Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии

Ботина, Светлана Геннадиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии"

На правах рукописи

Богина Светлана Геннадиевна

Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2011

2 1 ДПР 2011

4844312

Работа выполнена в Центральной лаборатории микробиологии Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности Россельхозакадемии

Научный консультант:

Доктор технических наук, профессор Семенихина Вера Филатовна Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Шендеров Борис Аркадьевич

Доктор биологических наук, профессор Складнев Дмитрий Анатольевич

Доктор медицинских наук, профессор Суворов Александр Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, п. Оболенск (Московская область).

Защита состоится « 2011 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

Автореферат разослан «_»__ 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели особое значение. Современная биотехнология неразрывно связана с использованием новых подходов к созданию и отбору новых микроорганизмов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. Фундаментальные основы промышленной биотехнологии микроорганизмов, направленные на получение продуктов питания и пробиотических препаратов нового поколения, заложены в трудах российских и зарубежных ученых (Семенихиной В.Ф., 2007; Ганиной В.И., 2005; Рогова И.А., 2006; Шевелевой СЛ., 2005; Шендерова Б.А., 2005; Алешкина В.А., 2003; Алешкина A.B., 2010; Амерхановой A.M., 2009; Бондаренко В.М., 2007; Bover-Cid S., 2003; De Vuyst L„ 2008; Eerola S., 2006; Klaenhammer T.R., 2008; Leroy F., 2008; Madsen S.M., 2004; Niinivaara F., 2005; Tanous C., 2003; Vandamme E.J., 2004 и др.).

Исследования и фундаментальные достижения последних десятилетий в микробиологии, генетике и молекулярной биологии дали возможность изучения генетического разнообразия бактериальных штаммов. С развитием генетической систематики, с расширением круга используемых методов, направленных на изучение бактериального генома, и накоплением экспериментальных данных, касающихся генетического разнообразия различных таксономических групп бактерий, современная таксономия бактерий стала быстро развиваться, что позволило решить многие спорные вопросы систематики конкретных групп микроорганизмов (Турова Т.П., 2009). Вместе с тем оставались нерешенными проблемы, связанные с противоречиями между данными молекулярной систематики и традиционными представлениями, основанными на анализе фенотипа в отношении группы молочнокислых бактерий, имеющих практическое применение.

Машенцева Н.Г., 2008). В этой связи особую актуальность приобретает использование современных фундаментальных научных достижений изучения бактериального генетического разнообразия в прикладных областях науки. Фенотипическая характеристика штамма, применяемая для идентификации, паспортизации и типирования штаммов бактерий, в настоящее время уже не является достаточной для установления таксономического положения изучаемого организма и целостной характеристики его свойств. В отношении штаммов молочнокислых бактерий, практически использующихся в пищевой промышленности, применение современных молекулярно-биологических подходов для таксономической идентификации, молекулярно-генетической паспортизации, генотипирования бактерий позволит выбирать лучшие стартовые культуры для промышленного применения и получения качественных и безопасных пищевых продуктов и бактериальных препаратов.

Цель работы - применение комплекса молекулярно-биологических методов для изучения генетического разнообразия штаммов молочнокислых бактерий и использование результатов этого исследования при отборе бактериальных культур для создания заквасок, позволяющих гарантировать производство качественных и безопасных кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.

Задачи исследования

1. Выделить природные штаммы молочнокислых бактерий из естественной среды обитания (молоко, кисломолочные продукты домашнего изготовления, микробиота человека).

2. Показать необходимость использования молекулярно-биологических методов при установлении видовой принадлежности молочнокислых бактерий. Применить метод анализа последовательности гена 16S рРНК для идентификации бактериальных штаммов, принадлежащих к родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus.

3. Изучить генетическое разнообразие природных штаммов Streptococcus thermophilus с использованием методов геномной рестрикции и PFGE.

4. Продемонстрировать возможность использования метода анализа данных о последовательности гена 16S рРНК для внутривидовой дифференциации подвидов L. ¡actis subsp. cremoris и L. lactis subsp. ¡actis. Применить этот метод для идентификации бактериоцинпродуцирующих штаммов L. lactis.

5. Изучить разрешающую способность метода RAPD-PCR для штаммовой идентификации молочнокислых бактерий и осуществить генетическую паспортизацию природных и промышленных культур бактерий родов Streptococcus и Lactobacillus с использованием этого метода.

6. Обосновать необходимость проведения исследований с использованием молекулярно-биологических подходов ' для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Применить метод ПЦР-генотипирования штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса.

7. Протестировать штаммы Streptococcus thermophilus на наличие технологичных и пробиотических свойств (способность синтезировать экзополисахариды, витамины и утилизировать галактозу) и отобрать среди них наиболее перспективные культуры для использования в качестве заквасок и бактериальных концентратов при производстве кисломолочных продуктов общего и функционального назначения.

Научная новизна работы

Впервые проведено выделение и изучение новых штаммов молочнокислых бактерий из различных экологических ниш (молоко, кисломолочные продукты домашнего изготовления, микробиота человека: гастроинтестинальный тракт, ротовая полость и грудное молоко кормящих женщин) и разных географических регионов (Россия, страны Восточной и Западной Европы), на основании этого получены новые фундаментальные знания о физиолого-биохимических и генетических особенностях штаммов бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus.

Получены новые фундаментальные знания о внутривидовом разнообразии природных изолятов молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus. При использовании методов геномной рестрикции и пульс-гель электрофореза (PFGE) и сравнительного анализа подобия геномных фингерпринтов приведены доказательства вариабельности изученных штаммов по размерам их геномов. Показано, что размер геномов у исследованных штаммов сильно варьирует — от 1417 до 2075 т.п.н., т.е. различия между минимальным и максимальным значением размера генома составляют около 600 т.п.н., что свидетельствует о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.

Впервые выявлено генетическое разнообразие изученных в работе штаммов бактерий рода Enterococcus, что послужило основой классификации организмов, имеющих существенное отличие в нуклеотидных последовательностях генов rrs, как нового вида - Enterococcus lactis. (Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК типового штамма нового вида Enterococcus lactis СК1114 депонирована в базе данных NCBI (номер депонированной последовательности AY902459. Штамм депонирован в коллекции ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов (номер депонированного штамма В8713)).

Впервые выявлено существование уникальных замен в проксимальной области гена 16S рРНК у штаммов подвида Lactococcus lactis subsp. cremoris, дающее возможность проводить точную молекулярную таксономическую идентификацию культур L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. lactis, трудно дифференцируемых с использованием классических микробиологических подходов.

Теоретическая значимость работы

Теоретически обоснована необходимость использования молекулярно-биологических подходов для отбора бактериальных стартерных культур при создании заквасок для биотехнологии, позволяющих гарантировать выпуск

качественных и безопасных кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.

Полученные новые данные о таксономическом, генетическом разнообразии и биохимических, технологических, пробиотических и генетических свойствах штаммов бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus расширяют границы фундаментальных знаний о бактериях этих систематических групп и возможностях их использования в различных биотехнологических процессах.

Практическое значение работы

Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий родов Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus дало возможность целенаправленно проводить отбор штаммов, перспективных для использования в биотехнологии, с учетом их генетических характеристик.

Проведена реклассификация (с применением методов молекулярно-генетической идентификации) некоторых производственных культур рода Lactobacillus, применяемых в промышленности РФ в качестве заквасок при изготовлении кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов, что позволяет производителям использовать современные данные об истинном таксономическом положении культур и их генетических характеристиках.

Показана необходимость проведения исследований с помощью молекулярно-биологических подходов для изучения

антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Примененное ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса служит основанием исключения из состава заквасок культур, которые могут быть источником трансмиссивных генов антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

Проведенная паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью методики RAPD-PCR и неспецифических праймеров дает возможность защиты правообладателей бактериальных культур от несанкционированного использования штаммов, авторами которых они являются, в аналогичных биотехнологических процессах недобросовестными производителями.

Полученные данные о наличии технологических, производственно -ценных и пробиотических свойств у штаммов Streptococcus thermophilus (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу) могут быть критерием отбора наиболее перспективных культур для применения в качестве заквасок и бактериальных концентратов при изготовлении кисломолочных продуктов . общего и функционального назначения в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии. Штаммы термофильного молочнокислого стрептококка, обладающие важными производственно-ценными свойствами, депонированы в коллекцию молочнокислых культур и бифидобактерий ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Определенные в ходе проведения работы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК некоторых из изучаемых штаммов лакгококков, лактобацилл, стрептококков и энтерококков были депонированы в

базу давших Nucleotide Sequence Database of National Center for Biotechnology Information (GenBank NCBI) в качестве референтных последовательностей при проведении филогенетических и биоинформатических исследовательских работ (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuc!eotide/?term=Botina). Номера депонированных последовательностей: DQ255948, AY902459, AY683836, AY902456, AY902457, AY902458, AY902459, AY902460, AY902461, AY683829, AY683830, AY683831, AY683832, AY683833, AY683834, AY683835, AY683836, DQ255948, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308, EF114307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308, EFI14307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777, GU560031, GU560032, GU560033, GU560034, GU560035, GU560036, GU560037, GU560038, GU560039, GU560040, GU560041, GU560042, GU560043.

Внедрение результатов работы

Полученные данные о технологических и производственно-ценных свойствах культур термофильных молочнокислых стрептококков послужили основой для оформления патента на изобретение №2337953, Российская Федерация, МПК C12N1/20, А23С9/12, заявка 2007117139/13 от 08.05.2007, публикация патента 11.10.2008 г., бюллетень № 31. «Штамм бактерий Streptococcus themophilus для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты».

На основании теоретических и практических результатов были разработаны «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». (Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, протокол №2 от 14.10.2010. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010).

Современные молекулярно-биологические методики, примененные и модифицированные в ходе исследования, используются при проведении научных исследований в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Основные результаты работы нашли применение в лекционных курсах по повышению квалификации для практикующих микробиологов молочного производства «Микробиология молока и молочных продуктов», «Методы и организация производственного контроля» и в обучающем процессе при подготовке аспирантов ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При таксономической идентификации штаммов молочнокислых бактерий, принадлежащих к родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus следует опираться на результаты исследований, полученные с помощью

применения молекулярно-биологических методов, основанных на анализе последовательности рибосомальных генов.

2. Применение методов геномной рестрикции и PFGE, а также метода RAPD-PCR, дает возможность оценить генетическое разнообразие природных штаммов молочнокислых бактерий и позволяет осуществлять генетическую паспортизацию промышленных штаммов молочнокислых бактерий.

3. Необходимо использовать молекулярно-биологические подходы для изучения устойчивости к антибиотикам производственных штаммов молочнокислых бактерий с целью исключения из состава заквасок культур, которые могут служить источником генов трансмиссивной антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

4. Применение в лабораторной практике молекулярно-биологических подходов при видовой идентификации, молекулярно-генетической паспортизации и определении в составе геномов генов, отвечающих за антибиотикорезистентность, позволяет проводить отбор безопасных производственных культур с целью их последующего использования в составе заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотических препаратов.

Апробация работы

Диссертация апробирована на расширенном заседании Ученого Совета ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности Россельхозакадемии 24 ноября 2010 г., протокол №8.

10-ая школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), Международная научная конференция: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2006), ASM Conference on Streptococcal Genetics, (France, Sain-Malo 2006), Международная конференция «Успехи биотехнологии» (г. Цахкадзор, Республика Армения, 2006), Международная конференция «Микробные биотехнологии» (Одесса, 2006), Российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), Международный конгресс по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2007), The 3th European Conference on Prokaryotic Genomics, ProkaGENOMICS (2007, Gottingen), Second International Congress of Central Asia Infectious Diseases (Alma Aty, 2008), Пятый съезд Вавиловского общества 'генетиков и селекционеров (Москва, 2009), 13-ая международная Пущинская школа - конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино, 2009), Юбилейный Пятый Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009),

11-й международный славяно-балтийский научный форум "Санкт-Петербург -Гастро-2009" (Санкт Петербург, 2009), XXXII International Congress of the Society for Microbial Ecology and Disease (2009, St. Petersburg, Russia), Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы

биологии, наногехнологий и медицины», (Ростов-на-Дону, 2009), Конференция РАСХН-РФФИ. Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России. (Сергиев Посад, 2009), Второй Международный Конгресс-партнеринг и выставка по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике (Москва, 2010).

Исследования, составившие основу работы, были поддержаны грантами РФФИ, грантами Президента Российской Федерации для молодых российских ученых кандидатов наук.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 61 научная работа, из них 29 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 30 - в материалах научных конференций, 1 патент на изобретение, 1 методические указания.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 287 страницах машинописного текста, включает 26 таблиц, 26 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 41 отечественный и 323 зарубежных цитируемых источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили 155 штаммов бактерий следующих видов: Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Enterococcus durons, Enterococcus lactis sp. nov., Lactococcus lactis subsp. cremoris и Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

В процессе исследований были использованы классические микробиологические, молекулярно-генетические, аналитические методы и их модификация.

Микробиологические методы исследования, В работе использовались классические микробиологические методы работы с непатогенными бактериальными культурами. Основными средами для культивирования штаммов бактерий служили среда М21 и MRS. При выращивании бактерий на плотных питательных средах применялись анаэростаты и газогенерирующие пакеты (bioMerieux, Франция), обеспечивающие атмосферу, содержащую 10% С02. Для изучения морфологических характеристик изучаемых культур готовили препараты, окрашенные по Граму и метиленовым синим, микроскопировали с иммерсией при увеличении 90x15. Биохимическая идентификация проводилась с использованием тест-системы API-50CHL (bioMerieux, Франция), позволяющей оценивать ферментативную активность 50 субстратов и программного обеспечения к ней API WEB, согласно инструкции к набору. Способность культур сквашивать молоко оценивали используя лакмусовое молоко фирмы "Difco". Способность бактерий расщеплять эскулин

определяли с применением среды следующего состава: казеиновый пептон -0,5%, мясной экстракт - 0,3%, цитрат железа - 0,05%, эскулин - 0,1%, агар -1,5%, pH 6,6. Для исследования антибиотикочувствительности был применен диско-диффузионный метод на основе методических рекомендации по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04). Способность штаммов синтезировать экзополисахариды оценивалась при росте бактерий на среде следующего состава: сухое молоко с пониженным содержанием жира - 10% (или цельное обезжиренное молоко в качестве основы среды), дрожжевой экстракт - 0,5%, агар - 1,5%, сахароза -1%, рутениевый красный - 80 мг/л. Кислотообразующая активность штаммов оценивалась по снижению pH молока, сквашенного соответствующим бактериальным штаммом. Бактерии инкубировали в цельном стерильном молоке с пониженным содержанием жира (0,5%) без внесения дополнительных компонентов в термостате при оптимальной для вида температуре инкубации в течение 3, 6, 8, 168 ч. Измерение pH проводилось при помощи электронного рН-метра "Mettler Toledo МР220". Титруемую кислотность определяли по ГОСТ 3624-92 "Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности".

Молекулярно-биологические методы исследования: генетические методы, используемые в работе (выделение плазмидной ДНК из микроорганизмов, выделение хромосомной ДНК, электрофорез ДНК, рестрикция ДНК и др.) являются модификацией известных методов (Маниатис Т., 1984). Получение препаратов плазмидной ДНК из молочнокислых бактерий проводили согласно методике (Anderson, McKay, 1983). Компьютерный анализ подбора праймеров проводили с применением компьютерных программ: NCBI Blast2 - определение гомологии при изучении сиквенсов с соответствующих праймеров, Oligo 6.31 -основной расчет характеристик ПЦР, возможности образования праймерами дуплексов и вторичных структур, определение мест неспецифического праймирования на матрице, Oligonucleotide Properties Calculator - определение температуры отжига праймеров и % GC состава. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её модификации (видоспецифическая, штаммоспецифическая, RAPD-PCR) проводилась по стандартным или модифицированным методикам. Для постановки ПЦР использовали реактивы фирмы "Fermentas", праймеры, специально подобранных нами и синтезированные фирмой "Синтол", амплификатор фирмы "Perkin Elmer". Выделение и очистку ДНК из арагозного геля проводили с использованием набора для очистки амплифицированной ДНК фирмы "Sigma", согласно рекомендациям фирмы-производителя. Секвенирование фрагментов генов осуществляли по методу Сэнгера (Senger et al., 1977) на автоматическом анализаторе ДНК ABI PRISM™ фирмы "Applied Biosystems", с набором реактивов "ABI Prism BygDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" фирмы "Applied Biosystems". Пульс-гель электрофорез геномной ДНК проводили в 1% агарозном геле, приготовленном на агарозе "Sigma", тип А при напряженности поля 6 В/см в 0,5 % буфере TBE при 14°С в аппарате CHEF-DRIII фирмы "BioRad", с режимом постепенного изменения времени пульса с 5 до 15 сек в течение 24 ч. Изображение гелей получали при помощи цифрового фотоаппарата "Casio QV-3500 EX",

изображеиия сохранялись в виде графических файлов с расширением .TIFF и экспортировались в программу для обработки гелей. Геномный анализ проводился по полным последовательностям геномов бактерий, доступных в GenBank, на основе гомологии к нуклеотидным последовательностям интересующих генов у молочнокислых бактерий с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Филогенетический анализ. Для анализа полученных последовательностей генов применяли программу Blast в Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Результаты секвенирования анализировались с использованием компьютерной программы Vector NTI: ContigExpress. Множественное выравнивание последовательностей проводились в программе ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html), филогенетический анализ, расчет генетических дистанций, построение дендрограмм - в программе Mega4.0 в Internet (http://www.megasoftware.net). Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом PFGE и анализ фореграмм, полученных методом RAPD-PCR, построение филогенетических дендрограмм осуществлялись с применением компьютерного обеспечения BioNumerics (версия 4.0; Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Для анализа рестриктограмм проводилось вычисление подобия геномных фингерпринтов согласно алгоритму Дисе (Dice) и по методу корреляции Пирсона (с учетом коэффициента корреляции для континуальных переменных). Для построения дендрограмм использовали матрицу подобия, полученную согласно алгоритму последовательной кластеризации. Для вычисления статистической значимости были применены два основных инструмента программы: метод выключения кластеров (cluster cut-off method) и кофенетическая корреляция (cophenetic corrélation). Подсчет величин фрагментов рестрикции осуществлялся в программе BioNumerics.

Аналитические методы исследования. Определение синтезируемых веществ проводили методом ВЭЖХ на хроматографе "Alliance" (Séparations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996).

Статистическую обработку результатов экспериментов осуществляли по стандартным программам и общепринятым алгоритмам с применением регрессионного анализа и оптимизации.

Экспериментальные результаты работы получены автором лично и совместно с коллегами из лаборатории генетики микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов, Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, кафедр микробиологии и генетики МГУ им. М.В. Ломоносова, Национального института сельскохозяйственных исследований Франции (INRA), лаборатории генетики микроорганизмов отдела генетических основ биотехнологии Института общей генетики РАН, ФГУН Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, Центральной лаборатории микробиологии ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии, а также с сотрудниками, работавшими под руководством диссертанта.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Применение молекулярно-биологических подходов для видовой идентификации молочнокислых бактерий 1.1. Сравнение генотипических и биохимических характеристик штаммов Streptococcus thermophllus, выделенных из кисломолочных продуктов Термофильные молочнокислые стрептококки (Streptococcus thermophilus) -немногочисленные представители «полезных» бактерий этого рода, с точки зрения их широкого применения при изготовлении кисломолочных продуктов. В связи с тем, что в России продолжается поиск конкурентоспособных стартовых культур для пищевой промышленности, актуальными являются исследования, направленные на детализацию биологических, генотипических и производственно-ценных характеристик штаммов S. thermophilus, использующихся в качестве заквасок при промышленном производстве йогурта, ряженки, простокваши и некоторых видов сыров. Целью данного раздела работы являлось изучение фенотипических и генотипических характеристик 72 штаммов S. thermophilus, выделенных из различных кисломолочных продуктов домашнего приготовления (йогурт, сметана, сыры, простокваша, творог, кислое молоко), изготовленных в разных географических регионах мира (России, странах СНГ, Италии, Хорватии, Словении, Франции). Для этого была проведена работа по изучению сахаролитических свойств у всех штаммов из собранной нами коллекции бактерий, и определена последовательность гена 16S рРНК в проксимальном участке гена протяженностью 500 пар нуклеотидов. Сравнительный анализ фрагментов генов 16S рРНК, у собранных нами штаммов позволил обнаружить гомологию этого фрагмента с нуклеотидными последовательностями у типового представителя этого вида АТСС 19258, а также с другими последовательностями, характерными для бактерий вида S. thermophilus (АВ161183, АВ200871, DQ295043, AY730718, AY687382, AY687383, DQ176426), Депонированными в NCBI, и с последовательностью AY683829, депонированной ранее нами (рисунок 1), на уровне 100%.

