Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение области связывания IgA на рекомбинантном белке Bac стрептококка группы B

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение области связывания IgA на рекомбинантном белке Bac стрептококка группы B"

На правах рукописи

~~5 ОД 2 5 ДЕН ?ПП1

УСТИНОВИЧ Ирина Анатольевна

ИЗУЧЕНИЕ ОБЛАСТИ СВЯЗЫВАНИЯ ^А НА РЕКОМБИНАНТНОМ БЕЛКЕ Вас СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ В

Специальность 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в отделе молекулярной микробиологии Научно исследовательского Института экспериментальной медицины Российской Акаде мии медицинских наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Суворов А.Н.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ценева Г. Я. доктор биологических наук, профессор Заикина H.A.

Ведущее учреждение: Военно-медицинская академия МО РФ.

Защита диссертации состоится ШгИО^р2000 г. в £ . часов на заседанш Диссертационного совета К084.63.01 по защите диссертаций на соискание учено! степени кандидата наук при Санкт-Петербургской Химико-фармацевтическо! Академии.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

3 А~ S

Автореферат разослан ?.'' 1

. ООО г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.В. Кириллова

ЕОМ Ц о

^¿ЛЯ-V

ВВЕДЕНИЕ

Патология, вызываемая стрептококками группы В, представляет важную медицинскую и социальную проблему во всех странах мира. Стрептококки группы В способны вызывать тяжелейшие септические заболевания у новорожденных детей и патологию беременности. Стрептококковая инфекция у новорожденных протекает быстро, иногда молниеносно, при этом летальность достигает 50-60% . Ребенок заражается при родах или еще антенатально от матери, в родовых путях которой содержится СГВ. Причиной заболеваний новорожденных становится но-сительство женщиной СГВ. Процент бессимптомного носительства достигает в разных странах от 30% до 50%, причем наиболее часто инфекция передается половым путем.

Кроме инфекций у детей СГВ вызывают серьезные заболевания у взрослых: пиелонефрит, артрит, эндокардит, мастит, септицемию, бронхопневмонию. Частой причиной самопроизвольного прерывания беременности также может являться инфекция СГВ. В последние годы накопились данные о способности СГВ вызывать серьезные инвазивные поражения различных органов и систем человека с 32% летальных исходов, в том числе токсические состояния и некротические фасциты.

Проблема стрептококковой патологии и детской смертности особенно остро стоит в нашей стране, где в связи с ухудшением экономической ситуации и снижением уровня жизни населения резко понизилась рождаемость. В ряде регионов страны смертность в 2-3 раза превосходит рождаемость.

Следовательно, изучение биологии и патогенных свойств стрептококков группы В актуально как с научной, так и с социальной и экономической точек зрения. В настоящее время накоплена значительная информация относительно типовой полисахаридной капсулы - основного фактора патогенности стрептококков группы В. Однако, кроме полисахаридов, СГВ продуцируют большую группу веществ белкового происхождения, таких как нуклеазы, протеазы, CAMP фактор, С5а пептидаза и др., роль которых в формировании вирулентности изучена недостаточно. В частности, на поверхности СГВ экспрессируется белок Вас, обладающий способностью связывать иммуноглобулин А человека через Fc часть молекулы. Роль этого белка в развитии инфекционного процесса, структурная организация белковой молекулы и особенности строения его гена изучены недостаточно. Однако, очевидно, что в местах колонизации СГВ (влагалище, прямая кишка), где IgA превалирует в пуле иммуноглобулинов, наличие белка, связывающего IgA, биологически оправдано. Уровень IgA на слизистых и в биологических жидкостях часто указывает на общее состояние иммунной системы, а его изменение свидетельствует о возникновении серьезных заболеваний, таких как IgA нефропатии, иммунодефициты, вирусные заболевания, включая ВИЧ-инфекции. Белок, способный связывать иммуноглобулин А человека, может быть использован для определения содержания IgA в биологических секретах, а значит, представляет интерес с практической точки зрения.

Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Целью работы явилось изучение рекомбинантного IgA рецепторного белка Вас СГВ. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Осуществить клонирование фрагмента гена IgA рецептора СГВ и получить рекомбинантный белок Вас, обладающий IgA рецепторной активностью.

2. Выделить и охарактеризовать рекомбинантный IgA рецепторный белок.

3. Установить область связывания IgA на молекуле белка Вас. Для этого предполагалось:

- проклонировать фрагмент ДНК, кодирующий аминокислотную последовательность MLKKIE, по предварительным исследованиям отвечающую за связывание IgA. Получить рекомбинантный белок, содержащий последовательность MLKKIE и проанализировать его на способность связывать иммуноглобулин А;

- осуществить сайт-специфический мутагенез области MLKKIE. Получить рекомбинантный белок с измененной областью MLKKIE и оценить его IgA связывающую способность.

4. Получить изогенные мутанты СГВ с нарушенной экспрессией гена IgA рецептора.

5. Оценить возможность использования рекомбинантного IgA рецепторного белка для определения иммуноглобулина А в биоптатах слизистой желудка и прямой кишки.

Научная новизна и теоретическая ценность работы.

1. Проклонирован фрагмент гена bac, кодирующий функционально активный IgA рецепторный белок. Получен и охарактеризован иммунохимическими и биохимическими методами рекомбинантный белок Вас, обладающий IgA рецепторной активностью.

2. Осуществлено клонирование фрагмента гена bac, ответственного за синтез аминокислотной последовательности MLKKIE. Полученный рекомбинантный белок обладает IgA рецепторной активностью и вызывает образование антител у кроликов.

4. Доказана значимость аминокислотной последовательности MLKKIE для проявления белком Вас функциональной IgA рецепторной активности.

5. Впервые были сконструированы изогенные мутанты СГВ с нарушенной экспрессией белка IgA рецептора.

6. Впервые рекомбинантный IgA рецепторный белок был использован для определения количества иммуноглобулина А в биоптатах слизистой желудка и прямой кишки.

Практическая ценность.

Проведенные исследования позволили сконструировать штамм, продуцирующий рекомбинантный IgA рецепторный белок, который может быть использован в клинико-лабораторной практике для определения количества иммуноглобулина А в биологических жидкостях. Полученные рекомбинантные белки, кодируемые фрагментами гена bac и не обладающие IgA рецепторной активностью, могут послужить компонентами для создания комплексных вакцин против СГВ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Проклонированная часть гена bac стрептококка группы В кодирует функционально активный IgA рецепторный белок.

2. Аминокислотная последовательность MLKKIE, присутствующая в белке Вас, действительно необходима для проявления белком IgA связывающих свойств.

3. Рекомбинантный IgA рецепторный белок может быть использован для определения концентрации иммуноглобулина А в биоптатах слизистых желудка и прямой кишки.

Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-генетических методов (полимеразная цепная реакция, ДНК - ДНК гибридизация, секвенирование ДНК) и иммунологических методов исследования (ELISA, Western-blott анализ и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные результаты.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 8 научных работах и доложены на б симпозиумах и конференциях: 4-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Санта Фе, США, в 1994 г.; Конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции "Биотехнология-94", Санкт-Петербург, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции памяти акад. А.А.Баева, Москва, Россия, в 1996 г.; Международном конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине, Флоренция, 1999 г., XIV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Новая Зеландия, 1999 г. Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1996, 1997, 1998, 1999 гг.).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 103 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, собственные исследования и их обсуждение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 4 таблицами и 22 рисунками, указатель литературы содержит 131 источник, в том числе 4 отечественных и 127 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы штаммы стрептококков группы В различных серологических типов, штаммы Escherichia coli JM 109 и М15. Для селекции штаммов, содержащих плазмиды, которые несут маркер антибиотикоустойчиво-сти к среде добавляли ампицилин (50-100 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) или эритромицин (1000 мкг/мл).

Стрептококки группы В выращивали в среде Todd-Hewitt Broth (ТНВ, Difco, USA). На основе этого бульона готовили 2,5% агаризованные среды. Для выявления гемолитических колоний к расплавленному агару добавляли свежую кровь

барана (5%). Мутанты СГВ выращивали на TUB с добавлением лошадиной сыворотки (10%), крови барана (5%) и эритромицина (5 мкг/мл).

В работе были использованы плазмиды pBluescript II SK +/-, pUC 18, p7EMR; плазмиды pQE-30, pQE-31, pQE-32 (QIAGEN, USA).

Метод блоттинга проводили следующим образом: мембрану с пробами помещали в раствор блотто (1 часть PBS и 2 части 3% молока) на 30 минут, затем мембрану помещали либо:

а) в раствор "блотто", содержащий IgA (Sigma, USA), а затем в раствор "блотто", содержащий антисыворотку к IgA (Sigma, USA), меченную щелочной фосфатазой (Sigma, USA). Для детекции связывания IgA отмытую в PBS мембрану помещали в раствор с субстратом для щелочной фосфатазы (5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат) в присутствии NBT.

б) в раствор "блотто", содержащий соответствующий коньюгат, меченный перок-сидазой хрена. Для детекции связывания IgA отмытую в PBS мембрану помещали в раствор, содержащий 3 г/л пара-фенилендиамина и 0.15% Н2 02.

В колоний блотте, с целью вскрытия клеток, нитроцеллюлозный фильтр с перенесенными на него колониями инкубировали в 0.1% SDS и 0,2nNaOH.

