Идентификация и характеристика отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов

Ботина, Светлана Геннадиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и характеристика отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. Ломоносова _Биологический факультет_

на правах рукописи

БОТИНА СВЕТЛАНА ГЕННАДИЕВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ШТАММОВ ТЕРМОФИЛЬНЫХ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХСЯ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2004г.

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ '' БЕСПЛАТНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

академик РАЕН, Суходолец В. В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Складнее Д.А.

кандидат биологических наук, Стоянова Л.Г.

Ведущая организация: Институт микробиологии РАН

Защита состоится «25» ноября 2004 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, корп.12, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. '

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просьба присылать по указанному адресу учёному секретарю диссертационного совета. <

Автореферат разослан «_» октября 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук £7с<л^ Пискункова Н.Ф.

Ъ^О (8 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и её актуальность.

Разнообразие кисломолочных продуктов обусловлено применением бактериальных заквасок, состав которых представлен различными видами молочнокислых бактерий. От штаммов, входящих в состав бактериальной закваски зависят специфика вкуса, консистенция и ряд других свойств кисломолочных продуктов. Молочнокислые бактерии могут быть выделены из различных источников, а потому процесс выделения и определения видовой принадлежности бактерий представляется важным этапом на пути к использованию их в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотиков. До недавнего времени в России идентификация и классификация молочнокислых бактерий проводилась на основе изучения морфологических, физиологических и биохимических признаков. Очевидная ограниченность этих методов требует для более точной идентификации микроорганизмов исследований их геномных характеристик, чего в отношении отечественных культур молочнокислых бактерий практически не применялось [Ганина и др., 1999].

Способность термофильных молочнокислых бактерий расти и размножаться при температуре 42-45°С является важным условием технологического процесса, связанного с производством таких кисломолочных продуктов как йогурт и некоторые виды сыров. В последнее время возрос интерес к изучению именно термофильных молочнокислых бактерий. В большей степени это связано с развитием молочной промышленности в мире вообще и в России в частности и как следствие этого производством новых кисломолочных продуктов и поиском новых штаммов молочнокислых бактерий, пригодных для использования их в качестве заквасок. В связи с этим несомненный интерес представляют исследования с применением различных методов идентификации молочнокислых термофильных бактерий, вводимых в состав бактериальных заквасок для получения кисломолочных продуктов.

Предыстория работы.

На основании проведенных ранее исследований среди изучаемых штаммов различного происхождения, идентифицированных (на основании микробиологических тестов и данных ДНК-ДНК-гибридизации) как Streptococcus thermophilus было выявлено 5 обособленных групп гомологии. Внутри отдельных групп (геномоваров) уровень геномного родства штаммов составлял 80-90%, тогда как между штаммами из разных групп обычно реассоциировало 20-60% ДНК. Термин геномовар в таксономическом отношении строго не определён и может практически соответствовать как разным видам (для которых фенотипические различия пока не установлены), так и разным расам в рамках одного и того же вида [Rossello-Mora, Amann, 2001]. Столь низкие значения геномного родства в рамках вида S. thermophilus могли быть результатом горизонтального переноса и накопления чужеродных адаптивных генов в геномах исследуемых штаммов. Но, с другой стороны, эти данные могли указывать на возможное присутствие в

БИБЛИОТЕКА L

определяемых как 3. МегторЬНиз, других близкородственных видов молочнокислых термофильных бактерий. Таким образом, причины выявленного полиморфизма по уровню геномного родства между штаммами одного вида оставались неясными, что потребовало применения современных методов изучения генома для точного установления систематического положения изучаемых штаммов.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлась идентификация и характеристика отечественных штаммов термофильных молочнокислых кокков, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов.

6 процессе выполнения работы были поставлены и решены следующие задачи: 1) создание коллекции штаммов термофильных молочнокислых кокков; 2) идентификация и характеристика штаммов термофильных молочнокислых бактерий на основании изучения их фенотипических и биохимических свойств; 3) идентификация I

отечественных штаммов термофильных молочнокислых кокков с использованием подходов, основанных на изучении их генома; 4) оценка безопасности штаммов термофильных молочнокислых кокков, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов, путём определения в составе их геномов генов, кодирующих признаки патогенности.

Научная новизна работы.

На примере штаммов бактерий собранной коллекции проведена идентификация и дана характеристика штаммам термофильных молочнокислых бактерий, использующимся при изготовлении кисломолочных продуктов на территории России и стран СНГ. Проведена оценка безопасности культур термофильных молочнокислых кокков в случае их использования в пищевой промышленности. Изучена разрешающая способность разных методов исследования, использующихся при идентификации и таксономической классификации штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

Практическая значимость работы.

Получено представление о таксономическом положении штаммов, использующихся в качестве заквасок на территории России и южных регионов СНГ. Продемонстрирована разрешающая способность используемых в работе методов для оценки таксономического положения штаммов термофильных молочнокислых бактерий. Сделано заключение о приемлемости полученных в ходе исследования результатов для анализа культур, внедряемых в производство кисломолочных продуктов и для характеристики степени их безопасности. Методы, используемые в работе, могут быть рекомендованы для использования в лабораториях, занимающихся выделением и идентификацией новых культур с целью применения их как заквасок в молочной промышленности.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 3 Всероссийских и Международных конференциях. Основные положения диссертации отражены в 8 публикациях, из которых 4 статьи и 4 тезисов; 2 статьи сданы в печать.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 159 страниц машинописного текста, 11 рисунков, 13 таблиц. Библиография включает 245 литературных источников отечественных и зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись 55 штаммов молочнокислых термофильных кокков, в том числе штаммы, предоставленные нам * разными коллекциями и коллегами и выделенные нами из различных

кисломолочных продуктов и заквасок, использующихся при их изготовлении.

Все использованные в ходе работы штаммы депонированы во ВКПМ (ГосНиигенетика, Москва). Данные о происхождении и характеристика всех использованных в работе штаммов представлены в таблицах 1 и 3.

Среда и условия культивирования термофильных молочнокислых бактерий. Основной средой для культивирования служила среда М21, с добавлением глюкозы либо лактозы в качестве источника сахара. Состав среды: 0,5% пептона, 1,0% дрожжевого экстракта, 30% мясного бульона, 5% сахара, 0,1% аскорбиновой кислоты, 0,2% КН2Р04, 0,85% Na2HP04, 0,012% MgS04, pH 7,0. Соответствующая твёрдая среда содержала 1,5 % агара. Бактерии выращивались в течение ночи в термостате при температуре 42°С.

Микробиологические методы исследования.

Микроскопирование препаратов культур бактерий проводили, используя микроскоп фирмы "Rathenow" и стандартные методы окрашивания грамположительных кокков.

Способность бактерий сбраживать сахара тестировали на среде М21 с анализируемым углеводом и красителем бромкрезоловым пурпурным (БКП), в концентрации 32мг/л. 1 Ферментационную активность культур оценивали используя

лакмусовое молоко фирмы «Difco».

Способность бактерий расщеплять эскулин определяли с использованием среды следующего состава: казеиновый пептон - 0,5%, мясной экстракт - 0,3%, цитрат железа - 0,05%, эскулин - 0,1%, агар -1,5%, pH 6,6.

О синтезе экзополисахарида свидетельствовало бледно-розовое окрашивание колоний при росте бактерий на среде следующего состава: молоко - 10%, дрожжевой экстракт - 0,5%, агар - 1,5%, сахароза - 1%, рутениевый красный - 80 мг/л [Mora et al., 2002].

Антибиотикоустойчивость изучаемых штаммов тестировали по способности бактерий расти на агаризованной среде М21 с добавлением следующих антибиотиков: канамицин, эритромицин, рифампицин, левомицитин, тетрациклин, стрептомицин, фузидин, спектиомицин,

касугамицин, полимиксин в концентрациях от 10 до 1000 мкг/мл. Определяли максимальные концентрации антибиотиков, при которых штаммы способны расти.

Способность бактерий расти в присутствии NaCI исследовали на среде М21 с добавлением тестируемого вещества в концентрации от 2 до 7%.

Характер гемолиза тестировали по способности бактерий образовывать зоны просветления на среде следующего состава: основа кровяного агара (blood agar base), pH 7,3, стерильная баранья дифибринированная кровь - 5%.

Получение фаголизатов проводили с использованием техники двухслойного посева.

Молекулярно-биологические методы исследования.

Получение препаратов тотальной ДНК. Осаждение и промывание биомассы, а также выделение нативной хромосомной ДНК проводили, как описано ранее [Лысенко и др., 2001]. Для экспериментов по гибридизации ДНК экстрагировали и очищали по методу Мармура [Маптшг, 1961].

Получение препаратов плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли по щелочной методике [Anderson, McKay, 1983].

Нуклеотидный состав ДНК* определяли методом термической денатурации [Owen et al., 1969].

Уровень ДНК-ДНК гибридизации* определяли методом оптической реассоциации [De Leu et al., 1970].

Рестрикцию плазмидной и геномной ДНК проводили по общепринятым методикам [Маниатис и др., 1984] с использованием эндонукпеаз рестрикции Smal, Pstl, Hind фирмы "Fermentas", согласно рекомендациям производителя.

Электрофорез плазмидной ДНК проводили в агарозном геле в ТБЕ - буфере с использованием агарозы фирмы "Sigma" и «Хеликон» [Маниатис и др., 1984], при напряжении электрического поля 15 В/см, с использованием маркеров ДНК фирмы «Fermentas».

Пульс-гель электрофорез геномной ДНК проводили в 1% агарозном геле "Sigma", при напряжении поля 6 В/см в 0,5 х TBE при 14° С в аппарате CHEF-DRIII фирмы "BioRad".

Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием реактивов фирмы «Fermentas», праймеров, специально подобранных нами и синтезированных фирмой «Синтол», с помощью амплификатора "Perkin Elmer".

При проведении видоспецифичной ПЦР использовались праймеры, позволяющие проводить амплификацию следующих генов: lacZ (5'-CACTATGCTCAGAATACA-3', 5'-CGAACAGCATTGATGTTA-3'), gor (5'-TCATGTGGTATGGTGCTCAGG-3', 5'-GTTACTAATTTCATGGTTGACAGC-3'), pepC (S'-CAATTGATTTGACTAAAGATGAGG-S', 5'-CCAACCTTATCTCC-

'Работа проводилась совместно с к. б. н. Лысенко А. М., за что автор выражает благодарность.

CCAAGAG-3'), ddl (5'-TAGAGACATTGAATATGCC-3', 5-CATCGTGTAAGC-TAACTTC-3').

При определении последовательности генов 16S рРНК, амплификация гена велась с использованием праймеров: 5'-GAGTTTCATCCTGGCTCAGGACCA-3', 5-CCGACCTTCCGATACGGGCT-АССТ-3'.

Для определения присутствия в геноме исследуемых бактерий генов, кодирующих признаки патогенности, использовались следующие праймеры: ген адд (5'-AAGAAAAAGAAGTAGACCAAC-3', 5'-AAACG-СAAGACAAGTAAATA-3'), ген gelE (5'-ACCCCGTATCATTGGTTT-3', 5'-ACGCATTGCTTTTCCATC-3'), ген cylA (5'-TGGATGATAGTGATAGGAAGT-3', 5'-TCTACAGTAAATCTTTCGTCA-3'), ген esp (5'-TTGCTAATGCTAGT-CCACGACC-3', 5'-GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA-3').

Температурно-временной профиль ПЦР подбирался индивидуально для каждой пары праймеров в соответствии с учётом температуры их отжига.

Выделение и очистку ДНК из арагозного геля проводили с использованием набора для очистки амплифицированной ДНК фирмы «Sigma» (США), согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Секвенирование очищенных фрагментов генов 16S рРНК проводили по методу Сэнгера [Senger et al., 1977], используя автоматический секвенатор.

Компьютерный анализ подбора праймеров проводили с использованием компьютерных программ: NSBI Blast2, Oligo6.31, Oligonucleotide Properties Calculator.

Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК.

Сравнительный анализ и поиск гомологичных последовательностей проводился по базе NCBI [httpV/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast]. Анализ результатов секвенирования проводили с помощью компьютерных программ: Vector NTI: ContigExpress, AlignX; ClustalX, TreeView и Mega2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Идентификация штаммов термофильных молочнокислых стрептококков с использованием подходов, основанных на изучении сходства их геномов.

1.1. Определение нуклеотидного состава ДНК у штаммов термофильных молочнокислых бактерий.*

Определённый методом термической денатурации нукпеотидный состав ДНК исследуемых штаммов варьировал от 37,8 до 40,0 % Г+Ц пар, что соответствует виду & Ле/торМив. Это позволяло или, по крайней мере, не противоречило отнесению штаммов нашей коллекции к данному виду. Хотя следует отметить, что среднее значение этого показателя для бактерий вида 5>. №егторЫ1из не намного отличается от значений Г+Ц состава для близкородственных бактерий видов & ва/л/зт«, Е. с1игап5, Е. faecium, Е. IаесаНэ (табл.1). Значения Г+Ц состава всех изучаемых и референтных штаммов приведены в таблице 1 и таблице 3.

Таблица 1. Бактериальные штаммы, использованные в качестве типовых в экспериментах по гибридизации ДНК, их видовая принадлежность и Г+Ц состав.

Название штамма Вид Коллекция Г+Ц состав

АТСС19434 Е. faecium Giraffa G.