Результаты проведенного исследования показали, что большинство изученных культур обладают способностью утилизировать только три сахара: лактозу, сахарозу и глюкозу. В то же время, некоторые из исследуемых штаммов оказались неспособными утилизировать фруктозу или сахарозу, и были обнаружены штаммы, способные ферментировать галактозу, целлобиозу, тагатозу, рибозу, раффинозу, мальтозу. Эти данные подтвердили известное явление гетерогенности сахаролитической активности у представителей термофильного стрептококка и демонстрируют сложность интерпретации результатов биохимических показателей при идентификации бактерий S. thermophilus с использованием классических микробиологических методов или коммерческих тест-систем, основанных на способности исследуемых штаммов ферментировать сахара. Такие штаммы можно отнести к «нетипичным», и их легко перепутать с другими молочнокислыми бактериями. С другой стороны, разнообразие в биохимических параметрах метаболизма штаммов S. thermophilus дает большой потенциал для использования бактерий этого вида в качестве объекта исследования в научных целях, а также в производственных

биотехнологических процессах, основанных на ферментации нетрадиционных углеводов штаммами данного вида.

1ПО»АУ1ввЭвЗ АУ1МЭ93

лузетоге

а.опи*лу*«деоз »• вшпдиМ» ЛУ2в1Св6

8.гп*»<Юл1си«вМ254017

• .•оилиаМЭШЮГ

• их» Ав0024*1

Рисунок 1. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов Б. ЛегторЫЫя, основанная на сходстве нуклеотидных последовательностей проксимального участка гена 16Б рРНК протяженностью в 500 нуклеотидов.

1.2. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы salivarius рода Streptococcus Метод сравнения последовательностей генов 16S рРНК часто используется для определения видовой принадлежности микрофлоры, присутствующей в молочных продуктах. Целью данного раздела работы являлось исследование строения генов 16S рРНК у представителей различных видов стрептококков для выявления внутриродовых различий в последовательностях этого гена и возможности использования полученных результатов при молекулярной идентификации близкородственных видов рода Streptococcus.

Для проведения филогенетического анализа нами были исследованы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК у 10 типовых штаммов из группы viridans рода Streptococcus. Особенно детально было изучено разнообразие строения генов 16S рРНК у представителей трех видов стрептококков, принадлежащих группе salivarius: Streptococcus thermophilus, S. salivarius, S. vestibularis. Основываясь на анализе последовательностей гена 16S рРНК, все исследованные стрептококки нами были распределены в кластеры, соответствующие трем филогенетическим группам: salivarius (в которую вошли типовые штаммы & thermophilus, S. salivarius, S. vestibularis), bovis (штаммы S. macedonicus, S. bovis, S. equinus) и mitis (штаммы S. mitis, S. gordonii, S. oralis, S. sanguinis) (рис. 2).

Группа salivarius

100

Группа bovis 100

Группа mitis

75r S.salivarius AY188352

100 И-S-thermophilus AY188354

L Svestibularis AY168353 -S. macedonicus SMZ94012

100 |

• S- equinus AJ301607 — S bovis AB002481

■ S-gordonii AY4S5606

-S.mitis AY281078

-— S. oralis AY485602

-S-sanguinis AY281085

0.005

Рисунок 2. Филогенетическое дерево, построенное с использованием bootstrap-анализа по результатам сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK десяти видов - представителей группы viridans рода Streptococcus.

На основании данных о строении гена 16S рРНК гомология нуклеотидных последовательностей между типовыми представителями видов S. thermophilus и S. salivarius по нашим данным составляет 99.8%, в отношении же еще одного представителя группы salivarius - вида S. vestibularis гомология со S. thermophilus составляет 99.6%. Столь высокие уровни гомологии гена 16S рРНК у разных видов внутри группы salivarius объяснимы наличием всего 4 нуклеотидных замен (из 1540 п.н.) между последовательностями генов типовых

представителей видов S. themophilus и S. salivarius, а также 6 замен и 1 мононуклеотидной делеции в последовательностях этого гена видов S. themophilus и S. vestibularis (таблица 1).

Таблица 1. Позиции варьирующих нуклеотидов у представителей группы salivarius рода Streptococcus (по результатам анализа полных нуклеотидных

последовательностей генов 16S рРНК, представленных в базе данных NCBI).

Позиция/ последовательность 193 195 277 468 513 1290 1494

S. themophilus AY 1883 54 G A T G A G С

S. vestibularis AY188353 A G С A A T

S. salivarius AY188352 G A С A A A T

Примечание: 193 нуклеотид в последовательности гена 16S рРНК представителей рода Streptococcus соответствует 188 нуклеотиду малой субъединицы рРНК Е. coli штамма АТСС25922 (номер последовательности DQ360844).

Три близкородственных вида, рассмотренные нами как представители группы salivarius, имеют разное происхождение. Так, штаммы S. themophilus нередко выделяются из кисломолочных продуктов, представители этого вида рассматриваются как стартовые культуры при изготовлении заквасок. Местом обитания бактерий вида S. salivarius является ротовая полость животных и человека, его представители могут быть этиологическим фактором заболеваний зубов. Источником выделения бактерий вида S. vestibularis также является ротовая полость человека, однако они не ассоциированы с каким либо инфекционным процессом. Исходя из полученных данных о филогенетическом родстве стрептококков группы salivarius, отметим, что определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК может быть рекомендовано в качестве быстрого и достоверного приема при дифференциации близкородственных видов этих бактерий.

1.3. Молекулярно-генетическая идентификация подвидов Lactococcus lactis Молочнокислые лактококки (Lactococcus lactis) широко применяются в молочной промышленности при изготовлении творога, сметаны и некоторых видов сыров. Фенотипически штаммы L. lactis subsp. lactis и L. lactis subsp. cremoris различают по способности расти в присутствии 4% NaCl и при температуре 40°С, а также гидролизировать аргинин. Однако, как отмечают многие авторы (это подтверждено и в наших исследованиях), в некоторых случаях, фенотипическая характеристика представителей подвидов L. lactis не

коррелирует с генотипической классификацией. Это позволяет прийти к заключению, что фенотипическая характеристика штамма уже не является достаточной для установления таксономического положения изучаемого организма. В случае, когда при идентификации традиционными микробиологическими методами организмы трудноотличимы, применение генотипичееких методов при установлении таксономического положения бактерий, используемых в пищевой промышленности, следует рассматривать как обязательную процедуру.

Нами был проведен филогенетический анализ полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК у штаммов, принадлежащих подвидам Lactococcus lactis, депонированных в базе данных NCBI, для рассмотрения возможности применения этого метода для точной идентификации представителей L. lactis subsp. lactis и L. lactis subsp. cremoris.

Результаты филогенетического анализа последовательностей гена 16S рРНК у изучаемых штаммов представлены на филогенетическом дереве (рис. 3) построенном в программе Mega4, с использованием Neighbor-Joining кластерного метода расчета генетических расстояний и bootstrap анализа, отражающего достоверность кластеризации. Как видно из представленных данных, по характеру последовательностей штаммы можно распределить в 2 кластера, один из которых составляют культуры Lactococcus lactis subsp. cremoris, полные нуклеотидные последовательности которых характеризуются 100% сходством. Второй кластер включает штаммы подвидов Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis, сходство последовательностей гена 16S рРНК у которых колеблется у отдельных штаммов от 100 до 99,3%.

- АВ100805

-АМ08В020

— АВ100803

-АВ0С8215

~-EF589778

-АВ100799

^—AB1Q0801

-АВ100800

АВ100802

Lactococcus lactis

_subsp. cremoris AB008214

100 АВ100792 АВ100794

-1-1-1-1-H-1—:—I

0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 ■ ОЛОО

Рисунок 3. Филогенетическое дерево, построенное на основании сходства полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК подвидов Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris и Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis.

На рисунке 4 представлены участки нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК у изученных штаммов ЬаЫососсий 1асШ зиЬэр. сгетот, содержащие 10 нуклеотидных замен, позволяющих точно дифференцировать их от представителей близкородственного подвида LаМососсия 1асШ БиЬзр. 1асШ.

АВ100800

ABl00799 ABl00801 ABl00803 ABl00805 ABl00802 ABl00792 ABl00794 AB008214 AB008215

EF589778 ---------------------------

ДМ088020 GAGACTTTGA TCCTQ3CTCA G.........

-GACGAACOC TGGCGSCGTG CCTAATACAT GCAAGTTGAG CGCTG4AGGT TGGTAITTGT

-A3AGTTTGA TCATQjCTCA G -AGAGTTTGA TCATfflCTCA G

AB100800 ABl00799 ABl00801 AB100803 ABl00805 ABl00802 ABl00792 ABl00794 AB008214 AB008215 EF589778 AM088020

ABl00800 ABl00799 ABl00801 ABl00803 ABl00805 ABl00802 ABl00792 ABl00794 AB008214 AB008215 EF589778 AM088020

81 160 ACCGACTGGA TGAGCAGCGA ACGGGTGAGT AACGCGTGGG GAATCTGCCT TTGA3CGGGG GACAACATTT GGAAACGAAT

.A.T.T. .A.T.T. .A.T.T. ■A.T.T.

161 240

GCTAATACCG CATAAAAACT ТТАААСДСАА GTTTTAAGTT TGAAA3ATGC AATTGZATCA CTCAAAGATG ATCCCGCGTT

Рисунок 4. Участки нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК подвидов Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis, Lactococcus ¡actis subsp. cremoris и Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis bv. diacetylactis, содержащие нуклеотидные замены.

Эти замены располагаются в проксимальной части гена от 63 до 181 позиции (нумерация дана по последовательности АМ088020). Таким образом, даже имея возможность секвенирования первых 200 нуклеотидов гена 16S рРНК у штамма со спорным таксономическим положением внутри вида Lactococcus ¡actis, можно точно установить его принадлежность к подвиду ¡actis или cremoris. Последовательности генов 16S рРНК, свойственных бактериям Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis и Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis bv. diacetylactis идентичны; поэтому дифференциацию бактерий варианта diacetylactis, следует производить путем биохимического исследования способности бактерий Lactococcus ¡actis subsp. ¡actis продуцировать диацетил. Таким образом, проведенные нами исследования позволили продемонстрировать существование уникальных замен в проксимальной области гена 16S рРНК у представителей подвида cremoris, позволяющие проводить точную дифференциацию культур L. ¡actis subsp. cremoris и L. lactis subsp. ¡actis.

1.4. Рекласснфикация таксономической принадлежности некоторых отечественных пробиотических штаммов лактобацилл

Лактобациллы - важный биотехнологический объект, поскольку они широко применяются в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания (йогурт, простокваша, ряженка и сыры); некоторые штаммы лактобацилл (обладающие пробиотическими свойствами) используются в составе лекарственных препаратов, БАД, продуктов функционального питания для человека и кормовых добавок для животных.

С использованием комплекса микробиологических и молекулярно-биологических методик нами было проведено уточнение таксономической принадлежности производственных штаммов лактобацилл, на протяжении нескольких десятилетий используемых в РФ в качестве заквасок в различных биотехнологических процессах.

Филогенетический анализ данных о строении генов 16S рРНК у производственных и референтных штаммов приведен на рисунке 5. Полученные результаты позволили провести молекулярно-генетическую идентификацию родовой и видовой принадлежности всех исследованных культур. Исключение представляют штаммы, относящиеся к группе L. casei-paracasei. Анализ литературы свидетельствует, что установить видовую принадлежность на основе сравнения 16S РНК невозможно из-за ее 100%-го сходства у представителей этой группы (Acedo-Felix Е. and Perez-Martinez G., 2003). Отечественные производственные штаммы лактобацилл по результатам нашего анализа последовательностей их генов 16S рРНК были разделены на 2 группы. В первую группу вошли штаммы L. casei ГКНМ 577, L. plantarum 8-РА-З, L. plantarum CS 396, видовая принадлежность которых соответствует их исходным паспортным данным, составленным на основании традиционных микробиологических методов исследования. Ко второй группе отнесены штаммы L. acidophilus (NK-1, ЕгЗ 17/402 НАРИНЭ, К3Ш24, 100 аш, NNIE), L. brevis ГКНМ 23, L. delbrueckii (ГКНМ 101, ГКНМ 526), L. fermentum 90-ТС-4 и L. plantarum 421-2, у которых последовательность гена 16S рРНК не соответствует видовому положению, указанному в паспортных данных. Сравнение нуклеотидной последовательностей генов 16S рРНК производственных штаммов с таковой международных баз данных позволило установить, что штаммы NK-1, Ег317/402 НАРИНЭ, 100 аш, NNIE, идентифицированные ранее, как L. acidophillus, на самом деле относятся к L. helveticus, штаммы L. brevis ГКНМ 23 и L. acidophillus К3Ш24 - к группе L. casei/paracasei, штаммы L. delbrueckii ГКНМ 101 и fermentum 90-ТС-4 - к L. plantarum, штамм L. delbrueckii ГКНМ 526 - к L. fermentum, а штамм L. plantarum 421 -2 - к L. rhamnosus. .<

Номера последовательностей генов 16S .рРНК, реклассифицированных нами штаммов лактобацилл, в базе данных NCBI: GU560031, GU560032, GU560033, GU560034, GU560035, GU560036, GU560037, GU560038, GU560039, GU560040, GU560041, GU560042, GU560043.

I. р1атагипг) 8-РА-э С. р1ап1агит СБ-ЗЭб 1_.р1атагит ир1атагит WCFS1 1_. р^апГашт 90-ТС-4

-и р!атагит 101

-Ь-Ьге^ АТСС367

I. feгmentum 526 ГегтеШит 1Р03956

-Г

У i-L.fi

100 ь

и гатпоэиз 421-2 1_П1атпо5из АТСС7469 1~ [.. сазе!/рагасазе( 577 !_. са5е1/рагасазе1 23-1 Ь сазе^рагасазе! 324 Ьса5е1 АТСС334 1_.рагасазе|

■ 1_.йе1Ьшескн sub.Bulg.ATCC ВАА-365 I— 1_аск1ор№1и9 ЫСРМ 1_Ье1\е!юиз ОРС4571

Ье[\вИсиз 1\1К-1 и. Ье^Исиэ 100 $6 1_ Ье1хисив Ег315/402 - 1_ ЬеЬ«№сиз ЫЫЕ

Е.соП 81Г.К-12 биЬз^.ОНЮВ

100

Рисунок 5. Филогенетическое дерево, построенное на основании анализа последовательности генов 16Б рРНК исследуемых и референтных штаммов лактобацилл.

2. Изучение генетического разнообразия бактерий рода Еп/егососсих, выделенных из кисломолочных продуктов Стабильность оперонов рРНК (ггп), обычно присутствующих в клетках бактерий в виде множественных копий (К1аррепЬасЬ 1.А., Ы а!., 2001), зависит от генетического взаимодействия между ними по механизму генной конверсии, что приводит к гомогенизации ггп оперонов и содержащихся в них генов 16Б (/•«) и 238 (гг[) рРНК (Ыао О., 2000). Рекомбинационный механизм генной конверсии состоит в особом разрешении структур Холлидея, которое приводит к односторонней передаче генетической информации в виде относительно коротких (содержащих до нескольких сот нуклеотидов) фрагментов однонитевой ДНК от одного ггп оперона к другому (Ыао Б., 2000, Вс1гап Е., е1 а1., 1997). Однако важно отметить, что полной гомогенизации гпп оперонов в клетках бактерий не происходит: некоторые ггп опероны сохраняют определенные отличия в генах т и /г/. Тем не менее, высокий уровень сходства (>99 %) между множественными ггп оперонами одной клетки позволяет определять последовательность генов 16Б рРНК, используя суммарную ДНК

штамма бактерий. Именно такие данные о нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК в разных штаммах бактерий представлены в базе данных GenBank.

В нашей работе было показано, что штаммы Е. durons и Е. faecium, выделенные из кисломолочных продуктов, имеют некоторые отличия в нуклеотидных последовательностях генов rrs по сравнению со штаммами этих видов энтерококков, представленными в базе данных GenBank. Помимо этого, среди энтерококков, используемых в качестве заквасок, была обнаружена группа штаммов (рис. 6), имевших существенное отличие в последовательностях генов rrs. В проксимальной области генов rrs эти штаммы несли конфигурацию нуклеотидных замен характерную для вида Е. durons, а в дистальной части - для Е. faecium. Образование данной группы штаммов (СК1026, СК1114, СК1025) могло быть следствием образования особого вида бактерий (Е. lactis sp. nov.), использующего в качестве основной среды обитания молоко.

СК1116

- СК1106

- СК1107

---Е durans AJ276354

-Е durans AJ420801

Е hirae Y17302

- Е hirae AJ276356

Е hirae AJ420799

--СК1028

- СК1114

- СК1025

-Е faecium AY675247

___Е faecium AJ420800

-I Е faecium AJ276355

|-Е faecium AY057055

1-Е faecium AY172S70

|-Е mundffi АВ066266

I-Е mundtii Y18340

I-1

0.001

Рисунок 6. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов различных видов энтерококков, построенная исходя из степени гомологии нуклёотидных последовательностей генов rrs.

Вывод о возможной принадлежности группы штаммов к предположительно новому виду подтверждается данными исследований, в которых, в частности, проведено сравнение полных нуклеотидных последовательностей генов rrs предположительно нового вида и родственного вида Е. hirae. Исходя из полученных данных,.можно предположить, что отличия в гомологии различных оперонов рРНК отражают изменения структуры геномов в процессах видообразования у бактерий..

Как следует из дедрограммы, представленной на рис. 6, группа штаммов СК1025, СК1026 и СК1114, предположительно относящихся к отдельному виду Е. Iactis, попала в одну ветвь дерева с Е. faecium. Степень гомологии между этими штаммами очень высокая - 99.7-99.9%, причем особенно высокий уровень гомологии по отношению к виду Е. ¡actis, т.е. штаммам СК1025, СК1026 и СК1114, обнаружил штамм Е. faecium (номер депонированной последовательности в NCBI - AY675247). Но этот штамм, выделенный из пищевого продукта, обнаруживает существенное сходство с Е. Iactis в наборах варьирующих нуклеотидов (рисунки 6 и 7) и, вероятно, должен быть отнесен к данному виду. Здесь важно обратить внимание на то, что разные виды энтерококков отличаются наличием в генах rrs определенных устойчивых комбинаций варьирующих нуклеотидов (рис. 7).

21 54 98 287 1148 1268 1321 1338

Е. 1actis —Т-- -Т— —А— ..„С— „С-- --Т-..... —-С-- ..-С—

Е. faeciwn —А~ -А--- —G— ..„С— „.у/.... -С-- --Т-..... .—С" —G—

Е. Iiirae -----А~ -А— —G—■ —G— ~Т—- -С-..... ...-Т- „А---

Е. durons -----д_ -Т— —А—- —с— --С-..... -—Т-- -А—-

СК1106 —т~ .т— ...А— —Y - — —с— -----с—- -----т~ ...А—

AY675247 —А_ -Т— ...д.... —с— -Т-— .....т— -----с- —G—

Е. mundtii -----д... -А— —G—■ -С-- —■/ /— ...т—- -----с—- —т- ...А—

Рисунок 7. Позиции общих варьирующих нуклеотидов в генах rrs у родственных видов энтерококков.

Примечание: Номера позиций соответствуют

последовательности, приближенной к гену J6S рРНК Е. coli. Подчеркнуты комбинации нуклеотидов — предположительные продукты конверсионного переноса фрагментов ДНК между генами rrs. В нижней части рисунка представлены позиции соответствующих нуклеотидов у штамма молочнокислых энтерококков CK 1106 Е. durons, штамма AY675247 и у Е. mundtii. Такую же последовательность нуклеотидов, как у СК1106, имеют штаммы СК1107 и СК1116. Варьирующие нуклеотиды, характерные для Е. mundtii, не показаны. Y = С или Т.