Для выделения хромосомной ДНК клетки СГВ лизировали добавлением 50 мМ ЭДТА, лизоцима в концентрации 1 мг/мл, SDS до 1 %. Депротеинизацию ДНК проводили протеиназой К (0,5 мг/мл). ДНК обрабатывали фенолом и хлороформом, а затем осаждали этанолом. Выделение плазмидной ДНК проводили по Bimboim Н.С. (1979).

ДНК фрагменты и амплификаты выделяли из агарозного геля согласно протоколу QIAGEN (USA). Рестрикцию, лигирование и электрофорез ДНК проводили по Маниатис Т. с соавт., (1984).

Трансформацию клеток E.coli проводили по Darget (1979). Электропорацию СГВ проводили на приборе Gene Pulser (Bio-Rad, USA).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на термоциклере Perkin -Elmer Cetus (USA) с использованием ДНК полимеразы (Ampli Tag, Perkin - Elmer Cetus) согласно протоколу фирмы.

Гибридизацию с диоксигениновым зондом проводили в соответствии с протоколом фирмы "Boehringer Mannheim" набора "DNA Labeling and Detection Kit Nonradioactive".

Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили по методу Sanger F. et al. (1977), при использовании набора фирмы USB (США).

Выделение рекомбинантных белков из клеток E.coli проводили разрушением ультразвуком три раза по 15 секунд в ультразвуковом дезинтеграторе MSE (Англия).

В культурах штаммов, содержащих рекомбинантные белки активность связывания с IgA определяли двумя методами, методом блоттинга и количественно -методами ИФА (двухслойным методом и методом конкурентного сязывания).

Электрофоретическое разделение белковых молекул проводили по Laemmli (1970). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводили по Towbin H. et. al. (1979). Определение белка в растворах осуществляли по Лоури (1982).

Очистку рекомбинантньгх белков проводили аффинной хроматографией на колонке с сефарозой, иммобилизованной IgA, либо на колонке с Ni-NTA агаро-зой (QIAGEN, США).

Коньюгирование пероксидазы хрена с белками проводили перйодатным методом согласно Фриммелю (1987).

Иммунная сыворотка кроликов была получена при иммунизации хромато-графнчески очищенным рекомбинантным белком из штамма E.coli М15 рЮ по схеме Poirier (1985).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

■-ЧИ '

Клонирование фрагментов гена IgA рецептора.

С целью клонирования фрагмента гена IgA рецептора (гена bac) 15 штаммов различных серотипов СГВ были проанализированы на способность связывать человеческий IgA. Для дальнейшей работы был выбран штамм 219/4849 с наибольшей IgA связывающей активностью. ДНК этого штамма послужила матрицей в полимеразной цепной реакции (ПЦР), праймеры Р5 и Р6 были сконструированы на область гена bac, ответственную за синтез функционального IgA рецепторного белка. В результате амплификации был получен фрагмент ДНК размером 1500 н.п. (Рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма амплификации фрагмента bac гена 1.5 т.н.п.:

1. Продукт ПЦР с праймерамл Р5 и Р6 на матрице ДНК штамма 2 Î 9/4849.

2. Маркер, ДНК фага дикого типа, гидролизованная рестриктазами HindlII и EcoRI.

Этот фрагмент ДНК был проклонирован в плазмидный вектор pBluescript II SK +/- и получен штамм E.coli, обладающий IgA рецепторнной активностью.

1г 1-iSL

Размер вставки в плазмиде оказался в два раза больше, чем ожидался - 3000 н.п., вследствие того, что при лигировании встроился удвоенный амплификационный фрагмент. Рекомбинантная плазмида была обозначена как р20.

Для того, чтобы ограничить рамки области проклонированного фрагмента гена bac, необходимой для синтеза функционально активного IgA рецепторного белка было предпринято субклонирование фрагментов р20, рестрицированной по EcoRl и BglII сайтам. В результате был получен клон, обладающий IgA активностью, содержащий рекомбинантную плазмиду р4.2 со вставкой размером 1500 н.п. (Рис. 2). Молекулярный вес рекомбинантного белка, кодируемого данной плазмидой, оказался равным 35 kD. В Western-blott анализе белок проявил IgA рецепторную активность. Штамм E.coli JM 109 р4.2 был использован в дальнейшем как продуцент белка IgA рецептора.

bat

lkb

2kb

Р5

1500 н.п.

Р6

500 н.п.

700 н.п.

Р1 _245н.п.рЗ Р4 338 н.п. р2

Р1 12зн-пР2

MLKKIE ITNEDKDSMLKKIEDINRQA

Плазмиды р4.2

рн

рХ рЮ р2 р123

Функциональная

активность рекомбинантного белка

+

35 kD

+ 14 kD 20 kD

О

Рис. 2. Клонирование фрагментов гена bac, кодирующих область связывания IgA.

Проведенный рестрикционный анализ рекомбинантной плазмиды р4.2 показал, что ферментом HindIII вырезается фрагмент ДНК размером 500 н.п., а при рестрикции ферментом Xbal - фрагмент размером 700 н.п.. Эти фрагменты были переклонированы в плазмидный вектор pUC18, однако в рекомбинантных штаммах IgA рецепторной активности не было обнаружено. Плазмида, содержащая вставку размером 700 н.п., была названа рХ (Рис. 2). Данная плазмида была просеквени-рована. В результате анализа нуклеотидной последовательности обнаружилось 99% гомологии с представленной в литературных данных нуклеотидной последовательностью гена bac (Jerlstrom P.J., et. al., 1991), что подтвердило принадлежность данного участка ДНК гену bac и точность выполненной процедуры клонирования.

Таким образом, в результате клонирования различных фрагментов гена bac минимальный размер последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантный функционально активный IgA рецепторный белок с молекулярным весом 35 kD, оказался равен 1500 н.п. В работе Jerlstrom с соавт. (1997 г.), была определена область, состоящая из шести аминокислот MLKKIE, которая, по мнению авторов, является значимой для проявления Вас белком функциональной активности. Однако, в этой работе не было приведено прямых доказательств роли последовательности MLKKIE в связывании IgA.

Определение роли последовательности MLKKIE белка Вас в проявлении им IgA рецепторной активности.

С целью выяснения значения последовательности MLKKIE, а также с целью локализации центра связывания IgA на молекуле белка Вас были прокло-нированы два фрагмента гена bac: один, содержащий участок ДНК, ответственный за синтез последовательности MLKKIE, другой, где участок кодирующий MLKKIE модифицирован. Рекомбинантные белки, полученные в результате клонирования, были проанализированы на способность связывать IgA.

На основании сведений о нуклеотидной последовательности гена bac были сконструированы прямой и обратный праймеры Р1 и РЗ, фланкирующие участок гена bac, в центре которого локализована область, кодирующая MLKKIE. В праймеры были заложены сайты узнавания рестриктазы HindIII. С помощью ПЦР, используя праймеры Р1 и РЗ, на матрице ДНК штамма 219/4849 был ампли-фицирован фрагмент ДНК размером 245 н.п. (Рис. 2). Для клонирования этого фрагмента был использован набор векторов: pQE 30, pQE31, pQE32 (QIAGEN, USA). Эта векторная система имеет ряд преимуществ. Во-первых, она позволяет встроить фрагмент ДНК таким образом, чтобы сохранилась рамка трансляции встроенного гена. Используя набор из этих трех векторов, можно поместить клонируемую последовательность во все три возможные фазы трансляции. В одном из этих трех вариантов обязательно должен синтезироваться интактный рекомбинантный белок. Во-вторых, в плазмидах pQE полилинкеру предшествует область, кодирующая полипептид из шести гистидинов, вследствие этого синтезируется

г*

целевой рекомбинантный белок ковалентно связанный на своем N-конце с шестью гистидиновыми остатками. Слитые рекомбинантные белки можно очищать на Ni-NTA агарозе за счет сильного аффинного взаимодействия между Ni-NTA смолой и полипептидом из шести гистидинов. При этом можно получить высокую степень очистки белка, где примеси будут составлять лишь 1%. В-третьих, ситема векторов pQE содержит промотор для индуцибельной экспрессии реком-бинантного белка.

Векторы pQE30, pQE31, pQE32 и амплифицированный фрагмент размером в 245 н.п. были рестрицированы ферментом Hindlll и лигированы. Затем следовала кальциевая трансформация культуры E.coli Ml 5 и высев клеток на среду, содержащую ампициллин и канамицин. В каждом из трех вариантов с pQE30, с pQE31 и с pQE32 были получены рекомбинантные плазмиды со вставкой 245 н.п.. Используя метод ПЦР, были выбраны лишь те клоны, где вставка ориентирована в направлении от 5' к 3' концу. Затем клоны, содержащие pQE30, pQE31 и pQE32 с правильно ориентированной вставкой, были исследованы на способность экс-прессировать слитый рекомбинантный белок. С этой целью лизаты анализируемых клонов инкубировали с Ni-NTA агарозой, а элюаты анализировали в SDS-PAGE. Оказлось, что рекомбинантный белок синтезируется в случае с pQE32, содержащей вставку размером 245 н.п.. Плазмида была названа р10 (Рис. 2), а штамм, содержащий данную плазмиду E.coli М15 р10. Анализ белка в SDS-PAGE показал, что молекулярный вес слитого белка равен 14 kD (Рис. 3). В Western-blott анализе белок проявил IgA рецепторную активность. Данный белок оказался иммуногенным. Белком из штамма E.coli М15 р10, очищенным на колонке с Ni-NTA агарозой, были иммунизированы кролики с целью получения антисыворотки. С данной антисывороткой были проанализированы в иммуноблотте НС1-экстракт СГВ, содержащий Вас белок, и рекомбинантный белок, к которому была получена антисыворотка. Оказалось, что взаимодействие антисыворотки с реком-бинантным белком выражено сильнее чем с белком Вас, содержащемся в НС1-экстракте.