В4461 L. 1actis sp. cremoris ВКПМ 36,5

АС021 L. 1actis sp. 1actis Румер JIM. 37,1

В4610 E. faecalis ВКПМ 38,4

АТСС19258 S. thermophilus ATCC 39,6

АТСС 7073 S. saiivarius ATCC 41

1.2. Анализ сходства тотальных геномов штаммов термофильных молочнокислых бактерий по результатам ДНК-ДНК гибридизации, определяемой методом оптической реассоциации ДНК в растворе*

По результатам исследования гомологии ДНК у 53-х штаммов (предположительно относимых к виду Streptococcus thermophilus) методом оптической реассоциации ДНК в растворе подтверждено наличие в исследуемой коллекции штаммов, относящихся к пяти ранее установленным геномоварам (I-V), а также выявлен новый (VI) геномовар.

Анализ проводился с использованием в качестве референтных -шести штаммов, отнесённых к шести геномоварам: В3371 (I), 108 (II), 5 (III), 722 (IV), 6kb (V), СТ48 (VI), а также с использованием типового штамма АТСС19258 (Т). По результатам межштаммовой гибридизации все изучаемые нами штаммы были разделены на 6 геномоваров (I, II, III, IV, V, VI), в каждый из которых вошли штаммы, характеризующиеся

' Работа проводилась совместно с к.б.н. Лысенко А. М.

высокой степенью геномного сходства. Уровень геномного родства (уровень гибридизации, уровень гомологии ДНК) между штаммами, принадлежащими к одному геномовару довольно высок, он составлял 80 -98%, тогда как между штаммами разных геномоваров он составлял 20 -50% (данные представлены в таблице 2). Однако, некоторые штаммы, принадлежащие к разным геномоварам, дают сравнительно высокие уровни (до 60 %) гомологии ДНК, что может свидетельствовать о родстве между определёнными геномоварами. Обращает на себя внимание тот факт, что по отношению к типовому штамму АТСС19258 значения реассоциации ДНК у штаммов из всех групп (исключение составляет II группа) не ниже 40% (табл.2). Этот показатель может свидетельствовать о том, что штаммы изучаемой нами коллекции если и не принадлежат к одному виду, то представлены близкородственными видами молочнокислых термофильных бактерий И, хотя сравнение данных ДНК-ДНК-гибридизации собранных нами штаммов с типовым штаммом S. thermophilus АТСС19258 обнаружило показатели уровня геномного родства в пределах 40 - 50%, что, в ряде случаев недостаточно для отнесения многих изучаемых штаммов к предполагаемому виду, следует отметить, что значения геномного родства при использовании в качестве референтных штаммов видов L. lactis sp. Iactis, L. Iactis sp. cremoris, S. salivarius, E. faecium, E. faecalis были ещё ниже.

Таблица 2. Значения геномного родства (в % %) между двумя наборами штаммов термофильных стрептококков, представляющих разные геномовары. *

АТСС

В3371 108 5 722 6kb СК1019 19258

Штаммы (О (II) (III) (IV) (V) (VI) (Т)

В6448 (1) 98 25 34 31 51 35 57

СКЮОЗ(И) 35 83 23 39 23 20 36

В6403 (III) 32 26 83 50 45 30 47

704 (IV) 30 32 51 98 52 50 47

В1364 (V) 54 33 45 51 92 26 54

СК1012(VI) 31 18 35 47 19 95 53

IL1704 (Т) 62 31 48 50 41 47 89

Примечание: * В скобках - группа гомологии штамма.

Таблица 3. Штаммы бактерий, использованные в работе, характеристика субстратов их выделения, Г+Ц

состав, принадлежность к установленному геномовару.

Название Синоним г+ц Геномо

№ штамма названия Источник выделения Коллекция состав вар

1 2 3 4 5 6 7

1 АТСС19258 В7520 АТСС АТСС 39,6 Т

2 В3371 комбинированная закваска ВНИМИ 38,3 I

3 В6453 комбинированная закваска вними 39,5 I

4 В6454 комбинированная закваска ВНИМИ 38,6 I

5 В6469 комбинированная закваска ВНИМИ 38,4 I

6 В6472 комбинированная закваска ВНИМИ 39,2 I

7 В6448 комбинированная закваска ВНИМИ 39,4 I

8 СК1002 мацони, Краснодар Ботина С.Г. 38,3 I

9 СК1010 сметана рыночная, Моск. область Ботина С.Г. 39,1 I

10 СТ154 СК1029 йогурт Ганина В.И. 39,8 I

11 Т10/7 СК1030 рыночный творог, Евпатория Ганина В.И. 40 I

12 108 кисломолочный продукт, Ташкент Аверина О.В. 38,7 II

11 32 кисломолочный продукт, Ташкент Аверина О.В. 39,3 II

14 СК1003 В8328 брынза, Краснодар Ботина С.Г. 38,6 II

15 СК1004 В8253 брынза, Краснодар Ботина С.Г. 38,2 II

16 СК1013 В8250 брынза, Баку Ботина С.Г. 31,1 II

17 СК1014 В8327 брынза, Баку Ботина С.Г. 39,5 II

18 СК1017 _В8326 закваска для сыра, Углич Ботина С.Г. 39,8 II

19 5 В8251 кисломолочный продукт. Цент, регион Аверина О.В. 40,2 III

20 В2094 кисломолочный продукт, Украина ВКПМ 39,8 III

21 В2095 кисломолочный продукт, Украина ВКПМ 39,2 III

22 В2894 кисломолочный продукт, Украина ВНИМИ 38,5 I

23 521 В6403 комбинированная закваска ВНИМИ 39,3 III

24 722 В8282 кисломолочный продукт, Ташкент Аверина О.В. 38,4 IV

25 6кЬ В8252 комбинированная закваска ВНИМИ 39,1 V

26 ТВ23 ггиД-б СК1034 мутант 6кЬ Калинина Н.А. V

1 2 3 4 5 6 7

27 ТВ23 B6410 мутант 6кЬ Калинина H.A. 38,6 V

28 НК32 B6415 мутант 6кЬ Калинина H.A. 38,5 V

29 410 CK1036 мутант 6кЬ ВНИМИ 38 V

30 Т13 CK1023 самоквасный творог, Моск. область Ганина В.И. 39,6 V

31 СТ161 CK1022 йогурт Ганина В.И. 38,4 V

32 В1363 комбинированная закваска ВНИМИ 39,4 V

33 635 CK1037 комбинированная закваска ВНИМИ 38,4 V

34 229 CK1038 комбинированная закваска ВНИМИ 37,8 V

35 В1364 комбинированная закваска ВНИМИ 39,2 V

36 СК1001 закваска для сыра, ВНИКМИ Ботина С.Г. 39,6 V

37 617 B6402 комбинированная закваска ВНИМИ 38,8 V

38 НКМ CK1035 мацони Калинина H.A. 38,5 V

39 ТР20 CK1025, B8257 скисшее молоко, Московская область Ганина В.И. 39,3 VI

40 Т48 CK1026, B8256 скисшее молоко, Краснодар Ганина В.И. 39,4 VI

41 Т24 CK1028, B8255 простокваша, Белгород Ганина В.И. 39,8 VI

42 СТ138 CK1019 йогурт Ганина В.И. 38,2 VI

43 СТ9 CK1020 самоквасный к.м. продукт, Украина Ганина В.И. 38,7 VI

44 СТ14 CK1021 самоквасная простокваша, Евпатория Ганина В.И. 39 VI

45 СТ132 CK1024 самоквасная простокваша, Украина Ганина В.И. 38,6 VI

46 СТ95 CK1027 простокваша, Краснодар Ганина В.И. 39,9 VI

47 СК1012 закваска для сыра Ботина С.Г. 39,4 VI

48 IL1704 B8254 Кулакаускас С. 38,7 T

49 СК1005 йогурт Ботина С.Г. 39,2 T

50 СК1016 квашеная капуста Ботина С.Г. 38,8 T

51 S. 131 Giraffa G. T

52 S.t33 Giraffa G. T

53 S.t47 Giraffa G. T

54 B3166 скисшее молоко, Украина ВКПМ H.o.

55 B3165 скисшее молоко, Украина ВКПМ H.o.

1.3. Определение размера генома штаммов термофильных молочнокислых бактерий и анализ сходства геномной ДНК методом геномной рестрикции.

Дальнейшим этапом исследования было изучение штаммов собранной коллекции, относящихся к разным геномоварам, методом геномной рестрикции. Для штаммов термофильных стрептококков, близких по происхождению, анализ фрагментов ДНК, полученных при использовании редкощепящих рестриктаз, позволяет оценивать сходство геномов по числу общих (идентичных по величине) фрагментов рестрикции. В нашей работе метод пульс-гель электрофореза Эта!-рестриктов ДНК использовался, прежде всего, для паспортизации штаммов термофильных кокков из разных групп гомологии, что в условиях продолжительного культивирования бактерий, лишенных генетических маркеров, представляется необходимым.

Результатом данного исследования явилось то, что в нашем материале геномы с достаточно большим числом общих 5/г7а/-рестриктов встречались в основном только среди штаммов, принадлежащих к одной группе гомологии. Профили электрофореграмм Зта/-рестрикгов хромосом штаммов из разных групп гомологии (рисунок 1), как правило, очень сильно отличаются друг от друга, хотя в каждом из сравниваемых геномов может быть обнаружено некоторое число рестриктов близких по величине.

5 6 7 8 9 10 11

Рисунок 1. Образцы Srnal-рестрикции геномной ДНК штаммов из разных групп гомологии

1) конкатамеры ДНК фага Д; 2) СК1002 (I); 3) В3371 (I); 4) 5 (III); 5) В2094 (III); 6) 722 (IV); 7) СК1023 (V); 8) В1364 (V); 9) СК1021 (VI); 10) СК1026 (VI); 11) АТСС 19258 (Т).

По данным табл. 4 величина генома у большинства исследованных нами штаммов, определенная как сумма 5ша/-рестриктов, превышает 2000 т.п.н. (2 Mb), тогда как у производственных штаммов S. thermophilus, используемых в западной Европе, размер генома варьирует близко к значению 1850 т.п.н. Данных о величине геномов у отечественных производственных штаммов термофильных молочнокислых бактерий в научной литературе мы не встретили.

Таблица 4. Примерные размеры геномной ДНК у штаммов термофильных молочнокислых бактерий, принадлежащих к разным геномоварам.

Размеры геномов у штаммов (в Mb.), в скобках указан геномовар

В CK CK CK CK CK iL ATCC

3371 1004 1013 5 722 6kb 1025 1026 1028 1704 19258

(I) (II) (») (III) (IV) (V) (VI) (VI) (VI) (T) (T)

2,18 2,10 2,17 2,11 2,27 3,00 2,04 1,85 1,84 2,37 1,99

1.4. Наличие плазмид у штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

Наличие у многих молочнокислых бактериях плазмид продемонстрировано многократно разными исследователями. Поэтому значения величины геномов у изучаемых нами штаммов могли быть, хотя бы отчасти, зависимы от присутствия плазмидных ДНК среди Smal-рестриктов. Для изучения этого вопроса штаммы термофильных стрептококков (данные для некоторых из них приведены на рисунке 2), представляющих разные группы гомологии, были исследованы на присутствие плазмид. Было показано, что большинство штаммов содержат крупную плазмиду размером -120 т.п.н., а некоторые штаммы содержат и более мелкие плазмиды. В целом, оказалось, что наличие или отсутствие плазмид не имеет отношения к гомологии штамма: в каждой из групп встречались штаммы, не содержащие плазмид. Штаммы с наименьшим размером геномов - СК1026 и СК1028 (см. табл. 4) оба несут плазмиды, причем первый - не менее двух плазмид (рис. 2). Таким образом, присутствие плазмид по всей вероятности не могло привести к завышению величины генома.

Рестрикционный анализ плазмид, выделенных из штаммов, относящихся к разным геномоварам, с использованием эндонуклеаз рестрикции Pstl, Hind, показал, что обнаруженные нами плазмиды одинакового размера не идентичны.

Наличие плазмид у молочнокислых бактерий является важным свойством, так как многие производственно ценные признаки этих бактерий могут иметь плазмидную детерминацию. Однако по литературным данным термофильные молочнокислые бактерии в большинстве не содержат плазмид. Если они их и содержат, то это -маленькие, криптические плазмиды, либо плазмиды большего размера -25,5 т.п.н. [Mercenier,1990], наличие которых авторы не связывают со

способностью утилизировать углеводы и устойчивостью к антибиотикам. Поэтому сам факт наличия у изучаемых нами бактерий плазмиды р120, является важным.

Рисунок 2. Плазмидные профили штаммов термофильных молочнокислых кокков.

А: 1 - В2095; 2 - СК1002; 3 - IL1704; 4 ■ В2094; 5 - плазмида Е. coli Р121 (121т.п.н.); 6 - плазмида Е. coli RP4::D (98 т.п.н.); 7 - плазмида Е. coli RP4 (60.т.п.н.).

Б: 1 - В2094; 2 - СК1004; 3 - 722, 4 - СК1025; 5 - СК1010; 6 - В3371; 7-В2894; 6-СК1026; 9-СК1028; 10-В1364; 1 - В6448.