Такие комбинации из близко расположенных друг к другу нуклеотидных замен принято рассматривать в качестве продуктов однонаправленных генных конверсий, ответственных за гомогенизацию множественных оперонов ггп (Cilia V., et al., 1996, Hashimoto J.G., et al., 2003). Как показано на рис. 7, виды Е.

durans и E. faecium отличаются друг от друга наличием определенных комбинаций близлежащих нуклеотидных замен, как в проксимальной, так и в дистальной областях генов rrs. Так, у штаммов Е. durans в проксимальной и дистальной областях генов rrs имеются наборы нуклеотидов Т-А и С-Т-А, соответственно, тогда как у штаммов Е. faecium в этих позициях обнаруживаются другие наборы: A-G и T-C-G. Исключение составил упомянутый выше штамм Е. faecium AY675247, который имел наборы варьирующих нуклеотидов, характерные для предположительно нового вида Е. lactis. Такого же типа отличия имеются между E. hirae и новым видом E. lactis. Интересно, что E. hirae имеет в проксимальной области (позиции 54-98) комбинацию нуклеотидов свойственную Е. faecium, а в дистальной области генов (позиции 1268-1321-1338) - комбинацию, свойственную Е. durans. Е. lactis, напротив, имеет в проксимальной области комбинацию нуклеотидов, свойственную Е. durans, а в дистальной области генов rrs - комбинацию, свойственную Е. faecium (рис. 7). Следует отметить также тот факт, что штаммы E. mundtii имели в указанных позициях такие же наборы нуклеотидов как E. hirae, но Е. mundtii, как более далеко отстоящий вид, имел особые специфические наборы варьирующих нуклеотидов, которые на рис. 7 не показаны.

На основании полученных данных, делается предположение, что образование нового вида у бактерий может быть следствием такого преобразования генов рРНК, которое приводит к появлению качественно измененной динамической структуры генома, способного к видоизменению в результате генетических рекомбинаций между ггп оперонами. В геноме бактерий Е. faecium имеется 6 ггп оперонов (Оапа К., et al., 2002) и, возможно, они также как ггп опероны Е. coli образуют некоторую динамическую систему, в которой отдельные опероны (и гены rrs в них) могут отличаться по гомологии и по этой причине иметь разную вероятность вступления в генетическое взаимодействие друг с другом. Мы предполагаем, что в процессе образования новых видов у бактерий должно происходить формирование новой динамической системы как особой системы взаимодействия между ггп оперонами. Формирование новой системы взаимодействия между ггп оперонами может инициироваться стечением случайных событий в процессах генной конверсии, приводящих к появлению негомологачных комбинаций отдельных нуклеотидов в прежде полностью гомологичных ггп оперонах и в генах rrs в частности. В таких случаях последующий естественный отбор, ведущий новый вид (в соответствии с адаптационной моделью Фишера (Fisher R.A., 1958)) к вершине приспособленности, произведет постепенное «отлаживание» уровня гомологии между различными ггп оперонами, требуемого в контексте достижения максимально возможного уровня приспособленности. Таким образом, фиксация новой комбинации нуклеотидов в генах rrs создает базу для формирования новой динамической системы бактериального генома, т.е. нового вида.

3. Изучение генетического разнообразия и анализ размеров геномов

штаммов Streptococcus thermophilus Генетическое разнообразие в рамках вида выражается в различиях на физиологическом уровне и в строении генома у отдаленных групп из разных экологических ниш. Изучение этих различий имеет значение для характеристики вида как таксона. В связи с этим представляет интерес сравнение как фенотипических, так и генотипических свойств сформировавшихся в разных природных условиях групп микроорганизмов вида Streptococcus thermophilus, культуры которого широко используются в составе заквасок при промышленном и домашнем изготовлении кисломолочных продуктов. Поэтому актуальным является использование различных методов ДНК-типирования для разграничения культур бактерий на уровне штамма и изучения внутривидового разнообразия бактерий S. thermophilus.

Метод сравнения фингерпринтов, полученных при рестрикции геномной ДНК широко используется, прежде всего, для паспортизации культур бактерий одного вида, что в условиях продолжительного исследования коллекции штаммов, не имеющих генетических маркеров, является необходимым. Для штаммов термофильных стрептококков анализ фрагментов ДНК, полученных при использовании эндонуклеазы рестрикции Smal, позволяет оценивать сходство геномов по числу общих (идентичных по величине) фрагментов рестрикции в составе полученных паттернов и оценить генетическое разнообразие культур по величине их геномов.

Рестриктограммы хромосомной ДНК изучаемых нами штаммов, полученные при помощи эндонуклеазы рестрикции Smal и результаты сравнительного анализа профилей рестрикции представлены в виде филогенетического дерева со схематичным изображением фрагментов геномной рестрикции изучаемых штаммов на рисунке 8. Как видно из приведенных результатов, фингерпринты разных штаммов сильно отличаются друг от друга. Штаммы исследованной нами коллекции характеризовались большим разнообразием в наборе рестрикционных фрагментов геномной ДНК, хотя для многих из них показано наличие близких или практически идентичных по величине фрагментов.

Генетическая организация бактерий термофильных стрептококков имеет ряд особенностей. Прежде всего, представители вида Streptococcus thermophilus отличаются от других молочнокислых бактерий относительно небольшим размером генома. Например, для разных видов стрептококков величина хромосомы варьирует в следующих пределах: S. mutans - 2030-2200 т.п.н., S. agalactiae - 2200 т.п.н., S. waius - 2150-2250 т.п.н., S. macedonicus - 2150-2250 т.п.н. Геном S. thermophilus самый маленький и составляет по разным данным от 1500 до 1824 т.п.н. Размер генома исследованных нами штаммов сильно варьирует и составляет значения от 1417 до 2075 т.п.н., что говорит о значительной внутривидовой дивергенции геномов изучаемых нами штаммов. Таким образом, исходя из полученных нами данных размер геномов изученных нами штаммов S. thermophilus варьирует в пределах до 30%, что говорит о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.

PFGE

s наша Шяя 3SS832S£382S32;

IIII I 11 11 1,11 I I,

I I

11,111{ I

lllll

I I I I I

I I I I I I

i 11

I I

lili

I I

I I I

i j 1

I I

I i I t

I I

] I

S I

I I I

11 I

I I

III I il

8 $ ft I I y I y

I I I ! I 1 ; I! I II I I I I I I I I I I I ! I I í и I I I

11 11

Рисунок 8. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов Б. ¡ИегторЫЫ, основанная на результатах сравнительного анализа фингерпринтов, полученных методом геномной рестрикции с использованием эндонуклеазы Бта! и пульс-гель электрофореза (согласно корреляции Дисе).

Примечание: Ветви дендрограммы, уровень подобия которых менее значения воспроизводимости (в данном случае значение составляет 70%), считаются разными кластерами, и обозначены прерывистой линией. Ветви дендрограммы, уровень подобия которых превышает значение воспроизводимости, обозначены сплошной линией. Для каждой ветви представлены значения кофенетической корреляции. Справа от фингепринтов располагаются названия штаммов, а сверху - шкала величин фрагментов, выраженная в т.п.н.

В настоящее время доказано, что в эволюции бактерий генетический обмен играет такую же важную роль, как и в эволюции высших организмов. Наиболее убедительные данные в пользу такого заключения были получены при помощи метода "геномного вычитания", основанного на гибридизации ДНК разных штаммов одного вида: было показано, что разные штаммы в рамках вида могут отличаться по содержанию чужеродной ДНК, полученной в результате горизонтального переноса генов. Чужеродная ДНК, происходящая от других видов бактерий, может составлять до 30% размера генома бактерий. Таким

образом, благодаря горизонтальному переносу генов между разными видами геном бактерий, помимо несущественных генов, имеющих адаптивное значение, может содержать также чужеродные гены, несвойственные данному виду.

Следует отметить, что метод геномной рестрикции может быть использован для молекулярного типирования штаммов, ненесущих генетических маркеров, однако он не может быть рекомендован для оценки видовой принадлежности и степени филогенетического родства штаммов таксономически удаленных видов. Полученные индивидуальные паттерны промышленных штаммов микроорганизмов могут быть использованы для паспортизации культур в решении вопроса об авторстве производственно-ценных штаммов молочнокислых бактерий.

4. Генетическое разнообразие природных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий 4.1. Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus. Генетическая паспортизация бактериальных культур методом RAPD-PCR

Было проведено изучение внутривидовых различий штаммов вида S. thermophilus методом RAPD-PCR. Метод анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов (randomly amplified polymorphic DNA (или RAPD-PCR) с применением случайных праймеров) используется для дифференциации генетически немаркированных штаммов молочнокислых бактерий. Он основан на использовании коротких праймеров, которые достаточно эффективно гибридизуются с хромосомной ДНК. Число и расположение сайтов связывания таких неспецифических праймеров различаются среди бактерий разных видов и штаммов. При разделении RAPD-PCR-фрагментов на электрофорезе получаются паттерны, которые служат «дактилоскопическими» характеристиками определенных штаммов. Метод RAPD-PCR является быстрым методом идентификации и паспортизации природных изолятов бактерий, для микробиологического анализа (контроля качества продуктов) и мониторинга культур молочнокислых бактерий, входящих в состав производственных заквасок, а также таксономического и генотипического анализа штаммов бактерий на уровне рода (вида) и на штаммовом уровне.

Дендрограммы анализа экспериментов, полученные с использованием программы BioNumerics и построенные на основании данных RAPD-PCR с использованием различных праймеров различаются (рис. 9, 10). Это связано с тем, что праймеры подобраны для разных участков генома, что не дает возможности построения совокупного филогенетического дерева. Сопоставление результатов RAPD-PCR с использованием нескольких вариантов праймеров, подобранных таким образом, чтобы затронуть как консервативные области генома бактерий, так и более вариабельные участки, позволяет получить представление о внутривидовом разнообразии S. thermophilus.

tViBon согтгШяо Щ~|00£1 (а) — %40 60 SO 100*

ми

L_l-1 lllll

42.S,

- i

ПЗ

в1? С 'О' в® в в

£8 Я 8 йЧ Я S 11 I I I 11 I I, 11,1 I ,1

SSS3S 8Й8 Я 38 о

Ж Г».'« Г} -чг r-i ~ SC

I, I I 1,1 I

Ш.-

78.1 П-

S8L4,' '' 1_

5.U

96.6

'96 М' 91.9

« SM

«йЗг-

эдт.

шГ

<>1.4

зС

I I

I I I II I I

I I

I II I I I I I

I I I I I I I I I

I I

вал всзп

пав

BC3U ВС324

ваз*

BOJ6 B76J7 BC2S7 ВС2» ВС236 BC2« ЕШ1 BC22I ВС233 ATCCI9BB

ват

ВС223

вал веко

BC2J6 ВС32? ВС332 ВСБ7

веш пав

Рисунок 9. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов S. thermophilus основанная на результатах сравнительного анализа фингерпринтов, полученных посредством метода RAPD-PCR с использованием праймера М13 согласно корреляции Пирсона.

Примечание: Справа от фингепринтов располагаются названия штаммов, сверху - шкала величин фрагментов выраженная в т.п.н.

При использовании метода RAPD-PCR и сравнительном анализе подобия ПЦР-фингерпринтов нами были получены данные о внутривидовом разнообразии природных изолятов Streptococcus thermophilus. На основании полученных данных мы пришли к заключению, что использование метода RAPD-PCR с применением праймера ERIC-1 более предпочтительно для видовой идентификации бактерий вида Streptococcus thermophilus, а при использовании праймера М13 - для паспортизации природных изолятов бактерий этого вида на уровне штамма (рис. 9,10).

Teuton eluc-l

toneblk-o[0-lùc»ïl

О») —

er1c-i

%70 80 90

7j.2'

100 è —I I

S : « ■

m m i.....г

OSÎ

8ЯН I 1,1

I I

I III

II II

I 11

I I I I

I I

I I I

BCJJ6

вез m

BC236 вс-ш bc2j3

bcjoj

BC221

bc223

bc259

BC231

bc257

atccw2î8

BC323

bc321

BC3U

ec317

вел:

bcj16

вал ваш вон

вез 13

вез;»

вс332 вс250 B7G?

Рисунок 10. Дендрограмма родственных взаимоотношений штаммов S. themophilus основанная на результатах сравнительного анализа фингерпринтов, полученных посредством метода RAPD-PCR с использованием праймера ERIC-1 согласно корреляции Пирсона.

4.2. Генетическое разнообразие и генетическая паспортизация производственных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus Генетическое типирование штаммов лактобацилл проводили с помощью анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК (RAPD-PCR) с тремя вариантами праймеров (М13, MSP, ERIC-1). Показано, что применение этой методики с использованием праймера ERIC-1 дает наиболее достоверные и воспроизводимые результаты по сравнению с использованием праймеров М13 и MSP и позволяет проводить идентификацию на видовом и паспортизацию на штаммовом уровне у лактобацилл используемых для биотехнологических целей (рис. 11-13).

При использовании праймеров М13 и MSP образовывалось большое количество фрагментов, размер которых варьировал от 200 до 5000-6000 п.н.; основная зона разделения фрагментов находилась в пределах 400-2500 п.н. (рис. 11 и 12). При этом идентификация значительной части фрагментов, полученных с обоими указанными праймерами, была затруднена из-за присутствия неспецифических продуктов реакции. При использовании праймера ERIC-1 количество ПЦР-фрагментов для всех штаммов, как правило, не превышало 10, и основная зона разделения фрагментов находилась в пределах 400-2000 п.н. (рис. 13). Также следует отметить хорошую воспроизводимость результатов, полученных при использовании данного варианта праймера. Таким образом, на основании проведенных исследований нами показано, что для идентификации культур лактобацилл на штаммовом уровне наиболее удобным является использование праймера ERIC-1, который в отношении исследуемых видов латобацилл можно рассматривать как инструмент для идентификации на видовом и паспортизации на штаммовом уровне. Но использование его одного не дало бы полной картины генетического разнообразия культур в пределах одного вида, поскольку не редко в результате эксперимента па электрофореграммах разных штаммов с использованием этого праймера (рис. 11, 12 и 13) присутствуют одинаковые наборы RAPD-фрагментов (например дорожки 1, 2, 4 и 5 на рис. 13), что не подтверждается данными об идентичности культур при использовании других праймеров в данной работе (например дорожки 1, 2, 4 и 5 на рис. 11 и 12).

1 2 3 4 3 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рисунок 11. Электрофореграммы ЯАРй - фрагментов изучаемых и типовых штаммов, полученных с использованием праймера М13. Слева указаны размеры фрагментов маркера ДНК.

Примечание: Последовательность расположения штаммов на рисунке 11 аналогична последовательности расположения штаммов на рисунке 13.

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19

Рисунок 12. Электрофореграммы RAPD - фрагментов изучаемых и типовых штаммов, полученных с использованием праймера MSP.

Примечание: Слева указаны размеры фрагментов маркера ДНК. Последовательность расположения штаммов на рисунке 12 аналогична последовательности расположения штаммов на рисунке 13.

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рисунок 13. Электрофореграммы RAPD - фрагментов изучаемых и типовых штаммов, полученных с использованием праймера ER1C-1.

Прьшечание: Слева указаны размеры фрагментов маркера ДНК. 1 - L. plantarum АТСС 8014, 2 -1. plantarum 90-ТС-4, 3 - L. plantarum ГКНМ 101,4-1. plantarum 8-РА-З, 5 - L. plantarum CS 396, 6 - L brevis DSM 20054, 7 - L.fermentum DSM 20052, 8 - L.fermentum ГКНМ 526, 9 -L. rhamnosus 421-2, 10 - L. buchneri DSM 20057, 11 - L. casei/paracasei DSM 20011, 12 - 1. casei/paracasei ГКНМ 23, 13 - L. casei/paracasei ГКНМ 577, 14 - L. casei/paracasei К3Ш24, 15 - L. delbrueckii DSM 20072, 16 - L. helveticus NK-1, 17 - L. helveticus Er 317/402, 18 - L. helveticus ЮОаш, 19 - L. helveticus NNIE.

5. Антибиотикорезистентность пробиотических лактобацилл.

5.1. Характеристика устойчивости к антибиотикам пробиотических бактерий рода Lactobacillus

Многие бактерии содержат гены устойчивости к антибиотическим препаратам, ответственные за различные механизмы, которые позволяют бактериям преодолевать присутствие антибиотиков в окружающей среде (Canton R., 2009). Совокупность генов, кодирующих устойчивость к антимикробным препаратам недавно назвали резистомой ("resistome") (Josephson J„ 2006, D'Costa V.M., et al„ 2006, Wright G.D., 2007). Известно, что представители симбионтной микробиоты (лактобациллы и бифидобактерии) могут выступать в качестве резервуара генов антибиотикорезистинтности, которые способны передаваться патогенным и условно патогенным бактериям в пищеварительном тракте человека. Изучение распространения генов антибиотикорезистентности у молочнокислых бактерий помогает лучшему пониманию роли этих бактерий в передаче признаков антибиотикорезистентности и решению проблемы биологической безопасности стартовых и пробиотических культур молочнокислых бактерий. В этой связи становится понятным необходимость определения у потенциальных пробиотических штаммов не только наличия признака устойчивости к антибиотикам, но и тестирование их ДНК на предмет обнаружения генов антибиотикорезистентности и возможности передачи этих генов другим представителям кишечной микробиоты.

13 штаммов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus (4 штамма L. plantarum, 4 штамма L. helveticus, 3 штамма L. casei, по одному штамму L. rhamnosus и L. fermentum), использующихся в качестве стартовых культур при производстве пробиотических препаратов на территории РФ, были исследованы на устойчивость к 15 антибиотикам, принадлежащим к пенициллинам, аминогликозидам, макролидам, линкозаминам, тетрациклину, хлорамфениколу и рифампицину. Все исследованные культуры проявили относительную чувствительность к ампициллину, хлорамфениколу, рифампицину, рокситромицину, эритромицину и азитромицину. При этом ни один штамм не был чувствителен ко всем использованным антибиотикам. Представители L. plantarum демонстрировали наиболее широкий спектр устойчивости: один штамм - к тетрациклину и трем аминогликозидам, и три штамма - к тетрациклину и пяти аминогликозидам; у одного штамма обнаружена высокая устойчивость к клиндамицину и у двух штаммов - к линкомицину. Вместе с тем два штамма L. plantarum отличались устойчивостью к бензилпенициллину, сопряженной с чувствительностью к другому Р-лактамному антибиотику ампициллину. Очевидно, такая устойчивость не связана с активностью р-лактамазы и может объясняться специфическим мутационным изменением одного из пенициллин-связывающих белков клеточной стенки. У штаммов L. helveticus, L. caseilparacasei, L. rhamnosus и L. fermentum выявлена перекрестная устойчивость к двум-пяти различным аминогликозидам. Данные об определении устойчивости к антибиотикам пробиотических штаммов лактобацилл представлены в таблице 2.

Таблица 2. Устойчивость к антибиотикам пробиотических штаммов ЬаМоЬасШш.

Штамм / Устойчивость к антибиотику*

№ Антибиотик Ь, р\апШгит Св 396 р1атагит 8-РА-З £. р1аШагит 90-ТС-4 Ь. р1ап!агит ГКНМ 101 Ь. ИеЫеИсиэ Ег 317/402 Л. АеЬеНаи ЮОаш НеЫеИсиз ЫК-1 £. сазеУ рагасазе/ ГКНМ 23л1 сазе!/ рагасазе1 1 ГКНМ 577 I £. ЬеЬеНсш Ш1Е ^ 1 <У <3 Й о -5* 8 5 3 ■о £. гкатпозш 421-2 /егтепшт ГКНМ 526

Пенициллины

1. Бензилпенициллин - + + - - - - - - Но. - - -

2. Ампициллин - - - - - - - - - Но. - - -

Аминогликозиды 1 поколения

3. Стрептомицин + + + + + -/+ - + + Н.о. -/+ + +

4. Неомицин + -/+ + + + -/+ + + + Но. -/+ + -/+

5. Канамицин + + + + + + + + + Н.о. ч+ + +

Аминогликозиды 2 поколения

6. Гентамицин + - + + + - + + + Н.о. + +

Аминогликозиды 3 поколения

7. Амикацин + + + + - + + + + Н.о. + + +

Тетрациклины

8. | Тетрациклин + + + + - - - - + - -

Макролиды

9. Эритромицин -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ - - - - + - - -

10. Азитромицин -/+ - 4+ -/+ - - - -/+ - Н.о. - - -

И. Рокситромицин - - - - - - - - - Н.о. - - -

Линкозамины

12. Линкомицин + -7+ + -1+ - -/+ -!+ -/+ - Н.о. - -/+ -

13. Клиндамицин -/+ + - - - -/+ -!+ - - Н.о. - - -

Хлорамфеникол

14. Хлорамфеникол - - - - - - - - + - - -

Ансамицины

15. Рифампицин - - - - - - - - - Н.о. - - -

Примечание: »Устойчивость определяли по размеру зоны подавления роста клеток вокруг диска с антибиотиком: высокая устойчивость (+), низкая, незначительная устойчивость (—/+) и чувствительность (—), и.о.- не определено.