Для получения рекомбинантного IgA рецепторного белка СГВ, в котором нарушена MLKKIE структура был проклонирован фрагмент гена bac с нуклео-тидными заменами в области, кодирующей MLKKIE. С этой целью был сконструирован обратный праймер Р2, гомологичный области, кодирующей MLKKIE. В праймер был заложен сайт узнавания рестриктазы EcoRI. Произведенные нуклео-тидные замены нарушили последовательность, кодирующую MLKKIE. Аминокислота Lys была замещена аминокислотой Arg, а аминокислота Glu аминокислотой Gin. При этом последовательность MLKKIE модифицировалась в последовательность MLKRIQ. Прямым праймером был Р4, сконструированный на область нуклеотидной последовательности гена bac, находящуюся на расстоянии 550 н.п. от Р2. В качестве матрицы в ПЦР использовалась хромосомная ДНК штамма СГВ 219/4849. Размер амплифицированного фрагмента составил, как и ожидалось, 550 н.п. В праймер Р5 не был заложен сайт рестрикции, что затрудняло клонирование. Поэтому амплифицированный фрагмент был рестрицирован ферментами EcoRI и Dral, проклонирован в плазмидный веггор pBluescript II SK+/-. Затем фрагмент

размером 338 н.п. был переклонирован в векторную систему рС>Е по сайтам рестрикции Крп1 и ВашН1. Наличие вставки в р(}Е30, в рС>Е31 и в р(}Е32 было подтверждено амплификацией с использованием праймеров Р1 и Р2.

12 3 4

Рис. 3. SDS-PAGE полипептидов, выделенных из штаммов Е. coli, содержащих различные участки гена bac.

1. Рекомбинантный белок, выделенный из штамма JM109 р4.2.

2. Маркер молекулярных масс.

3. Рекомбинантный белок, выделенный из штамма М15 р2.

4. Рекомбинантный белок, выделенный из штамма М15 р10.

При анализе клонов на предмет синтеза рекомбинатного белка было выявлено, что белок синтезировался в клонах, содержащих рекомбинантную pQE30. Рекомбинантная плазмида со вставкой 338 н.п. была названа р2 (Рис. 2), а штамм, содержащий данную плазмиду, E.coli Ml5 р2. SDS-PAGE анализ рекомбинантно-го белка показал, что его молекулярный вес равен 20 kD (Рнс. 3). В Western-blott анализе белок с измененной последовательностью MLKKIE не проявил IgA ре-цепторной активности.

Был сконструирован синтетический олигопептид из 20 аминокислот, содержащий MLKKIE последовательность. Пептид был проанализирован в иммуноб-лоттинге и в ИФА на способность связывать IgA, однако IgA рецепторных свойств он не проявил. Этот факт указывает на то, что для проявления функциональной активности необходима определенная конформация белковой молекулы IgA рецептора, которая в данном случае отсутствовала.

Анализируя результаты по клонированию различных фрагментов bac гена, и изучая IgA рецепторные свойства рекомбикантных белков, кодируемых этими фрагментами, можно сделать вывод, что наличие MLKKIE структуры в IgA рецепторном белке является необходимым условием для проявления его IgA связывающей активности. Нарушения MLKKIE структуры приводят к утрате функ-» циональной активности белка.

Выделение, очистка и характеристика рекомбинантных полипептидов, являющихся фрагментами белка Вас.

В результате клонирования фрагментов гена IgA рецептора были созданы различные рекомбинантные плазмиды, две из которых кодировали функционально активный IgA рецепторный белок. Плазмида р4.2 содержала вставку размером 1500 н.п., кодирующую белок со стабильной IgA рецепторной активностью. Плазмида р10 содержала вставку размером 245 н.п. Рекомбинантный белок, экс-прессируемый штаммом E.coli Ml 5 р10, синтезировался ковалентно связанным с полипептидом из 6 гистидиновых остатков. Наличие этого полипептида позволяет легко очищать слитый белок на Ni-NTA агарозе. Однако IgA рецепторная активность белка была нестабильна, вследствие чего штамм E.coli М15 р10 не мог быть использован как продуцент белка IgA рецептора. Поэтому, для получения ре-комбинантного белка с целью изучения его IgA рецепторных свойств и возможностей практического использования, был выбран штамм, содержащий р4.2.

С целью выделения максимального количества IgA рецепторного белка были апробированы различные методы вскрытия клеток, такие как лизис кипячением, кипячением в присутствии 2% SDS, лизис ультразвуком, щелочью, лизис ли-зоцимом с последующим осмотическим шоком. Наибольший выход функционально активного IgA рецепторного белка наблюдался при разрушении клеток ультразвуком и кипячением с 2% SDS. Эти два метода вскрытия клеток были выбраны для дальнейшей работы.

Культуру штамма E.coli JM109 р4.2 выращивали, лизировали ультразвуком и очищали белок аффинной хроматографией на IgA сефарозе. SDS-PAGE белка, очищенного на IgA сефарозе показал одну полосу белка с молекулярным весом 35 kD (Рис. 3). Выход белка составил 1мг с одного литра культуры. Была определена константа связывния IgA рецепторного белка с сывороточным IgA. Она оказалась равной 3,7х108М"'.

Препарат очищенного IgA рецепторного белка штамма E.coli JM109 р4.2, белок, выделенный из штамма E.coli М15 р2 с измененной MLKKIE структурой, а также синтетический полипептид из 20 а.к., содержащий MLKKIE последовательность, были проанализированы на способность связываться с сывороточным IgA человека иммуноферментными методами: двухслойным (сэндвич) методом и методом конкурентного связывания. При анализе двухслойным методом исследуемые белки были иммобилизованы на твердой фазе, затем наносились различные концентрации IgA, выявлялось взаимодействие IgA рецепторного белка с IgA при помощи анти-IgA, меченной пероксидазой. Методом конкурентного связыва-

ния определялась способность белков, находящихся в свободном состоянии, связывать IgA. На твердую поверхность полистиролового планшета иммобилизовали IgA, а анализируемый рецепторный белок инкубировали одновременно с анти-IgA, меченой пероксидазой. Таким образом, анти-IgA и рецепторный белок конкурировали за иммуноглобулин А, иммобилизованный на твердой фазе. Ферментативная активность твердой фазы, то есть комплексов иммобилизованного IgA с коньюгатом, обратно пропорциональна концентрации рецепторного белка. В результате было продемонстрировано, что только белок, выделенный из штамма E.coli JM109 р.4.2, обладает IgA связывающей способностью, тогда как синтетический полипептид и белок, в котором нарушена MLKKIE, последовательность не связывают IgA. Эти данные согласуются с уже описанными результатами по связыванию IgA анализируемыми рекомбинантными белками в Western blott анализе и в иммунноблоттинге.

Создание интеграционных мутантов СГВ по гену IgA рецептора.

Вызывает интерес значение IgA рецепторного белка в формировании вирулентности СГВ. Создание штаммов СГВ, в которых отсутствовала бы IgA ре-цепторная активность, позволило бы внести ясность в этот вопрос. С этой целью в штамм СГВ, экспрессирующий функционально активный IgA рецепторный белок, вводится плазмидный вектор, содержащий часть гена IgA рецептора. Необходимо, чтобы вектор являлся суицидным, то есть был не способен к автономной репликации. Встраивание всей плазмидной ДНК в хромосому происходит в результате гомологичной рекомбинации в области гомологии плазмидной и хромосомной ДНК, то есть в области гена IgA рецептора, что приводит к нарушению структуры гена и прекращению выработки его белкового продукта. В качестве плазмидного вектора была использована p7EMR. Этот вектор является суицидным и имеет селективный маркер устойчивости к эритромицину. В эту плазмиду по Xbal сайтам из плазмиды рХ был переклонирован фрагмент гена IgA рецептора размером 700 н.п. Наличие вставки в плазмиде было подтверждено методом Southern гибридизации с дигоксигениновым зондом bac ген. Плазмиду p7EMR, содержащую фрагмент bac гена размером 700 н.п. использовали для трансформации штамма СГВ 219/4849. Введение плазмиды в СГВ осуществлялось методом электропорации. Суть данного подхода состоит в том, что кратковременное воздействие электрического поля высокой напряженности на клеточную мембрану приводит к образованию в ней пор, время существования и размер которых достаточны, чтобы макромолекулы ДНК могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При высеве трансформантов на селективную среду, в данном случае на среду, содержащую эритромицин, выживали лишь те клетки, в которых произошло встраивание рекомбинантной p7EMR в хромосому. В результате было отобрано два мутантных клона, которые затем были проанализированы на способность связывать IgA методом колоний блоттинга. Оказалось, что ни один из клонов не обладает IgA рецепторной активностью. Полученные результаты указывают на то, что при встраивании рекомбинантной плазмиды в хромосомную

ДНК по зонам гомологии произошло нарушение последовательности bac гена в области, необходимой для синтеза функционально активного белка IgA рецептора.

Определение иммуноглобулина А в биоптатах, полученных от люден с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).