2. Изучение фенотипических особенностей и биохимических свойств штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

Далее нами проведен сравнительный анализ штаммов термофильных кокков с использованием стандартных микробиологических методов идентификации бактерий. Результаты проведённых тестов (была изучена ферментационная активность, устойчивость к бактериофагам, рост в неблагоприятных условиях среды, сахаролитическая активность, антибиотикоустойчивость, способность синтезировать экзополисахарид) показали, что большинство штаммов обнаруживают общие свойства как со стрептококками, так и с энтерококками.

В таблице 5 представлены результаты исследований биохимических свойств, на сновании которых принято дифференцировать роды Enterococcus и Streptococcus. Отличительным признаком бактерий рода Enterococcus является их способность расти при содержании NaCI в среде до 6,5 % и способность ферментировать эскулин, а для бактерий рода Streptococcus критическим значением содержания NaCI, при котором они способны расти, является 2% и они не способны к ферментации эскулина. В нижней части таблицы приведены значения для типовых штаммов Streptococcus thermophilus. Как видно из представленных данных, штаммы, относящиеся ко II геномовару, обладают свойствами, характерными для энтерококков.

Способность молочнокислых бактерий синтезировать экзополисахарид (данные представлены в таблице 5) является важным

производственным признаком заквасочного штамма, поскольку обеспечивает получение более вязкой текстуры продукта, что ценится при производстве йогуртов. Интересно, что этим признаком, по нашим данным, обладают штаммы, обнаруживающие сходство свойств с энтерококками.

Таблица 5. Фенотипичвские особенности штаммов термофильных кокков из разных геномоваров*.

Штамм Гено- Рост на среде М21 с Синтез Расщепление

мовар NaCI экзополиса- эскулина

5% 6% 7% харида

В6448 I - - - - +

В3371 I + - - - +

СК1004 II + + + + +

СК1013 II + + + + +

5 III + - - + -

В2094 III + + - - +

722 IV + + - + -

6kb V ± - - - +

В1364 V - - - - +

СК1025 VI + + - - +

СК1026 VI + + - - +

АТСС19258 т - - - - -

ST31 т - - - - -

примечание: "+" - наличие признака, - отсутствие признака, "±" -признак слабо выражен.

При рассмотрении других биохимических признаков обнаружено, что некоторые из штаммов также обладают свойствами характерными для энтерококков. В отечественной учебной литературе такие штаммы характеризуются как «нетипичные» штаммы вида S. thermophilus [Степаненко, 1999].

3. Генотипирование штаммов термофильных молочнокислых бактерий методом видоспецифичной ПЦР.

Уточнение видовой принадлежности штаммов молочнокислых термофильных бактерий было проведено с помощью типирования штаммов собранной коллекции с использованием метода видоспецифичной ПЦР и пар праймеров, специально подобранных и позволяющих проводить амплификацию генов, характерных для видов S. thermophilus и Е. faecium (поскольку часть штаммов по биохимическим свойствам была наиболее близка к этому виду). Для типирования штаммов S. thermophilus использовали р-гапактозидазный ген (lacZ) [Lick et al., 1996], а для типирования энтерококков ген фермента D-Ala;D-Ala

лигазы (ddl), принимающего участие в синтезе пептидогликанов [Dutka-Malenetal., 1995].

Результаты исследования (рисунок 3) показали, что ген lacZ отсутствует у большинства штаммов собранной коллекции. Он обнаружен только у типовых штаммов (АТСС19258, ST31, ST33, ST47) и у трёх штаммов, отнесённых ранее к геномоварам I и V (СК1002, СК1010, В6402). Но наиболее важный результат проведенного ПЦР-анализа - это обнаружение гена ddl Е. faeclum у штаммов, относящихся ко II, III и IV геномоварам. Таким образом, штаммы геномовара II, относятся к энтерококкам, а именно к Е. faecium, что подтверждается низкими значениями гомологии ДНК бактерий этого геномовара в отношении всех других штаммов и его особенно выраженное фенотипическое сходство с энтерококками.

-*• '< * & ¿щи.-* ш.

М 1 2 3 4 5 б М t М 2 3 4

Рисунок 3. Электрофорез фрагментов генов: A: ddl (величина 550 п.н.)

М-1 -100 bp. DNA Ladder, 1 - СК1004, 2 - СК1013, 3 - В6448, 4 - 722, 5 -АТСС19258, 6 - АТСС 19434. Б: lacZ (величина 968 п.н.)

1 - В6448, М - 100 bp. DNA Ladder, 2 - АТСС19258, 3 - S.t. 47, 4-ATCC19434.

Таким образом, на этом этапе показано присутствие среди бактерий изучаемой коллекции штаммов, относящихся к видам S. themophilus и Е. faecium. Однако большая часть штаммов геномоваров I, V, VI не обнаружила в составе своих геномов генов, характерных для этих двух видов, и потому для их идентификации был предпринят следующий этап исследования.

4. Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штаммов термофильных молочнокислых бактерий для установления их систематического положения. Филогенетический анализ генов 16S рРНК.

Для уточнения видовой принадлежности 13-ти взятых для исследования штаммов термофильных молочнокислых бактерий нами

разработан дизайн праймеров, с помощью которых была проведена амплификация гена 16S рРНК и определена его последовательность в участке, протяжённостью более 500 пар нуклеотидов (п.н.), что соответствует позициям с 50 по 580 нуклеотид гена малой рибосомной РНК у Е. coli.

При анализе результатов секвенирования с помощью компьютерных программ полученные нами последовательности сравнивали с последовательностями соответствующего сегмента гена для разных видов термофильных молочнокислых бактерий, наличие которых предполагалось в составе изучаемой коллекции, взятых из базы NSBI, а именно: S. thermophilus (AY188354, Х68418, Х59028), Е. faecium (AJ420800, AY172570, AJ291732), Е. durans (AJ276354, AJ420801, Y18359), Е. faecalis (AJ420803, AF515223, АВ022693). Из проведенного исследования следует, что большая часть изученных штаммов относится к виду Е. durans (В3371, 6kb, СК1025, СК1026, В3165, В3166, В2095), Е. faecium (СК1013, 722, 5) и только три - к виду S. thermophilus (СК1002, СК1010 и В6402). Штаммов, идентифицированных нами как Е. faecalis не обнаружено. Различия в генетических расстояниях между штаммами более наглядным образом проявляются в расположении штаммов по отношению друг к другу на филогенетическом дереве (рис. 4). Обращает на себя внимание факт обособленного положения на филогенетическом дереве штамма 722 Он имеет в анализируемом участке гена характерных только для него 7 нуклеотидных замен. В связи с этими данными следует обратить внимание на то, что штамм 722 происходит из г. Ташкента и по данным ДНК-ДНК гибридизации представляет обособленный геномовар IV. Согласно ПЦР-тесту, этот штамм несет ген ddl Е. faecium, а по результатам секвенирования он может представлять собой географически обособленный таксон в рамках вида Е. faecium.

В таблице 6 приведены результаты определения гомологии установленных нами и взятых из GenBank последовательностей гена 16S рРНК. Степень гомологии в этой таблице рассчитана исходя из генетических дистанций, которые отражают различия между штаммами в числе нуклеотидных замен в расчете на 100 п. н. в участке гена 16S рРНК протяженностью в 530 н. п. (из 1542). По данным табл. 6 штаммы, относящиеся к одному виду, имеют сходство ДНК на высоком уровне - от 98.4 до 100 %. В принципе такое же высокое сходство (97.6 - 99.6 %) между штаммами двух близкородственных видов - Е. faecium и Е. durans. В то же время между штаммами этих двух видов и штаммами S. thermophilus различия более существенные - сходство ДНК на уровне 78.4 - 80.7 % (табл. 6).

Определённые нами нуклеотидные последовательности штаммов СК1002, СК1010, СК1013, 722, 5, В3371, 6kb, СК1025 депонированы в базу данных GenBank, им присвоены идентификационные номера: AY683829, AY683830, AY683831, AY683832, AY683833, AY683834, AY683835, AY683836, соответственно.

Таблица 6. Уровень гомологии между штаммами молочнокислых термофильных энтерококков и стрептококков по результатам сравнительного анализа последовательностей участка гена 16Э рРНК.*

Штамм или группа штаммов** Степень гомологии между штаммами или группами штаммов

№№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Группа Е. f. 722 СК1013 1 100

2 98.6

3 99.8 98.4

Груши Е. d. Группа 6kb В3371 4 99.4 98.0 99.6

5 99.2 97.8 99.4 99.8

6 99.0 97.6 99.2 99.6 99.8

Группа S. t. СКЛОК) СК1002 S. t. Х68418 7 80.4 78.6 80.4 80.4 80.4 80.2

8 79.6 78.4 79.6 79.7 79.6 79.4 99.2

9 80.7 78.9 80.7 80.7 80.7 80.4 99.8 99.0

10 79.9 78.1 79.7 79.9 79.8 79.7 99.4 98.6 99.2. 100

* По результатам сравнения нуклеотидных последовательностей протяженностью в 530 пар нуклеотидов.

" Состав групп:

Е. I = Е. faecium АЛ2579, АМ20800, штамм 5;

ЕЛ = Е. (¿игапэ АМ20801, АЛ76354, В2095, СК1026, СК1025;

6кЬ = 6кЬ, В3165, В3166;

Б! = & 1ЬегторЫ1и5 АУ188364, В6402.

Несмотря на то, что на данном этапе работы определялась последовательность высококонсервативного гена близкородственных видов бактерий, использованный метод, по нашим данным, обладает разрешающей способностью для установления таксономического положения исследуемых штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

82095 СК1В25 СК1026 ;АЛ76354 А»20801 6кЬ' В3166 ВЭ165 I- В3371 СК1013 АЛ20300 АУ172570 5

722 г- СК1Ш0 ХВ84Т8 СИШ2 АУ188354 В6402

0:08

0Лв

0П4

ом

от

Рисунок 4. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов термофильных молочнокислых стрептококков и энтерококков, основанная на сходстве нуклеотидных последовательностей в участке гена 168 рРНК протяжённостью в 530 нуклеотидов.

Масштаб в нижней части рисунка (0,02) соответствует генетическому расстоянию 2%, т.е. две нуклеотидные замены на каждые 100 нуклеотидов. Длина горизонтальных ветвей дендрограммы соответствует генетическому расстоянию между последовательностями. Его можно измерить с помощью масштаба, для этого достаточно сложить длины горизонтальных ветвей, по которым нужно «пройти» от одной нуклеотидной последовательности до другой.

Условные обозначения: АМ20800, АУ172570 - Е. faecium.

АМ20801, АЛ76354 - Е. с^галв.

АУ188354, Х68418 - & ШегторЬИив.

5. Тестирование признаков патогенности у молочнокислых энтерококков методом ПЦР.

В наших предшествующих этапах исследования было показано, что многие отечественные штаммы термофильных молочнокислых бактерий, используемые в составе заквасок и рассматривавшиеся ранее как термофильные стрептококки (Streptococcus thermophilus), на самом деле относятся к энтерококкам - Enterococcus durans и Е. faecium. Естественной средой обитания энтерококков служит желудочно-кишечный тракт человека и животных. Устойчивость энтерококков к высокой температуре, а также к действию антибиотиков и разнообразных вредных факторов внешней среды (например, низких значений pH, высоких концентраций солей и т.п.) позволяет им колонизировать различные ниши и нередко служить причиной микробного заражения молочных и мясных продуктов. Энтерококки иногда рассматриваются как патогены «второго плана» и служат причиной госпитальных инфекций Хотя с другой стороны, молочнокислые бактерии рода Enterococcus обладают рядом производственно-ценных признаков (ароматообразование, протеолитическая активность, антагонистические свойства, антибиотикоустойчивость, синтез бактериоцина), что обуславливает использование этих бактерий в качестве заквасок при приготовлении сыров, в качестве пробиотиков и как природных биоконсервантов.

В зарубежной литературе исследователями проводится разграничение между следующими типами штаммов у энтерококков: 1 -штаммы, использующиеся в качестве заквасок, 2 - штаммы, выделяемые из молочных и мясных продуктов, 3 - клинические изоляты (патогенные варианты). Штаммы последнего типа в основном относятся к виду Е. faecalis и лишь небольшое их число - к Е. faecium.

Штаммы, исследованные нами с помощью различных методов, идентифицированы как Е. durans и Е. faecium, тогда как штаммов Е. faecalis не было обнаружено. Но с другой стороны, гены вирулентности, определяющие патогенность штаммов, обычно находятся на плазмидах. Поэтому может вызвать беспокойство тот факт, что большинство исследованных нами штаммов содержат крупную плазмиду - р120.

Для обнаружения возможного присутствия в геномах штаммов энтерококков генов, кодирующих признаки вирулентности, было проведено генотипирование изучаемых штаммов с использованием метода ПЦР. Гены, определение которых велось, отвечали за различные признаки патогенности у энтерококков, обеспечивающие прикрепление бактерии к поверхности зукариотической клетки (адд), синтез токсина, обеспечивающего гидролизис гемоглобина и других биоактивных компонентов клетки (gelE), синтез цитолизина (cylMBA) и его транспорт (esp).

Объектами исследования в данной работе служили штаммы термофильных молочнокислых энтерококков, в том числе 4 штамма, отнесенных Е. faecium: СК1004, СК1013, 5, 722 и 7 штаммов, отнесенных к Е. durans: В3371, В2095, 6kb, В3165, В3166, СК1025, СК1026. В

качестве контрольных штаммов использовали £ /¡аеса//в В4610, £ /аесшт АТСС19434 и 5. МегторЫГиз АТСС19258.