5.2. ПЦР-генотипирование штаммов молочнокислых лактобацилл на наличие генов устойчивости к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов антибиотикорезистентности. Был проведен молекулярно-генетический анализ штаммов лактобацилл на наличие генов антибиотикорезистентности: tetW/O и tetM, кодирующих устойчивость к тетрациклину; егтТ и ermB, кодирующих устойчивость к эритромицину; и catTC, кодирующего устойчивость к хлорамфениколу. Наличие перечисленных выше генов, отвечающих за признаки устойчивости к антибиотикам, проводили с помощью ПЦР.

ПЦР-тест на детерминанты устойчивости к широко используемым в клинической практике антибиотикам - тетрациклину, хлорамфениколу и эритромицину, показал наличие гена tetM конъюгативного транспозона у одного штамма L. casei/paracasei и у двух штаммов L. helveticus. Результаты исследования представлены на рисунке 14. Определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов генов tetM у штаммов L. casei/paracasei К3Ш24, L. helveticus NNIE и L. helveticus Ег 317/402 и их сравнительный анализ подтвердил идентификацию гена tetM по участку кодирующей последовательности в 400 нуклеотидов (99,8-100% совпадения друг с другом и с аннотированными генами у Enterococcus faecalis и Streptococcus pneumoniae).

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14

—-----!.......................t (ИЦ|

Рисунок 14. Электрофорез с результатами детекции гена Те1М у штаммов лактобацилл.

Примечание: 1 - Ь. 1геЬеИсш Ег 317/402; 2 — Ь. Ъ.е1\еИси5 ЮОаш; 3 - Ь. са5е1/рагасазе1 К3Ш24,' 4 - Ь. НеЬеНсш ЫЫ1Е; 5 - Ь. /егтепШт ГКНМ 526; 6 - Ь. сазеУрагасая^ ГКНМ 577; 7 - Ь. рЬЫагит 8-РА-З; 8 -Ь. рЬМагит 90-ТС-4; 9 - Ь. рЬМагит С3396; 10 - Ь. ЬеЬеНсш ЫК-1; 11 - Ь. рШагит ГКНМ 101; 12 - Г гЬатпояия 421-2; 13 - Ь. са5еИрагаса5е1 ГКНМ 23 л1; 14 - маркер ДНК.

Геномный анализ. Для лактобацилл характерно наличие природной устойчивости к ряду антибактериальных препаратов. В связи с этим был проведен геномный анализ трех штаммов лактобацилл - Ь. ЬеЫейсш ЭРС 4571, Ь. са5е1 АТСС 334, Ь. сазе1 ВЬ23 - для выявления генов (Ш1У/0/М, егтТ/В,

catT/C), определяющих резистентность к тетрациклину, эритромицину и хлорамфениколу. Для геномов этих штаммов полная нуклеотидная последовательность доступна в базе данных NCBI, а их видовое положение идентично таксономическому положению изучаемых штаммов, у которых обнаружены вышеупомянутые гены. Геном L. helveticus DPC 4571 и L. casei BL2 представлен только хромосомными генами, у L. casei АТСС 334 помимо хромосомы присутствует также одна плазмида (plasmid 1). Как показал проведенный нами биоинформатический анализ генов tetW/0/М, егтТ/В, catT/C, в геномах перечисленных штаммов лактобацилл они не обнаруживались ни в хромосомах, ни в плазмиде.

ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов репликации и коныогативного переноса. Плазмиды являются генетическими структурами, способными достаточно легко передаваться между клетками микроорганизмов как одного вида, так и других видов и даже родов бактерий. Плазмиды несут различные гены, в том числе гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому желательно чтобы штаммы, используемые в качестве пробиотических, не содержали плазмид.

С использованием сконструированных праймеров были проведены исследования по обнаружению у трех штаммов лактобацилл генов, гомологичных генам репликации плазмид L. helveticus pLHl и pLJl и L. casei plca36, а также гена trsK соединительного белка конъюгации плазмиды L. casei plca36. Результаты этих исследований представлены на рисунке 15. Из представленных данных видно, что ген rep, гомологичный гену rep плазмид L. helveticus pLHl и pLJl, присутствует у всех 3-х исследованных культур микроорганизмов. Ген rep, гомологичный гену rep плазмиды L. casei р!саЗб, обнаружен у штамма L. casei/paracasei К3Ш24; ген trsK, гомологичный гену trsK плазмиды L. casei plca36, обнаружен у всех исследованных штаммов. Таким образом, вероятность того, что исследуемые штаммы содержат плазмиды, (причем конъюгативные), является достаточно высокой. Поскольку исследуемые штаммы содержали ген, кодирующий резистентность к тетрациклину (tetM), исключить плазмидную его локализацию не представляется возможным. На основании полученных результатов, мы полагаем, что штаммы L. casei/paracasei К3Ш24, L. helveticus NNIE, L. helveticus Er 317/402 не пригодны для прямого использования в качестве пробиотиков, поскольку могут служить источником трансмиссивных генов устойчивости к антибиотикам в микробиоте человека.

Исследования штаммов L. casei/paracasei К3Ш24. L. helveticus Er 317/402 и L. helveticus NNIE показали, что они содержат ген резистентности к тетрациклину (tetM) (рис.14). При этом уровень устойчивости к тетрациклину у штаммов L. casei/paracasei К3Ш24 и L. helveticus Er 317/402 был крайне низок, в то время как штамм L. helveticus NNIE проявил высокую устойчивость к этому антибиотику (табл. 2). Проведенные нами исследования демонстрируют определенные трудности, возникающие при тестировании признака антибиотикорезистентности, поскольку штаммы могут содержать молчащие гены, либо обладать генами, определяющими другие механизмы устойчивости.

1 2 3 4 5 8

7 8 9 10 11

Рисунок 15. Электрофорез с результатами детекции генов репликации и конъюгативного переноса у штаммов лактобацилл.

Примечание: а - ген rep Lactobacillus casei plca36, б - ген rep L. helveticus pLHl, в - ген trsK L. casei plca36,

I, 11 - маркер ДНК; 2, 5, 8 - L. helveticus NNIE; 3, б, 9 - L. casei/paracasei КзШ^; 4, 7, 10 -L. helveticus Er 317/402.

6. Технологические и пробиотические свойства штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов домашнего

изготовления

Способность штаммов Streptococcus thermophilus ферментировать

галактозу. Особенностью термофильного стрептококка является слабовыраженная сахаролитическая активность. Бактерии вида S. thermophilus обычно ферментируют только лактозу, глюкозу и сахарозу, реже сбраживают раффинозу и, как правило, не ферментируют манит, инулин, глицерин, сорбит, салицин, рамнозу, трегалозу и декстрин. Способность S. thermophilus быстро поглощать и перерабатывать лактозу является определяющим фактором в некоторых биотехнологических процессах. Лактоза - дисахарид, состоящий их двух частей - глюкозной и галактозной. S. thermophilus утилизирует глюкозный, но, как правило, не использует галактозный остаток. Накопление галактозы в продуктах питания нежелательно по разным причинам - галактоза плохо усваивается человеком, избыток галактозы в молочных продуктах может неблагоприятно сказаться на самочувствии людей, особенно страдающих лактазной недостаточностью. Галактоза в молочнокислых продуктах может приводить к потемнению сыров типа «моццарелла», развитию гнилостной и/или патогенной микрофлоры, образованию СОг бактериями, не входящими в состав закваски. Среди изученных нами культур лишь 5 штаммов (ВС216, ВС227, ВСЗ15, ВС324, ВС337) были способны утилизировать галактозу.

Качественное определение продукции экзополнсахаридов

осуществлялось микробиологическим методом с использованием селективной среды с красителем. Нами было установлено, что примерно четвертая часть изученных коллекционных штаммов термофильных стрептококков были способны в процессе культивирования продуцировать ЭПС.

Количественное определение ЭПС. При изучении культуральной жидкости, полученной при выращивании штаммов термофильных стрептококков в питательной среде М21 при температурах 37°С, 42°С и 50°С в течение 1, 2 и 3 суток инкубации, нами было обнаружено, что максимальная продукция ЭПС у исследуемых штаммов термофильных стрептококков наблюдалась при температуре 42°С. Исключение составляет штамм ВС227, для которого этот параметр составляет 50°С. Максимальное количество ЭПС синтезируется к концу 3 суток инкубирования. Исключением является штамм ВС320, продукция ЭПС которого на вторые и третьи сутки не различалась. Наибольшие показатели продукции ЭПС выявлены у штаммов ВС320 и ВС321; количество продуцируемых ими ЭПС составляет 5,864 и 6,127 г/л, соответственно.

Синтез витаминов стартовыми культурами молочнокислых бактерий. Тенденцией сегодняшнего дня является создание функциональных продуктов питания с целью профилактики заболеваний потребителей. В настоящее время чаще всего в этой роли выступают кисломолочные продукты. Нами с использованием метода ВЭЖХ была изучена способность штаммов Streptococcus thermophilus к продукции фолиевой кислоты (витамина группы В). По результатам проведенных экспериментов нами были отобраны штаммы, способные к синтезу этого витамина. На рисунке 16 приведены данные для штамма ВС323, способного при культивировании в течение суток при температуре 37°С синтезировать фолат в концентрации 4,5810 мкг/л.

Рисунок 16. Хроматограмма культуральной жидкости штамма Б. ¡ЬегторкНиз 323, продуцирующего фолат при выращивании в жидкой питательной среде.

Способность молочнокислых бактерий синтезировать витамины группы В показана для многих штаммов стрептококков, лактобацил, лактококков и бифидобактерий и является пробиотической характеристикой этих микроорганизмов, обосновывающая их использование в качестве стартовых

культур при производстве пробиотических и функциональных продуктов питания. Применение современных подходов для обнаружения наличия у промышленно значимых видов бактерий технологических и пробиотических свойств позволяет более грамотно использовать культуры бактерий в различных биотехнологических процессах и проводить выбор стартовых культур молочнокислых бактерий для разных кисломолочных продуктов, что является основой для гарантии качества готового продукта.

выводы

1. Установлена вариабельность изученных штаммов Streptococcus thermophilus по величине их геномов. Показано, что размер геномов у исследованных штаммов (определенный на основании данных геномной рестрикции и PFGE) сильно варьирует - от 1417 до 2075 т.п.н., что свидетельствует о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.

2. Выявлено генетическое разнообразие изученных в работе штаммов рода Enterococcus, выражающееся в особом строении гена 16S рРНК. Предложено отнести организмы имеющие существенное отличие в последовательностях генов 16S рРНК к новому виду - Enterococcus lactis sp. nov.

3. Продемонстрировано существование уникальных замен в проксимальных областях генов 16S рРНК подвидов Lactococcus lactis subsp. lactis и L. lactis subsp. cremoris, позволяющее проводить точную молекулярную идентификацию культур внутри вида L. lactis.

4. Установлено, что метод RAPD-PCR обладает хорошей разрешающей способностью при видовой и штаммовой дифференциации бактерий Streptococcus thermophilus, Lactobacillus plantarum, L. helveticus, L. casei, L. rhamnosus, L. fermentum. Продемонстрированы преимущества метода RAPD-PCR с применением праймера М13 для штаммовой паспортизации S. thermophilus и с применением праймера ERIC-1 - для паспортизации перечисленных видов лактобацилл.

5. Проведена реклассификация систематического положения (на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК) и генетическая паспортизация методом RAPD-PCR некоторых производственных культур рода Lactobacillus, использующихся в промышленности РФ в качестве заквасок при изготовлении кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов, что позволяет производителям использовать современные данные об истинном таксономическом положении культур и их генетических характеристиках.

6. Показана необходимость проведения исследований с применением молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Применено ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса, что дает возможность исключения из состава заквасок культур, которые могут служить источником трансмиссивных генов антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

7. Определено наличие технологических и пробиотических свойств (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу) у штаммов Streptococcus thermophilus, что позволило отобрать наиболее перспективные культуры для использования в качестве заквасок и бактериальных концентратов в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При таксономической идентификации штаммов молочнокислых бактерий, принадлежащих родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus следует опираться на результаты исследований, полученных с применением молекулярно-биологических методов, основанных на анализе последовательности рибосомальных генов.

2. При генетической паспортизации промышленных штаммов молочнокислых бактерий следует использовать метод RAPD-PCR, позволяющий получать индивидуальные геномные паттерны, что служит дактилоскопическими характеристиками штамма и защищает авторов культуры от несанкционированного использования их в аналогичных биотехнологических процессах.

3. При изучении антибиотикорезистентности штаммов молочнокислых бактерий необходимо использовать молекулярно-биологические подходы, основанные на генотипированиии наличия генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса с целью исключения из состава заквасок культур, которые могут служить источником генов трансмиссивной антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

4. Применение в лабораторной практике комплексного подхода, реализуемого с помощью молекулярно-биологических методов при видовой идентификации, молекулярно-генетической паспортизации и определения в составе геномов генов, отвечающих за антибиотикорезистентность позволяет проводить отбор безопасных производственных культур с целью их использования в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотических препаратов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1. Лысенко A.M. Подтверяедение систематического положения Streptococcus salivarius / Лысенко A.M., Ботнна С.Г., Суходолен В.В. // Микробиология. - 2002. - Т.71. - № 5. - С.713-716.

2. Ботина С.Г, Генетическое многообразие штаммов молочнокислых термофильных бактерий на территории стран СНГ / Ботина С. Г., Лобанов

A.О., Лысенко А. М., Суходолен В.В. // Биотехнология. - 2004. - Т.2. - С.3-12.

3. Ботнна С.Г. Выяснение таксономического положения отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий по данным секвенирования генов 16S рРИК / Ботина С.Г., Лысенко А. М., Суходолец

B.В. // Микробиология. - 2005. - Т.74. - №4. - C.520-S25.

4. Ботина С.Г. Отечественные штаммы энтерококков, используемые в качестве заквасок, не содержат генов вирулентности, обычно присутствующих в патогенных штаммах Е. faecalis I Ботина С.Г., Суходолец В.В. // Биотехнология. - 2005. - №2. - С.33-37.

5. Суходолец В.В, Молочнокислые энтерококки Ettterococcus faecium и Enterococcus durons: разнообразие в последовательностях нуклеотидов в генах 16S рРНК / Суходолец В.В., Ботина С.Г., Лысенко A.M., Тренина М.А. //Микробиология. - 2005.- Т.74. - №6.- С.810-815.

6. Сультимова Т.Д. Скрининг бактериоцин-продуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. ¡actis / Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г., Ботина С.Г. // Материалы Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии». - 1-3 ноября 2005, г. Москва. - С. 107.

7. Ботина С.Г. Изучение видового и генетического разнообразия термофильных молочнокислых бактерий с применением комплексного подхода к идентификации и оценке свойств штаммов / Ботнна С.Г., Корниенко М.А., Пиксасова О.В., Нетрусов А.И., Суходолец В.В. // Материалы Второй Международной Научно-Практической конференции «Перспективы развития биотехнологий в России». - 1-2 декабря 2005. - Пущино. - С.49-51.

8. Ботина С.Г. Изучение видообразования у бактерий при сравнительном анализе генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков / Ботина

C.Г., Суходолец B.B. II Материалы научного симпозиума, посвященного памяти Е. Н. Кондратьевой 21-24 декабря 2005 года, биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва. - С.84.

9. Ботина С.Г. Видовое и генетическое разнообразие природных штаммов молочнокислых бактерий / Ботина С.Г., Корниенко М.А., Пиксасова О.В., Нетрусов А.И., Суходолец В.В. // Материалы научного симпозиума, посвященного памяти E.H. Кондратьевой. - 21-24 декабря 2005 года, биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва. - С.85.

10. Ботина С.Г. Видообразование у бактерий: сравнение генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков / Ботина С.Г., Суходолец В.В. // Генетика. - 2006. - Т.42. - №3. - С.325-332.

11. Стоянова Л.Г. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из

свежего молока / Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т.42. - №5. -С.560-568.

12. Ботина С.Г. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования / Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В.// Генетика. - 2006.- Т.42. - №12.-С.1621-1635.

13. Ботина С.Г.. Изучение возможности использования бактерий рода Enterococcus в качестве стартовых культур / Ботина С.Г., Машенцева Н.Г., Баранова Е.А., Осанова A.A., Корниенко М.А., Пиксасова О.В. // Материалы 10-ой школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века». Пущино, 17-21 апрель, 2006. - С.359.

14. Ботина С.Г. Изучение генетического разнообразия молочнокислых бактерий, выделенных из различных регионов России и Белоруссии / Ботина С.Г., Корниенко М.А., Пиксасова О.В., H.A. Белясова II Материалы Международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск, 1-2 июня 2006 г. - С.92-93.

15. Ботина С.Г. Генотипический анализ молочнокислых бактерий, выделенных из национальных кисломолочных продуктов различных регионов мира / Ботина С.Г., Пиксасова О.В., Корниенко М.А., Нетрусов А.И. // Материалы Международной научной конференции «Успехи биотехнологии» - г. Цахкадзор, Республика Армения, 11-14 июля 2006 года. - С. 120.

16. Пиксасова О.В. Изучение внутривидового разнообразия бактерий Streptococcus thermophilus методами PFGE и RAPD-PCR / Пиксасова О.В., Корниенко М.А., Ботина С.Г. // Международная конференция «Микробные биотехнологии». - Одесса, 11-15 сентября 2006 года. - С.90.

17. Ботина С.Г., Суходолец В.В. Изучение генетического разнообразия бактерий вида Streptococcus thermophilus методами молекулярного типирования / Ботина С.Г., Суходолец В.В. // Материалы Российской школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. - 26 ноября - 2 декабря 2006 г. Москва-Пущино. -С.35.

18. Ботина С.Г. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы salivarius рода Streptococcus на основании данных о строении генов 16S рРНК / Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Микробиология.

- 2007. - Т.76. - №3 - С.429-432.

19. Ботина С.Г. Технологические свойства штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов / Ботина С.Г., Корниенко М.А., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Биотехнология. - 2007.

- №3. - С.21-27.

20. Ботина С.Г. Генетическое разнообразие природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus I Ботина С.Г., Пиксасова О.В., Цыганков Ю.Д., Суходолец B.B. II Генетика. - 2007. - Т. 43. - № 5. - С.601-608.

21. Ботина С.Г. Сравнительный анализ размеров геномов штаммов Streptococcus thermophilus / Ботина С.Г., Пиксасова О.В., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Генетика. - 2007 - Т.43. - №7. - С.891-897.

22. Ботина С.Г. Сравнение данных генотипических и биохимических характеристик штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов / Ботина С.Г., Тренина М.А., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2007. - №6. -С.670-676.

23. Ботина С.Г. Идентификация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования / Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Нетрусов А.И., Хлебников B.C., Харитонов В.Д. II Материалы Международного конгресса по пробиотикам. - Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г. - С.94.

24. Ботина С.Г. Видовая идентификация и генетическая паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетнческого типирования / Ботина С.Г. // Молочная промышленность. - 2008. - №3. -С.50-52.

25. Ботина С.Г. Штаммы Streptococcus thermophilus, ферментрующие галактозу/Ботина С.Г.//Молочная промышленность. - 2008.- №4.-С.54-56.

26. Семенихина В.Ф. Закваски с низкой постокислителыюй активностью / Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Ботина С.Г., Абрамова A.A. II Молочная промышленность. - 2009. - № 5. - С.61-62.

27. Ивашкина Н.Ю. Оригинальный отечественный пробиотик аципол: молекулярно-биологические и метаболические характеристики / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастероэнтерологии, гепатологии и колипроктологии. - 2009. - №2. - С.72-78.