Создав штамм, продуцирующий белок, который специфически связывает иммуноглобулин А человека, была исследована возможность использования этого белка для определения уровня содержания ^А в биоптатах, полученных от людей с заболеваниями ЖКТ. Секреторный ^А является основным иммуноглобулином, присутствующим в серозно-слизистых секретах человека. Известно, что большинство чужеродных антигенов, включая токсины и болезнетворные бактерии, поступают в организм через ЖКТ. В ЖКТ, в пейеровых бляшках, в норме синтезируется большое количество секреторного IgA, выполняющего функции иммунного барьера. Уровень секреции 1§А варьирует в зависимости от состояния организма и характера патологии. Однако, точная количественная характеристика этого уровня затруднена. В настоящем исследовании биоптаты, полученные от людей заболеваниями ЖКТ, были проанализированы на содержание в них иммуноглобулина А с использоваием ^А рецепторного белка двухслойным (сэндвич) методом.

Принцип метода заключался в следующем: на твердую поверхность полистиролового планшета иммобилизовали препарат хроматографически очищенного рекомбинантного белка IgA рецептора, затем наносили пробы образцов биоптатов в разведении и контрольный ряд разведений иммуноглобулина А, инкубировали 1 час при 37°С, для детекции во все лунки вносили анти-^А, меченную перокси-дазой. Для контрольного разведения строили калибровочную кривую, по которой определяли количество 1£А в исследуемых образцах.

Очищенный, рекомбинантный 1§А рецепторный белок обладает строгой специфичностью в отношении иммуноглобулина А. Это обуславливает высокую чувствительность метода и позволяет определять количество 1§А в биоптатах как в пределах нормы, так и осуществлять мониторинг количества ^А в биоптатах людей с заблеваниями ЖКТ в процессе лечения.

15

ВЫВОДЫ

1. Осуществлено клонирование в гетерологичной системе E.coli фрагмента гена IgA рецептора (гена bac) стрептококка группы В, кодирующего область связывания IgA. Получен и охарактеризован хроматографически очищенный рекомби-нантный белок IgA рецептора стрептококка группы В.

2. Осуществлено клонироваиние в векторную систему pQE фрагмента гена IgA рецептора, ответственного за синтез белка, содержащего последовательность MLKKIE. Выделен рекомбинантный белок, содержащий область MLKKIE и обладающий IgA рецепторной активностью. Получена антисыворотка к этому белку.

3. Доказано участие области MLKKIE белка Вас в связывании иммуноглобулина А.

4. Получены интеграционные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена IgA рецептора, актуальные для более полного изучения роли IgA рецепторного белка в формировании вирулентного фенотипа микроба.

5. Показана возможность использования рекомбинантного IgA рецепторного белка для анализа содержания иммуноглобулина А в биоптатах людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта и мониторинга количества IgA в процессе лечения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.Suvorov, I.Savelieva, A.Dmitriev, T.Gupalova, and A.Totolian. IgA receptor genes in group В Streptococci. Abstracts of 4th International Conference on Streptococcal Genetics, Santa Fe, New Mexico, USA, 1994, P. 33.

2. Т.В.Гупалова, А.Н.Суворов, И.А.Устинович, С.Н.Орлова, А.В.Дмитриев, А.А.Тотолян. Биотехнологические подходы к созданию рецепторов различных классов иммуноглобулинов. Тезисы докладов VI конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии", Пущино-на-Оке, 1994, С. 38.

3. T.V.Gupalova, A.N.Suvorov, I.A.Ustinovich, S.N.Orlova, A.V.Dmitriev, A.S.Andreev, A.A.Totolian. Biotechnological approaches to developing receptors for the different classes of immunoglobulins. Abstracts of International Conference "Biotechnology, St.Petersburg'94", St.Petersburg, 1994, P. 39-40.

4. А.В.Дмитриев, А.Н.Суворов, И.А.Устинович, А.А.Тотолян. Молекулярно-эпидемиологический анализ генов альфа и бета антигенов патогенных стрептококков группы В. Тезисы Международной Конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева. 1996, С. 80.

5. A.N.Suvorov, A.V.Dmitriev, I.A.Ustinovich, C.Schalen, A.A.Totolian. Molecular analysis of clinical group B streptococcal strains by use of alpha and beta gene probes. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1997, 17, P. 149-154.

6. Ustinovitch I., Vlasov G., Totolian A.A., Suvorov A.N.. Cloning and expression of the group B streptococcal IgA binding domain in the E.coli. Abst. of XIV LISSSD, Auclkland, New Zealand, 1999, PI0.18.

7. Ustinovitch I., Vlasov G., Totolian A.A., Suvorov A.N. Cloning of the gene of IgA receptor and it expression in E.coli. 17 International and 13 European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 1 International Congress of Clinical Molecular Biology, Firenze, Italy, 1999, Ml46, P. 153.

8. Ustinovitch I., Vlasov G., Totolian A.A., Suvorov A.N.. Cloning and expression of gene fragment IgA binding protein of group B streptococci. Folia Microbiologica, 1999,44, 6, P. 726-728.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Устинович, Ирина Анатольевна

Список сокращений и условных обозначений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие сведения о стрептококках

2.2. Факторы патогенности стрептококков группы В

2.3. Иммуноглобулин А: структура и функции

2.4. Иммунная система желудочно-кишечного тракта

2.5. Стрептококковые Fc- рецепторы, реагирующие с иммуноглобулином

А человека

2.5.1. IgA-рецепторы стрептококков группы А и S.pneumoniae

2.5.2. IgA-рецепторы стрептококков группы В

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Бактерии и плазмиды, культуральные среды и условия роста

3.2. Иммуноблоттнг бактриальных колоний (колоний блотт)

3.3. Выделение плазмидной ДНК

3.4. Выделение хромосомной ДНК

3.5. Рестрикция и лигирование ДНК

3.6. Полимеразная ценая ркакция (ПЦР)

3.7. Трансформация Escherichia coli

3.8. Электрофорез ДНК

3.9. Элюция фрагментов ДНК из агарозных гелей

3.10. Гибридизационный анализ ДНК

3.11. Секвенирование ДНК

3.12. Электропорация стрептококков группы В

3.13. Методы лизиса клеток E.coli для выделения рекомбинантных белков

3.14. Выделение и очистка рекомбинантных белков

3.14.1. Выделение и очистка рекомбинантного IgA-связывающего белка из штамма

E.coli JM 109 р4.

3.14.2. Выделение и очистка рекомбинантного белка из штамма E.coli М15 р

3.15. Электрофорез белков

3.16. Электроперенос белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу

3.17. Определение количества белка

3.18. Определение способности рекомбинантного рецептороного белка связывать человеческий IgA методами ИФА

3.18.1. Двухслойный (сэндвич) метод

3.18.2. Метод конкурентного связывания

3.19. Определение константы связывания

3.20. Определение молекулярного веса рекомбинантных белков

3.21. Приготовление аффинных колонок

3.22. Иммунизация животных, получение антисывороток

3.23. Определение концентрации иммуноглобулина А в биоптатах методом блоттинга

3.24. Определение концентрации иммуноглобулина А в биоптатах двухслойным (сэндвич) методом

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48 4.1. Анализ штаммов стрептококков группы В на присутствие

IgA-рецепторной активности

4.2. Клонирование фрагмента bac гена IgA-рецептора СГВ штамма 219/4849 и анализ клонов на способность экспрессировать рекомбинантный, функционально активный белок

4.3. Субклонирование фрагмента ДНК, содержащего ген bac и анализ экспрессии белка

4.3.1. Субклонирование фрагмента ДНК, содержащего ген IgA-рецептора

4.3.2. Клонирование фрагментов гена bac размером 500 н.п. и 700 н.п

4.4. Определение значения MLKKIE области для IgA-рецепторного белка

4.4.1. Клонирование фрагмента bac гена, ответственного за синтез

MLKKIE области

4.4.2. Получение и очистка рекомбинантного белка, содержащего

MLKKIE область, анализ антисыворотки к этому белку

4.4.3. Клонирование фрагментов гена bac, в которых нарушена последовательность, кодирующая MLKKIE и анализ рекомбинантных белков

4.5. Выделение IgA-рецепторного белка

4.6. Очистка IgA-рецепторного белка

4.7. Характеристика способности полученных рекомбинантных белков связывать IgA методами ИФА

4.8. Определение константы связывания IgA-рецепторного белка

4.9. Создание интеграционных мутантов СГВ по гену IgA-рецептора

4.10. Определение иммуноглобулина А в биоптатах, полученных людей с заболеваниями ЖКТ

4.10.1. Определение А в биоптатах методом блоттинга

4.10.2. Определение концентрации ^А в биоптатах двухслойным методом

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение области связывания IgA на рекомбинантном белке Bac стрептококка группы B"

Инфекции, вызванные стрептококками группы В, являются важной медицинской и социальной проблемой во всех странах мира. Стрептококки группы В способны вызывать тяжелейшие септические заболевания у новорожденных детей. Стрептококковая инфекция у новорожденных протекает быстро, иногда молниеносно. Летальность достигает 50-60%. Ребенок заражается в родах или еще антенатально от матери, в родовых путях которой содержится СГВ. Причиной заболеваний новорожденных становится носительство женщиной СГВ. Процент бессимптомного носительства достигает в разных странах от 30% до 50%, причем наиболее часто инфекция передается половым путем.

