. Для изучения специфичности сыворокл серох^рупяы В использовали набор из 40 штаммов, зключлз в него к шта:д.:ы определенной серотшовой принадлежности. Наблюдали четкую реакцию на "4 креста". Обе сыворотки не вступали в реакцию с гетеролог;г-:нымл штаммами. В реакции преципитация з геле получены адекзатше результаты, подтзерндагащие высокую специфичность испытуесывороток.

При определении титра специфических антител, характеризующего активность препаратов, показано, что обе сыворотки, кандидаты в рефереяс-реагенты, были высокоактивны, юл ели средние титры в реакции агглютинации по Ноблю 1:70 (сызоротка серогруппы С) и 1:20 (сыворотла серогругшы В). Показатель активности сыворотки серо-группы С, определявши методом ВИЭ2>, был равен- 1:700 (таблица 3). Соотношение антител (сыворот.-.а серогрупгш С) В разведении 1:8 и антигена (поллсахаркдная ыензнгококкозая вакцина А + С, содержащая 250 мкг очищенного полисахарида) 2500 нг было эквивалентным (см. таблицу 2).

Таким образом, сыворотки серогрупп В (серия № 29) и С (серия !« 43) по предусмотренным параметрам соответствовали требованиям, предъявляемым к референс-реагентам.

Заключительным этапом этого раздела исследований были эксперименты, позволяющие решить вопрос о стабильности разработанных

Таблица 3

Определение специфической активности сывороток . серогоупя В и С, предлагаемых в качестве резерекс-реагентов

Штаммы ; Средний титр ; Штаммы ■ ¡Средний титр

серогоуп- -1-1 серогруп- ;в рА по

лы й \ в _рЛ' ; ВИЭФ | ш В ¡Ноблю

; по Ноблю } | (

1. 0538 88 1152 0657 40

2. 23248 83 998 4 941 40

3. 13102 84 928 13090 20

4. 23252 72 800 23251 20

5. 691 64 672 '202 20

6. 2241 60 576 1642 20

7. 369" 60 336 "258 20

8. 1259 .55 220 17 (Куба) 10

9. СЕЗ 5(э 192 "1141 "5

10. 54 52 156 "688 5

М ± т 68,0+1,66 700,0+35,9 20,0+0,36

стандартных препаратоа. Результаты испытаний их в условиях хранения при температура плюс 8°С, 37°С, 43°С показывает, что содержание в течение 1,5 месяцев при температуре плюс 8°С и 37°С на оказызае? влияния на исходные свойства препаратов. Сыворотки четко работали в реакции агглютинации на стекле и не вызывали перекрестках реакций с гетерсиогичными штаммами. Не отмечено снижения активности яри использовании сывороток в реакции агглютинации по Ноблю и ВИЭФ. Хранение в жестких условиях при температуре шюс 43°С приводило к 50 % скихению активности, что согласуется с литературными данными (Лузина 2.В. и соавт., 1982; Иванова Д., 1978; Каретникова Э.С. и соавт., 1990) и является допустимым при аттестации стандартных препаратов. Таким образом, на основании фактического материала, свидетельствующего о стабильности испытуемых

сывороток сэрогрупд А, В, С, определен срок их действия - 5 лет, при температуре хранения хтсос 8-°С.

Последупциз наблюдения (6 ¡-.'.осяцез, 12- месяцез, 3 года, 5 лет) подтвердите, что активность ре'зереяс-прэпаратоз оставалась на исходном уровне в течение прогнозируемого срока годности при указанном рех-кме хранения (таблица 4).

Таблица 4

Стабильность иеЗеэенс-пэаг-знгоз аггяпгаЕзоукзэс менлнгокоххозых сызооотсх А, В, С после длительного срока хоаяэкпя;*

Рересенс-ре агенты серогруял Исходный титр _ дан ныэ пря тз: хранекня '.нературе станд +8°С :,ртнкх пропара тез (5 лет

¡п-.укологпче зк :е реа?

рА на с I пэкле ; рА по Ноблю 1 ! -

А I :120 4+ I. 120 + 2,62 1:778 + 37,1

В т :20 4+ !■ 20 + 0,35 -

С I :70 ■ 4+ ■ 1: 63 + 1,66 1:700 + 35,9

На предприятии-изготовителе (НК'ЗС г.Санкт-Петербург) и в П1СК им. Л.А.Тарасевича применение реЗеренс-реагектов в качестве препаратов сравнения в параллельных опытах с знозь выпускаемым!: сериями агглютянирутздах сывороток пркзэло к повышению качества последних и снлкению процента несовпадений в результатах контроля.

Исследования, связанные с подготовкой стандартных препаратов агглютинирующее сывороток с-зрогрупп А, В, С нельзя считать законченными, не уделив долг.кого внимания штаммам менингококков, используемым при изучении этих сызороток. Проведена работа по оценке штаммов, полноценных по содержанию поллсахаридного антигена. В результате пришли к выводу,- что из-за вариабельности содержания полисахарида в культурах, хранящихся на различных питательных средах нецелесообразно предлагать набор определенных штаммов с целью

использования их как эталонных при контроле соответствия диагностических препаратов требованиям НТД. Более правильно было бы рекомендовать-апробированный ме.тод отбора штаммов, способный выявлять изменения в свойствах менлнгококковых культур.