28. Ботина С.Г. Идентификация подвидов Lactococcus Iactis / Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. II Молочная промышленность. - 2009. -№6. - С.68-69.

29. Ботина С.Г. Генотипические и метаболические характеристики бактерий рода Enterococcus, выделенных из молочных продуктов / Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. II Молочная промышленность. - 2009. - №8. - С.47-49.

30. Ботина С.Г. Молекулярно-генетическая идентификация, ДНК-генотипирование и паспортизация пробиотических культур микроорганизмов с целью разработки технологий производства бактериальных заквасок для биотехнологической промышленности 1 Ботина С.Г., Даниленко В.Н. // Материалы Пятого съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. -Москва, 21-27 июня 2009 г. - С.56.

31. Ботина С.Г. ДНК-генотипирование, молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация стартовых культур молочнокислых бактерий, используемых в производстве заквасок для молочной промышленности / Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Харитонов В.Д. // Материалы Юбилейного Пятого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - 16-20 марта 2009 г. - С.24.

32. Ботина С.Г. ДНК-генотипирование и молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация пробиотических культур микроорганизмов, используемых в производстве заквасок прямого внесения для

биотехнологической промышленности / Ботина С.Г., Даниленко В.Н. // Материалы 11-ого международного славяно-балтийского научного форума "Санкт-Петербург - Гастро-2009". - 20-22 мая 2009 г. - С.44.

33. Ивашкина Н.Ю. Генетические характеристики пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2009.

- №1.- С.93.

34. Ивашкина Н.Ю. Устойчивость пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus к воздействию среды верхних отделов желудочно-кишечного тракта / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2009. - №1. - С.93.

35. Ивашкина Н.Ю. Определение способности штаммов лактобактерий продуцировать биогенные амины / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2009.

- №5. - С.55.

36. Ивашкина Н.Ю. Определение способности штаммов лактобактерий продуцировать витамины / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2009.

- №5. - С.56.

37. Ивашкина Н.Ю. Продуцирование полисахаридов штаммами лактобактерий // Ивашкина НЛО., Ботина С.Г., Маев И.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2009. - №5. - С.56.

38. Ботина С.Г. Генотипическая характеристика и изучение пробиотических свойств культур бактерий рода Lactobacillus / Ботина С.Г., Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. // Материалы XXXII International Congress of the Society for Microbial Ecology and Disease. - Октябрь, 29-30, 2009. - Санкт Петербург. -C.38.

39. Глазова А.А. Изучение технологических характеристик и пробиотических свойств молочнокислых бактерий рода Lactobacillus / Глазова А.А., Климина К.М., Ботина С.Г. // Материалы 13-ой международной Путинской школы конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века». - сентябрь-октябрь, 2009. -С. 160.

40. Климина К.М. Генотипическая характеристика молочнокислых бактерий рода Lactobacillus / Климина К.М., Глазова А.А., Ботина С.Г. //Материалы 13-ой международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века», - сентябрь-октябрь, 2009. - С. 166.

41. Ботина С.Г. Реклассификация отечественных производственных культур бактерий рода Lactobacillus и сравнительная характеристика их технологических свойств / Ботина С.Г., Климина К.М., Глазова А.А., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. // Материалы II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». -Ростов-на-Дону, сентябрь, 2009. - С.10.

42. Ботина С.Г. Изучение физиолого-биохимических, фенотипических, генотипических, технологических характеристик и производственно-ценных свойств штаммов из коллекции ВНИМИ видов: Str. thermophilus, L. bulgaricus и создание высокотехнологичных заквасок для производства кисломолочных

продуктов: йогурта, ряженки, простокваши / Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. // Материалы Конференции РАСХН-РФФИ. Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России. - Сергиев Посад, октябрь, 2009. - С. 168-171.

43. Ботина С.Г. Экзополисахариды молочнокислых бактерии. Использование штаммов, синтезирующих ЭПС в производстве кисломолочных продуктов питания / Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семеннхнна В.Ф. // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - №1. -С.42-45.

44. Ботина С.Г. Штаммы Streptococcus thermophilus, продуцирующие экзополисахариды / Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. // Хранение н переработка сельхозсырья. - 2010. - №2. - С.33-35.

45. Ботина С.Г. Синтез витаминов стартовыми культурами молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus / Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - №3. -С.54-56.

46. Ботина С.Г. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей / Ботина С.Г., Червинец Ю.В., Климина К.М., Коробан Н.В., Червинец В.М., Гаврилова О.А., Лебедев Д.В., Миронов А.Ю. // Клиническая лабораторная диагностика. -2010. - №11. - С.43-46.

47. Ботина С.Г. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus / Ботина С.Г., Климина К.М., Коробан Н.В., Амерханова A.M., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. // Генетика. - 2010. -Т.46. - № 11.- С.1306-1313.

48. Ботина С.Г. Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus нз гастроинтестинальной микробиомы людей / Ботина С.Г., Коробан Н.В., Климина К.М., Глазова А.А., Захаревич Н.В., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. // Генетика. - 2010. - Т.46. - №12. - С.1589-1597.

49. Климина К.М. Выделение и молекулярно-генетическая идентификация аэротолерантной бактериальной микрофлоры из грудного молока / Климина К.М., Глазова А.А., Ботина С.Г. // Материалы 14-ой Международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века». - 19 -23 апреля 2010 г.-С.232.

50. Ботина С.Г. Тестирование резистентности потенциальных пробиотических бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей к антибактериальным препаратам: определение и способность к переносу генов устойчивости / С.Г. Ботина, А.А. Глазова, К.М. Климина, Н.В. Коробан, О.Г. Жиленкова, Е.У. Полуэктова, В.В. Зинченко, В.Н. Даниленко И Материалы второго международного конгресса-партнеринга и выставки по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике. - 12-15 апреля 2010 года в Центре Международной Торговли. - Москва. - С.28.

51. Ботина С.Г. Разработка технологий универсального быстропереориентируемого производства заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности / Ботина С.Г., Даниленко В.Н., Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Будрик В.Г., Харитонов В.Д. // Материалы

Международной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия». -Саранск. - май, 2010. - С.70.

52. Ботина С.Г. Определение генетических детерминантов, ответственных за проявление технологических свойств у стартовых культур молочнокислых бактерий: тестирование наличия генов синтеза экзополисахаридов у производственных штаммов Lactobacillus helveticus. Научно-инновационный подход при моделировании технологического процесса производства заквасок прямого внесения / Ботина С.Г., Абрамова А.А., Раскошная Т.А., Зинченко В.В. Коробан Н.В., Бабыкин М.М. // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Принципы пищевой комбинаторики - основа моделирования поликомпонентных пищевых продуктов». - Углич, сентябрь, 2010. -С.33-34.

53. МУ 2.3.2.2789-10 «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Методические указания. - М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. - 2010. - 93 с. Авторский коллектив: В.А.Тутельян, С.А. Шевелёва, С.А. Хотимченко, В.А. Исаков, И.Я. Конь, В.К. Мазо, Н.Р. Ефимочкина, Э.Н. Трушина, С.Ю.Батищева, А.В.Черкашин, А.В. Булахов, Н.К. Янковский, В.Н. Даниленко, С.Г. Ботина, О.В. Аверина, В.А. Алешкин, A.M. Амерханова, О.Г. Жиленкова, М.С. Бляхер, И.М. Федорова, Е.А. Воропаева, Ю.В. Черепанова, A.JI. Гинцбург, Ю.В. Ананьина, Б.С. Народицкий, Н.А. Зигангирова, JT.H. Нестеренко, И.А. Шагинян, М.Ю. Чернуха, А.А. Ховаев,

B.М. Червинец, Ю.В. Червинец, В.В. Зинченко, Е.А. Карбышева, В.Д. Харитонов, В.Ф. Семенихина, И.В. Рожкова, В.Г. Будрик, А.И. Туркин. Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, протокол № 2 от 14.10.2010. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010.

54. Ботина С.Г. Молекулярно-генетическая характеристика и пробиотический потенциал бактерий рода Lactobacillus / Ботина С.Г., Ивашкина Н.Ю., Маев И.В. // Молекулярная медицина. - 2011. - №1. -

C.53-57.

55. Ивашкина Н.Ю. Экспериментальные доказательства пробиотических свойств бактерий рода Lactobacillus / Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г. II Российские медицинские вести. - 2011.- №1.- С.63-70.

56. Червинец Ю.В. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию биопленок лактобациллами, выделенными из полости рта здоровых людей / Червинец Ю.В., Ботина С.Г., Глазова А.А., Коробан Н.В., Червинец В.М., Самоукина A.M., Гаврилова О.А., Лебедев Д.В., Миронов АЛО. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - №2. - С.44-46.

57. Ботина С.Г. Характеристика устойчивости к антибиотикам потенциальных пробиотнческих бактерий рода Lactobacillus из гастроинтсстнналыюн микробиомы человека / Ботина С.Г., Е.У. Полуэктова, А.А. Глазова, Н.В. Захарович, Н.В. Коробам, М.М. Бабыкин, В.В. Зинченко, О.Г. Жиленкова, A.M. Амерханова, В.Н. Даннлснко // Микробиология. - 2011. - Т. 80. - №2. - С.175-183.

58. Botina S.G. Rearrangement of the RNA genes in closely related Enterococcus Species: new species Enterococcus lactis / Botina S.G. and Sukhodolets V.V. // ASM Conference on Streptococcal Genetics. - France. - Sain-Malo 18-21 June, 2006. - P. 117.

59. Bolotin A. Genomic signatures of food-associated Enterococci 1 Bolotin A., Barbe V., Botina S., Quinquis В., Weissenbach J., Ehrlich SD // The 3th European Conference on Prokaryotic Genomics, ProkaGENOMICS. - 2007, Gottingen, October 7-10.-P.27.

60. Bolotin A. Genomic signatures of food-associated Enterococci / Bolotin A., Barbe V., Botina S., Quinquis В., Tanganurat W., Couloux A., Weissenbach J., Ehrlich S.D. // Second International Congress of Central Asia Infectious Diseases. - March 27-30, 2008. - P.32.

Изобретения

61. Патент на изобретение №2337953 Российская Федерация, МПК C12N1/20, А23С9/12, заявка 2007117139/13 от 08.05.2007, публикация патента 11.10.2008 г., бюллетень № 31. Штамм бактерий Streptococcus thermophilus для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты / Тренина М.А., Ботина С.Г., Стоянова Л.Г., Цыганков Ю.Д. Заявитель и патентообладатель ФГУП ГосНИИгенетика.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Б АД - биологически активная добавка

ГКНМ - Государственная коллекция нормальной микрофлоры человека ФГУ

МНИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КЖ- культуральная жидкость

МГУ - Московский государственный университет

РФ - Российская Федерация

РАН - Российская академия наук

п.н.- пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ЭПС - экзополисахариды

NCBI - National Center for Biotechnology Information pH - водородный показатель PFGE - пульс-гель электрофорез

RAPD-PCR (РАПД-ПЦР) - анализ полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК

Подписано в печать:

30.03.2011

Заказ № 972 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Объем: 2,5 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ботина, Светлана Геннадиевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ, ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ И ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРИРОДНЫХ И ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

1.1. Проблемы, возникающие при фенотипической идентификации молочнокислых бактерий

1.2. Особенности Г+Ц состава ДНК молочнокислых бактерий. Применение метода ДНК-ДНК-гибридизации для идентификации молочнокислых бактерий

1.3. Методы типирования ДНК

1.3.1. Методы, основанные на рестрикции ДНК

1.3.2. Применение метода геномной рестрикции для идентификации и паспортизации культур молочнокислых бактерий

1.3.3. Использование метода ДНК-типирования с помощью ПЦР для идентификации молочнокислых бактерий

1.4. Использование данных анализа последовательностей генов 16S рРНК для идентификации молочнокислых бактерий и установления их филогенетического родства

1.5. Сравнительная характеристика некоторых молекулярно-генетических методов типирования бактерий

Глава II. ЧАСТНАЯ БИОЛОГИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, ИССЛЕДУЕМЫХ В РАБОТЕ

2.1. Частная биология бактерий вида Streptococcus thermophilus

2.1.1. История становления современной классификации грамположительных каталазоотрицательных кокков

2.1.2. Фенотипическая характеристика

2.1.3. Генотипические особенности

2.2. Частная биология молочнокислых лактобацилл

2.2.1. Морфологические свойства

2.2.2. Культуральные свойства

2.2.3. Биохимические свойства

2.2.4. Систематика

Глава III. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ПРОИЗВОДСТВЕННО-ЦЕННЫЕ СВОЙСТВА МОЛОЧНОКИСЛЫХ СТРЕПТОКОККОВ И МОЛОЧНОКИСЛЫХ ЛАКТОБАЦИЛЛ

3.1. Использование молочнокислых бактерий в пищевой промышленности в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Основные производственно-ценные свойства.

3.1.1. Кислотообразование МегторкИш

3.1.2. Активность 5. МегторкИш по отношению к галактозе

3.2. Синтез экзополисахаридов штаммами молочнокислых бактерий

3.2.1. Структурно - функциональная характеристика экзополисахаридов молочнокислых бактерий

3.2.2. Биосинтез ЭПС

3.2.3. Использование ЭПС+ штаммов молочнокислых бактерий в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Штаммы микроорганизмов

4.2. Питательные среды и условия культивирования бактерий

4.3. Микробиологические методы исследования

4.3.1. Микроскопирование

4.3.2. Определение ферментационной активности штаммов

4.3.3. Способность бактерий утилизировать сахара

4.3.4. Способность бактерий расщеплять эскулин

4.3.5. Определение спектра чувствительности к антибактериальным препаратам

4.3.6. Кислотообразующая активность штаммов 90 "

4.3.7. Способность штаммов синтезировать экзополисахариды

4.3.8. Способность бактерий ферментировать галактозу

4.4. Аналитические методы исследования

4.4.1. Количественное определение ЭПС

4.4.2. Определение содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ

4.5. Генетические и молекулярно-биологические методы исследования

4.5.1. Выделение тотальной ДНК

4.5.2. Получение препаратов плазмидной ДНК

4.5.3. Рестрикция плазмидной и геномной ДНК

4.5.4. Электрофорез нативной и рестрицированной ДНК

4.5.5. Приготовление препаратов для проведения пульс-гель электрофореза геномной ДНК

4.5.6. Пульс-гель электрофорез геномной ДНК

4.5.7. Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом геномной рестрикции и пульс гель электрофореза (РЕОЕ)

4.5.8. Компьютерный анализ подбора праймеров

4.5.9. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

4.5.10. Выделение и очистка ДНК

4.5.11. Секвенирование фрагментов генов

4.5.12. Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК

4.5.13. Проведение RAPD-PCR

4.5.14. Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом RAPD-PCR, построение филогенетических деревьев и определение генетических дистанций

4.5.15. Генотипирование генов вирулентности

4.5.16. Генотипирование генов устойчивости к антибиотикам

4.5.17. Генотипирование генов репликации и конъюгативного переноса

4.5.18. Геномный анализ

4.6. Статистическая обработка полученных данных

4.7. Программное обеспечение

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава V. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

5.1. Сравнение данных генотипических и биохимических характеристик штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов

5.2. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы salivarius рода Streptococcus на основании данных о строении генов 16SpPHK

5.3. Идентификация подвидов Lactococcus lactis на основании данных о строении генов 16S рРНК

5.4. Реклассификация таксономической принадлежности отечественных пробиотических штаммов лактобацилл

Глава VI. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ БАКТЕРИЙ РОДА ENTEROCOCCUS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Видообразование у бактерий: сравнение генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков

6.2. Генотипирование молочнокислых энтерококков на возможное присутствие генов вирулентности, свойственных патогенным энтерококкам

Глава VII. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНАОБРАЗИЯ И АНАЛИЗ РАЗМЕРОВ ГЕНОМОВ ШТАММОВ STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS

Глава VIII. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРИРОДНЫХ И ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

8.1. Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus

8.2. Генетическая паспортизация производственных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus

Глава IX. ХАРАКТЕРИСТИКА УСТОЙЧИВОСТИ К АНТИБИОТИКАМ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ РОДА LACTOBACILLUS

Глава X. ИЗУЧЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

10.1. Технологические свойства штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов

10.2. Изучение технологических характеристик бактерий рода Enterococcus, выделенных из кисломолочных продуктов

10.3. Идентификация и отбор антагонистически активных культур Lactococcus lactis subsp. lactis

10.4. Разработка заквасок с низкой постокислительной активностью

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии"

Актуальность проблемы

Исследования и фундаментальные достижения последних десятилетий в микробиологии, генетике и молекулярной биологии дали возможность изучения генетического разнообразия бактериальных штаммов. С развитием генетической систематики, с расширением круга используемых методов, направленных на изучение бактериального генома и накоплением экспериментальных данных, касающихся генетического разнообразия различных таксономических групп бактерий, современная таксономия бактерий стала быстро развиваться, что позволило решить многие спорные вопросы систематики конкретных групп микроорганизмов [37]. Вместе с тем оставались нерешенными проблемы, связанные с противоречиями между данными молекулярной систематики и традиционными представлениями, основанными на анализе фенотипа в отношении группы молочнокислых бактерий, имеющих практическое применение.

До недавнего времени при отборе штаммов для создания бактериальных заквасок использовались только стандартные микробиологические подходы оценки стартерных культур, такие как выделение, идентификация таксономического положения на основе изучения их морфологических, физиолого-биохимических свойств, определение условий культивирования и их технологических свойств. Однако применение только этих традиционных технологий не всегда позволяет эффективно отбирать безопасные и технологичные штаммы молочнокислых бактерий для использования их в качестве заквасочных культур в производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Многими исследователями отмечалось, что у микробиологов возникают трудности при идентификации на видовом и дифференциации на внутривидовом уровне бактерий различных родов факультативных анаэробов. Особенно трудно идентифицировать виды внутри родов: Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus с помощью классических фенотипических методов [52, 67, 141, 145, 122-126, 141, 145, 304, 325]. В этой связи особую актуальность приобретает использование современных фундаментальных научных достижений изучения бактериального генетического разнообразия в прикладных областях науки. Фенотипическая характеристика штамма, применяемая для идентификации, паспортизации и типирования штаммов бактерий, в настоящее время уже не является достаточной для установления таксономического положения изучаемого организма и целостной характеристики его свойств. Что же касается штаммов молочнокислых бактерий, практически использующихся в пищевой промышленности, применение современных молекулярно-биологических подходов для таксономической идентификации, молекулярно-генетической паспортизации, генотипирования бактерий позволит выбирать лучшие стартовые культуры для промышленного применения и получения качественных и безопасных пищевых продуктов и бактериальных препаратов.

Задачи исследования

4. Продемонстрировать возможность использования метода анализа данных о последовательности гена 16S рРНК для внутривидовой дифференциации подвидов L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. Iactis. Применить этот метод для идентификации бактериоцинпродуцирующих штаммов L. lactis.

5. Изучить разрешающую способность метода RAPD-PCR для штаммовой идентификации молочнокислых бактерий и осуществить генетическую паспортизацию природных и промышленных культур бактерий Streptococcus и Lactobacillus с использованием этого метода.

6. Обосновать необходимость проведения исследований с использованием молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Применить метод ПЦР-генотипирования штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса.

7. Протестировать штаммы Streptococcus thermophilics на наличие технологичных и пробиотических свойств (способность синтезировать экзополисахариды, витамины и утилизировать галактозу) и отобрать среди них наиболее перспективные культуры для использования в качестве заквасок и бактериальных концентратов при производстве кисломолочных продуктов общего и функционального назначения.

Научная новизна работы

Получены новые фундаментальные знания о внутривидовом разнообразии природных изолятов молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus. При использовании методов геномной рестрикции и пульс-гель электрофореза (PFGE) и сравнительного анализа подобия' геномных фингерпринтов приведены доказательства вариабельности изученных штаммов по размерам их геномов. Показано, что размер геномов у исследованных штаммов сильно варьирует — от 1417 до 2075 т.п.н., т.е. различия между минимальным и максимальным значением размера генома составляет около 600 т.п.н., что свидетельствует о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.

Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК типового штамма нового вида Enterococcus lactis СК1114 депонирована в базе данных NCBI (номер депонированной последовательности AY902459. Штамм депонирован в коллекции ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов (номер депонированного штамма В8713).