Кроме инфекций у детей СГВ вызывают серьезные заболевания у взрослых: пиелонефрит, артрит, эндокардит, мастит, септицемию, бронхопневмонию. Частой причиной самопроизвольного прерывания беременности также может являться инфекция СГВ. В последние годы накопились данные о способности СГВ вызывать серьезные инвазивные поражения различных органов и систем человека с 32% летальных исходов, в том числе токсические состояния и некротические фасциты.

Проблема стрептококковой патологии и детской смертности особенно остро стоит в нашей стране, где в связи с ухудшением экономической ситуации и снижением уровня жизни населения резко понизилась рождаемость. В ряде регионов страны смертность в 2-3 раза превосходит рождаемость.

Следовательно, изучение биологии и патогенных свойств стрептококков группы В актуально как с научной, так с социальной и экономической точек зрения. В настоящее время накоплена значительная информация относительно полисахаридной капсулы - основного фактора патогенности стрептококков группы В. Однако, кроме полисахаридов, СГВ продуцируют большую группу веществ белкового происхождения, таких как нуклеазы, протеазы, CAMP фактор, С5а пептидаза и др., роль которых в формировании вирулентности изучена недостаточно. В частности, на поверхности СГВ экспрессируется белок Вас, обладающий способностью связывать иммуноглобулин А человека через Fc часть молекулы. Роль этого белка в развитии инфекционного процесса, структурная организация белковой молекулы и особенности строения гена мало изучены. Однако очевидно, что в местах колонизации СГВ (влагалище, прямая кишка), где IgA превалирует в пуле иммуноглобулинов, наличие белка, связывающего IgA, биологически оправдано. Уровень IgA на слизистых и в биологических жидкостях часто указывает на общее состояние иммунной системы, а его изменение свидетельствует о возникновении серьезных заболеваний, таких как IgA нефропатии, иммунодефициты, вирусные заболевания, включая ВИЧ-инфекции. Белок, способный связывать иммуноглобулин А человека, может быть использован для определения содержания IgA в биологических секретах, а значит, представляет интерес с практической точки зрения.

Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Целью работы явилось изучение рекомбинантного IgA-рецепторного белка Вас СГВ. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Осуществить клонирование фрагмента гена IgA-рецептора СГВ и получить рекомбинантный белок Вас, обладающий IgA-рецепторной активностью.

2. Выделить и охарактеризовать рекомбинантный IgA-рецепторный белок.

3. Установить область связывания IgA на молекуле белка Вас. Для этого предполагается:

- проклонировать фрагмент ДНК, кодирующий аминокислотную последовательность MLKKIE, по предварительным исследованиям отвечающую за связывание IgA. Получить рекомбинантный белок, содержащий последовательность MLKKIE и проанализировать его на способность связывать иммуноглобулин А. осуществить сайт-специфический мутагенез области MLKKIE. Получить рекомбинантный белок с измененной областью MLKKIE и оценить его IgA связывающую способность.

4. Получить изогенные мутанты СГВ с нарушенной экспрессией гена IgA-рецептора.

5. Оценить возможность использования рекомбинантного IgA-рецепторного белка для определения иммуноглобулина А в биоптатах слизистой желудка и прямой кишки.

Научная новизна и теоретическая ценность работы.

1. Проклонирован фрагмент гена bac, кодирующий функционально активный IgA-рецепторный белок. Получен и охарактеризован иммунохимическими и биохимическими методами рекомбинантный белок Вас, обладающий IgA-рецепторной активностью.

2. Осуществлено клонирование фрагмента гена bac, ответственного за синтез аминокислотной последовательности MLKKIE. Полученный рекомбинантный белок обладает IgA-рецепторной активностью и вызывает образование антител у кроликов.

3. Путем создания генно-инженерных конструкций доказана значимость MLKKIE последовательности для проявления белком Вас функциональной IgA-рецепторной активности.

4. Впервые были сконструированы изогенные мутанты СГВ с нарушенной экспрессией белка IgA-рецептора.

5. Впервые рекомбинантный IgA-рецепторный белок был использован для определения количества иммуноглобулина А в биоптатах слизистой желудка и прямой кишки.

Практическая ценность.

Проведенные исследования позволили сконструировать штамм, продуцирующий рекомбинантный IgA-рецепторный белок, который может быть использован в клинико-лабораторной практике для определения количества иммуноглобулина А в биологических жидкостях. Полученные рекомбинанатные белки, кодируемые фрагментами гена bac и не обладающие IgA-рецепторной активностью, могут послужить основой для создания комплексных вакцин против СГВ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Проклонированная часть гена bac стрептококка группы В кодирует функционально активный IgA-рецепторный белок.

2. Аминокислотная последовательность MLKKIE, присутствующая в белке Вас действительно необходима для проявления белком Ig А связывающих свойств.

3. Рекомбинантный IgA-рецепторный белок может быть использован для определения концентрации иммуноглобулина А в биологических жидкостях.

Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-генетических методов (полимеразная цепная реакция, ДНК -ДНК гибридизация, секвенирование ДНК) и иммунологических методов исследования (ELISA, Western-blott анализа и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные результаты.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 8 научных работах и доложены на 6 симпозиумах и конференциях: 4-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Санта Фе, США, в 1994 г.; Конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции "Биотехнология-94", Санкт-Петербург, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции памяти акад. А.А.Баева, Москва, Россия, в 1996 г.; Международном конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине, Флоренция, 1999 г., XIV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Новая Зеландия, 1999 г. Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1996, 1997, 1998, 1999 гг.).

12

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, главу собственных исследований и обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 4 таблицами и 22 рисунками, указатель литературы содержит 131 источник, в том числе 5 отечественных и 126 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Устинович, Ирина Анатольевна

6. ВЫВОДЫ

1. Осуществлено клонирование в гетерологичной системе E.coli фрагмента гена IgA рецептора (гена bac) стрептококка группы В, кодирующего область связывания IgA. Получен и охарактеризован хроматографически очищенный рекомбинантный белок IgA рецептора стрептококка группы В.

2. Осуществлено клонироваиние в векторную систему pQE фрагмента гена IgA рецептора, ответственного за синтез белка, содержащего последовательность MLKKIE. Выделен рекомбинантный белок, содержащий область MLKKIE и обладающий IgA рецепторной активностью. Получена антисыворотка к этому белку.

3. Доказано участие области MLKKIE белка Вас в связывании иммуноглобулина А.

4. Получены интеграционные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена IgA рецептора, актуальные для более полного изучения роли IgA рецепторного белка в формировании вирулентного фенотипа микроба.

5. Показана возможность использования рекомбинантного IgA рецепторного белка для анализа содержания иммуноглобулина А в биоптатах людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта и мониторинга количества IgA в процессе лечения.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стрептококки группы В являются причиной возникновения серьезных заболеваний новорожденных и взрослых людей, в первую очередь беременных женщин. Несмотря на интенсивное изучение этой бактериальной инфекции, во всем мире проблема лечения и профилактики заболеваний, вызванных стрептококком группы В, остается актуальной. Известно, что белки стрептококков группы В участвуют в формировании вирулентности, однако роль отдельных белков в формировании вирулентного фенотипа изучена недостаточно. К числу белков - факторов патогенности стрептококков группы В, относится Вас белок (Р антиген), способный связывать иммуноглобулины А через Fc часть молекулы.

Представленное исследование имело целью дополнить имеющиеся данные относительно IgA-рецепторного белка Вас стрептококков группы В. В связи с этим был поставлен ряд задач, включающих в себя клонирование рецепторного участка гена IgA-рецептора; локализацию области ДНК, кодирующей центр связывания Вас белка, ответственного за IgA связывание; выделение и использование рекомбинантного IgA-рецепторного белка в клинико-лабораторной диагностике, создание изогенных мутантов СГВ по bac гену.

Работа проводилась с использованием современных методов молекулярной генетики, иммунохимии и молекулярной микробиологии. В исследовании были применены разнообразные методы молекулярной биологии: клонирование и секвенирование, полимеразная цепная реакция, гибридизационный анализ, хроматографическая очистка белков и методы иммуноферментного анализа, инсерционный мутагенез.

С целью клонирования участка bac гена, кодирующего область связывания IgA, был выбран один из клинических штаммов СГВ, активно связывающий иммуноглобулин А . ДНК этого штамма была использована в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции. Праймеры были синтезированы на основе известной нуклеотидной последовательности bac гена штамма SB 35 [66]. Синтезированный фрагмент ДНК в размером 1,5 т.н.п. был проклонирован в систему E.coli. В результате удалось получить рекомбинантный клон E.coli, обладающий IgA-рецепторной активностью. Это свидетельствовало о том, что проклонированный фрагмент ДНК действительно содержал участок гена bac стрептококка группы В. Учитывая тот факт, что проклонированный фрагмент не имел стрептококкового промотора, было сделано заключение о том, что в данном случае транскрипция инициировалась с промотора вектора и о том, что при клонировании нам удалось попасть в рамку считывания белка. Рекомбинантный белок из этого штамма, названного JM109 р4.2, был выделен и хроматографически очищен на аффинной колонке с иммуноглобулином А. Способность очищенного белка связывать IgA была охарактеризована методами в иммуноприципитации на нитроцеллюлозных мембранах и иммуноферментного анализа. Была определена константа связывания сывороточного иммуноглобулина А рекомбинантным белком из штамма JM109 р4.2, она оказалась равной 3,7х108 М"1.