Согласно полученным нами данным, 3 из 4 указанных генов действительно присутствовали в контрольном штамме £ faecalis, но они не обнаруживались ни в одном из изучаемых нами штаммов энтерококков. Причём ген еэр не обнаружен нами и у контрольного штамма £ /аесаНэ (данные на рисунке не приведены).

HI I ?J*SS789 Ю <1 12 13 М Ш

IJP

«Ю . .

ш t г з V i и I » и « и о u in

pst

иг 12 3 4 $ С 7 I i 1» 111Z 11, Н Ml

fy-r -

*xt• « * »5

^ . ,, ' . 1 ««SP

Рисунок В. Электрофорез фрагментов генов:

А - адд, Б - gelE, В - cylA.

М1 и М2- маркеры размера ДНК,

образец 1 - штамм £ faecalis В4610,

2-Е. faeciumАТСС19434,

3-S. thermophilus АТСС19258,

4-14- штаммы B2095, CK1025, B3165, B3166, 722, CK1026, 5, CK1013, 6kb, B3371, CK1004, соответственно.

бактерий для решения вопроса об использовании бактерий рода Enterococcus в качестве заквасок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе данного исследования проведено изучение основных морфологических, физиолого-биохимических, производственно-ценных свойств и геномных характеристик штаммов собранной коллекции термофильных молочнокислых кокков, применяемых для производства кисломолочных продуктов. Всестороннее исследование культур позволило также провести сравнительный анализ методов таксономической идентификации, применительно к термофильным молочнокислым бактериям.

Изучение процентного состава Г+Ц-пар ДНК штаммов термофильных молочнокислых бактерий позволило предположительно отнести их к виду S. thermophilus. Нуклеотидный состав ДНК исследуемых штаммов варьировал от 37,8 до 40,0 % Г+Ц пар, что соответствует виду S. thermophilus. Однако среднее значение этого показателя для организмов данного вида не намного отличается от значений Г+Ц состава для близкородственных бактерий видов S. salivarius, Е. durans, Е. faecium, Е. faecalis. Поэтому располагая только этим показателем невозможно точно идентифицировать видовую принадлежность бактерий.

Сравнение данных ДНК-ДНК-гибридизации собранных нами штаммов с типовым штаммом S. thermophilus АТСС19258 обнаружило в ряде случаев довольно низкие показатели уровня геномного родства (30 -50%), что также не позволяло отнести многие изучаемые штаммы собранной коллекции к данному виду. Однако следует отметить, что значения геномного родства исследуемых штаммов при использовании в качестве типовых штаммов видов L. Iactis sp. Iactis, L. Iactis sp. cremoris, S. salivarius, E. faecium, E. faecalis были ещё ниже.

Использование метода геномной рестрикции позволило произвести паспортизацию изучаемых штаммов и показало широкую вариабельность штаммов по величине генома. Применение метода геномной рестрикции может быть использовано как достоверный способ паспортизации штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

Результаты проведенных микробиологических тестов показали, что большинство штаммов собранной коллекции обнаруживает общность свойств с энтерококками. В отечественной литературе такие штаммы характеризуются как «нетипичные» штаммы вида S. thermophilus. Следует отметить, что бактерии рода Enterococcus более устойчивы к неблагоприятным воздействиям окружающей среды (растут при более высокой температуре, не теряя способности ферментировать сахара, обладают устойчивостью к ряду антибиотиков, способны синтезировать экзополисахарид, обладают повышенной сахаролитической активностью) по сравнению с бактериями вида S. thermophilus. Таким образом, использование только микробиологических тестов для идентификации штаммов бактерий, могло привести к тому, что на территории России

штаммы энтерококков использовались при домашнем и промышленном производстве кисломолочных продуктов.

Наиболее точными методами для идентификации штаммов молочнокислых термофильных кокков следует считать методы видоспецифичной ПЦР с использованием пар праймеров, позволяющих проводить амплификацию генов, характерных для энтерококков и стрептококков и сравнение секвенированных последовательностей генов 168 рРНК. Данные методы позволяют наиболее точно определить видовую принадлежность близкородственных видов бактерий. При использовании этих методов штаммы бактерий нашей коллекции были идентифицированы как относящиеся к видам Е. (¡игапв, Е. faecium и & МегторЫ/ив.

ВЫВОДЫ

1. На основании данных, полученных методом ДНК-ДНК-гибридизации, подтверждено наличие в исследуемой коллекции термофильных молочнокислых бактерий штаммов, относящихся к пяти ранее установленным геномоварам (I-V), а также выявлен новый (VI) геномовар.

2. Показано, что штаммы термофильных молочнокислых кокков обнаруживают широкое разнообразие физиологических и биохимических признаков. Часть штаммов по своим биохимическим свойствам обнаруживают сходство с бактериями рода Enterococcus.

3. Обнаружена широкая вариабельность исследуемых штаммов по фрагментам рестрикции и величине геномов. Показано, что метод геномной рестрикции может быть использован для паспортизации штаммов термофильных молочнокислых бактерий У большинства штаммов обнаружена плазмида размером около 120 т.п.н.

4. В результате изучения штаммов термофильных молочнокислых бактерий с использованием метода видоспецифичной ПЦР на присутствие в составе их геномов генов ddl Е. faecium и lacZ S. thermophilus показано, что большинство исследуемых штаммов не относятся к виду S. thermophilus, а штаммы геномоваров II, III, IV представлены бактериями вида Б. faecium.

5. На основании определения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК установлено систематическое положение штаммов как относящихся к видам: S. thermophilus, Е. durans и Е. faecium. Подтверждено, что данный метод позволяет осуществить наиболее точную идентификацию видовой принадлежности штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

6. Показано отсутствие генов вирулентности (адд, gelE, cylA), свойственных патогенным энтерококкам, у штаммов, идентифицированных как Е. durans, Е. faecium. Предложено использовать данный метод для определения риска использования штаммов молочнокислых энтерококков в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ботина С.Г., Суходолец В.В., Лысенко А.М. Дивергенция по гомологи ДНК среди отечественных штаммов Streptococcus thermophilus. / Материалы Всероссийской научной конференции «Экологические проблемы и пути их решения в зоне среднего Поволжья». С. 181 - 182. Саранск: 27 - 30 сентября 1999 г.

2. Лысенко А.М., Ботина С.Г.. Ганина В.И., Суходолец В.В. Дивергенция по уровню гибридизации ДНК и образование видов-двойников у молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus. II Микробиология.

2001. Т. 70. №1. С. 70-76.

3. Ботина С.Г.. Лысенко А.М., Суходолец В.В., Тренина М.А. Сравнение геномов у штаммов молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus различного происхождения. II Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 819 -823.

4. Лысенко А.М., Ботина С.Г., Суходолец В.В. Подтверждение систематического положения Streptococcus salivarius. II Микробиология.

2002, Т. 71. №5. С. 713-716.

5. Ботина С.Г., Лысенко А.М., Суходолец В.В. Дивергенция по гомологии ДНК среди отечественных штаммов Streptococcus thermophilus, использующихся в качестве заквасок при производстве молочнокислых продуктов. / Материалы Международной научной конференции: «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий». С. 71 - 72. Саранск: 12-15 сентября 2002 г.

6. Ботина С.Г.. Лобанов А.О., Лысенко А.М., Суходолец В.В. Генетическое многообразие штаммов молочнокислых термофильных бактерий на территории стран СНГ. // Биотехнология. 2004. Т. 2, С. 3 -12.

7. Ботина С. Г. Изучение плазмидного состава и устойчивости к бактериофагам штаммов молочнокислых термофильных стрептококков, использующихся при приготовлении различных кисломолочных продуктов. / Материалы Международной научной конференции: «Наука и бизнес. Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина». С. 119 -121. Пущино: 17-19 марта 2004 г.

8- Ботина С. Г. Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК у штаммов молочнокислых термофильных бактерий для установления их систематического положения. / Материалы Международной научной конференции: «Наука и бизнес. Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина». С. 122 -124. Пущино: 17 -19 марта 2004 г.

9. Ботина С.Г., Лысенко А.М., Суходолец В В. Выяснение таксономического положения отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий по данным секвенирования генов 16S рРНК. И Микробиология (в печати).

10. Ботина С.Г.. Суходолец В.В. Отечественные штаммы энтерококков, используемые в качестве заквасок, не содержат генов вирулентности, обычно присутствующих в патогенных штаммах Е. faecalis. II Биотехнология (в печати).

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 20.10.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 75 экз. Заказ 1067. Тел. 939-3890, 939-3891, 928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова. 2-й учебный корпус, 627 к.

РНБ Русский фонд

2005-4 34018

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ботина, Светлана Геннадиевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1. Развитие представлений о методах классификации бактерий.

1.1. Виды информации, используемые в бактериальной таксономии.

1.2. Генотипические методы определения таксономической принадлежности и родства микробных культур.

1.2.1. Определение соотношения азотистых оснований в ДНК (Г+Ц состав) и уровня геномного родства методом ДНК-ДНК-гибридизации

1.2.2. Методы типирования ДНК.

1.2.2.1. Типирование, основанное на изучении хромосомных и плазмидных профилей штаммов бактерий.

1.2.2.2. Типирование, основанное на использовании метода полимеразной цепной реакции.

1.2.3. Секвенирование рибосомных РНК как метод, позволяющий наиболее точно проводить таксономическую идентификацию бактерий .22 1.3. Сравнительный анализ методов ДНК-ДНК-гибридизации и определения нуклеотидной последовательности гена 168 рРНК при идентификации бактерий на разных таксономических уровнях.

2. Методы, используемые для идентификации и классификации молочнокислых бактерий.

2.1. Проблемы идентификации и классификации термофильных молочнокислых кокков.

2.2. Свойства штаммов молочнокислых бактерий и методы, применяемые для их идентификации.

2.2.1.Фенотипические свойства термофильных молочнокислых бактерий.

2.2.2. Особенности Г+Ц состава молочнокислых бактерий.

2.2.3. Применение метода ДНК-ДНК-гибридизации для идентификации молочнокислых бактерий.

2.2.4. Применение метода геномной рестрикции для идентификации молочнокислых бактерий.

2.2.5. Плазмиды молочнокислых бактерий.

2.2.6. Использование метода ДНК-типирования с помощью ПЦР для идентификации молочнокислых бактерий.

2.2.7. Использование данных анализа нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК для идентификации молочнокислых бактерий и установления их филогенетического родства.

3 Изучение молочнокислых бактерий с точки зрения их практического применения.

3.1. Молочнокислые бактерии как закваски.

3.2. Молочнокислые бактерии как пробиотики животных и человека.

3.3. Свойства культур молочнокислых бактерий, обеспечивающие их использование как заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотиков.

3.3.1. Антагонистические свойства молочнокислых бактерий.

3.3.2. Способность ароматообразования у молочнокислых бактерий.

3.3.3. Фагоустойчивость молочнокислых бактерий.

3.4. Энтерококки как стартовые культуры при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотиков.

3.5. Патогенные энтерококки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Объекты и методы исследований.

1. Штаммы и условия культивирования.

1.1. Объекты исследований.

1.2. Среда и условия культивирования термофильных молочнокислых бактерий.

2. Методы исследований.

2.1. Микробиологические методы исследования.

2.2. Генетические и молекулярно-биологические методы исследования.

2.2.1. Выделение ДНК.

2.2.2. Анализ ДНК.

2.2.3. Амплификация генов и фрагментов генов.

2.2.4. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена 168 рРНК.

2.3. Филогенетический анализ.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

1. Идентификация отечественных штаммов термофильных молочнокислых стрептококков с использованием подходов, основанных на изучении сходства их геномов.

1.1. Определение нуклеотидного состава ДНК у штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

1.2. Анализ сходства тотальных геномов штаммов термофильных молочнокислых бактерий по результатам

ДНК- ДНК-гибридизации.

1.3. Определение размера геномов термофильных молочнокислых бактерий и анализ сходства хромосомной ДНК методом геномной рестрикции и пульс-гель электрофореза.

1.4. Изучение плазмидных профилей штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

2. Изучение фенотипических особенностей и биохимических свойств термофильных молочнокислых бактерий.

2.1. Микроскопирование.

2.2. Изучение ферментационной активности термофильных молочнокислых кокков.

2.3. Сравнительный анализ степени термофильности молочнокислых термофильных кокков.

2.4. Изучение способности штаммов термофильных молочнокислых бактерий к росту при повышенных концентрациях NaCl в среде.

2.5. Изучение способности штаммов термофильных молочнокислых бактерий синтезировать экзополисахарид.

2.6. Способность штаммов термофильных молочнокислых бактерий ферментировать эскулин.

2.7. Способность штаммов термофильных молочнокислых бактерий ферментировать различные сахара.

2.8. Устойчивость штаммов термофильных молочнокислых бактерий к бактериофагам.

2.9. Устойчивость штаммов термофильных молочнокислых бактерий к различным антибиотикам.

2.10. Способность штаммов термофильных молочнокислых

• бактерий к гемолизу.

3. Генотипирование штаммов термофильных молочнокислых бактерий методом видоспецифичной полимеразной цепной реакции (species-specific PCR).

4. Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК штаммов термофильных молочнокислых бактерий для установления их систематического положения. Филогенетический анализ результатов сравнения генов 16S рРНК.

5. Тестирование признаков вирулентности у молочнокислых энтерококков методом ПЦР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и характеристика отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов"

Постановка проблемы и её актуальность.

Разнообразие кисломолочных продуктов обусловлено применением бактериальных заквасок, состав которых представлен различными видами молочнокислых бактерий. Наиболее широко для производства кисломолочных продуктов используются культуры мезофильных лактококков и термофильных стрептококков. Специфика вкуса, консистенция и ряд других свойств кисломолочных продуктов зависят от штаммов, входящих в состав бактериальной закваски. Способность термофильных молочнокислых бактерий расти и размножаться при температуре 42-45°С является важным условием технологического процесса, связанного с производством таких кисломолочных продуктов как йогурт и некоторые виды сыров.

В последнее время возрос интерес к изучению именно термофильных молочнокислых бактерий. В большей степени это связано с развитием молочной промышленности в мире вообще и в России в частности и как следствие этого производством новых кисломолочных продуктов и поиском новых штаммов молочнокислых бактерий, пригодных для их использования в качестве заквасок. Однако до сих пор штаммы, использующиеся как закваски в России и странах СНГ, недостаточно изучены, нет чётко выработанной схемы, по которой бы определялась не только технологическая пригодность, но и безопасность использования вновь внедряемых в молочную промышленность культур бактерий.

Молочнокислые бактерии выделяют из различных источников: самоквасных кисломолочных продуктов, частей растений, в частности цветов, а также с овощей и фруктов. Поэтому очень важно правильно провести все этапы выделения и идентификации для определения видовой принадлежности бактерий, в дальнейшем планируемых для использования в качестве заквасок. До недавнего времени идентификация и классификация молочнокислых бактерий проводилась на основе изучения морфологических, физиологических и биохимических признаков. Очевидная ограниченность этих методов требует для более точной идентификации микроорганизмов исследований геномных характеристик, что является особенно важным в отношении штаммов, рекомендуемых для использования при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотиков. Отечественные штаммы термофильных молочнокислых бактерий, использующиеся в пищевой промышленности, практически не анализировались по генотипическим характеристикам и их уровень дивергенции по сравнению с зарубежными штаммами и типовыми культурами не изучен [Ганина и др., 1999]. Так, например, отнесение многих промышленных штаммов термофильных стрептококков к виду Streptococcus thermophilus было условным вследствие недоступности ранее многих методов идентификации бактерий. В связи с этим несомненный интерес представляют исследования с применением различных методов идентификации молочнокислых термофильных бактерий, вводимых в состав бактериальных заквасок для получения кисломолочных продуктов.

Предыстория работы.

В лаборатории генетики бактерий ГосНИИгенетики (зав. лаб. - проф. Суходолец В. В.) была проведена совместная работа с лабораторией Института Микробиологии РАН (с.н.с. Лысенко А. М.), по изучению штаммов молочнокислых термофильных бактерий, использующихся в качестве заквасок при производстве различных кисломолочных продуктов. Среди изучаемых штаммов различного происхождения, идентифицированных ранее (на основании микробиологических тестов и данных ДНК-ДНК-гибридизации) как Streptococcus thermophilus было выявлено 5 обособленных групп гомологии. Внутри отдельных групп геномоваров1) уровень геномного родства составил 80-90%, тогда как между штаммами из разных групп обычно реассоциировало 20-60% ДНК. Столь низкие значения геномного родства в рамках вида ЖегторИИт могли быть результатом горизонтального переноса и накопления чужеродных адаптивных генов в геномах исследуемых штаммов. Но, с другой стороны, эти данные могли указывать на возможное присутствие в изученной группе штаммов, определяемых как 1кегторЫ1и5, других видов молочнокислых термофильных бактерий. Таким образом, причины выявленного полиморфизма по уровню геномного родства между штаммами одного вида оставались не ясными, что потребовало применения современных методов изучения генома для точного установления систематического положения изучаемых штаммов.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлась идентификация и характеристика отечественных штаммов термофильных молочнокислых стрептококков, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов.

В процессе выполнения работы были поставлены и решены следующие задачи:

1. Создание коллекции штаммов термофильных молочнокислых кокков.

2. Идентификация и характеристика штаммов термофильных молочнокислых бактерий на основании изучения их фенотипических и биохимических свойств.

3. Идентификация отечественных штаммов термофильных молочнокислых кокков с использованием подходов, основанных на изучении их генома.

1 Термин геномовар в таксономическом отношении строго не определён и может практически соответствовать как разным видам (для которых фенотипические различия пока не установлены), так и разным расам в рамках одного и того же вида [ЯоззеНо-Мога, Ашапп, 2001].

4. Оценка безопасности штаммов термофильных молочнокислых кокков, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов, путём определения в составе их геномов генов, кодирующих признаки вирулентности.

Научная новизна работы.

1. На примере штаммов бактерий собранной коллекции проведена идентификация и дана характеристика штаммам термофильных молочнокислых бактерий, использующимся при изготовлении кисломолочных продуктов на территории России и стран СНГ.

2. Проведена оценка безопасности культур термофильных молочнокислых кокков в случае их использования в пищевой промышленности.

3. Изучена разрешающая способность разных методов исследования, использующихся при идентификации и таксономической классификации штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

Практическая значимость работы.

1. Получено представление о таксономическом положении штаммов, использующихся в качестве заквасок на территории России и южных регионов СНГ.

2. Даны рекомендации о возможности использования изученных штаммов в качестве стартовых культур.

3. Продемонстрирована разрешающая способность используемых в работе методов для оценки таксономического положения штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

4. Сделано заключение о приемлемости полученных в ходе исследования результатов для анализа культур, внедряемых в производство кисломолочных продуктов и для характеристики степени их безопасности.

5. Методы, используемые в работе, рекомендуются для использования в лабораториях, занимающихся выделением и идентификацией новых культур с целью применения их как заквасок в молочной промышленности.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ботина, Светлана Геннадиевна

ВЫВОДЫ

1. На основании данных, полученных методом ДНК-ДНК-гибридизации, подтверждено наличие в исследуемой коллекции термофильных молочнокислых бактерий штаммов, относящихся к пяти ранее установленным геномоварам (1-У), а также выявлен новый (VI) геномовар.

3. Обнаружена широкая вариабельность исследуемых штаммов по фрагментам рестрикции и величине геномов. Показано, что метод геномной рестрикции может быть использован для паспортизации штаммов термофильных молочнокислых бактерий. У большинства штаммов обнаружена плазмида размером около 120 т.п.н.

4. В результате изучения штаммов термофильных молочнокислых бактерий с использованием метода видоспецифичной ПЦР на присутствие в составе их геномов генов с1<Л1 Е. /аесгит и 1ас2 5. г/гегторкИш показано, что большинство исследуемых штаммов не относятся к виду 5. А^егторЬИиз, а штаммы геномоваров II, III, IV представлены бактериями вида Е./аесгит.

5. На основании определения нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК установлено систематическое положение штаммов как относящихся к видам: £ гкегторИИш, Е. йигат и Е. /аестт. Подтверждено, что данный метод позволяет осуществить наиболее точную идентификацию видовой принадлежности штаммов термофильных молочнокислых бактерий.

6. Показано отсутствие генов вирулентности (gelE, су1А), свойственных патогенным энтерококкам, у штаммов, идентифицированных как Е. (Яигат, Е. /аесгит. Предложено использовать данный метод для определения риска использования штаммов молочнокислых энтерококков в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение процентного состава Г+Ц-пар ДНК штаммов изучаемых бактерий позволило предположительно отнести их к виду 5. ЖегторкИт. Нуклеотидный состав ДНК исследуемых штаммов варьировал от 37,8 до 40,0 % Г+Ц пар, что соответствует виду 5. МегторНИш. Однако среднее значение этого показателя для организмов данного вида не на много отличается от значений Г+Ц состава для близкородственных бактерий видов 5. заШапш, Е. с1игат, Е. /аесшт, Е. /аесаШ. Поэтому располагая только этим показателем, по видимому, невозможно точно идентифицировать видовую принадлежность бактерий.

Сравнение данных ДНК-ДНК-гибридизации собранных нами штаммов с типовым штаммом (ИегторкИиз АТСС19258 обнаружило довольно низкие показатели уровня геномного родства (30 - 50%), что недостаточно для отнесения многих изучаемых штаммов собранной коллекции к предполагаемому виду. Однако следует отметить, что значения геномного родства при использовании в качестве типовых штаммов видов Ь. \actis зр. \actis, Ь. 1асШ Бр. сгетопБ, 5". эаНуапт , Е. /аесшт, Е./аесаНБ были ещё ниже.

Использование метода геномной рестрикции позволило произвести паспортизацию штаммов изучаемой нами коллекции и показало широкую вариабельность штаммов по величине генома и сходству фрагментов рестрикции.

Результаты проведённых микробиологических тестов (была изучена ферментационная активность, устойчивость к бактериофагам, рост при повышенной температуре инкубации и в неблагоприятных условиях среды, сахаролитическая активность, антибиотикоустойчивость, способность синтезировать экзополисахарид) показали, что большинство штаммов собранной коллекции обнаруживают общность свойств с энтерококками. В литературе такие штаммы характеризуются как «нетипичные» штаммы вида 5. ^егторкИиъ. Следует отметить, что бактерии рода Ешегососст более устойчивы к неблагоприятным воздействиям окружающей среды (растут при более высокой температуре, не теряя способности ферментировать сахара, обладают устойчивостью к ряду антибиотиков, способны синтезировать экзополисахарид, обладают повышенной сахаролитической активностью) по сравнению с бактериями вида & ЖегторкИж. Таким образом, не исключено, что использование только микробиологических тестов для идентификации штаммов бактерий, могло привести к тому, что на территории России штаммы энтерококков могли использоваться при домашнем и промышленном производстве кисломолочных продуктов.

Наиболее точными методами для идентификации штаммов молочнокислых термофильных кокков мы считаем методы видоспецифичной ПЦР с использованием пар праймеров, позволяющих проводить амплификацию генов, характерных для энтерококков и стрептококков и сравнение секвенированных последовательностей генов 168 рРНК. Данные методы позволяют наиболее точно определить видовую принадлежность близкородственных видов бактерий. При использовании этих методов штаммы бактерий нашей коллекции были идентифицированы как относящиеся к видам Е. с1игат, Е. /аесшт и 5. ЖегторНИш.

Молочнокислые штаммы бактерий рода ЕМегососсш обладают рядом производственно-ценных признаков (ароматообразование, протеолитическая активность, антагонистические свойства, антибиотикоустойчивость, синтез бактериоцина), что обуславливает использование этих бактерий в качестве заквасок при приготовлении сыров, в качестве пробиотиков и как природных биоконсервантов. Однако энтерококки, выделенные из различных кисломолочных продуктов, могут являться загрязнителями и вызывать у человека отравления. Поэтому, для использования бактерий Е. /аесшт, Е. с1игаю как заквасок важно учитывать не только наличие у них ряда ценных производственных признаков, но и отсутствие детерминированных признаков вирулентности. Для обнаружения наличия в геноме штаммов бактерий энтерококков генов, кодирующих различные признаки вирулентности, было проведено генотипирование изучаемых штаммов с использованием метода ПЦР. Гены, определение которых велось, отвечали за различные признаки патогенности у энтерококков, обеспечивающие прикрепление бактерии к поверхности эукариотической клетки, синтез токсина, обеспечивающего гидролизис гемоглобина и других биоактивных компонентов, синтез цитолизина и его транспорт. В составе штаммов собранной нами коллекции и идентифицированных как Е. /аесшт и Е. йигат тестируемых генов вирулентности не обнаружено, что обуславливает возможность использования данных штаммов в качестве заквасок.

Таким образом, проведённые исследования показывают, что для наиболее точной идентификации микроорганизмов необходимы исследования не только физиолого-биохимических свойств, но и геномных характеристик, что особенно важно для штаммов, рекомендуемых при производстве кисломолочных и лечебно-профилактических продуктов, и пробиотиков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ботина, Светлана Геннадиевна, Москва

1. Аверина О.В., Лысенко A.M., Ермакова J1.M., Огай Д.К., Суходолец В.В. Сравнительное изучение гомологии ДНК у штаммов термофильных и мезофильных молочнокислых стрептококков различного происхождения // Микробиология. 1998. Т. 67. № 6. С. 792-798.

2. Антипов В.А., Субботин В.М. Эффективность и перспективы применения пробиотиков // Ветеринария. 1980. №12. С. 65 67.

3. Ганина В.И., Лысенко A.M., Шалыгина A.M., Ермакова Л.М. Изучение геномных характеристик мезофильных лактококков и термофильных молочнокислых стрептококков, используемых для получения кисломолочных продуктов// Биотехнология. 1999. №2. С. 9-14.

4. Калинина H.A., Ганина В.И., Суходолец В.В. Плазмидный состав и контроль араматообразования у производных штаммов лактококков // Биотехнология. 1994. № 8. С. 7 10.

5. Калинина H.A., Молотова Н.О., Ганина В.И., Суходолец В.В. Изучение фагоустойчивости и плазмидных профилей штаммов молочнокислых бактерий, используемых в составе заквасок при производстве творога и сметаны // Биотехнология. 1991. № 6. С. 33 -35.