Теоретическая значимость работы

Практическое значение работы

Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий родов Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus дало возможность целенаправленно проводить отбор штаммов, перспективных для использования в биотехнологии, с • учетом их генетических характеристик.

Проведена реклассификация (с применением методов молекулярно генетической идентификации) некоторых производственных культур рода Lactobacillus, применяемых в промышленности РФ в качестве заквасок при изготовлении кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов, что 1 позволяет производителям использовать современные данные об истинном таксономическом положении культур и их генетических характеристиках.

Показана необходимость проведения исследований с помощью молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Примененное ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса служит основанием исключения из состава заквасок культур, которые могут быть источником трансмиссивных генов антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

Проведенная паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью методики RAPD-PCR и неспецифических праймеров дает возможность защиты правообладателей бактериальных культур от г несанкционированного использования штаммов, авторами которых они. являются, в аналогичных биотехнологических процессах недобросовестными производителями.

Полученные данные о наличии технологических, производственно -ценных и пробиотических свойств у штаммов Streptococcus thermophilic (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу) могут быть критерием отбора наиболее перспективных культур для применения в качестве заквасок и бактериальных концентратов при изготовлении кисломолочных продуктов . общего и функционального назначения в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии. Штаммы термофильного молочнокислого стрептококка, обладающие важными производственноценными свойствами, депонированы в коллекцию молочнокислых культур и бифидобактерий ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Определенные в ходе проведения работы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК некоторых из изучаемых штаммов лактококков, лактобацилл, стрептококков и энтерококков были депонированы в базу данных Nucleotide Sequence Database of National Center for Biotechnology Information (GenBank NCBI) в качестве референтных последовательностей при проведении филогенетических и биоинформатических исследовательских работ www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/?term=Botina). Номера депонированных последовательностей: DQ255948, AY902459, AY683836, AY902456, AY902457, AY902458, AY902459, AY902460, AY902461, AY683829, AY683830, AY683831, AY683832, AY683833, AY683834, AY683835, AY683836, DQ255948, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308, EF114307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308, EF114307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777, GU560031, GU560032, GU560033, GU560034, GU560035, GU560036, GU560037, GU560038, GU560039, GU560040, GU560041, GU560042, GU560043.

Внедрение результатов работы

Полученные данные о технологических и производственно-ценных свойствах культур термофильных молочнокислых стрептококков послужили основой для оформления патента на изобретение №2337953, Российская Федерация, МПК C12N1/20, А23С9/12, заявка 2007117139/13 от 08.05.2007, публикация патента 11.10.2008 г., бюллетень № 31. «Штамм бактерий Streptococcus thermophilics для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты».

На основании теоретических и практических результатов были разработаны «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». (Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, протокол № 2 от 14.10.2010. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010).

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на международных и российских научных конференциях: Вторая Международная Научно-Практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России» (2005, Пущино), 10-ая школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), Международная научная конференция: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2006), ASM Conference on Streptococcal Genetics, (France, Sain-Malo 2006), Международная конференция «Успехи биотехнологии» (г. Цахкадзор, Республика Армения, 2006), Международная конференция «Микробные биотехнологии» (Одесса, 2006), Российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва - Пущино, 2006), Международный конгресс по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2007), The 3-th European Conference on Prokaryotic Genomics, ProkaGENOMICS (2007, Gottingen), Second International Congress of Central Asia Infectious Diseases (Alma Aty, 2008), Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), 13-ая международная Пущинская школа -конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино, 2009), Юбилейный Пятый Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009), 11-й международный славяно-балтийский научный форум "Санкт-Петербург - Гастро-2009" (Санкт Петербург, 2009), XXXII International Congress of the Society for Microbial Ecology and Disease (2009, St. Petersburg, Russia), Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы, биологии, нанотехнологий и медицины», (Ростов-на-Дону, 2009), Конференция РАСХН-РФФИ. Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России. (Сергиев Посад, 2009), Второй Международный Конгресс-партнеринг и выставка по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 61 научная работа, из них 29 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки

РФ, 30 - в материалах научных конференций, 1 патент на изобретение, 1 методические указания.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ботина, Светлана Геннадиевна

выводы

2. Выявлено генетическое разнообразие изученных в работе штаммов рода Enterococcus, выражающееся в особом строении гена 16S рРНК. Предложено отнести организмы, имеющие существенное отличие в последовательностях генов 16S рРНК к новому виду - Enterococcus lactis sp. nov.

4. Установлено, что метод RAPD-PCR обладает хорошей разрешающей способностью при видовой и штаммовой идентификации бактерий Streptococcus thermophilus, Lactobacillus plantarum, L. helveticus, L. casei, L. rhamnosus, L. fermentum. Продемонстрированы преимущества метода RAPD-PCR с применением праймера М13 для штаммовой паспортизации S. thermophilus и с применением праймера ERIC-1 - для паспортизации перечисленных видов лактобацилл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

4. Применение в лабораторной практике комплексного подхода; реализуемого с помощью молекулярно-биологических методов при видовой идентификации, молекулярно-генетической паспортизации и определения в составе геномов генов, отвечающих за антибиотикорезистентность, позволяет проводить отбор безопасных производственных культур с целью их применения в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотических препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ботина, Светлана Геннадиевна, Москва

1. Ботина С.Г., Лобанов А.О., Лысенко A.M., Суходолец В.В. Генетическое многообразие штаммов молочнокислых термофильных бактерий на территории стран СНГ // Биотехнология. 2004. - Т.2. -С.3-12.

2. Ботина С.Г., Суходолец В.В. Отечественные штаммы энтерококков, используемые в качестве заквасок, не содержат генов вирулентности, обычно присутствующих в патогенных штаммах Е. faecalis // Биотехнология. 2005. - №2. - С.33-37.

3. Ботина С.Г. Видовая идентификация и генетическая паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования // Молочная промышленность. 2008. - №3. - С.50-52.

4. Ботина С.Г. Штаммы Streptococcus thermophilus, ферментрующие галактозу // Молочная промышленность. 2008. - №4. - С.54-56.

5. Ботина С.Г., Климина K.M., Коробан Н.В., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus // Генетика. 2010. Т.46. - №11. - С. 13061313.

6. Ботина С.Г., Корниенко М.А., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. Технологические свойства штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов // Биотехнология. 2007.-№3.- С.21-27.

7. Ботина С.Г., Коробан Н.В., Климина K.M., Глазова A.A., Захаревич Н.В., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей //Генетика. -2010. Т.46. №12. - С.1589-1597.

8. Ботина С.Г., Лысенко А.М., Суходолец В.В. Выяснение таксономического положения отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий по данным секвенирования генов 16S рРНК // Микробиология. 2005. - Т.74. - №4. - С.520-525.

9. Ботина С.Г., Пиксасова О.В., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. Генетическое разнообразие природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus // Генетика. 2007. - Т. 43. - №5. - С.601-608.

10. Ботина С.Г., Пиксасова О.В., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. Сравнительный анализ размеров геномов штаммов Streptococcus thermophilus // Генетика. 2007. - Т.43. - №7. - С.891-897.

11. Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. Экзополисахариды молочнокислых бактерий. Использование штаммов, синтезирующих ЭПС в производстве кисломолочных продуктов питания // Хранение и переработка сельхозсырья. 2010. - №1. - С.42-45.

12. Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. Синтез витаминов стартовыми культурами молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus // Хранение и переработка сельхозсырья. 2010. - №3. -С.54-56.

13. Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. Штаммы Streptococcus thermophilus, продуцирующие экзополисахариды // Хранение и переработка сельхозсырья. 2010. - №2. - С.33-35.

14. Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. Генотипические и метаболические характеристики бактерий рода Enterococcus, выделенных из молочных продуктов // Молочная промышленность. -2009. №8. - С.47-49.

15. Ботина С.Г., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В. Идентификация подвидов Lactococcus lactis // Молочная промышленность. 2009. -№6. - С.68-69.

16. Ботина С.Г., Суходолец В.В. Видообразование у бактерий: сравнение генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков // Генетика. 2006. - Т.42. - №3. - С.325-332.

17. Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования // Генетика. 2006. - Т.42. -№12. - С.1621-1635.

18. Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы salivarius рода Streptococcus на основании данных о строении генов 16S рРНК // Микробиология. -2007. Т.76. - №3. - С.429-432.

19. Гусев М.В., Минеева JI.A. Микробиология. 2003. М.: Академия. 464 с.

20. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание // Грантъ. -2002.- 294 с.

21. Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., Маев И.В. Оригинальный отечественный пробиотик аципол: молекулярно-биологические и метаболические характеристики // Российский журнал гастероэнтерологии, гепатологии и колипроктологии. 2009. - №2. -С.72-78.

22. Ленгелер И., Древе Г., Шлегель Г. Современная микробиология: прокариоты: в 2-х томах. Т. 2. - 2005. - М.: Мир. - 496 с.

23. Лысенко А.М., Ботина С.Г., Суходолец В.В. Подтверждение систематического положения Streptococcus salivarius // Микробиология. 2002.- Т.71.- № 5. - С.713-716.

24. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. - 1984. - 479 с.

25. Материалы круглого стола «Рациональный выбор пробиотика в практике гастроэнтеролога» // Рос. мед. вести. 2007. Т. 12. - №4. - С. 46—48.

26. Мецлер Д. Биохимия. М.: Мир. 1980. - 2 т. - 606 с.

27. Нечаева A.A., Суходолец В.В. Генетическое изучение производственных штаммов Lactococcus lactis: выявление трансмиссибельных плазмид по признаку сбраживания лактозы // Генетика. 1996. - Т.32. - №2. - С.218-227.

28. Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. Иммунологические препараты и перспективы их применения в инфектологии // ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ Москва. - 2002. - 608с.

29. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (УК 4.2.1890-04) // Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. 2004. - Т.6. - №4. - С.306-359.

30. Полтев В.И. Болезни пчел. Л.: Колос. 1964. - 4 изд. - 288 с.

31. Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Ботина С.Г., Абрамова A.A. Закваски с низкой постокислительной активностью // Молочная промышленность. 2009. - № 5. - С.61-62.

32. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов / Учебник для ВУЗов. Сергиев Посад: ООО "Все для Вас -Подмосковье". - 1999. - 415 с.

33. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из свежего молока // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т.42. - №5. - С.560-568.

34. Суходолец В.В., Ботина С.Г., Лысенко A.M., Тренина М.А. Молочнокислые энтерококки Enterococcus faecium и Enterococcus durans: разнообразие в последовательностях нуклеотидов в генах 16S рРНК // Микробиология. 2005. - Т.74. - №6. - С.810-815.

35. Турова Т.П. Применение данных ДНК-ДНК-гибридизации и анализа генов 16S рРНК для решения таксономических проблем на примере порядка Haloanaerobiales // Микробиология. 2000. - Т.69. - №6. -С.741 - 752.

36. Хоулт Дж. (ред). Краткий определитель бактерий Берджи / М: Мир. 1997. Т.2. - 780 с.

37. Шендеров Б. А. Современное состояние и перспективы развития концепции. Пробиотики, пребиотики и синбиотики // Пищевые ингридиенты. Сырье и материалы. 2005. - №2. - С.23-26.

38. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.З: Пробиотики и функциональное питание / М.: Грантъ. -2001.-288 с.

39. Шидловская В.П. Органолептические свойства молока и молочных продуктов. Справочник. М.: Колос. 2000. - 200 с.

40. Acedo-Felix Е. and Perez-Martinez G. Significant differences between Lactobacillus casei subsp. casei АТСС 393T and a commonly used plasmid-cured derivative revealed by a polyphasic study // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2003.- V.53.-N.1.- P.67-75.

41. Agerholm-Larsen L., Bell M.L., Grunwald G.K., Astrup A. The effect of a probiotic milk product on plasma cholesterol: a meta-analysis of short-term intervention studies // Eur. J. Clin. Nutr. 2000. - V.54. - N.ll. - P.856 -860.

42. Ajdic D., Sutcliffe I.C., Russel R.R.B., Ferretti J.J. Organization and nucleotide sequence of the Streptococcus mutans galactose operon // Gene. 1996. V. 180.- N.4. - P. 137-144.

43. Amann R., Glocker F-O., Neef A. Modern methods in subsurface microbiology: in situ identification of microorganisms with nucleic acid probes //FEMS Microbiol. Rev. 1997. - V.20. -N.3. - P. 191 -P.200.

44. Amann R., Ludwig W. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V.24. -N.3. - P.555 — 565.

45. Ammor M.S., Florez A.B., Mayo B. Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and bifidobacteria // Food Microbiol. -2007. V.24. - N.6. - P.559-570.

46. Anderson D.G., McKay L.L. Simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci // Appl. Env. Microbiol. 1983. -V.46. - N.3. - P.549-552.

47. Anderson Ph., Roth J. Spontaneous tandem genetic duplications, in Salmonella typhimurium arise by unequal recombination between rRNA (rrn) cistrons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V.78. - N.5. -P.3113-3117.

48. Andrighetto C., De Dea P., Lombardi A., Neviani E., Rossetti L., Giraffa G. Molecular identification and cluster analysis of homofermentative thermophilic lactobacilli isolated from dairy products // Res. Microbiol. 1998. V.149. - N.9. - P.631-643.

49. Andrighetto C., Kniff E., Lombardi A., Torriani S., Vancanneyt M., Kersters K., Swings J., Dellaglio F. Phenotypic and genetic diversity of enterococci isolated from Italian cheeses // J. Dairy Res. 2001. - V.68. -N.2. -P.303 -316.

50. Appuhamy S., Parton R., Coote J.G., Gibb H.A. Genomic fingerprinting of Haemophilus somnus by a combination of PCR methods // J. Clin. Microbiol. 1997. - V.35. - N3. - P.288-291.

51. Aquilanti L., Garofalo C., Osimani A., Silvestri G., Vignaroli C., Clementi F. Isolation and molecular characterization of antibiotic-resistant lactic acid bacteria from poultry and swine meat products // J. Food Prot. 2007. - V.70. - N.3. - P.557-565.

52. Aswathy R.G., Ismail B., John R.P., Nampoothiri K.M. Evaluation of the probiotic characteristics of newly isolated lactic acid bacteria //Appl. Biochem. Biotechnol. 2008. - V.151. - N.2. - P.244-255.

53. Aymerich T., Martin B., Garriga M., Hugas M. Microbial quality and direct PCR identification of lactic acid bacteria and nonpathogenic Staphylococci from artisanal low-acid sausages // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V.69. - N.8. - P.4583 - 4594.

54. Basaran P., Basaran N., Cakir I. Molecular differentiation of Lactococcus lactis subspecies lactis and cremoris strains by ribotyping and site specific-PCR // Curr. Microbiol. -2001.- V.42. N. 1. - P.45-48.

55. Begley M., Gahan C.G.M., Hill C. The interaction between bacteria and bile // FEMS Microbiol. Rev. 2005. - V.45 -N.29. -P.625-651.

56. Belicov A., Krzkov L., Krajcovic J., Jurkovic D., Sojka M., Ebringer L., Duinsk R. Antimicrobial susceptibility of Enterococcus species isolated from Slovak Bryndza cheese // Folia Microbiol (Praha). 2007. — V.52. — N.2. - P. 115-119.

57. Bellomo G., Mangiagle A., Nicastro L., Frigerio L. A controlled doubleblind study of SF68 strain as a new biological preparation for the treatment of diarrhea in paediatrics // Curr. Ther. Res. 1980. - V.28. - N.l. -P.927934.

58. Benateya A., Bracquart P., Linden G. Galactose-fermenting mutants of Streptococcus thermophilus // Can. J. Microbiol. 1991. V.37. N.2. -P. 136-140.

59. Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. Krieg N.R., Holt J.G. -Baltimore: Williams and Wilkins. 1984. - P.8-11.

60. Bernardeau M., Vernoux J.P., Henri-Dubernet S., Guguen M. Safety assessment of dairy microorganisms: the Lactobacillus genus // Int. J. Food Microbiol. 2008. - V.126. -N.3. - P.278-285.

61. Betran E., Rozas J., Navarro A., Barbadilla A. The estimation of the number and length distribution of gene conversion tracts from population DNA sequence data // Genetics. 1997. - V.146. - N.4. - P.89-99.

62. Bezkorovainy A. Probiotics: determinants of survival and growth in the gut //Am. J. Clin. Nutr. 2001. - V.73. -N.5. - P.399-405.

63. Biasucci G., Rubini M., Riboni S., Retetangos C., et al. Mode of delivery affects the bacterial community in the newborn gut. // Early Hum. Dev. 2010. V.98. -N.l. - P. 13-15.

64. Bizzarro R., Torri Tarelli G., Giraffa G., Neviani E. Phenotypic and genotypic characterisation of lactic acid bacteria isolated from Pecorino Toscano cheese // Ital. J. Food Sci. 2000. V.12. -N.3. - P.303-316.

65. Boutrou R., Thuault D., Bourgeois C.M. Identification and characterization of Streptococcus thermophilus strains by pulsed-field gel electrophoresis // J. Appl. Bacteriol. 1995. - V.79. -N.4. - P.454-458.

66. Bridge P.D., Sheath P.H.A. Numerical taxonomy of Streptococcus // J. Gen. Microbiol. 1983. - V.129. - N.3. - P.565 - 579.

67. Cai Y., Matsumoto M., Benno Y. Bifidobacterium lactis Meile et al. 1997 is a subjective synonym of Bifidobacterium animalis (Mitsuoka, 1969) Scardovi and Trovatelli, 1974 // Microbiol. Immunol. 2000. - V.44. - N.6. - P.815-820.

68. Callón C., Millet L., Montel M.C. Diversity of lactic acid bacteria isolated from AOC Salers cheese // J. Dairy Res. 2004. - V.71. - N.4. - P.231 -244.

69. Cantón R. Antibiotic resistance genes from the environment: a perspective through newly identified antibiotic resistance mechanisms in the clinical setting // Clin. Microbiol. Infect. 2009. - V.l. -N.l. - P.20-25.

70. Cerning J. and Marshall V.M.E. Exopolysaccharides produced by dairy lactic acid bacteria. Recent Results Develop // Microbiol. 1999. - V.54. -N.3.- P. 195-209.

71. Cerning J. Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria // Fed. Eur. Microbiol. Soc. Microbiol. Rev. 1990. - V.87. - N.2. - P.113-118.

72. Cerning J., Bouillanne C., Landon M. Desmazeaud M. J. Comparison of exocellular polysaccharide production by thermophilic lactic acid bacteria // Sci. Aliments. 1990. - V.10. - N3. - P.443-449.

73. Cerning J. Production of exocellular polysaccharides by lactic acid bacteria and dairy propionibacteria // Lait. 1995. - V.75. - N. 1. - P.463-472.

74. Chakrabortty, Das S., Majumdar S., Mukhopadhyay K., et al. Use of RNA arbitrarily primed-PCR fingerprinting to identify Vibrio cholerae genes differentially expressed in the host following infection // Infect. Immun. -2000. V.68. - N.7. - P.3878-3887.

75. Chana P., E.M. Bik, D.B. DiGiulio, D.A. Relman, and P.O. Brown. Development of the Human Infant Intestinal Microbiota // PLoS Biol. -2007. V.5. -N.7. -P.177- 182.

76. Chassy B.M., Beall J.R., Bielawski R.M., Porter E.V., Donkersloot J.A. Occurrence and distribution of sucrose-metabolizing enzymes in oral streptococci // Infect. Immun. 1976. - V.14. -N.2. - P.408 - 415.

77. Chevallier B., Hubert J.C., Kammerer B. Determination of chromosome size and number of rrn loci in Lactobacillus plantarum by pulsed-field gel electrophoresis // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - V.120. - N.l. - P.51 -56.

78. Chlegel L., Grimont F., Grimont P. A. D., Bouvet A. Identification of Major Streptococcal Species by rrn-Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis // J. Clin. Microbiol. 2003. - V.41. - N.2. - P.657-666.

79. Cilia V., Lafay B., Christen R. Sequence heterogeneities among 16S ribosomal RNA sequences, and their effect on phylogenetic analyses at the species level // Mol. Biol. Evol. 1996. - V.13. - N.3. - P.451- 461.

80. Cilia V., Lafay B., Lambert C., Nicolas J.L., Corre S. Vibrio pectenicida sp. nov., a pathogen of scallop (Pecten maximus) larvae // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. - V.48. - N.2. -P.481-487.

81. Cocolin L., Rantsiou K., Iacumin L., Urso R., Cantoni C., Comi G. Study of ecology of fresh sausages end characterization of populations of lactic acid bacteria by molecular methods // Appl. Environ. Microbiol. 2004. -V.70.-N.3. -P.1883 -1894.

82. Cohan F.M. What are bacterial species? // Annu. Rev. Microbiol. 2002. -V.56. - N.4. - P.457-487.

83. Collins M.D., Rodrigues U., Pigott N.E., Facklam R.R. Enterococcus dispar sp. nov. a new Enterococcus species from human sources // Lett. Appl. Microbiol. 1991. - V.12. -N.5. - P.95 -98.

84. Colwell R.R. Polyphasic taxonomy of the genus Vibrio: numerical taxonomy of Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and related Vibrio species. // J. Bacteriol. 1970. - V.104. -N.3. - P.410 - 433.

85. Cotter P.D., Hill C. Surviving the acid test: responses of gram-positive bacteria to low pH // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - V.67. - N.6. -P.429-453.

86. Crittenden R.G., Martinez N.R., Playne M.J. Synthesis and utilisation of folate by yoghurt starter cultures and probiotic bacteria // Int. J. Food Microbiol. 2003. - V.80. -N.3. - P.217-222.

87. Dabour N., LaPointe G. Identification and molecular characterization of the chromosomal exopolysaccharide biosynthesis gene cluster from Lactococcus lactis subsp. cremoris SMQ-461 // Appl Environ Microbiol. 2005.- V.71. -N.ll. P.7414-7425.

88. D'Aimmo M.R., Modesto M., Biavati B. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp. isolated from dairy and pharmaceutical products // Int. J. Food Microbiol. 2007. - V.l 15. - N. 1. - P.35-42.

89. D'Costa V.M., Griffiths E, Wright G.D. Expanding the soil antibiotic resistome: exploring environmental diversity // Curr. Opin. Microbiol. 2007. V.10. -N.5. - P.481-489.

90. D'Costa V.M., McGrann K.M., Hughes D.W., Wright G.D. Sampling the antibiotic resistome // Science. 2006. - V.311. - N.5759. - P.374-377.

91. De Angelis M., Gobbetti M. Environmental stress responses in Lactobacillus: a review // Proteomics. 2004. - V.67. -N.4. - P. 106-122.

92. De Vuyst L., De Vin F., Vaningelgem F. and Degeest B. Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria // Int. Dairy J. 2001. — V.65. — N. 11. — P.687-707.

93. De Vuyst, L. and B. Degeest. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria//FEMS Microbiol. Rev. 1999. - V.23. -N.l. - P. 153-177.

94. Degeest B., Vaningelgem F. and De Vuyst L. Microbial physiology, fermentation kinetics, and process engineering of heteropolysaccharideproduction by lactic acid bacteria // Int. Dairy J. 2001. - V.65. - N.l 1. - P. 747-757.

95. Delcour J., Ferain T., Deghorain M., Palumbo E. and Hols P. The biosynthesis and functionality of the cell-wall of lactic acid bacteria // Antonie van Leeuwenhoek. 1999. - V.76. - N.3. - P. 159-184.

96. Delgado S., Delgado T., Mayo B. Technological performance of several Lactococcus and Enterococcus strains of dairy origin in milk // J. Food. Prot. 2002. - V.65. - N.l0. - P. 1590 - 1596.

97. Dellaglio F., Felis G.E., Castioni A. Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus subsp. nov., isolated from Indian dairy products // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. - V.55. -N.l. - P.401-404.

98. Devirgiliis C., Caravelli A., Coppola D., Barile S., Perozzi G. Antibiotic resistance and microbial composition along the manufacturing process of Mozzarella di Bufala Campana // Int. J. Food Microbiol. 2008. - V.128. -N.2. - P.378-384.

99. Doco T., Wieruszeski J-M. and Fournet B., Structure of an exocellular polysaccharide produced by Streptococcus thermophilus // Carbohydr. Res. 1990. - V. 198. -N.3. -P.313-321.

100. Donkora O. N., Henrikssonb A., Vasiljevica T., Shaha N. P. Effect of acidification on the activity of probiotics in yoghurt during cold storage // International Dairy Journal. 2005. - V. 10. - N.l. - P. 1-9.

101. Duboc F., Mollet B. Application of exopolysaccharides in the dairy industry // Int. Dairy J. 2001. - V.76. - N. 11. - P.759-768.

102. Dutka-Malen S., Evers S., Courvalin P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR // J. Clin. Microbiol. 1995. - V.33. - N.2. -P.24 -27.

103. Eaton T.J., Gasson M.J. Molecular screening of Enterococcus virulens determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates // Appl. and Environ. Microbiol. 2001. - V.67. - N.3. - P. 16281635.

104. Eaton T.J., Gasson M.J. Molecular screening of Enterococcus virulens determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates // Appl. and Environ. Microbiol. - 2001. - V.67. - N.2. - P. 1628 -1635.

105. Eckburg, P.B., Bik, E.M., Bernstein, C.N. Diversity of the human intestinal microbial flora// Science. 2005. - V.308. -N.5728. - P. 1635-1638.

106. Elli M., Callegari M.L., Ferrari S. Survival of yogurt bacteria in human gut // Applied and environtmental microbiology. 2006. - V.72. - N.7. -P.5113-5117.

107. Facklam R., Hollis D., Collins M.D. Identification of gram-positive coccal and cocobacillary vancomicin-resistant bacteria // J. Clinic. Microbiol. 1989. -V.27. -N.4. -P.724- 730.

108. Facklam R. R. What happened to the Streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes // Clinical Microbiology Reviews. 2002. -V.15. - N.4. - P.613-630.

109. Facklam R.R., Padula J.F., Thacker L.G., Wortham E.C., Sconyers B.J. Presumptive identification of group. A, B, and D streptococci // Appl. Microbiol. 1974. - V.27. - N.l. - P. 107-113.

110. Facklam R.R., Thacker L.G., Fox B., Erique L. Presumptive identification of streptococci with a new test system // J. Clin. Microbiol. 1982. - V.15. -N.6. - P.987-990.

111. Farrow J.A.E., Collins M.D. DNA base composition, DNA-DNA homology and long-chain fatty acid studies on Streptococcus thermophilus and Streptococcus salivarius // J. Gen. Microbiol. 1984. - V.130. - N.4. -P.357-362.

112. Favier C.F., W.M. De Vos, and Akkermans A.D. Development of bacterial and bifidobacterial communities in feces of newborn babies // Anaerobe. -2003. V.56. -N.9. - P.219-229.

113. Fertally S.S., Facklam R. Comparison of physiologic tests used to identify non-beta-hemolytic aerococci, enterococci, and streptococci // J. Clinic. Microbiol. 1987. - V.25. -N.l. - P.1845 - 1850.

114. Fitz-Gibbon S.T., House C.H. Whole genome-based phylogenetic analysis of free-living microorganisms // Nucl. Acid. Res. 1999. - V.27. - N.4. -P.4218 — 4222.

115. Flint S. H., Ward J. H., Brooks J. D. Streptococcus waius sp. nov,, a thermophilic streptococcus from a biofilm // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - V.49. - N.3. - P.759-767.

116. Fons M., Hege T., Ladire M., Raibaud P., Ducluzeau R., Maguin E. Isolation and characterization of a plasmid from Lactobacillus fermantumconferring erythromycin resistance // Plasmid. 1997. - V.37. - N.3. -P. 199-203.

117. Fox G.E., Wisotzkey J.D., Jurshuk P. How close is close: 16S rRNA sequene identity may not be sufficient to quarantee species identity. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. - V.42. -N.2. - P. 166 - 170.

118. Fujita Y., Okamoto T., Irie R. Plasmid distribution in lactic streptococci // Agric. Biol. Chem. 1984. - V.48. -N.7. - P. 1885 - 1898.

119. Gagnaire V., Piot M., Camier B., Vissers J.P., Jan G., Leonil J. Survey of bacterial proteins released in cheese: a proteomic approach // Int. J. Food Microbiol. 2004. - V.94. - N.4. - P. 185 - 201.

120. Galli D., Lottspeich F., Wirth R. // Mol. Microbiol. 1990. - V.4. - N. 1. -P.895-904.

121. Gelsomino R., Vancanneyt M., Cogan T.M., Condon S., Swings J. Source of enterococci in a farmhouse raw-milk cheese. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V.68. -N.7. - P.3560 - 3565.

122. Gillespie B.E., Jayarao B.M., Oliver S.P. Identification of Streptococcus species by randomly amplified polymorphic deoxyribonucleic acid fingerprinting // J. Dairy Sci. 1997. - V.80. -N.3. - P.471^176.

123. Gilmore M.S., Segarra R.A., Booth M.C., Bogie C.P., Hall L.R., Clewell D.B. // J. Bacteriol. 1994. -V. 176. - N.2. -P.7335-7344.

124. Giraffa G, Rossetti L. Monitoring of the bacterial composition of dairy starter cultures by RAPD-PCR // FEMS Microbiol. Lett. 2004. - V.237. N.l. - C.133-138.

125. Giraffa G. Enterococci from foods // FEMS Microb. Rev. 2002. - V.26. -N.2. - P.163-171.

126. Giraffa G. Functionality of enterococci in dairy products // Int. J. Food Microbiol. 2003. - V.88. -N.2. -P.215-222.

127. Giraffa G., Chanishvili N., Widyastuti Y. Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology // Res. Microbiol. — 2010. — V.161. N.6. — P.480-487.

128. Giraffa G., Carminati D., Neviani E. Enterococci isolated from dairy products: a review of risks and potential technological use // J. Food Prot. -1997. V.60. -N.l. - P.732-738.

129. Giraffa G., Neviani E. Molecular identification and characterisation of food-associated lactobacilli // Ital. J. Food Sci. 2000. - V.12. - N.3 -P.403- 423.

130. Giraffa G., Paris A., Valcavi L. Genotypic and phenotypic heterogeneity of Streptococcus thermophilus strains isolated from dairy products // J. Appl. Microbiol. 2001. - V.91. - N.2. - P.937 - 943.

131. Godon J.-J., Chopin M.-C., Erlich S.D. Branched-chain amino acid biosynthesis genes in Lactococcus lactis subsp. lactis. // J. Bacteriol. -1992. V.174. -N.3. - P.6580 - 6589.

132. Gonzalez C.F., Kunka B.S. Transfer of sucrose-fermenting ability and nisin production phenotype among lactic streptococci // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V.49. -N.l. - P.627 -633.

133. Goodfellow M., Minnikin D.E. Introduction to chemosystematics. In: Chemical Methods in Bacterial Systematics. eds. M. Goodfellow, D.E. Minnikin / London. Acad. Press. - 1985. - P. 1-16.

134. Goodfellow M., O'Donnell A.G. Handbook of New Bacterial Systematics / Eds Goodfellow M., O'Donnell A.G. / L.: Academic Press Ltd. 1993. -P.3-54.

135. Gordillo M.E., Singh K.V., Baker C.J., Murrey B.E. Typyng of group B streptococci: comparison of pulsed-field electrophoresis and conventional electrophoresis // J. Clin. Microbiol. 1993. - V.31. -N.2. - P. 1430- 1434.

136. Grimont P.A.D. Use of DNA reassociation in bacterial classification // Can. J. Microbiol. 1988. - V.34. -N.2. - P.541 - 546.

137. Grossiord B., Vaughan E.E., Leusink E., de Vos W.M. Genetics of galactose utilisation via the Leloir pathway in lactic acid bacteria // Lait. -1998. V.78. -N.4. - P.77-84.

138. Gueimonde M., Laitinen K., Salminen S., and Isolauri E. Breast milk: a source of bifidobacteria for infant gut development and maturation? // Neonatology. 2007. - V.92. -N.2. -P.64-66.

139. Gutell R.R., Larsen N., Woese C.R. Lesson from evolving rRNA: 16S and 13S rRNA structures from a comparative perspective // Microbiol. Rev. -1994. V.58. - N.2. - P. 10-26.

140. Hammes W.P., Hertel C. The genera Lactobacillus and Carnobacterium / In: Prokaryotes. 2006. - P.320-403.

141. Hashimoto J.G., Stevenson B.S., Schmidt T.M. Rates and consequences of recombination between rRNA operons // J. Bacteriol. 2003. - V.185. -N.2. - P.966-972.

142. Heller K. J. Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristics and starter organisms // Am. J. Clin. Nutr. 2001. - V.73. - N.l. - P.374-379.

143. Higashimura M., Mulder-Bosman B., Reich R., Iwasaki T. and Robijn G.W. Solution properties of Viilian, the exopolysaccharide from Lactococcus lactis subsp. cremoris SBT 0495 // Biopolimers. 2000. — V.54. -N.2. -P.143-158.

144. Higuchi W., Muramatsu M., Dohmae S. et al. Identification of probiotic lactobacilli used for animal feeds on the basis of 16S ribosomal RNA gene sequence // Microbiol. Immunol. 2008. - V.52. -N.l 1. - P.559-63.

145. Holton J. B. Galactose disorder: an overview // J. Inherited Metab. Dis. -1990. V.13. -N.3. - P.476-486.

146. Holzapfel W.H., Haberer P., Geisen R. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition // Am. J. Clin. Nutr. -2001. V.73. -N.2. - P.365-373.

147. Huang C.H., Lee F.L., Liou J.S. Rapid discrimination and classification of the Lactobacillus plantarum group based on a partial dnaK sequence and DNA fingerprinting techniques // Antonie Van Leeuwenhoek. 2010. -V.97. — N.3. - P.289-296.

148. Huey B., Hall J. Hypervariable DNA fingerprinting in E. coli minisatellite probe from bacteriophage M13 // J. Bacteriol. 1989. - V.171. - N.3. -P.2528-2532.

149. Hulton C.S.J., Higgins C.F., Sharp P.M. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and other enterobacteria // Mol. Microbiol. 1991. - V.5. -N.2. - P.825-834.

150. Hummel A.S., Hertel C., Holzapfel W.H., Franz C.M. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria // Appl. Env. Microbiol. 2007. - V.73. -N.3. - P.730-739.

151. Hutkins R. W., Morris H. A. Carbohydrate metabolism by Streptococcus thermophilus: a review // J. Food Prot. 1987. - V.50. -N.l. - P.876-884.

152. Hutkins R. W., Morris H. A., McKay L. L. Galactokinase activity in Streptococcus thermophilus // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V.50. -N.l. - P.777-780.

153. Hutkins R. W., Nannen N. L. pH homeostasis in lactic acid bacteria // J. Dairy Sei. 1993. - V.76. -N.2. - P.2354-2365.

154. Huys G., D'Haene K., Danielsen M., Egervärn M., Vandamme P. Phenotypic and molecular assessment of antimicrobial resistance in Lactobacillus paracasei strains of food origin // J. Food Prot. 2008. -V.71. —N.2. - P.339-344.

155. Izawa N., Hanamizu .T, Iizuka R., Sone T., Mizukoshi H., Kimura K., Chiba K. Streptococcus thermophilus produces exopolysaccharides including hyaluronic acid // J. Biosci. Bioeng. — 2009. V.107. - N.2. -P.l19-123.

156. Jang J., Kim B., Lee J., Han H. A rapid method for identification of typical Leuconostoc species by 16S rDNA PCR-RFLP analysis // J. Microbiol. Methods. 2003. - V.55. -N.l. - P.295 - 302.

157. Jeffrei S.R., Dobgosz W.J. Transport of 3-galactosides in Lactobacillus plantarum NC2 // Applied and environmental microbiology. 1990. -V.56. - N.8. - P.2484-2487.

158. Jenkins J.K., Harper W.J., Courtney P.D. Genetic diversity in Swiss cheese starter cultures assessed by pulsed field gel electrophoresis and arbitrarily primed PCR // Letters in Applied Microbiology. 2002. - V.35. - N.12. -P.423-427.

159. Jensen M. A., Webster J. A., Straus N. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59. -N.4. - P.945-952.

160. Jones D. Comparison and differentiation of genus Streptococcus // Streptococci / Eds. Skinner F.A., Quesnel L.G. London: Academic Press. -1978.- P. 1-49.

161. Jorn A. Aas, Bruce J. Paster, Lauren N. Stokes, Ingar Olsen, and Floyd E. Dewhirst Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity // J. Clin. Microbiol. 2005. - V.43. -N.ll. — P. 123-128.

162. Josephson J. The microbial "resistome" // Environ. Sci. Technol. 2006. -V.40. -N.21. - P.6531-6534.

163. Kashiwagi T., Suzuki T., Kamakura T. Lactobacillus nodensis sp. nov., isolated from rice bran // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. - V.59. -N.l. - P.83-86.

164. Khalid N.M., Marth E.H. Lactobacilli their enzymes and role in ripening and spoilage of cheese: a review // Journal of dairy science. - 1990. - V.73. - N.2. - P.2669-2684.

165. Kilpper-Balz R., Fischer G., Schleifer K.H. Nucleic acid hybridization of group N and group D streptococci // Curr. Microbiol. 1982. - V.7. - N.2. -P.245 — 250.

166. Kindstedt P.S. Effect of manufacturing factors, composition, and proteolysis on the functional characteristics of mozzarella cheese // Crit. Rev. Food Sei. Nutr. 1993. - V.33. -N.l. - P. 167-187.

167. Klappenbach J.A., Dunbar J.M., Schmidt T.M. rRNA operon copy number reflects ecological strategies of bacteria // Appl. Environ. Microbiol. -2000. V.66. - N.2. - P.1328-333.

168. Klappenbach J.A., Saxman P.R., Cole J.R., Schmidt T.M. rrndb: the ribosomal operon copy number database // Nucleic Acids Res. 2001. -V.29. -N.2. - P.181-184.

169. Klein G., Pack A., Bonaparte C., Reuter G. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria // Int. J. Food Microbiol. 1988. - V.41. -N.3. - P.103-125.

170. Knauf H.J., Vogel R.F., Hammes W.P. Cloning, sequencing, and phenotypic expression of catA, which encodes the catalase of Lactobacillus sakei LTH667 // Applied and environmental microbiology. 1992. - V.58. N.3. - P.832-839.

171. Knight G.C., Nicol R.S., McMeekin T.A. Temperature step changes: a novel approach to control biofilms of Streptococcus thermophilus in a pilot plant-scale cheese-milk pasteurisation plant // Int. J. Food Microbiol. -2004. V.93. -N.3. - P.305- 318.

172. Kuhler G., Ludwig W., Schleifer K.H. Differentiation of lactococci by rRNA gene restriction analysis // FEMS Microbiol. Lett. 1991. - V.68. -N.3. - P.307-312.

173. Kumar S., Tamura K. Nei M. MEGA: molecular evolutionary genetic analysis, version 1.0. / The Pennsylvania State University. University Park. - PA. - 1993.

174. Kwon D.-H., El-Zaatari F.A.K., Woo J.-S., Perng C.-L., Graham D.Y., Goo M.F. Rep-PCR fragments as biomarkers for differentiating gastroduodenal disease-specific Helicobacter pylori // Dig. Dis. Sci. -1998. V.43. - N.2. - P.980-987.

175. Lan R., Reeves P.R. Gene transfer is a major factor in bacterial evolution // Mol. Biol. Evol. 1996. - V.13. -N.l. - P.47-55.

176. Lan R., Reeves P.R. Intraspecies variation in bacterial genomes: the need for a species genome concept // Trends Microbiol. 2000. - V.8. — N.9. -P.396-401.

177. Lancefield R.C. A serological differentiation of human and other group of streptococci // J. Exp. Med. 1933. - V.59. -N.2. - P.441-458.

178. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics / Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. -1991. Chichester: Wiley.- P.115-175.

179. Larkin M. Probiotics strain for credibility // The Lancet. 1999. - V.354. -N.l. - P.1884-1889.

180. Le Bourgeois P., Lautier M., Mata M., Ritzenthaler P. Physical and genetic map of the chromosome of Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 // J. Bacteriol. 1992. - V.174. -N.21. - P.6752-6762.

181. Le Bourgeois P., Lautier M., Ritzenthaler P. Chromosome mapping in lactic acid bacteria // FEMS Microbiology Reviews. 1993. - V.12. - N.3. - P.109-124.

182. Le Bourgeois P., Mata M., Ritzenthaler P. Genome comparison of Lactococcus strains by pulsed-field gel electrophoresis // FEMS Microbiol. Lett. 1989. - V.50. -N.l. - P.65-69.