На следующем этапе были предприняты попытки субклонировать участок bac гена из плазмиды р4.2 и тем самым локализовать область, ответственную за связывание иммуноглобулина А. Два фрагмента ДНК, 700 н.п. и 500 н.п., были получены в результате рестрикции р4.2 ферментами Xbal и HindIII, а затем проклонированы в плазмидный вектор pUC 8. Рекомбинантные плазмиды названы рХ и pH, соответственно. Однако ни в одном из двух вариантов IgA-рецепторной активности обнаружить не удалось. Вероятно, из-за нарушения рамки трансляции при клонировании изменилась аминокислотная последовательность рекомбинантных белков, что привело к утрате их функциональной активности.

Область размером в 100 н.п., принадлежащая 700 н.п. вставке плазмиды рХ, была просеквенирована. Анализ нуклеотидной последовательности показал 99% гомологии с аналогичной областью bac гена штамма SB35, нуклеотидная последовательность которого опубликована ранее [66]. Этот факт дает возможность убедиться в точности выполненных операций по синтезу и клонированию фрагмента bac гена.

По-прежнему оставался открытым вопрос относительно локализации центра связывания иммуноглобулина А на молекуле Вас белка. В литературных данных была указана область Вас белка, состоящая из шести аминокислот MLKKIE, которая, по мнению отдельных авторов, играет определенную роль в связывании иммуноглобулина А [74]. Однако представленные тому доказательства не позволяют, на наш взгляд, говорить об этом со всей определенностью. Для локализации центра связывания IgA на молекуле Вас белка и выяснения значения области MLKKIE в связывании IgA было решено получить два рекомбинанатных белка, в одном из которых MLKKIE область присутствует без изменений, а в другом MLKKIE структура нарушена. С этой целью были сконструированы праймеры, позволяющие синтезировать, в первом случае, фрагмент размером 245 н.п., содержащий область, кодирующую MLKKIE. Во втором случае синтезировался 123 н.п. фрагмент с нарушенной MLKKIE последовательностью. Это достигалось за счет того, что обратный праймер соответствовал участку ДНК, кодирующему MLKKIE с двумя нуклеотидными заменами. В результате, вместо области MLKKIE должна была синтезироваться область MLKRIQ. Полученные посредством ПЦР ДНК фрагменты были проклонированы в трех рамках считывания в системе векторов pQE фирмы QIAGEN. Это обеспечивало попадание в рамку считывания белка в одном из трех вариантов. Другим достоинством этой векторной системы являлась возможность легко очищать рекомбинантные белки за счет того, что они синтезируются слитыми с пептидом, состоящим из шести гистидиновых остатков. Ni-NTA агароза, связывающая полигистидиновые остатки, позволяет высокоэффективно очищать слитые белки.

В результате клонирования фрагмента 245 н.п. в pQE 32 удалось получить рекомбинантный белок размером 14 kD, содержащий в своем составе неизмененную последовательность MLKKIE. Этот белок обладал IgA-рецепторной активностью, хотя она была нестабильной. Белок оказался иммуногенным для кроликов и вызывал образование антител. Полученная кроличья антисыворотка реагировала в иммуноблотте как с самим белком, к которому она была получена, так и с полноразмерным Вас белком, полученным HCl экстракцией СГВ, содержащием бета антиген.

Фрагмент, в котором последовательность, кодирующая MLKKIE, была нарушена, был также проклонирован в три вектора системы pQE. Однако выделить рекомбинантный белок посредством очиски на Ni-NTA агарозе не удалось, возможно, из-за его малого размера. Для получения рекомбинантного белка большего размера с измененной областью MLKKIE дополнительно был сконструирован прямой ДНК праймер, соответствующий области bac гена, находящейся на 550 н.п. с 5' конца от обратного праймера. В результате, при помощи ПЦР был синтезирован фрагмент ДНК с нарушеннной последовательностью, кодирующей MLKKIE, и также проклонирован в три плазмидных вектора системы pQE. Из штамма, содержащего pQE 30 со вставкой, удалось выделить рекомбинантный белок размером 20 kD, в котором вместо MLKKIE структуры присутствует последовательность MLKRIQ. Этот белок был проанализирован в Western-блотте и методами иммуноферменотного анализа, однако IgA-связывающей активности обнаружено не было.

Эти данные позволяют сделать заключение о том, что аминокислотная последовательность MLKKIE действительно связана с функциональной активностью белка IgAрецептора СГВ, а нарушения структуры MLKKIE ведут к утрате IgA-связывающей активности белка.

Высокая специфичность взаимодействия IgA-рецепторного белка с иммуноглобулином А человека позволила использовать очищенный рекомбинантный IgA-рецепторный белок из штамма JM109 р4.2 для детекции иммуноглобулина А в пробах биоптатов слизистой желудка и прямой кишки людей с заболеваниями ЖКТ. Были опробованы два варианта анализа биоптатов: метод блоттинга и методы ИФА. Оказалось, что использование рекомбинантного IgA-рецепторного белка в обоих вариантах анализа позволяло с высокой чувствительностью выявлять наличие иммуноглобулина А в образцах и давать количественную оценку его содержания. Использование IgA-рецепторного белка в клинической практике позволяет также следить за динамикой содержания иммуноглобулина А в органах ЖКТ больных. Данный подход может позволить в будущем осуществлять экспресс диагностику уровня иммуноглобулина А в различных биологических жидкостях для оценки клинического состояния больных или их общего иммунного статуса.

Создание изогенных мутантов имеет целью изучение вклада того или иного фактора в формирование вирулентного фенотипа стрептококков группы В. Инсерционный мутагенез позволяет получить штамм, который отличается от родительского лишь по одному признаку. Мутанты СГВ, полученные нами, не обладали IgA связывающей активностью. Для их создания потребовалось фрагмент bac гена встроить в интеграционный плазмидный вектор p7EMR, а затем трансформировать этой рекомбинантной плазмидой родительский штамм СГВ 219/4849. Рекомбинантная плазмида встроилась в хромосому по гомологии, в области bac гена, тем самым, нарушив его экспрессию. Для выяснения биологической роли Вас белка стрептококков группы В планируется провести в будущем ряд экспериментов на животных с использованием мутантов и их родительских штаммов.

95

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Устинович, Ирина Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Беляков В.Д., Ходырев А.П., Тотолян А.А. Стрептококковая инфекция, 1978.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.

3. Ройт. А. Основы иммунологии. М: «Мир», 1991.

4. Тернер М., Ричарде Ф., Варга Дж. и др. Структура и функции антител. М.: Мир, 1993, 200с.

5. Хиатов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и при патологии. Иммунология, 1997, 5, 1-4.

6. Akerstrom В., Lindahl G., Bjorck L., Lindqvist A. Protein Arp and protein H from group A streptococci: Ig binding and dimerization are regulated by temperature. J. Immunol. 1992, 148, 3238-3243.

7. Akerstrom В., Lindguist A. and Lindahl G. Binding properties of protein Arp, a bacterial IgA-receptor. Mol. Immunol., 1991, 28, P. 249-357.

8. Akerstrom В., Lindqist A., Vander Mallen V., Grubb A., Lindahl G., Vaerman J.P. Interaction between streptococcal protein Arp and different molecular forms of human immunoglobulin A. Mol. Immunol., 1994, 5, 393-400.

9. Allison L.H., Moyle M., Shales M. and Ingles C.J. Extensive homology among the largest subunits of eukaryotic and prokaryotic RNA polymerases. Cell, 1985, 42, P. 599-610.

10. Anthony B. F., Concepcion N. F., Puentes S. M., Payne N.R. Nonimmune bindinng of human immunoglobulin A to type II group В streptococci. Infect. Immun.1990, 58 (6), 1789-95.

11. Armstrong G., Blevins A., Louria D.B., Henkel J.S., Moddy M.D., Sukany M. Group В, С and G streptjcoccal infections in a cancer hospital. Arm. N. Y. Acad. Sci., 1970, 174, 511-522.

12. Avelino C.C. and Benchetrit L.C.- Penicillin tolerance among beta-hemolytic streptococci and production of the group carbohydrates, hyaluronidase and desoxyribonucleasesc Mem.Inst.Oswaldo.Cruz., 1995,90,p 529-534.

13. Barton L.L., Feigin R.D. and Lins R. Group B beta hemolytic streptococcal meningitis in infants. J. Pediatr., 1973, 82, P. 719-721.

14. Bateman A., Eddy S.R., Chothia C. Members of the immunoglobulin superfamily in bacteria. Protein Science, 1996, 5, 1939-1941.

15. Bessen D.E. Localization of immunoglobulin A-binding sites within M or M-like proteins of groupA streptococci. Infect.Immun. 62:1968-1974, 1994.

16. Bessen D.E., Fischetti V.A. A human IgG receptor of group streptococci in associated with tissue site of infection and streptococcal class. J. Inf. Dis. 1990, 161, 747-754.

17. Bevanger L. Ibc protein as serotype markers of group B streptococci. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand., 1983, B 91, 231-234.

18. Bevanger, L. Ibc proteins as serotype markers of group B streptococci. Acta Path. Microb. Immunol. Scand. Sect. B, 1991, P. 231-234.

19. Bimboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant DNA. Nucl. Acid. Res., 1979, 7, 1513-1523.

20. Blake M.S., Donets M., Carr D., Qi H., Tai J.Y. Identification of the IgA binding domain on group B streptococcal p antigen. Abstracts of XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, 1996.

21. Bohnsack J.F., Zhou X., Williams P.A., Cleary P.P., Parker C.J. and Hill H.R.- Purification of the proteinase from group B streptococci that inactivates human C5ac Biochim. Biophys. Acta, 1991,1079,p 222-228.