6. Коршунов В.И., Синицына H.A., Тинодман Т.А., Цинигин В.В. Коррекция микрофлоры кишечника при химиотерапевтическом дисбактериозах с помощью аутоштаммов бифидобактерий // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1985. №6. С 20 25.

7. Лысенко A.M., Гальченко В.Ф., Черных H.A. Таксономическое изучение облигатных метанотрофных бактерий методом ДНК-ДНК гибридизации // Микробиология. 1988. Т. 57. Вып. 5. С. 816-822

8. Лысенко A.M., Карпушина С.Г., Суходолец В.В. Дивергенция по гомологии ДНК среди отечественных штаммов Streptococcus thermophilus //Микробиология. 1999. Т. 68. N4. С. 514-518.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М: Мир. 1984. 479 с.

10. Молотов C.B., Алхимова P.A., Пименова Н.В., Суходолец В.В. Получение и свойства мутантов молочнокислых стрептококков, дефектных по способности утилизации глюкозы // Биотехнология. 1994. № 11 12. С. 9— 12.

11. Молотоова Н.О., Танина В.И., Молотов C.B., Суходолец В.В. исследование фагоустойчивости и плазмидных профилей у мутантов производственных штаммов лактококков, дефектных по способности к сбраживанию Сахаров // Биотехнология. 1993. №3. С. 9 11.

12. Нечаева A.A., Калинина H.A., Суходолец В.В. Изучение плазмидных профилей и стабильности производственных штаммов лактококков // Генетика. 1995. Т. 31. № 9. С. 1210-1217.

13. Нечаева A.A., Суходолец В.В. Генетическое изучение производственных штаммов Lactococcus lactis: выявление трансмиссибельных плазмид по признаку сбраживания лактозы // Генетика. 1996. Т. 32. N 2. С. 218 227.

14. Прозоров A.A. Горизонтальный перенос генов у бактерий // Усп. совр. биол. 2000. Т. 120. № 6. С. 515-528.

15. Сафонов Т.А., Калинина Т.А., Романова В.А. Пробиотики как фактор стабилизирующий здоровье животных // Ветеринария. 1992. № 7 8. С. 3 - 4.

16. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. Учебник для ВУЗов. Сергиев Посад: ООО "Все для Вас - Подмосковье", - 1999. 415 с.

17. Суходолец В.В. Механизмы вертикальной эволюции // Успехи совр. биол. 1997. Т. 117. Вып. 5. С. 517 533.

18. Тетровская В.Т., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии // Медицина. 1976. С. 34 36.

19. Тренина М.А., Лысенко A.M., Суходолец В.В. Изменчивость плазмидного набора штамма Lactococcus lactis 195 // Микробиология. 1997. Т. 66. № 2ю С. 233 -236.

20. Турова Т.П. Мультикопийность рибосомных оперонов прокриот и её влияние на проведение филогенетического анализа // Микробиология. 2003. Т.72. № 4. С. 437 452.

21. Турова Т.П. Применение данных ДНК-ДНК-гибридизации и анализа генов 16S рРНК для решения таксономических проблем на примере порядка Haloanaerobiales. // Микробиология. 2000. Т. 69. № 6. С. 741 752.

22. Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Новикова Е.В., Полтараус А.Б., Назина Т.Н. Гетерогенность нуклеотидных последовательностей генов 16S рибосомальной РНК типового штамма Desulfotomaculum kuznetsovii // Микробиология. 2001. Т. 70. № 6. С. 788 795.

23. Хоулт Дж. (ред.) Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир. 1980. 495 с.

24. Agerbaek М., Gerdes L.U., Richelsen В. Hypocholesterolaemic effect of a new fermented milk product in healthy middle aged men // Eur. J Clin. Nutr. 1995. V. 49(5). P. 346- 352.

25. Agerholm-Larsen L., Bell M.L., Grunwald G.K., Astrup A. The effect of a probiotic milk product on plasma cholesterol: a meta-analysis of short-term intervention studies // Eur. J. Clin. Nutr. 2000. V. 54(11). P. 856 860.

26. Agerholm-Larsen L., Raben A., Haulrik N., Hansen A.S., Manders M., Astrup A. Effect of 8 week intake of probiotic on risk factors for cardiovascular diseases // Eur. J. Clin. Nutr. 2000. V. 54(4). P. 288 897.

27. Amann R., Glocker F-O., Neef A. Modern methods in subsurface microbiology: in situ identification of microorganisms with nucleic acid probes. // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. P. 191 -200.

28. Amann R., Ludwig W. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology.// FEMS Microbiol. Rev. 2000. V.24 P. 555 565.

29. Amann R.I., Ludvig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143- 169.

30. Anderson D.G., McKay L.L. Simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci // Appl. Env. Microbiol. 1983. V. 46. P. 549-552.

31. Anderssen A., Geis A., Krusch U., Teuber M.Plasmid-muster milchwirtchaftlich genutzter Starterkulturen //Milchwirtchaft 1984. V. 39. N 3. P. 140- 143.

32. Andrighetto C., Kniff E., Lombardi A., Torriani S., Vancanneyt M., Kersters K., Swings J., Dellaglio F Phenotypic and genetic diversity of enterococci isolated from Italian cheeses // J. Dairy Res. 2001. V. 68(2). P. 303 316.

33. Arizcun C., Barcina Y., Torre P. Identification and characterization of proteolyc activity of Enterococcus spp. Isolated from milk and Roncal and Idiazabal cheese // Int. J. Food Microbiol. 1997. V. 38. P. 17 24.

34. Aymerich T., Martin B., Garriga M., Hugas M. Microbial quality and direct PCR identification of lactic acid bacteria and nonpathogenic Staphylococci from artisanal low-acid sausages // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69(8). P. 4583-4594.

35. Baruzzi F., Matarante A., Morea M., Cocconcelli P.S. Microbial community dynamics during the Scamorza almurana cheese natural fermentation // J. Dairy. Sei. 2002. V. 85(6). P. 1390- 1397.

36. Bellomo G., Mangiagle A., Nicastro L., Frigerio L. // Curr. Ther. Res. 1980. V. 28. P. 927 934.

37. Boutrou R., Thuault D., Bourgeois C.M. Identification and characterization of Streptococcus thermophilus strains by pulsed-field gel electrophoresis // J. Appl. Bacteriol. 1995. V. 79. P. 454-458.

38. Bridge P.D., Sheath P.H.A., Numerical taxonomy of Streptococcus II J. Gen. Microbiol. 1983. V.129. P. 565 579.

39. Bridge P.G., Sneath P.H.A. Streptococcus gallinarum sp.nov. and Streptococcus oralis sp. nov. //Int. J. Syst. Bact. 1982.V. 32. P. 410 415.

40. Cai Y., Matsumoto M., Benno Y. Bifidobacterium lactis Meile et al. 1997 is a subjective synonym of Bifidobacterium animalis (Mitsuoka 1969) Scardovi and Trovatelli 1974 //Microbiol. Immunol. 2000. V. 44. P. 815 820.

41. Callon C., Millet L., Montel M.C. Diversity of lactic acid bacteria isolated from AOC Salers cheese // J. Dairy Res. 2004. V. 71. P. 231 244.

42. Chassy B.M., Beall J.R., Bielawski R.M., Porter E.V., Donkersloot J.A. Occurrence and distribution of sucrose-metabolizing enzymes in oral streptococci. // Infect. Immun. 1976. V. 14(2). P. 408 415.

43. Chevallier B., Hubert J.C., Kammerer B. Determination of chromosome size and number of rrn loci in Lactobacillus plantarum by pulsed-field gel electrophoresis. // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 120(1-2). P. 51 56.

44. Chopin A., Langella P., analogies de profiles plasmidiques chez les streptocoques du groupe N // Le Lait. 1982. V. 62. P. 705 719.

45. Cocolin L., Rantsiou K., Iacumin L., Urso R., Cantoni C., Comi G. Study of ecology of fresh sausages end characterization of populations of lactic acid bacteria by molecular methods // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 1883 -1894.

46. Cocolin L., Rantsiou K., Iacumin L., Urso R., Cantoni C., Comi G. Study of the ecology of fresh sausages and characterization of populations of lactic acid bacteria by molecular methods // Appl. Environ. Microbiol. 2004 V. 70(4). P. 1883 1894.

47. Collins M.D., Ash C., Farrow J.A., Willbanks S., Williams A.M. 16S ribosomal ribonucleic acid sequence analyses of lactococci and related taxa. Description of Vagococcus fluvialis gen. nov., sp. nov. // J. Appl. Bacteriol. 1989. V. 67. P. 453-460.

48. Collins M.D., Rodrigues U., Pigott N.E., Facklam R.R. Enterococcus dispar sp. nov. a new Enterococcus species from human sources 11 Lett. Appl. Microbiol. 1991. V. 12. P. 95-98.

49. Colwell R.R. Polyphasic taxonomy of the genus Vibrio: numerical taxonomy of Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and related Vibrio species. // J. Bacteriol. 1970. V. 104. P. 410 433.

50. Dalton T.L., Scott J.R. CovS inactivates CovR and required for growth under conditions of general stress in Streptococcus pyogenes. II J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 3928-3937.

51. De Ley J. Modern molecular methods in bacterial taxonomy: evolution, application, prospects. 1978. / In: Proc. 4th Int. Conf. Plant Pathogenic bacteria. V 1. Gilbert-Clarey, Tours, France.

52. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates // Eur. J. Beochem. 1970. V. 12. P. 133 — 142.

53. Deasy B.M., Rea M.C., Fitzgerald G.F., Cogan T.M., Berestford T.R A rapid PCR based method to distinguish between Lactococcus and Enterococcus // Syst. Appl. Microbiol. 2000. V. 23. P. 510 522.

54. Delgado S., Delgado T., Mayo B. Technological performance of several Lactococcus and Enterococcus strains of dairy origin in milk // J. Food. Prot. 2002. V. 65.(10). P. 1590- 1596.

55. Desiere F., Lucchini S., Canchaya C., Ventura M., Brussow H. Comparative genomics of phages and prophages in lactic acid bacteria. // Antonie Van Leeuwenhoek. 2002. V. 82(1-4). P. 73 91.

56. Donabedian S., Chow J.W., Shlaes D.M., Green M., Zervos M.J. DNA hybridization and contour-clamped homogeneous electric field electrophoresis for identification of enterococci to the species level //J. Clin. Microbiol. 1995 V. 33. P.141 145.

57. Dubernet S., Desmasures N., Guegyen M. A PCR-based methods for identification of lactobacilli at the genus level // FEMS Microbiol Lett. 2002. V. 214(2). P. 271 -275.

58. Dutka-Malen S., Evers S., Courvalin P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR// J. Clin. Microbiol. 1995. V. 33. P. 24 -2 7.

59. Eaton T.J., Gasson M.J. Molecular screening of Enterococcus virulens determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates // Appl. and Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 1628 1635.

60. Ercolini D., Moschetti G., Biaiotta G., Coppola S. Behavior of variable V3 region from 16S rDNA of lactic acid bacteria in denaturing gradient gel electrophoresis //Curr. Microbiol. 2001. V. 42. P. 199 202.

61. Facklam R. Hollis D., Collins M.D. Identification of gram-positive coccal and cocobacillary vancomicin-resistant bacteria // J. Clinic. Microbiol. 1989. V 27. N4. P. 724-730.

62. Farrow J.A.E., Collins M.D. DNA base composition, DNA-DNA homology and long-chain fatty acid studies on Streptococcus thermophilus and Streptococcus salivarius // J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P. 357-362.

63. Fernandes C.F., Shahani K.M., Amer M.A. Therapeutic role of dietary lactobacilli fermented dairy products // FEMS Microbiol. Rev. 1987. v. 46. P. 343 -356.

64. Fertally S.S., Facklam R. Comparison of physiologic tests used to identify non-beta-hemolytic aerococci, enterococci, and streptococci // J. Clinic. Microbiol. 1987. V. 25. P. 1845- 1850.

65. Fitz-Gibbon S.T., House C.H. Whole genome-based phylogenetic analysis of free-living microorganisms // Nucl. Acid. Res. 1999. V 27. P. 4218 4222.

66. Forde A., Fitzgerald G.F. Molecular organization of exopolysaccharide (EPS) encoding genes on the lactococcal bacteriophage adsorption blocking plasmid, pCI658 // Plasmid. 2003. V. 49(2). P. 130 142.

67. Fox G.E., Wisotzkey J.D., Jurshuk P. How close is close: 16S rRNA sequene identity may not be sufficient to quarantee species identity. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. P. 166 170.

68. Franz C.M., Stiles M.E. Schleifer K.H. Holzapfel W.H. Enterococci in foods -a conundrum for food safety // Int. J. Food Microbiol. 2003. V. 88. P. 105 -122.

69. Fujita Y., Okamoto T., Irie R. Plasmid distribution in lactic streptococci // Agric. Biol. Chem. 1984. v. 48. N 7. P. 1885 1898.

70. Fuller R. Probiotics in man and animals // Appl. Bacteriol. 1989. V. 66. P. 365 -378.

71. Gagnaire V., Piot M., Camier B., Vissers J.P., Jan G., Leonil J> Survey of bacterial proteins released in cheese: a proteomic approach // Int. J. Food Microbiol. 2004. V. 94. P. 185 201.