Чтобы обеспечить отбор культур, состоящих из 'колоний в, ов-форме в Е*ИВС г. Санкт-Петербурга разработан метод фагоцитарной селекщщ (Рогосов Г.И., Дубров К.Ф., Попова И.А.., 1980), позволяющий подбирать штаммы с высокий содержанием капсульного антигена и способностью максимально активизировать выработку соответствующих антител. .

Применение метода фагоцитарной' селекции оправдало в условиях производства, но к штаммам, используемым для контроля качества выпускаемых серий агглютинируюцих сывороток, предъявляются иные требования. Циркулирующие среди населения возбудители' менингокок-ковой инфекции в силу мозаичности антигенной структуры обладают • < различными серодогяческими свойствами. Используемые в диагностике агглйтикирующне сыворотки должны обладать способностью выявлять специфический антиген у штаммов, находящихся на разной стадии диссоциации и содержащих минимальное количество капсульного полисаха-редкого антигена. Для отббра штаммов в ГИСН им. Л.А.Тарасезича используют метод косого освещения. Для проверки однородности изу-чаег.ых культур, выделения определенных антигенных вариаций в пределах популяции штаммов и видов бактерий, ттод косого освещения имеет важное практическое значение.

Для окончательного резения вопроса о возможности использования разработанных референс-реагентов агглютинирующих сывороток серогрупя А, В, С в качестве постоянной единицы сравнения, проведено испытание их: в параллельных опытах с десятью производственна,'.¡: сориг-я препаратов аналогичных серогрупд в НЖВС. г.Санкт-Пе-тербуьга; для сероадакгиЗшсадии 538 свеясеввделенных штаммов в

Московском городском центре Госсанэпиднадзора; в центре по иения-гококковой инфекции ЦНИИ эпидемиологии. В отзывах отмечается, что референс-реагенты обладали высокой специфичностью, активностью, способствовали унификации результатов контроля качества в ОБК предприятия-изготовителя, что позволило отбирать серии, не соответствующие требования!/! НТД, и браковать их.

Необходимость второго раздела исследований обусловили данные литературы, свидетельствующие о выделении значительного количества полиагглвтнвабельных штаммов, серогруппозая принадлежность которых остается не расшифрованной. Лдя осуществления внутривидовой идентификации таких культур следовало проводить поиск иных, более стабильных антигенов, наименее подверяеяккх фенотиоиче'ским изменениям. К числу таких антигенов относятся белки, обдадаыцпе биологической специфичностью, в которой отражены не только специфика кодирующей белок генетической системы, но и принадлежность организма биотипу, роду, виду И -Т.Д.

Нами Епервые изучена возможность ьнутриввдозой идентификации менингококков, исходя из сходстза и различия в протеиногракках внеклеточных белков, полученных методом электрофореза в полиакрил-амидном геле.

Ва~.янм моментом при проведении сравнительных анализов является соблюдение строго стандартных условий получения белковых спектров. Определенное значение имеют условия культивирования бактерий, состав питательных сред, доза вносимого антигена, иначе нельзя говорить об абсолютной идентичности фракций, обладавшие здинаковыми подвижностяыи. При оценке сходства юш различай белковых спектров, полученных с помощью электрофореза в лолиакрил-амцдном геле использовали метод визуального сравнения протеино-'рамм с последующим описанием их, а такаа сравнивали белковые

фракции по относительной скорости миграции отдельны»'белков, путем вычисления Н£ . Наиболее объективные суждения о степени сходства или различая белковых спектроЕ были получены при сравнении штаммов но так называемое коэффициенту подобия.

Первоначально были сопоставлены электрофореграммы внеклеточных белков штаммов, принадлежащих к разным серогрудлам. Они огли-* чались друг от друга по общему рисунку и количеству крупных фракций: от 8 до 18. Неоднородность, в спектрах внеклеточных белков дозволила объединить исследуемые штаммы менингококков в несколько груш (рисунок I).

штамм

серогруппа

У Z 135' 29Ё W

Рис. I. Схема распределения фракции внеклеточных - белков менингококков.

В группы входили штаммы, имеющие одинаковый рисунок располокения белковых фракций и отличающиеся от протеинограмм других групп. Объединенные в ту или иную группу штаммы соответствовали определенной серогрупле (определяемой по капсульным долисахаркдным антигенам). Обнаруженный феномен нашел подтверждение при сравнительном изучении электрофореграплм 116 штаммов менингококков девяти

ерогрупп. • '

Для проведения сравнительных исследований предлог.эк набор, остоящий из 9 штаммов серогрулл а', в, с, В, x, Г, г, 7,-155, 29Е, Зладающих характерным рисунком располокения белковых- арак^й, целью дальнейшего использования их в качестве-коктрс.гышх. Осо-эе внимание придавали такому показателю как воспроизводимость, гепень воспроизводимости прозерена в восьми опытах с белковыми зтигенами контрольных штаммов девяти с ерогрупд, Число фракций с расположение выявляли в проходящем свете, а также на фотогра-1ях элехтрофореграмм.