22. Boyer K.M. Neonatal group B streptococcal infections. Curr. Opin. Pediatr., 1995, 7, No.l, P. 1318.

23. Brady L.J., Boyle M.D. Identification of non-immunoglobulin A-Fc-binding forms and low-molecular-weight secreted forms of the group B streptococcal P antigen. Infect. Immun., 1989, 57, P.1573-1581.

24. Brady L.J., Hosana A., Askeland D., Tai J. Cloning of non-IgA Fc binding forms of the group B streptococcal bata antigen. Abstracts of 4th International ASM Conference on Streptococcal Genetics., 1994, P. 33.

25. Brdy L.J., Daphtary U. D., Ayub E.M., and Boyle M. D. P. Two novel antigens associated with group B streptococci identified by a rapid two stage radioimmunossay. J. Infect. Dis., 1988, 158, 965-972.

26. Cherhi G.B., Kaplan E.L., Schlievert P.M., Bitti A. and Orefici G.- First reported case of Streptococcus pyogenes infection with toxic shock-like syndrome in Italyc Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1992,ll,p 836-838.

27. Chmourygina I., Suvorov A.N., Ferrieri P., and Cleary P.P. Conservation of the C5a peptidase genes in group A and B streptococci. Infect.Immun. 64:2387-2390, 1996.

28. Christensen K.K., Svennigsen N., Pahlader K., Ingermarsson E., Linden V. and Chrestensen P.Relation between neonatal pneumonia and maternal carrige of B streptococcic Scand. J. Infect. Dis.,1982,14,p 261-266.

29. Christie R., Atkins N.E. and Munch-Petersen E.- A note on a lytic phenomenon shown by group B streptococcic Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci.,1944,22,p 197-202.

30. Cimolai N. and Roscoe D.L. Contemporary context for early-oneset group B streptococcal sepsis of the newborn. Am. J.Perinatol. 12 No. 1:46-49, 1995.

31. Chun C.S.Y., Brady L.J., BoyleM.D.P., Dilon H.C. and Ayoub E.M .Group B streptococcal C protein-associated antigens: association with neonatal sepsisc JID,1991,163,p 786-791.

32. Cleary P.P., Kaplan E.L., Handley J.P., et al- Clonal basis for resurgence of serious Streptococcus pyogenes disease in the 1980sc Lancet, 1992,339,p 518-521.

33. Cleat P. and K.N.Timmis Cloning and Expression of the b protein gene of group B streptococci and a study of its product's binding capacity of human IgA. BIBP 1:225-232, 1990.

34. Cleat P.H. and Timmis K.N. Cloning and expression in Escherichia coli of the Ibc protein genes of group B streptococci: binding of human immunoglobulin A to the beta antigen. Infect. Immun. 1987, 55,No.5,P. 1151-1155.

35. Colman G, Efstratiou A. and Marrison D. Streptococci and related organisms, identification methods in applied and enviromental microbiology, 1992. pp. 221-249.

36. Colman G., Tanna A., Efstration A., Gaworzewska E.T. The serotypes of Streptococcus pyogenes present in Britain during 1980-1990 and their association with disease. J. Med. Microbiol., 1993, 39,165-178.

37. Cumming C.G. Group B streptococcal cell surfaces. J.Med.Microbiol. 18 No.2:151-155, 1984. 148

38. Cunniff H., Bump C.M. Extra-respiratory non-group D isolates of streptococci. Am.J.Med.Technol., 1976, 42, 195-200.

39. Curtis S.N., Krause R.M. Identification of rham nose as an antigenic determinant of group B streptococci carbohydrate. Federation Proceeding, 1964, 23, 151-155.

40. Dagert M., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. Gene, 1979, 6, 23-28.

41. Demers B., Simor A.E., Vellend H., et al- Severe invasive group A streptococcal infections in Ontario, Canada: Streptococcal Infections, 1993, pi987-1991.

42. Düben J., Jelinkova J. and Neubauer M.- Group B streptococci in the female genital tract and nosocomial colonization of newbornc Infect.Immun.,1978,23,p 89-94.

43. Dunna R.L., Wienberg A.N., Medrek T.F., Kunz L.J. Streptococcal infections. Medicine, 1969, 48, 87-127.

44. Eloy C., Handrois J.P. Aspect clinigues et biologigu es des infections humaines a streptocogue du group B. Sci.Vet.Med.comp., 1985, 87(4), 3-18.

45. Ferrieri P.- GBS infections in the newborn infant: diagnosis and tretmentc Antibiot. Chemother.,1985,35,p 211-215.

46. Ferrieri P. Neonatal susceptibility and immunity to major bacterial pathogens. Rev.Infect.Dis. 12 Suppl.4:394-400, 1990.

47. Ferrieri P. Neonatal susceptibility and immunity to major bacterial pathogens. Rev. Infect. Dis., 1990, 12, Suppl.4, P. 394-400.

48. Ferrieri P., Flores A. Surface protein expression in group B streptococcal invasive isolates. Abstracts of XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, 1996.

49. Flingold D.S., Wienberg A.N., Medrek T.F., Kunz L.J. Extra-respiratory streptococcal infections. Importance of various serological groups. N. Engl. J. Med., 1966, 275, 356-361.

50. Franciosi R.A., Knostman J.D. and Zimmerman R.A.- Group B streptococcal neonatal and infant infectionsc J. Pediatr.,1973,82,p 707-710.

51. Friquet B., Chffotte A.F., Djavadi-Chaniancel L., Goldberg M.E. J.Immunol. Meth., 1985, 77, 305319.

52. Frithz E., Heden L.O., Lindahl G. Extensive sequence homology between IgA receptor and M proteins in Streptococcus pyogenes. Mol. Microbiol., 1988, 3, 1111-1119.

53. Ganapathy M.E. and Rissing J.R. Group B streptococcal vertebral osteomyelitis bacteremia. South. Med. J., 1995, 88, No.3, P. 350-351.

54. Garland S.M. and Kelli N. Early-onse neonatal group B streptococcal sepsis: economics of various prevention strategies. Med. J. Aust., 1995,162, No.8, P. 413-417.

55. Gasc A.M., L.Kauc, P.Barraille, M.Sicard, S.Goodgal. Gene localization, size, and physical map of the chromosome of Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol.,1991, 173, P. 7361-7367.

56. Geourjon C. and DelCage G. Intractive and graphic coupling between multiple alignments, secondary structures prediction and motif/pattern scaning into protein sequences. Cabios 9:87-91, 1993.

57. Gomez-Rodrig, Ferreiro J.L. and Formigo E. Osteoarticular infections caused by Streptococcus agalactiae. Report of 4 cases. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 1995, 13, P. 99-103.

58. Gravekamp C., Horensky D.S., Michel J.L., Madoff L. Variation in repeat number within the alpha C protein of group B streptococci alters antigenicity and protective epitopes. Infect. Immun., 1996, 64, P. 3576-3583.

59. Hackett S.P., Stevens D.L. Stretococcal toxic shock syndrome synthesis of tumor necrosis factor and interleukin-1 by monocytes stimulated with pyrogenic exotoxin A and streptolysin O. J.Infect. Dis., 1992, 165, 879-885.

60. Hammerschmidt S., Verheul A.F.M., Chhatwal G.C. SpsA, a novel surface protein from Streptococcus pneumoniae with specific binding to SigA and secretory component. ASM Conference on streptococcal genetics, 1998, P. 17-18.

61. Hauge M., Jaspersgaard C., Poulsen K., and Kilian M. Population structure of Streptococcus agalacttiae reveals an association between specific evolutionary lineages and putative virulence factors but not disease. Infect.Immun. 64:919-925, 1996.

62. Heden L.O., Lindahl G. Conserved and variable regions in protein Arp, the IgA receptor of Streptococcus pyogenes. J.Gen. Microbiol., 1993, 139, 2067-2074.

63. Hill H.B., Caldwell G.G., Wilson E., Hager D., Zuimmerman R.A. Epidemic of pharingits due to streptococci of Lancefield group G. Lancet., 1969, 371-374.

64. Hill H.R., Bohnsack J.F., Morris E.Z., et al- Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complemente J. Immunol., 1988,141 No.l0,p 3551-3556.

65. Holm E.S., Norrby A., Bergholm A-M. and Norgen M.- Aspects of pathogenesis of serious group A streptococcal infec- tion in Sweden, 1988-1989c JID.,1992,166,p 31-37.

66. Jahnson L., Bjorsell-Ostling E., Bonnersting J. and Holmberg h.- Streptococcal myositisc Scand J Infect Dis.,1993,24,p 661-665.

67. Jennings H.J., Katzenellenbogen C., Lugowski C. and Kasper D.L.Structure of the native polysacharide antigens of type la and type lb group B Streptococcusc Biochemistry,1993,258, p1258-1263.

68. Jerlstrom P.G., Chatwal G.S., and Timmis K.N. The Iga binding b antigen of the c protein complex of group B streptococci: sequence determination of its gene and detection of two binding regions. Molec.Microb. 5(4):843-849, 1991.

69. Jerlstrom P.G., Talay S.R., Valentin-Weigand P., Timmis K.N., and Chatwal G.S. Identification of an immunoglobulin A binding motif located in the b-antigen of the c protein complex of group B streptococci. Infect.Immun. 64:2787-2793,1996.