72. Galli D., Lottspeich F., Wirth R. Sequence analysis of Enterococcus faecalis aggregation substance encoded by the sex pheromone plasmid pADl // Mol. Microbiol. 1990. V. 4. P. 895 904.

73. Garvie E.I., Farrow J.A.E. Sub-divisions within the genus Streptococcus using deoxyribonucleic acid/ribosomal ribonucleic acid hybridization I I Zbl. Bakt.Hyg. I. Abt. Orig. C2. 1981. P. 299 310.

74. Gasson M. J. Genetic engenering: thechniques and potential // Develop. Food Microbiol. 1986. N 2. P. 7 10.

75. Gasson M.J. Progress and potential in biotechnology of lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 12. P. 3 20.

76. Gelsomino R., Vancanneyt M., Cogan T.M., Condon S., Swings J. Source of enterococci in a farmhouse raw-milk cheese. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68(7). P. 3560- 3565.

77. Gillis M., De Ley J., Cleen M. The determination of molecular weight 1970 of bacterial DNA from renaturation rates // Eur. J. Beochem. 1970. V. 12. P. 143 -153.

78. Giraffa G. Enterococcal bacteriocins: their potential as anti-Listeria factors in dairy technology // Food Microbiol. 1995. V. 12. P. 291 299.

79. Giraffa G. Enterococci from foods // FEMS Microb. Rev. 2002. V. 26. P. 163 -171.

80. Giraffa G. Functionality of enterococci in dairy products // Int. J. Food Microbiol. 2003. V. 88. P. 215 -222.

81. Giraffa G., Carminati D., Neviani E. // J. Food Prot. 1997. V. 60. P. 732 -738.

82. Giraffa G., Neviani E., Tarelli G.T. Antilisterial activity by enterococci in a model predicting the temperature evolution of Taleggio, an Italian soft cheese // Dairy Sci. 1994. V. 77. P. 1176 1182.

83. Giraffa G., Paris A., Valcavi L., Gatti M., Neviani E. Genotypic and phenotypic heterogeneity of Streptococcus thermophilus strains isolated from dairy products // J. App.l Microbiol. 2001. V. 91. P. 937 943.

84. Giraffa G., Rossetti L. Monitoring of the bacterial composition of dairy starter cultures by RAPD-PCR // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 237 (1). P. 133 -138.

85. Giraffa G., Sisto F. Susceptibility to vancomycin of enterococci isolated from dairy products // Lett. Appl. Microbiol. 1997. V. 25. P. 335 338.

86. Godon J.-J., Chopin M.-C., Erlich S.D. Branched-chain amino acid biosynthesis genes in Lactococcus lactis subsp. lactis. // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 6580 -6589.

87. Gonzalez C.F., Kunka B.S. Transfer of sucrose-fermenting ability and nisin production phenotype among lactic streptococci // Appl. Environ. Microbiol. 1985. V. 49. P. 627.

88. Goodfellow M., Minnikin D.E. Introduction to chemosystematics. In: Chemical Methods in Bacterial Systematics. (eds. M. Goodfellow, D.E. Minnikin) 1985. / London, Acad. Press. P. 1 16.

89. Goodfellow M., O'Donnell A.G. Handbook of New Bacterial Systematics / Eds Goodfellow M., O'Donnell A.G., / L.: Academic Press Ltd., 1993. P. 3 54.

90. Gordillo M.E., Singh K.V., Baker C.J., Murrey B.E. Typyng of group В streptococci: comparison of pulsed-field electrophoresis and conventional electrophoresis // J. Clin. Microbiol. 1993. V. 31. P. 1430 1434.

91. Grimont P.A.D. Use of DNA reassociation in bacterial classification. // Can. J. Microbiol. 1988. V. 34. P. 541 546.

92. Grimont P.A.D., Popoff M. Y., Grimont F., Coynault C., Leminin M. Reproducibility and correlation study of three deoxyribonucleic acid hybridization procedures // Curr. Microbiol. 1980. V. 4. P. 325 330.

93. Gutekunst H., Eikmanns B.J., Reinscheid D.J. The novel fibrinogen protein FbsB promotes Streptococcus agacactiae invasion into epithelial cells // Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 3495 3504.

94. Gutell R.R., Larsen N., Woese C.R., Lesson from evolving rRNA: 16S and 13S rRNA structures from a comparative perspective // Microbiol. Rev. 1994. V. 58. P. 10-26.

95. Hugenholtz J. // FEMS Microbiol Rev. 1993. V. 12. P 165.

96. Huggiens A.R. // Food Technology. 1984. V 34. P. 41.

97. Ishiwa H., Iwata S. drug resistance plasmids in lactobacillus fermentum И J. Gen. Appl. Microbiol. 1980. V. 26. N 1. P. 71 74.

98. Jain R., Rivera M.C., Lake J.A. Horizontal gene transfer among genomes: The complexity hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 3801 -3806.

99. Jang J., Kim B., Lee J., Han H. A rapid method for identification of typical Leuconostoc species by 16S rDNA PCR-RFLP analysis // J. Microbiol. Methods. 2003. V. 55(1). P. 295 302.

100. Jia R., Guo J.H., Fan M.W., Bian Z., Chen Z., Peng., Fan B. Mucosal immunization against dental caries with plasmid DNA encoding pac gene of Streptococcus mutans in rats // Vaccine. 2004. V. 20. P. 2511 2516.

101. Johnson J.L. Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. Krieg N.R., Holt J.G. Baltimore: Williams and Wilkins, 1984. - P. 8-11.

102. Jones D. Comparison and differentiation of genus Streptococcus II Streptococci / Eds. Skinner F.A., Quesnel L.G. London: Academic Press, 1978. P. 1 49.

103. Josephsen J., Vogensen F.K. // FEMS Microbiol. Lett. 1989. V. 59. P. 161.

104. Josephsen J., Waagner Nielsen E. Plasmid profiles and bacteriophage sensity of a Chadder starter used for five years without rotation // Milchwirtchaft. 1988. V. 43. N4. P. 219-223.

105. Kandier O., Weiss N. Genus Lactobacillus Beijerinck / In Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Hoit (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology. 1986. V. 2. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.

106. Kempler G.M., McKey L.L. Biochemistry and genetics of citrate utilization in Streptococcus lactis ssp. diacetylactis II J. Diary Sei. 1981. V. 64. P. 1527 -1539.

107. Kilpper-Balz R., Fischer G., Schleifer K.H. Nucleic acid hybridization of group N and group D streptococci // Curr. Microbiol. 1982. V. 7. P 245 250.

108. Klaenhammer T.R., Ahn С., Fremaux С., Milton К. Molecular properties of Lactobacillus bacteriocins. 1992. In: Bacteriocins, Microcin and Lactibiotics (James R., Ladyanrb C., Pattus F., Eds.) P. 37 58.

109. Kuhn I., Iversen A., Mollby R. The PhenePlate system for studies of the diversity of enterococcal populations from the food chain and the environment // Int. J. Food Microbiol. 2003. V. 88(2-3). P. 189 196.

110. Kumar S., Tamura K. Nei M. MEGA: molecular evolutionary genetic analysis, version 1.0. 1993 / The Pennsylvania State University, University Park, PA.

111. Lan R., Reeves P.R. Gene transfer is a major factor in bacterial evolution // Mol. Biol. Evol. 1996. V. 13. P. 47-55.

112. Lan R., Reeves P.R. Intraspecies variation in bacterial genomes: the need for a species genome concept // Trends in Microbiol. 2000. V. 8. P. 396 401.

113. Le Bourgeois P., Lautier M., Mata M., Ritzenthaler P. Physical and genetic map of chromosome of Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 6752-6762.

114. Le Bourgeois P., Lautier M., Ritzenthaler P. Chromosome mapping in lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 12(1-3). P. 109 123.

115. Le Bourgeois P., Mata M., Ritzenthaler P. Genome comparison of Lactococcus strains by pulsed-field gel electrophoresis // FEMS Microbiol. Lett. 1989. V. 50(1-2). P.65 -69.

116. Lick S., Keller M., Bockelmann W., Jochem-Heller K. // Syst. Appl. Microbiol. 1996. V. 19. P. 74-77.

117. Linaje R., Coloma M.D., Perez-Martinez G., Zuniga M. Characterization of faecal enterococci from rabbits for the selection of probiotic strains. // J. Appl. Microbiol. 2004. V. 96(4). P. 761 771.

118. Lloyd A.T., Sharp P.M. Evalution of the recA gene and the molecular phylogeny of bacteria // J. Evol. 1993. V. 37. P. 399 407.

119. Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogeny of bacteria beyond the 16S rRNA standard. // ASM News. 1999. V. 65. P. 752 757.

120. Ludwig W., Seewaldt E., Kilpper-Balz R., Schleifer K.H., Magrum L., Woese C.R. Fox G.E., Stakebrandt E. The phylogenic position of Streptococcus and Enterococcus II J. Gen. Microbiol. 1985. V.l31. P. 543 551.

121. Lund В., Edlund C., Barkholt L., Nord C.E., Tvede M., Poulsen R.L. Impact on human intestinal microflora of an Enterococcus faecium probiotic and vancomicin // Scand. J. Infect. Dis. 2000. V. 32(6). P. 627 632

122. Lupski J.R., Weinstock S. Short, interspersed repetitive DNA sequences in prokaryotic genome // J. Bacterid. 1992. V. 174. P. 4525 4529.

123. Lyons T.P. The probiotic concept: coming age // Feed Compouder. 1987. P. 22 -25.

124. Mac K., Wichmann-Schauer H., Peters J., Ellerbroek L. Species identification and detection of vancomycin resistance genes in enterococci of animal origin by multiplex PCR. // Int. J. Food Microbiol. 2003. V. 88(2-3). P. 305 309.

125. Maidak B.L., Cole J.R., Lilburn T.G., Parker C.T., Saxman P.R., Stredwick J.M., Garrity G.M., Olsen G.J., Pramanik S., Schmidt T.M., Tiedje J.M. The RDP (Ribosomal Database Project) continues // Nucleic Acid Res. 2000. V. 28. P. 173- 174.

126. Marmur J.A. A procedure for isolation DNA from microorganism // J. Mol. Biol. 1961. V. 3.P. 208-218.

127. Martinez-Murcia A.J., Collins M.D. A phylogenetic analysis of the genus Leuconostoc based on reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA // FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 58(1). P. 73 83.

128. Maynard Smith J., Smith N.H., O'Rourke M., Spratt B.G. How clonal are bacteria? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 4384-4388.

129. McKey L.L., Baldwin K.A. Conjugative 40-medadalton plasmid in Streptococcus lactis ssp. diacetylactis DRC3 is associated with resistance to nisin and bacteriophage // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 47.N 1. P. 68 -74.

130. McKey L.L., Baldwin K.A. Stabilization of lactose metabolism in Streptococcus lactis C2 11 Appl. Environ. Microbiol. 1978. V. 36. P 360 367.

131. McKey L.L., Baldwin. Application for biotechnology; present and future improvements in lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1990.V. 87. P. 3 14.

132. Mercenier, 1990. Molecular genetics of Streptococcus thermophilus. // FEMS Microbiol. Rev. 1990.V. 7. P. 61 77.

133. Mohn S.C., Ulvik A., Jureen R., Willems R.J., Leavis H., Harthug S., Langeland N. Duplex real-time PCR assay for rapid detection of ampicillin-resistant Enterococcus faecium II Antimicrob. Agents. Chemother. 2004. V. 48. P. 556-560.

134. Mohn S.C., Ulvik A., Jureen R., Willems R.J., Top J., Leavis H., Harthug S., Langeland N. Duplex real-time PCR assay for rapid detection of ampicillin-resistant Enterococcus faecium II Antimicrob. Agents. Chemother. 2004. V. 48(2). P. 556-560.

135. Mora D., Fortina M.G., Parini C., Ricci G., Gatti M., Giraffa G., Manachini P.L. Genetic diversity and technological properties of Streptococcus thermophilus strains isolated from dairy products. // J. Appl. Microbiol. 2002. V. 93. P. 278 287.

136. Mora D., Fortina M.G., Parini C., Ricci G., Gatti M., Giraffa G., Manachini P.L. Genetic diversity and technological properties of Streptococcus thermophilus strains isolated from dairy products // J. Appl. Microbiol. 2002. V. 93. P. 278 -827.

137. Morelll L., Vescovo M., Bottazzi V. Plasmid and antibiotic resistant in Lactobacillus helveticus and Lactobacillus bulgaricus isolated from natural whey cultures // Microbiología. 1983. V. 6. N 2. P. 145 154.

138. Ogier J.C., Son O., Gruss A., Tailliez P., Delacroix-Buchet A. Identification of the bacterial microflora in dairy products by temporal temperature gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 3691 3701.

139. Olasupo N.A., Schilinger U., Franz C.M., Holzapfel W.H. Bacteriocin production by Enterococcus faecium NA01 from "wara" a fermented skimmed cow milk product from west Africa // Lett. Appl. Microbiol. 1994. V. 19(6). P. 438-441.

140. Olsen G.J., Larsen G., Woese C.R., The ribosomal RNA database project // Nucleic Acid Res. 1991. V. 19. P. 2017 2021.

141. Ostlie H.M., Helland M.H., Narvhus J.A. Growth and metabolism of selected strains of probiotic bacteria in milk. // Int. J. Food Microbiol. 2003. V. 87(1-2). P. 17-27.