Наиболее достоверные результаты при оценке степени гектрофореграмм получены при введении в анализ коэффициента -ю-->бия. Коэффициенты подобия между группами колебались от 30 >.- до , %, Наибольшее сходство электрофореграмм наблюдали кез^У

серогрупп А и В, X и №-135 -, которое составляло 70-74 % л [енивалось как' среднее. Остальные группы распределились в преде-х 40-60 % и сходство между-'ними оценивалось каг низкое. Значения 'эффициентов подобия манду штаммами, где отмечалось единство в :сунках расположения фракций,было достаточно высоким и средней •казатель равнялся 95 Такая'высокая степень гомологии подтзер-дет вывод о тождественности результатов, полученных методом уппирования штаммов, исходя из специфического характера распределил внеклеточных белков на злектрофореграммах и серогрушшро-няя, базирующегося на различиях в химическом строении капсуль-х полисахаридов. *

Еыявлекная закономерность подтверядена при изучении 25 СЕеке-деленных штаммов, биохимические свойства которых позволили идон-фицировать их как- 1Т.тер1пй5.1:1сй.з но "в силу псашагглютлнабель-сти серологически не расшифрованных.- Сравнением рисунка белковых

спектров ме:кду собой, а также с эдектрофореграм-ма'^гконтрольных □гам./оэ была определена принадлежность к определенной серогруппе у 23 штампов.

Тазсм образом, использование для внутривидовой идентификации метода электрофореза в ПААГ ::э;кно рассматривать в качестве альтернативы при изучении штаммов к. ЕепапеИ;!;^.

Совокупность "широкого сп-зг.тра методических подходов позволяет полноценно охарактерл'зозать.Еыделеняые культуры, а разработан- ' нке и апробированные методы'успешно применять для оценки качества диагностических лрепаратоз и питательных сред.

ВЫВОДЫ

1. Внутривидовую идентификацию ьт.Еепз.пе:2.1;1<12з можно проводить не только по капсульным полисахаридным антигенам в реакции агглютинации на стекле, используя агглютинирующие сыворотки серо-грулп А, в, с, Б, X, т, г, 29Е , но и применяя впервые разработанный метод цдентификации по рисунку спектров внеклеточных белков.

2. Разработаны требования к стандартны!,5 образцам диагностически менингококковых сывороток серогрупп А, В, С: пр;п?отовлены й апробированы указанные п.караты.

3. Стандартные образцы могут быть использованы, как образец сравнения при оценке качества:

- выпускаемых производственны:: серий сывороток;

- диагностических препаратов (эрктроцитарных диагностикумов, ко- и латекс-реагентов);

- при оценке содержания специфического антигена в культурах менингококка в реакции агглютинации по Коблю и ВКЭФ.

4. Разработаны критерии оценки содержания лйянсахарндного .нткгена в штаммах: методы косого освещения и ЗКЗЗ являются до-таточяо объективныл д при отборе культур K.neningitidis для зтпх ;елей.

5. Разработан сертификат, подтверждающий качество выпускае-ых агглютинирующих сывороток.

6. Впервые показано, что электрофореграмлы внеклеточных белев менингококков неидентичны. Это позволило объединить их з

групп, тождественных девяти серогруппам, разделение которых сновано на различиях в химическом строении калсульякх полисаха-эдов.

7. Показано преиг.:ущестзо группирования N.ceningitidis по 1ектрам внеклеточных белков, позволяющее определить серогруппо-то принадлежность полиагглютинабелькых а'ташс®.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных па теме диссертации

1. Филимонова И.Н., Ковалева В.В., Андреева З.М., Трубникова

Г. Стандартизация ыенингохоккоьых сывороток серогрулп А, 3, С

rt *

Сб. Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии производства бактерийных препаратов. - Пермь. - 1988. - С.131-33.

2. Андреева З.М., Ковалеза В.В., Филимонова И.Н. Диагностике менянгококкозые сыворотли и их качество // Лабораторное 50. - IS89. - И 5. - С. 74-76.

3. Филш.:.онова И.Н., Дегтева Г.К., Андреева З.М. Специфиче-:е особенности внеклеточных белков менингококков // Ыенинго-сковая инфекция и гнойные менингиты (диагностика, профилактика,

лечение) // Новосибирск, 1990. - T.I. - С. 110-112/

4. Шобухоза, Т.О., Ерзоза 2.Б., Филимонова H.H. Номенклатура, - качество, стандартизация и внедрение диагностических препаратов

для диагностики меяингонокковой инфекции // Tain ке. - Новосибирск, 1990. - Т.2. - С. 122-123. . '

• д •

5. Филимонова H.H., £егтеза Г.К., Золчкевич H.A. Способ

• вдентлдэилацки представителей рода неЗссерий // Клиническая ла6о~ раторкая диагностика. - 1992. И 1-2. - С. 40-42.