Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональный анализ пептидаз у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пожидаева, Елена Станиславовна, Мюнхен



, ------

'^-«"кДКН,

кдНЛц

/1

решил в

62 11/2

БОТАНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ЛЮДВИГ-МАКСИМИЛИАН УНИВЕРСИТЕТ МЮНХЕН, ГЕРМАНИЯ ДЕПАРТАМЕНТ БИОЛОГИИ I

На правах рукописи

УДК: nbn:de:bvb: 19-28254

ПОЖИДАЕВА Елена Станиславовна

Функциональный анализ пептидаз у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, A.B. Соколенко

доктор биологических наук, профессор В.В. Зинченко

Мюнхен - 2004

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................... ........................................................7

Протеазы и их роль в гомеостазе клетки................................................

1. Классификация пептидаз................................................................................................................................7

2. Типы протеолиза белков..................................................................................................................................8

3. Семейства пептидаз..............................................................................................................................................10

3.1. АТФ-зависимые пептидазы................................................................................................................10

3.1.1. Семейство пептидаз С1р............................................................................................................11

3.1.2. Семейство пептидаз FtsH..........................................................................................................15

3.2. АТФ-независимые пептидазы..........................................................................................................16

3.2.1. Семейство пептидаз Deg............................................................................................................16

3.2.2. Семейство пептидаз Ctp..............................................................................................................18

3.2.3. Семейство пептидаз SppA.............................................................................................19

4. Роль пептидаз в клетке........................................................................................................................................20

5. Адаптация цианобактерий к изменяющимся условиям окружающей среды .. 22

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................................34

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................55

1. Сравнительный анализ пептидаз у Synechocystis и A.thaliana........................................55

2. Физиологический анализ мутантов по генам пептидаз у Synechocystis в

72

условиях стресса..............................................................................

3. Функциональный анализ белков семейства SppA-пептидаз у Synechocystis... 80

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................................11В

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................................120

СОКРАЩЕНИЯ

а.о. аминокислотные остатки

кДНК комплементарная ДНК

ДМСО диметил сульфоксид

ДНКаза I дезоксирибонуклеаза I

ДТ штамм дикого типа

ИПТГ (1РТС) Изопропил-бета-В-тиогалактозид

ОП (А) оптическая плотность

п.н. пар нуклеотидов

ПАА полиакриламидный

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНКаза рибонуклеаза

ЭДТА (БЭТА) этилендиаминтетрауксусная кислота

т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

Трис (Тиб) трис (гидроксиметил) аминометан

ОРС открытая рамка считывания

сск светособирающий комплекс

ФС1 фотосистема I

ФСИ фотосистема II

ТВЕ Трис борат, ЭДТА

ТХУ трихлоруксусная кислота

ТЕМЕД N514, К., Ы-тетрам етилэтилен диамин

АРС аллофикоцианин

Ар* устойчивость к ампициллину

Сшк устойчивость к хлорамфениколу

с!СТР дезоксицитозинтрифосфат

БЬ 2 1 низкий свет (20 мкмоль фотонов м" с" )

ББР диизопропилфторфосфат

EtBr бромистый этидий

HL 2 1 высокий свет (350 мкмоль фотонов м" с")

HS тепловой шок (42°С)

IgG иммуноглобулин G

IAA иодоацетамид

GmR устойчивость к гентамицину

KmR устойчивость к канамицину

LL 2 1 обычный свет (50 мкмоль фотонов м" с")

ML 9 1 повышенный свет (150 мкмоль фотонов м" с")

PC фикоцианин

PMSF фенилметилсульфонил фторид

ВВЕДЕНИЕ

Пептидазам, наравне с киназами, фосфатазами и белками-шаперонами, принадлежит ключевая роль в регуляции структурных и физиологических процессов, обеспечивающих быстрое и оптимальное приспособление клеток к изменяющимся условиям окружающей среды. Роль пептидаз в поддержании клеточного гомеостаза становится особенно очевидной после искусственного выключения определённых протеолитических процессов, что влечёт за собой кардинальные изменения в физиологии клетки (Huffaker, 1990; Gottesman et al., 1997; Kirschner, 1999). Благодаря интенсивному развитию геномики, в последние годы были полностью расшифрованы геномы различных организмов, что позволило выявить большое число генов, кодирующих протеолитические ферменты. Причём, и автотрофные, и гетеротрофные организмы, несмотря на различия в структуре клетки и форме жизни, содержат набор пептидаз, имеющих общие филогенетические корни (Clarke, 1999; Kieselbach, Funk, 2003). Согласно гипотезе об эндосимбиотической природе хлоропластов (Margulis, 1970), их предками были цианобактерии, о чем свидетельствует значительное структурное и функциональное сходство аппаратов фотосинтеза хлоропластов и цианобактерий (Bryan, 1994). В течение эволюции в растительной клетке происходило существенное по своему масштабу перестроение и перераспределение генетического потенциала, что, в конечном итоге, привело к разделению генетического материала по отдельным компартментам (Herrmann, 1997; Race et al., 1999; Herrmann, Westhoff, 2001). Описанная реструктуризация геномов включала внутриклеточный перенос генов, главным образом, от геномов органелл к ядру. Поэтому, не удивительно, что протеолитические системы пластид и митохондрий, несмотря на преобладающее ядерное/цитоплазматическое происхождение, имеют так же родство с протеолитическими системами цианобактерий в случае пластид, и а-протеобактерий в случае митохондрий (Gray

et al., 2001), и информация о протеолитических компонентах этих органелл, хотя бы частично, может быть получена из базы данных бактериальных геномов.

Известно, что в клетках фотосинтезирующих организмов функционирование фотосинтетического аппарата приводит к повреждению составляющих его белков. Поврежденные белки специфически разрушаются пептидазами и замещаются молекулами, синтезированными de novo. В настоящее время идентифицированы лишь отдельные компоненты протеолитической системы, вовлеченные в этот процесс (Lindahl et al., 2000; Haufiul et al., 2001; Ivleva et al., 2002). Вместе с тем, многочисленные экспериментальные данные указывают на существенную роль протеолитических белков в обеспечении эффективной работы оксигенного фотосинтеза, фундаментального биологического процесса, который происходит у цианобактерий и в хлоропластах растений. Различные исследования демонстрируют наличие большого числа пептидаз, имеющих прокариотическое происхождение, в клетках растений (Adam et al., 2001), однако функция большинства из них до сих пор остаётся неизвестной.

Используемая в данной работе цианобактерия Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis), открывает широкие возможности для молекулярного анализа генов пептидаз, так же присутствующих у растений. Этот штамм способен к росту при фотоавтотрофных и фотогетеротрофных условиях (Shestakov, Grigorjeva, 1982), что может быть успешно использовано для исследования генов, напрямую или опосредованно, участвующих в фотосинтезе. Для Synechocystis разработаны подходы, направленные на изучение функций генов, заключающиеся в ведении в них инсерционных или делеционных мутаций, полностью инактивирующих гены, в создании комплементационных и супрессорных мутантов.

Раннее, в лаборатории молекулярной генетики фотосинтеза (проф. Зинченко В.В., биологический факультет, МГУ им. Ломоносова), с целью функционального анализа генов пептидаз у Synechocystis, кодирующих гомологи растительных пептидаз, была создана коллекция мутантов с инсерционной и делеционной

инактивацией 22 генов пептидаз (Паничкин, 2001). В данной работе было показано, что полная сегрегация прошла только у 14 мутантов, тогда как 7 мутантов оставались гетерозиготными, что указывает на необходимость соответствующих генов (с1рВ1, с1рР1, с1рРЗ, с1рР4, с1рХ, згр, ЫгА) для жизнедеятельности клеток.

С целью получения большей информации о функциональной роли пептидаз у цианобактерий и растений в рамках решения вопросов сравнительной функциональной и эволюционной геномики, в данной работе были поставлены следующие основные задачи исследования:

1. поиск и идентификация протеолитических компонентов у цианобактерии 8упескосу8й$, имеющих гомологов у растения АгаЫ(1орз1з ¡каИапа (далее АлНаНапа).

2. Изучение физиолого-биохимических характеристик мутантов Бупескосузйз с инактивированными генами пептидаз в различных условиях стресса, для обнаружения генов участвующих в фотосинтезе.

3. Функциональный анализ генов яррА 1 и яррА2, кодирующих белки семейства БррА-пептидаз, для установления их роли в адаптации цианобактерии к световым режимам различной интенсивности.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Протеазы и их роль в поддержании гомеостаза клетки 1. Классификация пептидаз

У всех живых организмов осуществляется постоянный синтез и деградация белковых молекул. Концентрация индивидуальных клеточных белков определяется балансом между уровнями их синтеза и деградации, которые, в свою очередь, зависят от факторов внешней среды и контролируются набором регулируемых биохимических механизмов (Vierstra, 1993; Hengge, Bukau, 2003). Протеолиз является ключевым процессом, участвующим в поддержании гомеостаза клетки (Hershko, Ciechanovich, 1998; Vierstra, 1993; Bohley, 1996). Этот процесс катализируется пептидазами (или протеазами), белками с протеолитической активностью, обеспечивающими гидролиз пептидных связей внутри молекулы-мишени. В настоящее время пептидазы классифицируют по а) типу катализируемой реакции, б) химическому механизму катализа; в) по молекулярной структуре и гомологии пептидаз (Kenny, 1999; Rawling, Barrett, 1999).

Пептидазы могут проявлять селективность, гидролизуя, только определенные пептидные связи. Одна из форм этой селективности проявляется в гидролизе пептидной связи в специфическом положении полипептидной цепи белковой молекулы и лежит в основе классификации пептидаз по типу реакции: эндопептидазы и экзопептидазы. Экзопептидазы гидролизуют молекулу субстрата либо с N-конца (аминопептидазы), либо с С-конца (карбоксипептидазы). В зависимости от числа отщепляемых аминокислотных остатков экзопептидазы подразделяют на моно-, ди- и трипептидазы. Эндопептидазы катализируют расщепление связей, расположенных внутри молекулы. Согласно классификации пептидаз на основе химического механизма катализа (Hartley, 1960), эндопептидазы делятся на сериновые, цистеиновые, треониновые, глютаминовые, аспарагиновые, металлопептидазы и пептидазы с неизвестным типом катализа (Barrett, 1994 и 1995; Kenny, 1999). В базе данных по пептидазам MEROPS эти

семейства обозначаются латинскими буквами S, С, Т, G, А, М и U, соответственно. Данная система обладает рядом ограничений, поскольку определенное семейство, например сериновых пептидаз, включает пептидазы с различной молекулярной структурой и каталитическими механизмами. Более того, эта классификация не позволяет определить степень гомологии между белками. Поэтому, внутри одного семейства могут находиться белки, различающиеся как по своей молекулярной структуре, так и по типу катализа. Классификация пептидаз по молекулярной структуре и гомологии (Rawlings, Barrett, 1993) стала структурной основой базы данных по пептидазам MEROPS. Подобный подход в классификации стал возможным только после развития методов определения аминокислотных последовательностей белков и их трёхмерной структуры. Позднее, эта схема была дополнена белками, ингибирующими пептидазы (Rawlings et al., 2004).

2. Типы протеолиза белков

В клетках различают два типа протеолиза: неселективный протеолиз, приводящий к расщеплению белковых молекул неспецифичными пептидазами и избирательный (или ограниченный) протеолиз, катализируемый специфическими пептидазами в различных компартментах клетки.

Протеолиз первого типа происходит в результате согласованного действия различных пептидаз и во многих случаях протекает внутри лизосом или вакуолей, требуя затраты энергии АТФ (Seglen, Bohley, 1992; Knop et al., 1993). Число лизосом в клетке особенно быстро возрастает в условиях дефицита питательных веществ или гормонов, когда увеличивается число аномальных белков, образующихся в результате мутаций и ошибок биосинтеза. При этом большая часть аномальных белков, предназначенных для деградации, попадает в лизосомы случайным образом по неселективному пути. Однако, следует отметить, что в условиях дефицита питательных веществ также может происходить избирательный транспорт белков в лизосомы (Olson et al., 1991). Это было показано на культуре клеток млекопитающих (Terlecky et al., 1991). В процессе участвует белок

теплового шока Hsc73, который способен связываться со специфической аминокислотной последовательностью KFERQ цитоплазматических полипептидов, предназначенных для деградации в лизосомах (Chiang, Dice, 1988). При взаимодействии с шаперонами и лизосомальными мембранными рецепторами (Terlecky, Dice, 1993) цитоплазматические белки претерпевают конформационные изменения, затрачивая при этом энергию АТФ, что, в свою очередь, облегчает их транспорт в лизосомы. Примерно 25-30% всех цитозольных белков клеток человека содержат домены, взаимодействующие с антителами к аминокислотной последовательности KFERQ (Dice, 1992). Это дает основание полагать, что большинство белковых молекул животных клеток, предназначенных для протеолиза, попадает в лизосомы, используя этот путь (Dice, Chiang, 1989; Olson et al., 1991; Terlecky, Dice, 1993; Vierstra, 1993).

Второй тип протеолиза, избирательный протеолиз, отвечает за выборочный кругооборот клеточных белков, как в нормальных, так и в стрессовых условиях (Burgess et al., 1978; Ciechanover et al., 1980; Klausner, Sitia, 1990; Heinemeyer et al., 1991; Wagner et al., 1994; Ciechanover, 1998; Brown et al., 2000; Hicke, 2001). Одним из основных компонентов избирательного протеолиза является протеасома (Hershko et al., 1983; Hershko, 1988). У различных организмов протеасома представляет собой консервативный белковый комплекс размером более 2,5 МДа, осуществляющий АТФ-зависимое расщепление белков с образованием пептидов и свободной молекулы убиквитина. Убиквитин является небольшим консервативным полипептидом, состоящим из 76 аминокислот. Он способен связываться своим С-концом с боковыми лизинами белка-мишени. Наличие такой метки в белке является первичным сигналом для их сортировки, направляющей образовавшиеся конъюгаты к протеасомам для последующего протеолиза (Hershko, 1988; Ciechanover, Schwarz, 1989; Vierstra, 1993; Ciechanover, 1998; De Mot et al, 1999; Glickman, 2000). Убиквитин-зависимый протеолиз участвует в деградации белков, поврежденных во время различных стрессов, включая тепловой стресс. Увеличение

количества убиквитина, в данном случае, может выполнять сигнальную роль для протеолиза (Bond et al., 1988; Klausner, Sitia, 1990; Sommer, Jentsch, 1993; Kopito, 1997; Mayer et al., 1998; Kopito, Sitia, 2000; Lee et al., 2004). В клетках высших растений функция убиквитина сопряжена с расщеплением фитохром-содержащих фоторецепторов в условиях светового стресса (Shanklin et al., 1987; Hershko, 1988; Jabben et al., 1998).

Кроме убиквитин-зависимой протеасомы ограниченный протеолиз катализируется специфическими пептидазами, которые избирательно расщепляют одну или несколько пептидных связей в молекуле белка. Они входят в состав различных семейств {см. далее в главе 3) и выполняют различные функции в клетке. Специфические пептидазы участвуют в регуляции клеточного цикла (Pagano, 1997), генной экспрессии (Adam, 2000), дифференцировки клеток (Kinoshita et al., 1995), сортировки и доставки белков к месту их окончательной локализации (Perlman, Halvorson, 1983), а также процессов старения и запрограммированной смерти клеток (Huffaker, 1990; Matile et al., 1996; Hortensteiner, Fello, 2002).

3. Семейства пептидаз

Неселективный и ограниченный протеолиз обычно катализируются различными регуляторными механизмами, в различных органеллах и компартментах клетки (Burgess et al., 1978; Brown et al., 2000; Hicke, 2001).

В настоящий момент в клетках прокариот и эукариот наиболее подробно охарактеризованы пептидазы следующих семейств:

3.1. АТФ-зависимые пептидазы

В эту группу входят семейства пептидаз, которые относятся к подгруппе ААА+-белков (т.е. АТФаз, ассоциированных с другими клеточными активностями) и содержат в своей белковой последовательности консервативный АТФ-азный участок размером 200-250 а.о. (Neuwald et al., 1999; Ogura, Wilkinson, 2001; Lupas, Martin, 2002). Протеолитическая активность и регуляторная функция этих

ферментов сопряжены с гидролизом АТФ (Katayama-Fujimura et al., 1987; Horwich et al., 1999). АТФ-зависимые пептидазы проявляют высокую селективность, поскольку производят отбор субстратов-мишеней из общего пула внутриклеточных белков (Gottesman, Maurisi, 1992). Все известные АТФ-зависимые пептидазы являются олигомерами (Bochtler et al., 2000; Guo et al, 2002). В настоящий момент описаны четыре цитоплазматических (ClpAP, ClpXP, HslUV и Lon) и одна мембрано-связанная (FtsH) АТФ-зависимые пептидазы (Suzuki et al., 1997; Dougan et al., 2002; Gottesman, 2003). У эукариот также присутствует большой АТФ-зависимый мультикаталитический комплекс, называемый 268-