70. Johnson D.R., Ferrieri P. Group B streptococcal Ibc protein antigen: distribution of two determinants in wild-type strains of common serotypes. J.Clin. Microbiol., 1984, 19, P. 506-510.

71. Johnsson E., Andersson G., Lindahl G., Heden L.-O. Identification of the IgA-binding region in streptococcal protein Arp. J. Immunol., 1994, 153, 3557

72. Kawasaki E. Amplification of genomic DNA. In: PCR protocols, edited by Innis M., Geland D., Sninsky J. and White T. San Diego: Academic Press, 1990, p. 13-28.

73. Kreig N.R. and Holt J.G. Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology, Williams and Wilkins Co., 1984. pp. 1-1599.

74. Kuac L. and Goodgal S.H.- The size and physical map of the chromosome of Haemophilus parainfluenzaec Gene, 1989,83,p 377-380.

75. Kyhse-Andersen J. Elektroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid tranfer of proteins from polyacrilamid to nitrocellulose. J.Biochem. Biophys. Met., 1984, 10, 203-209.

76. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.(London)., 1970, 227, 680-686.

77. Lancefield R.C.- A serological differentiaion of specific type of bovine hemolityc streptococci (group B)c J. Exp. Med., 1934,59,p 441-458.

78. Lancefield R.C. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J.Exp. Med., 1933, 57, 571-595.

79. Leggiadro J., Bugnitz M.C., Peck B.A., et al- Group A streptococcal bacteremia in a mid-south children's hospitalc South Med J.,1993,86,p 615-618.

80. Lindahl G., Akerstrom B. Receptor for IgA in group A streptococci: cloning of the gene and characterization of the protein, expressed in Eschericia coli. Mol. Microbiol., 1989, 3, 239-247.

81. Lindahl G., Akerstrom B., Vaerman J.-P. and Stenberg L. Characterization of an IgA receptor from group B streptococci: specificity for serum IgA. Eur. J. Immunol., 1990, 20, P.2241-2247.

82. Lowry O.H., Rosenbraugh N.J., Ferr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J.Mol. Biol., 1957, 193, 265-273.

83. Lumb T.M. Group B streptococcus revisited. Pediatr. Nurs., 1994, 20, No.6, P. 578-580.

84. Madoff L.C., Hori S., Michel J.L., Baker C.J., Kasper D.L. Phenotypic diversity in the alpha C protein of group B streptococci. Infect. Immun., 1991, 59, P. 2638-2644.

85. Madoff L.C., Michel J.L., Gong E.W., Rodewald A.K. and Kasper D.L.- Protection of neonetal mice from group B streptococcal infection by maternal immunization with beta C proteinc Infect.Immun.,1993,60,p 4989-4994.

86. Maeland J.A., Brakstad O.G., Bevanger L., Kvan A.I. Streptococcus agalactiae beta gene and gene product variations. J. Med. Microbiol., 1997, 46 (12), 999-1005.

87. Martin T.R., Ruzinski J.T., Rubens C.E., Chi E.Y. and Wilson C.B.- The effect of type-specific polysaccharide capsule the clearence of group B streptococci from the lungs of infant and adult ratsc J. Infect. Dis., 1992,15,p 306-314.

88. Messing J., Gronenborn B., Muller-Hill B., Hofschneider P.H. Filamentous coli phage M13 as a cloning vehicle: Insertion of a Hindll fragment of the lac regulatory region in M13 replicative form in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 3642-3646.

89. Michel J.L., Madoff L.C., Olson K., Kling D.E., Kasper D.L. Large, identical, tandem repeating units in the C protein alpha antigen gene, bca, of group B streptococci. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1993, 89, P. 10060-10064.

90. Muller-Adolf H., Adolf J.E. and Kohler W- Erythrogenic toxins A,B and C:occurrence of the genes and exotoxin formation from clinical Streptococcus pyogenes strains associated with streptococcal toxic shock-like syndrome J.Clin.Microbiol.,1993.

91. Nicholas W.C., Steele C. Occurrence of groupable beta-hemolytic streptococci study among school children in Bismarck N.D. J.Am. Med. Assoc., 1962, 182, 197-205.

92. Parker M.T., Ball L.C. Streptococci and aerococci associated with systematic infections in man. J.Med. Microbiol., 1976, 9, 275-309. 259.

93. Podbielski A., Blankenshtein O. and Lutticken R.Molecular characterization of the cfb gene encoding group B streptococcal CAMP-factorc FEBS Lett, 1994,235,p 262-266.

94. Podbielski A., Flosdorff A. and WeberHeynemann J.- The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structural vir regulon genesc Infect.Immun.,1995,63,p 9-20.

95. Pritchard D.G. and Lin B.- Group B streptococcal neuraminidase is actually a hyaluronidasec Infect.Immun., 1993,61 ,p 3234-3239.

96. Rainard P., Sarradin P., and Poutrel B. Phenotypic variability of X-protein expression by mastitis-causing Streptococcus agalactiae of serotype NT/X and opsonic activities of specific antibodies. Microb.Pathog 16 No.5:359-372, 1994.

97. Riordan F.A., Thomson A.P., Sills J.A. and Hart C.A. Bacterial meningitis in the first three months of life. Postgrad. Med. J., 1995, 71, P. 36-38.

98. Rodley P.D., Romling U. and Tümmler B.- A physical genome map of the Burkholderia cepacia type strainc Molec.Microb.,1995,17,p 57-67.

99. Roger S., Wells R., and Rechsteiner M. Amino acid sequances common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 234:364-369, 1985.

100. Romling U., Greipel J. and Tümmler B.- Gradient of genomic deversity in the Pseudomonas aeruginosa chromosomec Molec.Microb., 1995,17,p 323-332.

101. Rubens C.E., Heggen L.M., Rachel F.H. and Wessels M.R.Identification of cpsD, a gene essential for type III capsule expression in group B streptococcic Molec.Microb.,1993,8,p 843-855.

102. Russell-Jones G.J., Gotsclich E.C. and Blake M.S.- A Surface Receptor Specific for Human IgA on Group B streptococci Posessing the Ibc Protein Antigene J.Exp.Med., 1984,160,p 14671475.

103. Schalen C. Prevalence of IgA receptors in clinical isolates of Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae: Serologic distinction between the receptors by blocking antibodies. FEMS I&M, 1993, 7, 39-46.

104. Schalen C., Christensen P., Grubb A.M., Samuelsson G., Svensson M.L. Demonstration of separate regions for human IgA and IgG in group A streptococci type 4. Acta Path. Microbiol. Scand. Sect C, 1980, 88,77-82.

105. Schlievert P.M., Gocke J.E. and Deringer J.R.- Group B streptococcal toxic shock-like syndrome: report of a case and purification of the associated pyrogenic toxinc Clin.Infect.Dis, 1993,17,p 26-31.

106. Schwartz B., Schuchat A., Oxtoby J., Cochi S.L., Hightower A. and Broome C.V.- Invasive group B Streptococcal disease in adultsc JAMA, 1991,266 No.8,p 1112-1114.

107. Stalhammer-Carlemalm M., Stenberg L. and Lindahl G.Protein rib: a novel group B streptococcal cell surface protein that confers protective immunity and is expressed by most strains causing invasive infectionsc J.Exp.Med., 1993,177,p 1593-1603.

108. Stegmayr B., Bjork S., Holm S., Nissel J., Rydvall A and Settergren B.- Septic shock induced by group A streptococcal infection: clinical and theraputical aspectsc Scand J Infect Dis.,1992,24,p 589-597.

109. Stenberg L. Genetics and Biochemistry of group A streptococcal cell surface proteins, with special reference to immunoglobulin A-binding proteins. Doctoral Thesis, Lund University, 1994.

110. Stenberg L., O'Toole P., Mestecky J., Lindahl G. Molecular characterization of protein Sir, a streptococcal cell surface protein, that binds both immunoglobulin A and immunoglobulin G. J.Biol. Chem., 1994, 269, 13458-13464.

111. Suvorov A.N., Cleary P.P. and Ferrieri P. C5a peptidase gene from group B streptococci. Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, 1991, P. 230-232.

112. Takashi S., Nagano Y., Nagano N., Hayashi O., Taguchi F. and Okuwaki Y.- Role of C5a-ase resístanse to opsonophagocytic killingc Infect.Immun.,1995,63,p 4764-4769.109

113. Thern A., Stenberg L., Dahlback B., Lindahl G. Immunoglobulin-binding surface proteins of Streptococcus pyogenes also bind human C4b-binding protein (C4BP), a regulatory component of the complement system. J.Immunol., 1994,152, 2342-2349.

114. Titi G, Mancuso G. and Tomasello F.- Cytokine appearance and effects of anti tumor necrosis factor alpha antibodies in a neonetal rat model of group B streptococcal infectionc Infect.Immun., 1993,61 ,p 227-235.

115. Verburgh C.A., Hendriks W.D., Ligthart J. and Berghout A.Necrotizing fsciitis caused by group A beta-hemolytic streptococcic Ned Tijdschr Geneeskd,1993,137,p 607-609.

116. Wood T.F., Potter M.A. and Jonasson 0.- Streptococcal toxic shock-like syndrome.The importance of surgical interventionc Ann Surg., 1993,217,p 109-114.

117. Yu C-E and Ferretti J. J.- Molecular epidemiologic analysis of the type A streptococcal exotoxin (Erythrogenic toxin) gene (speA) in clinical Streptococcal pyogenes strains1.fect.Immun., 1989,57,p 3715-3719.1108. БЛАГОДАРНОСТИ