142. O'Sullivan T., Daly C. Plasmid DNA in Leuconostoc species // Irish J. Food Sei. Technol. 1982. V. 6. N 2. P. 206.

143. O'Sullivan T.F., Fitzgerald G.F. Comparison of Streptococcus thermophilus strains by pulse field gel electrophoresis of genomic DNA // FEMS Microb. Lett. 1998. V. 168. P. 213-219.

144. Ottogalli G., Galli a., Dellagllio F. Taxonomic relations between Streptococcus thermophilus and some other streptococci II J. Dairy Res. 1979. V. 46. P. 127 — 131.

145. Owen R. J., Hill L. R., Lapage S. P. Determination of DNA base compositions from melting profiles in delute buffers // Biopolymers. 1969. V. 7. P. 503 316.

146. Pace N.R. New perspective on the natural microbial world: molecular microbial ecology // Feature. 1996. V. 62. P. 463 470.

147. Petrova P., Miteva V., Ruiz-Maso J.A., del Solar G. Structural and functional analysis of pt38, a 2.9kb plasmid of Streptococcus thermophilus yogurt strain // Plasmid. 2003 V. 50(3). P. 176-189.

148. Popoff M., Coynault C. Use of DEAE-cellulose ilters in the SI nuclease method for bacterial deoxyribonucleic acid hybridization // Ann. Microbiol. 1980. V. 113. P. 151 155.

149. Pouwels P.H., Leer R.J. Genetics of lactobacilli: plasmids and gene expression // Antonie Van Leeuwenhoek. 1993. V. 64(2). P. 85 107.

150. Poznanski E., Cavazza A., Cappa F., Cocconcelli P.S. Indigenous raw milk microbiota influences the bacterial development in traditional cheese from an alpine natural park// Int. J. Food Microbiol. 2004. V. 92(2). P. 141 151.

151. Reinheimer J.A., Binetti A.G., Quiberoni A., Bailo N.B., Rubiolo A.C., Giraffa G. Natural milk cultures for the production of Argentinian cheeses // J. Food Prot. 1997. V. 60. P. 59-63.

152. Richelsen B., Kristensen K., Pedersen S.B. Long-term (6 months) effect of a new fermented milk product n the level of plasma lipoproteins a placebocontrolled and double blind study // Eur. J. Clin. Nutr. 1996. V. 50(12). P. 811 -815.

153. Ried K. Gastrointestinal health. The role pro- and pre-biotics in standard foods // Aust. Fam. Phisician. 2004. V. 33(4). P. 253 255.

154. Rivera M.C., Jain R., Moore J.E., Lake J.A. Genomic evidence for the two functionally distinct gene classes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 6239 6244.

155. Rodrigues U., Collins M.D. Phylogenetic analysis of Streptococcus saccharolyticus based on 16S rRNA sequencing // FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 59. P. 231 -234.

156. Romero D. A., McKey L.L. Isolation and plasmid characterization f Lactobacillus species involved in the manufacture of fermented sausage // J. Food Protection. 1985. V. 48. N 12. P. 1028 1035.

157. Rossello-Mora R., Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 39-67.

158. Roussel Y, Colmin C, Simonet JM, Decaris B Strain characterization, genome size and plasmid content in the Lactobacillus acidophilus group (Hansen and Mocquot) // J. Appl. Bacteriol. 1993. V. 74(5).P. 549 556.

159. Roussel Y., Bourgoin F., Guedon G., Pebay M., Decaris B. Analisis of the genetic polymorphism between three Streptococcus thermophilus strains by comparing their phisical and genetic organization // Microbiology. 1997. V. 143. P. 1335-1343.

160. Roussel Y., Pebay M., Guedon G., Simonet J.M., Decaris B. Physical and genetic map of Streptococcus thermophilus A054. // J. Bacteriol. 1994 V. 176(24). P. 7413.-.7422.

161. Sabia C., Messi P., de Niederhausern S., Manicardi G., Bondi M. Study of two bacteriocins produced by Enterococcus casseliflavus and Ent. faecalis II Lett. Appl. Microbiol. 2004. V. 38(2). P. 99-105.

162. Salzano G., Moschetti G., Villani F., Coppola S. Biotyping of Streptococcus thermophilus strains by DNA fingerprinting // Res. Microbiol. 1993. V. 144. P. 381-387.

163. Sarantinopoulos P., Kalantzopulos G., Tsakalidou E. Citrate metabolism by Enterococcus faecalis FAIR-E 229 // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67(12). P. 5482 5487.

164. Savage D.S. Mechanism by which endogenous microorganisms colonize gastrointestinal epithelial surfaces // Prog. Fd. Nutr. Sc. 1983.V. 7. P. 65 74.

165. Schleifer K.H., Kilpper-Balz R. Molecular and chemotaxonomic approaches to the classification of Streptococci, Enterococci and Lactococci: a rewiew // System. Appl. Microbiol. 1987. V. 10. P. 1-19.

166. Schleifer K.H., Kilpper-Balz R. Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the genus Enterococcus nov. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb, nov // Int. J. Syst. Bact. 1984. V. 34. P. 31 -34.

167. Seal S.E., Jackson L.A., Daniels M.J. Use of tRNA consensus primers indicate subgroups of Pseudomonas solanacearum by polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 3759 3761.

168. Senger F., Nicklen S., Coulsen A. DNA sequencing with chain-terminating ingibitors // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. V. 84. P. 5453 5467.

169. Sherman J.M., Wing H.U. Streptococcus durans nov. sp. II J. Dairy Sei. 1937. V. 20. P. 165- 167.

170. Snel B., Bork P., Huynen M.A. Genome phylogeny based on gene content // Nat. Genet. 1999. V. 21. P. 108 110.

171. Solow B.T., Somkuti G.A. Comparison of low-molecular-weight heat stress proteins encoded on plasmids in different strains of Streptococcus thermophilus H Curr. Microbiol. 2000. V. 41(3). P. 177 181.

172. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 846 849.

173. Steele J. L., McKey L.L. Partial characterization of the genetic basis for sucrose metabolism and nisin production in Streptococcus lactis // Appl. Environ. Microbiol. 1986. V. 51. P. 57 64.

174. Steenson L.R., Klaenhammer T.R. Streptococcus cremoris M12R transconjugants carrying the conjugal plasmid pTR2030 are insensitive to attack by lytic bacteriophages // Appl. Environ. Microbiol. 1985. V. 50. P. 851 -858.

175. Su Y.A., Sulavik M.C., He P., Makinen K.K., Makinen P-L., Fiedler S., Wirth R., Clewell D.B. Nucleotide sequence of the gelatinase gene (gelE) from Enterococcus faecalis subs, liquefaciens II Infect. Immun. 1991. V. 59. P. 415 -420.

176. Suzzi G., Caruso M., Gardini F., Lombardi A., Vannini L., Guerzoni M.E., Andrighetto C., Lanorte M.T. A survey of the enterococci isolated from an artisananal Italian goat's cheese (semicotto caprino) // J. Appl. Microbiol. 2000. V. 89(2). P. 267 274.

177. Teixeira L.M., Facklam R.R., Steigerwalt A.G., Pgott N.E., Merquior V.L.C., Brenner D.J. Correlation between phenotypic characteristics and DNA relatedness within Enterococcus faecium strains I I J. Clinic. Microbiol. 1995. V. 33. N6. P. 1520- 1523.

178. Teuber M., Schwarz F., Perreten V. Molecular structure and evolution of the conjugative multiresistance plasmid pRE25 of Enterococcus faecalis isolated from a raw-fermented sausage // Int. J. Food Microbiol. 2003. V. 88(2-3) P. 325 -329.

179. Thompson J.K., Collins M.A. A comparison of the plasmid profiles of strains of lactic streptococci from a commercial mixed strain starter culture with those from fermented milk // Milchwirtchaft. 1989. V. 44 N 2. P. 65 69.

180. Thompson J.K., Collins M.A. A comparison of the plasmid profiles of strains of lactic streptococci from a commercial mixed strains starter culture with those from fermented milk // Milchwissenschaft. 1989. V. 44. N 2. P. 65 69

181. Tomita H., Fujimoto S., Manimoto K., Ike Y. Cloning and genetic and sequence analyses of the bacteriocin 21 determinant encoded on the Enterococcus faecalis pheromone-responsive conjugative plasmid pPDl // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 7843 7855.

182. Tong H., Gao X., Dong X. Streptococcus oligofermentans sp. nov., a novel oral isolate from caries-free humans II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1101 1104.

183. Torriani S., Zaparolli G., Dellaglio F. Use of PCR-based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subs, bulgaricus and L. delbrueckii subs, lactis II Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. N 10. P. 4351 4356.

184. Tulloch D. L., Finch L.R., Hillier A. J., Devidson B. E. Physical map of the chromosome of Lactococcus lactis subsp. lactis DL11 and location of six putative rRNA operons. // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 2768 2775.

185. Turgeon N., Frenette M., Moineau S. Characterization of a theta-replicating plasmid from Streptococcus thermophilus // Plasmid. 2004 V. 51(1). P. 24 36.

186. Turgeon N., Moineau S. Isolation and characterization of a Streptococcus thermophilus plasmid closely related to the pMV158 family. // Plasmid. 2001. V. 45(3). P. 171-183.

187. Urdaci M.C., Bressollier P., Pinchuk I. Bacillus clausii Probiotic Strains: Antimicrobial and Immunomodulatory Activities // J. Clin. Gastroenterol. 2004. V. 38. P. 86-90.

188. Ursing J.B., Rossello-Mora R.A., Garcia-Valdes E., Lalucat J. Taxonomic note: a pragmatic approach to the nomenclature of phenotypically similar genomic groups // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 604.

189. Van Belkum M.J., Hayema .J., Jeeninga R.E., Kok J., Venema G. Organization and nucleotide sequence of two lactococcal bacteriocin operons // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 492 489.

190. Vancanneyt M., Lombardi A., Andrighetto C., Knijff E., Torriani S., Bjorkroth K.J., Franz C.M., Foulguie Moreno M.R., Revets H., De Vuyst L., Swings J., Kersters K., Dellaglio F., Holzapfel WH. Intraspecies genomic groups in

191. Enterococcus faecium and their correlation with origin and pathogenicity // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 1381 1389.

192. Vandamme P., Pot B., Gilis M., De Vos P., Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 407-438.

193. Vauterin L., Hoste B., Kersters K. Swings J. Reclassification of Xantomonas. II Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V 45. P.472-489.

194. Versalovic J., Koeuth T., Lupski J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes // Nucleic Acid Res. 1991. V. 19. P. 6823-6831.

195. Viale A.M., Arakaki A.K., Soncini F.C., Petrreyra R.G. Evalutionary relationships among eubacterial groups asinferred from GroEL (chaperonine) sequence comparisons // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 527 533.

196. Viscardi M., Capparelli R., Di Matteo R., Carminati D., Giraffa G, Iannelli D. Selection of bacteriophage-resistant mutants of Streptococcus thermophilus. // J. Microbiol. Methods. 2003. V. 55(1). P. 109 119.

197. Viscardi M., Capparelli R., Iannelli D. Rapid selection of phage-resistant mutants in Streptococcus thermophilus by immunoselection and cell sorting // Int. J. Food Microbiol. 2003. V. 89(2-3). P. 223 231.

198. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acid Res. 1990. V. 18. P. 7213 7218.

199. Wessels D., Jooste P.J., Mostert J.F. Technologically important characteristics of Enterococcus isolated from milk and dairy products // J. Food Microbiol. 1990. V. 10. P. 349-352.

200. Whilei R.A., Hardie J.M. Streptococcus vestibularis sp. nov. from the human oral cavity // Int. J. Syst. Bact. 1988. V 38. N 4. P. 335 339.

201. Whiley R.A., Hardie J.M. Streptococcus vestibularis sp. nov. from the human oral cavity // J. Syst. Bacteriol. 1988. V. 38. P. 335-339.

202. Williams J.G.K., Kubelic A.R., livak K.J., Rafalski J. A., Tingey S.V. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acid Res. 1990. V 18. P. 6531 6535.

203. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. V. 51. P. 221 271.

204. Yoon J.H., Kang S.S., Cho Y.G., Lee S.T., Kho Y.H., Kim C.J., Park Y.H. Rhodococcus pyridinivorans sp. nov., a pyridine-degrading bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 2173 2180.

205. Zhang Y., Lei Y., Khammanivong A., Herzberg M.C. Identification of novel two-component system in Streptococcus gordonii V288 involved in biofilm formation I I Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 3489 3494.

206. MacKay L.L. Functional properties of plasmids in lactic streptococci // Antonie van Leeuwenhoec. 1983. V. 49. P. 259 274.

207. MacKay L.L. Functional properties of plasmids in lactic streptococci // Antonie van Leeuwenhoec. 1983. V. 49. P. 259 274.

208. MacKay L.L. Regulation of lactose metabolism in dairy streptococci // In: Developments in food microbiology. Ed. Davies R. London. Applied Scence Publiscers. 1982. V. 1. P. 153 182.

209. MacKay L.L. Regulation of lactose metabolism in dairy streptococci // In: Developments in food microbiology. Ed. Davies R. London. Applied Scence Publiscers. 1982. V. 1. P. 153 182.

Информация о работе

Ботина, Светлана Геннадиевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Идентификация и характеристика отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы