Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Альбуминовый рецептор стрептококка группы G: клонирование, характеристика и практическое использование

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Альбуминовый рецептор стрептококка группы G: клонирование, характеристика и практическое использование"

^ £

^ На правах рукописи

\

Орлова Светлана Николаевна

Альбуминовый рецептор стрептококка группы в: клонирование, характеристика и практическое использование

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Научно - исследовательском Институте Экспериментальной Медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук Тотолян A.A. кандидат биологических наук Гупалова Т.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Грандсгрем К.О. доктор биологических наук, профессор Заикина H.A.

Ведущие учереждения:

Санкт-Петербургский Институт Эпидемиологии и Микробиологии им. Пастера Миюдравмедпрома РФ.

" ^¿¡¿ССЬуиР 1997г. в /т а о Совета К 084.63.01 по защите

Защита диссертации состоится 'ЯУ'уЖЬ\иР 1997г. ъ1ЩМ асов на заседании Диссертационного Совета К < диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Санкт-Петербургской Химико-фармацевтической Академии

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института Автореферат разослан " 1^ С(й(лш 1997г.

Ученый секрктарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук Н.В.Кирилова

ВВЕДЕНИЕ

Бактериальные инфекции, вызываемые патогенными стрептококками, относятся к числу наиболее распространенных в инфекционной патологии. Именно поэтому стрептококковая проблема находится в сфере наблюдения со стороны Всемирной организации здравоохранения, которая рассматривает ее в ряду актуальных медико-экономических проблем современного здравоохранения.

Возникновение генно-инженерной методологии позволило в значительной мере усовершенствовать, ускорить и облегчить исследование разнообразных биологически активных веществ стрептококков. Однако, наши знания относительно мехашпмов патогенности и вирулентности стрептококков нуждаются в дальнейшем накоплении и развитии, поскольку прогресс в понимании молекулярных основ патогенности, безусловно, отстает по сравнению с большинством других бактериальных систем.

Следует отметить, что в связи с развитием такой перспекивной отрасли науки как биотехнология, изучение генетики патогенности стрептококков преследует не только фундаментальные, но также и прикладные цели использования стрептококков в качестве источника генно-инженерных конструкций и биотехнологических реагентов.

В последние годы интерес исследователей многих стран привлекла открытая у стрептококков способность реагировать с сывороточными белками человека и млекопитающих. Среди широкого спектра взаимодействия стрептококков с сывороточными белками человека особое значение представляет связывание микробами Fc фрагментов молекул IgG и IgA.

Наиболее хорошо изучен поверхностный Fc рецепторный белок А Staphylococcus aureus, который нашел применение во многих иммунохимических методах. Однако многочисленные работы по характеристике белка А позволили обнаружить и некоторые его недостатки. К их числу можно отнести низкий аффинитет в отношении отдельных видов

и подклассов ^О, неспособность взаимодействовать с ^ОЗ человека и, наоборот, способность слабо реагировать с ^А и человека. Это обстоятельство заставило обратиться к изучению функций и свойств рецепторных структур других микробов, в частности патогенных и условно-патогенных для человека стрептококков.

У стрептококков группы в был обнаружен т.н. белок в, обладающий по сравнению с белком А более высокой 1яС Рс-рецепторной активностью. Оказалось, что многие стрептококковые штаммы, экспрессирующие О белок, связывают и человеческий сывороточный альбумин. Полноразмерный геи О белка стрептококков группы О кодирует белок, обладающий как ^О связывающей способностью, так и альбумин связывающей способностью, причем , сайты связывания для ^С и альбумина локализованы в разных частях молекулы в белка, что определяет возможность разделения функций этого белка посредством методов генной инженерии.

Биологический смысл альбуминовой рецепции не ясен. Некоторые косвенные данные указывают на его патогенетическое значение. Поэтому получение высоко очищенного пептида, обладающего способностью связывать альбумин, должно помочь в решении этой проблемы и других вопросов метаболизма альбумина в клинико-лабораторной диагностике. Речь, в частности, может идти об определении малых концентраций альбумина в биологических жидкостях, например в моче, т.е. о микроальбуминурии. Последняя имеет определяющее значение в начальной стадии многих заболеваний, сопровождающихся нарушением фильтрационной функции почечных клубочков.

Определение концентрации иммуноглобулина и альбумина существенно не только в нефрологии, но и в патологии других органов и тканей. По этой причине рецепторные белки могут оказаться весьма полезным . инструментом для изучения белкового состава любых биологических жидкостей (кровь, ликвор, экссудаты и транссудаты любой локализации, слеза,слюна и различные экскреты).

Кроме того, необходимо отметить, что рекомбинантный альбуминсвязывающий белок может быть использован и как эффективный лиганд для аффинной хроматографии, с помощью которой можно получать высокоочищенный альбумин человека и некоторых млекопитающих, а также белковые препараты, из которых альбумин должен быть удален, как балластный компонент.

Исходя из изложенного, получение рецепторных белков стрептококкового происхождения методами генетической инженерии с последующей их очисткой посредством аффинной хроматографии является актуальной биотехнологической задачей.

Важным является создание высокопроизводительных штаммов-продуцентов рецепторных белков и создание па их основе принципиально новых диагностических тест - систем, в которых специфические антитела заменены лигандньши структурами.

Целью настоящего исследования является клонирование в E.coli полноразмерного гена G белка , обладающего и IgG, и альбумин-связывающей активностями,дальнейшее субклонирование соответствующего фрагмента гена G белка в Е. coli для выделения участка G белка, ответственного за связывание человеческого сывороточного альбумина, с последующим изучением свойств альбуминового рецептора и исследование возможности его прикладного использования для лабораторной диагностики. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1.Создать библиотеку стрептококковых генов и проанализировать отдельные клоны этой библиотеки на наличие специфических рецепторных белков.

2.Выделить из библиотеки хромосомных генов стрептококка группы G клоны, экспрессирующие G белок.

3.Субклонировать часть гена, ответственного за альбумин-связывающую активность.

4.Выделить и очистить альбуминовый рецепторный белок с последующим изучением его связывающих свойств.

5.Создать активный штамм-продуцент альбуминового редепторного белка.

6.Приготовить аффинную колонку на основе альбуминового редепторного белка.

7.Создать на основе альбуминового редепторного белка диагностические тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях.

Научная новизна работы состоит в том,что:

1.Создана библиотека генов стрептококка группы в штамма С148, продуцирующего в белок, в фаговом векторе замещения ЕМВЬ. ЗА.

2.Впервые проклонирован полноразмерный ген О белка без сигнальной последовательности в гетерологичной системе Е.соН с использованием экспрессионного вектора р1)С8 под промотором Р-галактозидазы.

3.Впервые проклонирован фрагмент гена в белка, ответственного за альбуминсвязывающую активность в гетерологичной системе Е.соН с использованием экспрессионного вектора риС8.

4.Вцервые получен отечественный и очищенный рекомбинанатный альбуминсвязывающий белок стрептококка группы в и изучены его связывающие свойства.

5.Впервые создан активный штамм-продуцент альбуминового рецепторного белка.

6.Впервые рекомбинантный альбуминовый рецепторный белок использован в качестве лиганда для аффинной хроматографии.

7.Впервые созданы диагностические тесгг-системы для количественного определения альбумина в биологических жидкостях человека на основе альбуминового рецепторного белка.

Теоретическая значимость.

Работа носит преимущественно теоретический характер. В ней показано создание библиотеки хромосомных генов стрептококка группы в, штамма С148, продуцирующего О белок, проведено клонирование гена в белка, обладающего и альбуминсвязывающими активностями,

проведено исследование с помощью клонирования в другую векторную систему, показывающее, что проклонирован ген без сигнальной последовательности, и что он имеет две функциональные активности за счет образовавшегося слитого с р-галактозидазой белка, обнаружены и исследованы клоны, продуцирующие разные функциональные активности, изучена связывающая способность альбуминового рецепторного белка с альбумином человека, что может помочь в выяснении биологической роли альбуминовой рецепции для деятельности стрептококков и в патологии.

Практическая значимость.

Проведенные исследования позволили создать штамм-продуцент альбуминового рецепторного белка, имеющего биотехнологическое и медицинское значение. Разработаны условия получения больших количеств белка, который может быть использован как лиганд в аффинной хроматографии. На основании использования альбуминсвязывающего белка созданы диагностические тест-системы, позволяющие проводить раннюю диагностику диабетической нефропатии, являющейся ведущей причиной высокой инвалидизации и смертности среди больных сахарным диабетом. На разработанные диагностические тест-системы и альбуминсвязывающий белок получены авторские свидетельства.

Положения, выносимые на защиту:

1 .Осуществлено клонирование фрагмента гена в белка стрептококка группы О, штамм С148, в плазмидном векторе р11С8, кодирующего альбуминсвязывающий белок.

s

2.Белок, кодируемый проклонированной частью гена G белка, выделен, очищен и охарактеризован.

3.Свойство альбуминового рецепторного белка связывать человеческий сывороточный альбумин нашло применение для создания тест-системы по определению концентрации альбумина в биологических жидкостях.

Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (ДНК-ДНК гибридизация, иммуноблотинг и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.

Апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Результаты диссертационного исследования были представлены и доложены на различных симпозиумах и конференциях: "Биотехнология С-Петербург-94", 1994; "Биотехнология-94", Пущино на Оке, 1994; "Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике", 1995; " III Международный конгресс Европейской ассоциации нефрологов",1996; "Международный симпозиум по новым методам в микробиологии",1996, Словакия; "XIII Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям", 1996, Париж.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста, включающие введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Работа проиллюстрирована 3 таблицами и 23 рисунками, указатель литературы содержит 122 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе был использован штамм стрептококка группы G -Streptococcus G 148, штамм Escherichia coli - JM 109, который был использован как бактериальный хозяин для плазмидных конструкций. Штаммы Escherichia coli - Q 358 и Q 359 использовались для клонирования в фаговом векторе EMBL За. Штаммы Escherichia coli ВНВ 2688 и ВНВ 2690 использовались для приготовления упаковочных экстрактов.

В качестве векторных плазмид использовались плазмиды pUC 8 и pSP 64.

Клетки Е. coli выращивали в LB среде [Collins M.L. and Hunsaker W.R.] в режиме встряхивания . Стрептококки группы G выращивались в среде Todd-Hewitt Broth (ТНВ, Difco, Laboratories, Detroit, USA).Bce бактериальные штаммы выращивались в условиях термостатирования при 37° С.

Трансформацию клеток E.coli JM109 плазмидной ДНК проводили по Dagert е.а.( 1979).

Упаковка фаговой ДНК in vitro проводилась по методу Hohn (1977). Клеточные экстракты для упаковки ДНК в головку фага объединялись заранее и хранились в жидком азоте. Упаковку фаговой ДНК проводили в течение 2 часов при 27° С, после чего проба высевалась на индикаторную культуру Е. coli.

Выделение ДНК из лямбдоидных бактериофагов проводилось в соответствии с методом для быстрого выделения небольших количеств ДНК бактериофага2,описанным Маниатис с соавт. (1984). Обычно фаговая ДНК очищалась в ступенчатом градиенте хлорида цезия. Плазмидная ДНК из клеток Е. coli, выделялась по методу Бирнбойма с соавт. (1979) ,а из стрептококков по методу Marmur (1961). Хромосомная ДНК для клонирования выделялась по методу, изложенному Маниатис ( 1984 ).После фенольной экстракции хромосомная ДНК стрептококков очищалась в градиенте хлорида цезия.

Рестрикция, цитирование и электрофорез ДНК проводились по Манниагас (1984). Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводился в соответствии с методом Laemmly (1970). Перенос белков после электрофоретического разделения из ПААГ на нитроцеллюлозные фильтры проводили по методу Kyhse-Andersen (1984).

Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с использованием препарата "QIAGEN" ( USA ), согласно прилагаемой инструкции. Нуклеотидная последовательность была определена после клонирования фрагментов ДНК с помощью ферментатаивного метода, описанного Sanger et.al.(1977). Гибридизацию ДНК проводили по Southern Е.(1975). Для всех гибридизационных процедур использовали набор " DNA Labeling and Detection Kit Nonradioactive" ( Boehringer Mannheim, Germany ). При этом ДНК зонд метили дигоксигенином, а участки ДНК-ДНК гибридизации выявляли при помощи шелочной фосфатазы в присутствии субстрата X -фосфата и красителя NBT.

Для иммуноблотинга бактериальных колоний нитроцеллюлозный фильтр с перенесенными на него колониями инкубировали в 0,1% SDS, 0,2М NaOH, 0,5% /?-меркаптоэтанола. Затем фильтр отмывали К-фосфатным буферным раствором рН = 7,2 и и инкубировали в растворе " блотто " , состоящего из одной части К-фосфатного буферного раствора рН = 7,2 и 2 частей обезжиренного 3% раствора молока, содержащего ДНКазу.Затем фильтр выдерживали 30 мин в растворе соответствующего конъюгата. Для разведения конъюгата использовали раствор "блотто".

Коньюгирование пероксидазы хрена с белками проводили перйодатным методом . Для приготовления аффинной колонки , активацию сефарозы проводили бромциановым методом. В активированную сефарозу добавляли белок, 10 мг белка на 1 мл геля.

Константу связывания альбуминового рецептора определяли по Friquet ( 1985). Способность альбуминового рецептора связывать человеческий сывороточный альбумин определяли методом ИФА в двух вариантах ( прямой и " сэндвич " ).

Основные результаты исследований и обсуждение

1.Клонирование части гена G белка, ответственного за связывание альбумина в фаговом и плазмидном векторах.

Банк хромосомных генов стрептококка группы G штамма Gl48, продуцирующего G белок, был сконструирован в векторе замещения бактериофага EMBL ЗА. Для анализа полученного банка генов был использован скрининг методом колоние-блотгинга (с использованием IgG, меченного пероксидазой хрена) позволяющий проводить идентификацию рекомбинантных фаговых клонов по экспрессируемому продукту. В результате такого скрининга был отобран фаговый клон, проявляющий наибольшую экспрессию IgG связывания. Из положительного клона была выделена ДНК, использованная затем в ряде последовательных этапов губклонирования для минимизации фрагмента гена G белка, отвечающего за связывание как IgG, так и ЧСА. Контроль активности связывания IgG и ЧСА проводился на каждом этапе клонирования. В результате был отобран ¡слон E.coli, продуцирующий белок, обладающий обеими связывающими активностями. Размер фрагмента гена G белка, кодирующего доуфункциональный белок, составил 1.5т.п.н.

Анализ структурной и рестрикционной карты G белка обнаружил, что гго вариант не кодировал сигнальную последовательность и хютветствующую промоторную область и согласно данных литературы кодировал белок, связывающий IgG, но не альбумин. Это указывает на :уществование регуляторных областей, включающих промотор и эибосомальные связывающие последовательности, функциональные в E.coli. Эдин такой возможный промотор по предположениям авторов локализован ла позициях 455-478 (Guss В. and Eliasson М.,1986), Последовательность ^огнесса -35 (ТТГАЦА ) идентична последовательности в E.coli, а юзможная последовательность Прибноу -10 (ТАГТАС) подобна юответстующей последовательности в E.coli (ТАТААТ). Положение обеих

последовательностей разделяется 17 нуклеотидными парами, что характерно для промоторов E.coli (16-18 п.н. ).

В нашем же случае 1.5 т.п.н. фрагмент кодировал G белок, связывающий как IgG, так и альбумин. Поэтому было выдвинуто предположение, что проклонированный нами фрагмент, кодирует слитый белок с р-галактозидазой. Для доказательства этого было проведено клонирование 1.5 т.п.н. фрагмента в плазмидный BeKTop-pSP64.

В результате этого этапа клонирования, благодаря свойствам выбранного вектора, та же самая в 1.5 т.п.н. вставка кодировала белок меньшего молекулярного веса, который связывал только IgG, и не связывал альбумин. Это явилось доказательством того, что полученный нами 65 kD белок, обладающий двумя функциональными активностями и кодируемый 1.5 т.п.н. вставкой без сигнальной последовательности .является слитым с р-галакгозидазой.

Состыковка с р-галактозидазой обычно приводит к повышению стабильности чужеродного белка в бактериальных клетках, поэтому во многих работах клонируемую ДНК соединяют в составе экспрессирующих векторов с фрагментом гена lac Z, содержащим промотор, участок связывания рибосом и триплеты нескольких первых аминокислот р-галактозидазы E.coli, которые задают рамку трансляции клонированной кодирующей последовательности. При совпадении рамок трансляции р-галактозидазы и клонированной ДНК в бактериальных клетках синтезируется целевой белок, но содержащий на N конце дополнительно несколько аминокислот р-галактозидазы. При этом иммунохимические свойства белка могут сохраняться, как и произошло в нашем случае.

Дальнейшая работа была посвящена субклонированию части гена G белка, ответственной только за связывание альбумина. В результате был проклонирован 0.64 т.п.н. фрагмент и кодируемый им белок связывал только альбумин (рис.1).

Рис.1 Схема клонирования фрагмента гена О белка, кодирующего альбуминовый рецептор.

2. Выделение и очистка альбуминсвязыванмцего рецепторного белка.В

ходе ряда экспериментов были подобраны условия для выделения альбуминового рецептора и проведена его очистка аффинной хроматографией. В связи с тем, что данный белок извлекался из E.coli при лизисе клеток детергентом в процессе кипячения, можно сделать вывод, что изучаемый белок секретируется из цитоплазмы клетки.

Для получения в клетках E.coli высокого уровня белкового продукта клонируемого чужеродного гена очень важна стабилизация этих белков в E.coli. Возникают случаи, когда белки подвергаются деградации клеточными ферментами-протеазами. Существует множество возможностей снизить действие этих протеаз, и одно из них правильный подбор условий куьтивирования созданного штамма. Нами были подобраны условия роста культуры для максимального выхода альбуминового рецептора с использованем ингибитора протеаз. Была изучена динамика роста культуры с параллельным определением экспрессии синтезируемого рецепторного белка. Оказалось, что наибольший выход белка наблюдается в начале стационарной фазы на 12 часу роста культуры.

В результате подбора условий культивирования мы добились выхода альбуминового рецептора 10-15 мг с одного литра культуральной жидкосги. Таким образом, нами был создан штамм-продуцент.

3. Характеристика альбуминового рецептора. Очищенный белок был проанализирован в SDS электрофорезе и Western blot. Установлено,что альбуминовый рецепторный белок обладает высокой степенью чистоты,гомогенен и имеет молекулярную массу 31kD. Препарат альбуминового рецепторного белка был исследован на способность связывать человеческий сывороточный альбумин(ЧСА) двумя методами ИФА. В первом из них препарат альбуминового рецепторного белка,иммобилизованный на твердой поверхности,служил для оценки количества связавшегося с ним меченного пероксидазой ЧСА. Во втором-на твердой фазе адсорбировали немеченный ЧСА,к нему из раствора

присоединялся альбуминовый рецепторный белок,который в свою очередь связывал из раствора меченный пероксидазой ЧСА. В результате анализа было установлено,что 1мг альбуминового рецептора может связывать до 10мг ЧСА. Для подтверждения того,что альбуминовый рецептор специфичен лишь в отношении ЧСА из сывороточных белков человека,была проанализирована сыворотка крови человека в SDS электрофорезе с последующим Western blot анализом. Результат анализа продемонстрировал,что альбуминовый рецепторный белок специфичен лишь в отношении альбумина человека. Других сывороточных белков альбуминовый рецептор не связывал.

Для прверки способности альбуминового рецепторного белка связывать как альбумин человека, так и альбумины различных млекопитающих был использован метод иммуноблотинга. Установлено,что альбуминовый рецептор эффективно связывал альбумин человека, мыши, крысы и морской свинки, слабо реагировал с альбумином лошади и совсем не связывал кроличий, бычий и яичный альбумин.

Для определения равновесной константы связывния альбуминового рецептора с ЧСА использовали метод Friquet. В качестве антитела служил альбуминовый рецептор,а в качестве антигена ЧСА. Расчет константы связывания призводили по методу Скэтчерда. Константа, связывания согласно данным составила 4.5x109М'. Изоэлектрическая точка была определена методом изоэлектрофокусирования и составила 5.8.

4. Использование альбуминового рецептора. Изучив свойства полученного альбуминсвязывающего белка, определив константу его связывания с ЧСА , показав высокое специфическое связывание его только с альбумином сыворотки человека и, убедившись в его уникальной стабильности, мы попытались использовать его как в качестве лиганда, так и для создания тест-систем. Для изучения способности альбуминового рецептора служить лигандом в аффинной хроматографии была приготовлена колонка с сефарозой, связанной с альбуминовым рецепторным белком. Полученные результаты доказали эффективность использования

рецептора в этом качестве. С помощью аффинной хроматографии был получен чистый препарат ЧСА, превосходящий по степени очистки выпускаемые коммерческие препараты (рис.2).

1 2 3 4 ' 5

Рис.2 SDS-PAGE, 1-коммерческий препарат ЧСА ( Serva ), 2- коммерческий препарат ЧСА ( Sigma ), 3,4,5 - препараты ЧСА, полученные аффинной хроматографией на колонке с иммобилизованным альбуминовым рецептором.

Как уже было отмечено в данной работе, проблема диагностики микроальбуминурии в повседневной клинической практике в нашей стране до настоящего времени не решена. Разработанные нами тест-системы на основе альбуминового рецептора апробированы с этой целью уже во многих клиниках Санкт-Петербурга. С помощью тест-систем поводится определение микроальбуминурии у больных сахарным диабетом в процессе лечения, что является необходимым условием контроля за течением заболевания. Данный метод позволил выявить микроальбуминурию у больных, у которых она не была выявлена при определении общего белка мочи существующими методами.

Все сказанное говорит в пользу высокой значимости проделанной работы по клонированию фрагмента гена, кодирующего альбуминсвязывающий белок, созданию штамма-продуцента, позволяющего

получать большие количества специфического белка, вполне перспективного и нашедшего применение в биотехнологии и в клинико-лабораторном деле.

Выводы

1. Сконструирована библиотека генов стрептококка группы G серотипа G148 штамма, продуцирующего G белок в лямбдоидном векторе EMBL -ЗА. Полученная библиотека проанализирована с использованием иммунологичесих методов. Обнаружены клоны, экспрессирующие как альбумин-, так и IgG-связывающую активность.

2. В плазмидном векторе pUC8 осуществлено клонирование гена двурецепторного белка G.

3. Путем клонирования фрагмента G белка в 1.5 т.п.н., кодирующего полноразмерный белок G в другой вектор, доказано, что полученный белок является слитым белком с р-галактозидазой.

4. Проведено субклонирование части гена G белка, ответственного только за альбуминсвязывающую активность в плазмидном векторе pUC8.

5. Создан высокоактивный штамм-продуцент альбуминового рецепторного белка.

6. Выделен, очищен и охарактеризован альбуминовый рецепторный белок.

7. Высокая аффинность альбуминового рецепторного белка позволила связать его с сорбентом и использовать в аффинной хроматографии.

8. Высокая специфичность альбуминового рецепторного белка позволила создать на его основе диагностические тест-систсмы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. T.V.Gupalova, T.V.Parchomenko, S.N.Orlova. Fluoriscent analysis of albumin from serum of patients after affinity chromotography with albumin receptor. Amsterdam, III Congress of EDTA Europien renal association, 1995.

2. T.V.Gupalova, S.N.Orlova, V.G. Palagnuk,A.A. Totolian. New methods of evaluation of microalbuminuria. Abstracts of International Symposium on the

Novel Methods and Standartisations in Microbiology, Kosice, Slovak Republic, 1996, p. 25.

3. S.N.Orlova, T.V.Gupalova, V.G. Palagnuk,A.A. Totolian. Usage of recombinant receptor proteins in clinical diagnostic. Abstracts of International Symposium on the Novel Methods and Standartisations in Microbiology, Kosice, Slovak Republic, 1996, p.25.

4.С.Н.Орлова,Т.В.Гупалова,В.Г.Палагнюк,А.А.Тотопян.

Создание рекомбинантного альбуминового рецептора и его использование в медицине. Тезисы докладов V конференции Российской Федерации " Новые направления биотехнологии ", Пущино - на- Оке, 1996, с. 116.

5. С.Н. Орлова, Т.В. Гупалова, В.Г. Палагшок, А.А. Тотолян. Определение микроальбуминурии с применением рекомбинантного альбуминсвязывающего рецептора стрептококка у больных сахарным диабетом. Нефрологический семинар. Сборник трудов IV ежегодного Санкт- Петербургского нефрологического семинара, 1996, с.270-271.

6. Т.В. Гупалова, С.Н. Орлова, А.А. Тотолян. Рекомбинантный HSA-рецептор стрептококка группы G . Патент на изобретение. № 2065746,1996.

7. С.Н. Орлова, Т.В. Гупалова, В.Г. Палагшок, А.А. Тотолян. Рецептор человеческого альбумина, клонирование, получение и характеристика очищенного препарата. Биотехнология, 1996, № 8, с. 13-21.

8. С.Н. Орлова, Т.В. Гупалова, В.Г. Палагшок, А.А. Тотолян. Определение микроальбуминурии с помощью стрептококкового альбуминового рецептора. Клиническая лабораторная диагностика, 1997, № 2, с. 14-18.

9. T.V.Gupalova, S.N.Orlova, А.А. Totolian. Albumin receptor of group G streptococcus : cloning, expression and characterisation. In: Advances inexperimental medicine and biology: Streptococci and the host, edited by Th.Horand et al., 1997,418,p.753-755.

10.S.N.Orlova, T.V.Gupalova, , A.A. Totolian. Streptococcal recombinant receptor as a Diagnostic Tool. In: Advancesinexperimental medicine and biology: Streptococci and the host, edited by Th.Horand et al.,1997,418,p.593-596.