183. Lebeer S., Vanderleyden J., De Keersmaecker S.C. Genes and molecules of lactobacilli supporting probiotic action // Microbiol Mol Biol Rev. -2008. V.72. -N.4. - P.728-764.

184. Letort C., Juillard V. Development of a minimal chemically defined medium for the exponential growth of Streptococcus thermophilus // J. Appl. Microbiol. 2001. - V.91. -N.3. - P. 1023-1029.

185. Letort C., Nardi M., Garault P., Monnet Y., Juillard V. Casein utilisation by Streptococcus thermophilus results in diauxic growth in milk // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V.68. -N.6. - P.3162-3165.

186. Liao D. Gene conversion drives within genie sequences: concerted evolution of ribosomal RNA genes in bacteria and archaea // J. Mol. Evol. 2000. V.51. - N.2. - P.305-317.

187. Lick S., Drescher K., Heller K.J. Survival of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus in the terminal ileum of fistulated Gottingen Minipigs // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V.67. — N.9. - P.4137-4143.

188. Lilburnl T.G., Garrity G.M. Exploring prokaryotic taxonomy // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V.54. -N.2. - P.7-13.

189. Lin C.F., Chung T.C. Cloning of erythromycin-resistance determinants and replication origins from indigenous plasmids of Lactobacillus reuteri for potential use in construction of cloning vectors // Plasmid. 1999. - V.42. -N.l. - P.31-41.

190. Liong M.T., Shah N.P. Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains // Journal of dairy science. 2005. - V.88. -N.2. - P.55-66.

191. Liu G., Hale G. E., Hughes C. L. Galactose metabolism and ovarian toxicity // Reprod. Toxicol. 2000. - V.14. -N.2: - P.377-384.

192. Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogeny of bacteria beyond the 16S rRNA standard // ASM News. 1999. - Y.65. - N.2. - P.752 - 757.

193. Ludwig W., Seewaldt E., Kilpper-Balz R., Schleifer K.H., Magrum L., Woese C.R., Fox G.E., Stakebrandt E. The phylogenic position of Streptococcus and Enterococcus // J. Gen. Microbiol. 1985. - V.131. -N.6. - P.543 - 551.

194. Lund B., Edlund C., Barkholt L., Nord C.E., Tvede M., Poulsen R.L. Impact on human intestinal microflora of an Enterococcus faeciumprobiotic and vancomicin // Scand. J. Infect. Dis. 2000. - V.32 -N.6. - P. 627-632.

195. Lupski J.R., Weinstock S. Short, interspersed repetitive DNA sequences in prokaryotic genome // J. Bacteriol. 1992. - V.174. - N.2. - P.4525 - 4529.

196. Mac K., Wichmann-Schauer H., Peters J., Ellerbroek L. Species identification and detection of vancomycin resistance genes in enterococci of animal origin by multiplex PCR // Int. J. Food Microbiol. 2003. - V.88. -N.2. - P.305-309.

197. MacPherson, A.J., Uhr T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria // Science. 2004. - V.303. -N.2 - P. 1662— 1665.

198. Maidak B.L., Cole J.R., Lilburn T.G., Parker C.T., Saxman P.R., Stredwick J.M., Garrity G.M., Olsen G.J., Pramanik S., Schmidt T.M., Tiedje J.M. The RDP (Ribosomal Database Project) continues // Nucleic Acid Res. 2000. - V.28. - N.2 - P.173 - 174.

199. Manes-Lazaro R., Ferrer S., Rossello-Mora R., Pardo I. Lactobacillus oeni sp. nov., from wine // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. - V.59. - N.8. -P.2010-2004.

200. Marsh P.D., Percival R.S. The oral microflora—friend or foe? Can we decide? // Int. Dent J. 2006. - V.56. - N.2. - P.233-239.

201. Martin R., Heilig HJ., Zoetendal E.G., Jimenez E., et al. Cultivation-independent assessment of the bacterial diversity of breast milk among healthy women // Res. Microbiol. 2007. - V.56. - N.5. - P.31-37.

202. Martin, R., S. Langa, C. Reviriego, E. Jiminez, et al. The commensal microflora of human milk: new perspectives for food bacteriotherapy and probiotics//Trends Food Sei. Technol. 2004. - V.15. -N.4. -P.121-127.

203. Martinez-Murcia A.J., Collins M.D. A phylogenetic analysis of the genus Leuconostoc based on reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA // FEMS Microbiol. Lett. 1990. - V.58. -N.l. - P.73 - 83.

204. Masaru N., Kobayashi M., and Okamoto T. Rapid PCR-Based Method Which Can Determine Both Phenotype and Genotype of Lactococcus lactis Subspecies //Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V.68. - N.5. - P.2209-2213.

205. Mathur S., Singh R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria-a review // Int. J. Food Microbiol. 2005. - V.105. -N.3. - P.281-295.

206. McMahon D.J., Oberg C.J. and McManus W., Functionality of Mozzarella cheese // Aust. J. Dairy Thecnol. 1993. - V.48. - N.5. - P.99-104.

207. Melissa P. Gut Reaction: Environmental Effects on the Human Microbiota // Environ Health Perspect. 2009. - V. 117. - N.5. - P. 198-205.

208. Mercenier A. Molecular genetics of Streptococcus thermophilus. // FEMS Microbiol. Rev. 1990. - V.7. - N.2. - P.61-77.

209. Mohn S.C., Ulvik A., Jureen R., Willems R.J., Leavis H., Harthug S., Langeland N. Duplex real-time PCR assay for rapid detection of ampicillin-resistant Enterococcus faecium // Antimicrob. Agents. Chemother. 2004. - V.48. - N.2. - P.556 - 560.

210. Monsan P., Bozonnet S., Albenne C., Joucla G., Willemot R.-M. and Remaud-Simeon M., Homopolisacharides from lactic acid bacteria. Int. Dairy J. -2001. -V.56.-N.il. -P.675-685.

211. Montel M.C, Champomier M.C. Arginine catabolism in Lactobacillus sake isolated from meat //Applied and environmental microbiology. 1987. — V.53. -N.ll. P.2683-2685.

212. Montersino S., Prieto A., Munoz R., de Las Rivas B. Evaluation of exopolysaccharide production by Leuconostoc mesenteroides strains isolated from wine // J. Food Sci. 2008. - V.73. -N.4. - P. 196-199.

213. Mora D., Fortina M.G., Parini C. et al. Genetic diversity and technological properties of Streptococcus thermophilus strains isolated from dairy products // J. Appl. Microbiol. 2002. - V.93. - N.4. - P.278 -287.

214. Morelli, L., Wright, A.V., Probiotic bacteria and transferable antibiotic resistance-safety aspects. Demonstration of the Nutritional Functionality of Probiotic // Foods News Letter. 1997. - V.45. - N.2. - P.9-14.

215. Mundt, J.O. Lactic acid streptococci / In P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, and J.G. Holt (ed.). / Bergey's manual of systematic bacteriology 1986. vol. 2: The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md. p. 1065-1066.

216. MacKay L.L. Functional properties of plasmids in lactic streptococci // Antonie van Leeuwenhoec. 1983. - V.49. -N.2. - P.259 - 274.

217. Narendranath N.V., Hynes S.H., Thomas K.C., Ingledew W.M., Effects of lactobacilli on yeast-catalyzed ethanol fermentations // Applied and environmental microbiology. 1997. - V.63. - N.ll. -P.4158-4163.

218. Nosova T., Jousimies- Somer H., Jokelainen K., Heine R., Salaspuro M. Acetaldehyd production and metabolism by human indigenous and probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains // Alchohol and alchoholism. 2000. - V.35. - N.6. -P.561-568.

219. Novelli G., Reichardt K. V. Molecular basis of disorders of human galactose metabolism: past, present, and future // Mol. Genet. Metab. -2000. V.71.-N.2.-P.62-65.

220. Ogier J.C., Son O., Gruss A., Tailliez P., Delacroix-Buchet A. Identification of the bacterial microflora in dairy products by temporal temperature gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol. -2002. V.68. -N.3. - P.3691—3701.

221. Olive D.M., Bean P. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms: minireview // J. Clin. Microbiol. -1999. V.37. -N.6. - P.1661-1669.

222. Olsen G.J., Larsen G., Woese C.R. The ribosomal RNA database project // Nucleic Acid Res. 1991. - V. 19. - N. 1. - P.2017 - 2021.

223. O'sullivan D.J., Klaenhammer T.R. Rapid Mini-Prep Isolation of High-Quality Plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59. -N.8. - P.2730-2733.

224. O'Sullivan T., Daly C. Plasmid DNA in Leuconostoc species // Irish J. Food Sci. Technol. 1982. - V.6. - N.2. - P.206-211.

225. O'Sullivan T.F., Fitzgerald G.F. Comparison of Streptococcus thermophilus strains by pulse field gel electrophoresis of genomic DNA // FEMS Microb. Lett. 1998. - V.168. -N.2. - P.213-219.

226. Ottogalli G., Galli A., Dellagllio F. Taxonomic relations between Streptococcus thermophilus and some other streptococci // J. Dairy Res. -1979. V.46. — N.5. - P. 127—131.

227. Pace N.R. New perspective on the natural microbial world: molecular microbial ecology // Feature. 1996. - V.62. - N.2. - P.463 - 470.

228. Pereira D. I. A., Gibson G. R. Cholesterol assimilation by lactic acid bacteria and Bifidobacteria isolated from the human gut // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V.68. -N.9. - P.4689-4693.

229. Perez P.F., J. Dore, M. Leclerc, F. Levenez, et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? // Pediatrics. -2007.- V. 119. N. 1. - P.724-732.

230. Perreten V., Vorlet-Fawer L., Slickers P., Ehricht R., Kuhnert P. and Frey J. Microarray-based detection of 90 antibiotic resistance genes of Grampositive bacteria // J. Clin. Microbiol. 2005. - V.43. - N.3. - P.2291-2302.

231. Peterson S. D., Marshall R. T., Nonstarter lactobacilli in cheddar cheese: a review// Journal of dairy science. 1990. - V.73.-N.1.-P.1395-1410.

232. Poolman B. Energy transduction in lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V.12. -N.2. - P. 125-148.

233. Poznanski E., Cavazza A., Cappa F., Cocconcelli P.S. Indigenous raw milk microbiota influences the bacterial development in traditional cheese from an alpine natural park // Int. J. Food Microbiol. 2004. - V.92. - N.2. -P.141 - 151.

234. Prodelalov J., Spanov A., Rittich B. Application of PCR, rep-PCR and RAPD techniques for typing of Lactococcus lactis strains // Folia Microbiol (Praha). -2005. V.50. -N.2. - P. 150-154.

235. Rajilic-Stojanovic, M., Smidt, H. & de Vos, W. M. Diversity of the human gastrointestinal tract microbiota revisited // Environ. Microbiol. 2007. -V.9.-N.9. -P. 2125-2136.

236. Renault P., Gaillardin C., Heslot H, Role of malolactic fermentation in lactic acid bacteria // Biochemie. 1988. - V.70. -N.2. -P.375-379.

237. Rodrigues U., Collins M.D. Phylogenetic analysis of Streptococcus saccharolyticus based on 16S rRNA sequencing // FEMS Microbiol. Lett. -1990. V.59. -N.l. - P.231 -234.

238. Rogosa M., Mitchell J.A., Wiseman R.F. A selective medium for the isolation and enumeration of oral and fecal lactobacilli // Journal of bacteriology. 1951. - V.62. -N.6. - P. 132-133.

239. Romano A.H., Trifone J.D., Brustolon M. Distribution of the phosphoenolpyruvaterglucose phosphotransferase system in fermentative bacteria // Journal of bacteriology. 1979. - V. 139. - N. 1. - P.93-97.

240. Rossello-Mora R., Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - V.25. - N.4. - P.39-67.

241. Rossetti L., Giraffa G. Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR fingerprint databases // J. Microbiol. Methods. 2005. - V.63. - N.2. - P. 135-144.

242. Roussel Y., Colmin C., Simonet J.M., Decaris B. Strain characterization, genome size and plasmid content in the Lactobacillus acidophilus group (Hansen and Mocquot) // J. Appl. Bacteriol. 1993. - V.74. - N.5. - P.549-556.

243. Roussel Y., Bourgoin F., Guedon G. Analysis of the genetic polymorphism between three Streptococcus thermophilus strains by comparing their physical and genetic organization // Microbiology. 1997. - V. 143. - N.2. -P.1335-1343.

244. Roussel Y., Pebay M., Guedon G., Simonet J.M., Decaris B. Physical and genetic map of Streptococcus thermophilus A054. // J. Bacteriol. 1994. -V.176. - N.24. - P.7413.-7422.

245. Ruoff K.L., Ferraro M.J., Holden J., Kunz L.J. Identification of Streptococcus bovis and Streptococcus salivarius in clinical laboratories // J. Clin. Microbiol. 1984. - V.20. -N.l. - P.223-226.

246. Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Matto J., Mattila-Sandholm T. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties // J. Biotechnol. -2000. — V.84. -N.3. P.197-215.

247. Saidet J.A.O., Gilliland S.E. Antioxidative activity of lactobacilli measured by oxygen radical absorbence capacity // Journal of dairy science. 2005. - V.88. — N.2. — P. 1352-1357.

248. Salama M., Sandine W., Giovannoni S. Development and application of oligonucleotide probes for identification of Lactococcus lactis subsp. cremoris. Appl Environ Microbiol. 1991. - V.57. -N.5. -P.1313-1318.

249. Salzano G, Moschetti G, Villani F, Coppola S. Biotyping of Streptococcus thermophilus strains by DNA fingerprinting // Res. Microbiol. 1993. -V.144. —N.5. - P.381-387.

250. Sanz Y., Sanchez E., Marzotto M., Calabuig M. Differences in faecal bacterial communities in coeliac and healthy children as detected by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2007. - Y.51. -N.3. - P.562-568.

251. Schleifer K.H., Ehrmann M., Krusch U. Neve H. Revival of the species Streptococcus thermophilus (ex Orla-Jensen, 1919) nom. rev. // Syst. Applied Microbiol. 1991. - V.14.-N.2. - P.386-388.

252. Schleifer K.H., Kilpper-Balz R. Molecular and chemotaxonomic approaches to the classification of streptococci, Enterococci and Lactococci: a rewiew // System. Appl. Microbiol. 1987. - V.10. - N.l. -P.l-19.

253. Serio A, Paparella A, Chaves-Lopez C, Corsetti A, Suzzi G. Enterococcus populations in Pecorino Abruzzese cheese: biodiversity and safety aspects //J. Food Prot. 2007. - V.70. -N.7. - P. 1561-1568.

254. Servin A.L. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens // FEMS microbiology reviews. 2004. -V.28. — N.2.- P.405-440.

255. Shah N.P., Ravula R.R. Infuence of water activity on fermentation, organic acids production and viability of probiotic bacteria // Australian Journal of Dairy Technology. 2000. - V.55. - N.2 - P. 127-131.

256. Sherman J.M. The Streptococci // Bacteriol. Rev. 1937. - V.l. - N.2. - P. 3-97.

257. Sherman J.M., Wing H.U. Streptococcus durans nov. sp. // J. Dairy Sci. 1937. V.20. -N.l. - P. 165-167.

258. Siegumfeldt H., Rechinger K. B., Jakobsen M. Dynamic changes of intracellular pH in individual lactic acid bacterium cells in response to a rapid drop in extracellular pH // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V.66. -N.6. - P.2330-2335.

259. Snel B., Bork P., Huynen M.A. Genome phylogeny based on gene content //Nat. Genet. 1999.-V.21.-N.1.- P.108-110.

260. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. - Y.44. - N.2. - P.846-849.

261. Starshinova N.V., Filimonova M.N. Nuclease biosynthesis and growth of Serratia marcescens in the presence of 2-(p-Aminobenzenesulfonamide)-thiazole //Microbiology. 2004. - V.56. -N.3. - P.64-80.

262. Stecchini M.L., Del Torre M., Munari M. Determination of peroxy radical-scavenging of lactic acid bacteria // International journal of microbiology. -2000. V.64. - N.2. - P. 183-188.

263. Stern M.J., Ames G.F.L., Smith N.H., Robinson E.C., Higgins C.F. Repetitive extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome // Cell. 1984. - V.37. -N.2. - P.825-834.

264. Stingele F., Neeser J.-R., and Mollet B. Identification and characterization of the eps (exopolysaccharide) gene cluster of Streptococcus thermophilus Sfi6 //J. Bacteriol. 1996. -V. 178. -N.2. - P. 1680-1690.

265. Stingele F., Newel J. and Neeser J. Unraveling the function of glycosyltransferases in Streptococcus thermophillus Sfi6 // Journal of Bacteriology. 1999.- V.181. -N.4.-P.6354-6360.

266. Su Y.A., Sulavik M.C., He P., Makinen K.K., Makinen P-L., Fiedler S., Wirth R., Sutherland I.W. Bacterial exopolysaccharides // Adv. Microbiol. Physiol. 1972. - V.8. -N.l. -P.143-213.

267. Sybesma W., Starrenburg M., Tijsseling L., Hoefnagel M.H., Hugenholtz J. Effects of cultivation conditions on folate production by lactic acid bacteria // Appl Environ Microbiol. 2003. - V.69. -N.8. - P.4542-4548.

268. Talwalkar A., Kailasapathy K. Metabolic and biochemical responses of probiotic bacteria to oxygen // Journal of dairy science. 2003. - V.86. -N.l. — P.2537-2546.

269. Tanskanen E.I., Tulloch D.L., Hiller A. J., Davidson B. E. Pulsed-field gel electrophoresis of Smal digests of lactococcal genomic DNA, a novel method of strain identification // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V.56. -N.10. - P.3105-3111.

270. Teanpaisan R., Hintao J., Dahlen G. Oral Lactobacillus species in type 2 diabetic patients living in southern Thailand // Anaerobe. 2009. - V.15. -N.4. - P. 160-163.

271. Tekaia F., Lazcano A., Dujon B. The genomic tree as revealed from whole proteome comparisons // Genome Res. 1999. - V.9. — N.4. - P.550-557.

272. Terzic-Vidojevic A Vukasinovic M, Veljovic K, Ostojic M, Topisirovic L. Characterization of microflora in homemade semi-hard white Zlatar cheese // Int. J. Food Microbiol. 2007. - V. 114. - N. 1. - P.36-42.

273. Tettelin H. Streptococcal genome provide food for thought // Nature Biotechnology. 2004. - V.22. - N.12. - P.1523-1524.

274. Teuber M., Schwarz F., Perreten V. Molecular structure and evolution of the conjugative multiresistance plasmid pRE25 of Enterococcus faecalis isolated from a raw-fermented sausage // Int. J. Food Microbiol. 2003. -V.88. -N.2. - P.325-329.

275. Torriani S., Zaparolli G., Dellaglio F. Use of PCR-based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subs, bulgaricus and L. delbrueckii subs, lactis // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Y.65. -N.10. - P.4351-4356.

276. Turgeon N., Frenette M., Moineau S. Characterization of a theta-replicating plasmid from Streptococcus thermophilus // Plasmid. 2004. -V.51. —N.l. - P.24 -36.

277. Turgeon N., Moineau S. Isolation and characterization of a Streptococcus thermophilus plasmid closely related to the pMV158 family. // Plasmid. -2001.-V.45. N.3. - P.171-183.

278. Ursing J.B., Rossello-Mora R.A., Garcia-Valdes E., Lalucat J. Taxonomic note: a pragmatic approach to the nomenclature of phenotypically similar genomic groups // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. - V.45. -N.2. - P.604-610.

279. Vadeboncoeur C., Moineau S. The relevance of genetic analysis to dairy bacteria: building upon our heritage // Microbial Cell Factories. 2004. -V.3. -N.3. - P.15-18.

280. Vaillancourt K., LeMay J. D., Lamoureux M., Frenette M., Moineau S., Vadeboncoeur C. Characterization of a galactokinase-positive recombinant strain of Streptococcus thermophilus // Appl. Environ. Microbiol. 2004. -V.70. — N.4. - P.4596-4603.

281. Van de Guchte M., Serror P., Chervaux C. Stress responses in lactic acid bacteria// Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - V.45. -N.2. - P.187-216.

282. Vancanneyt M., Snauwaert C., Cleenwerck I., Baele M., Descheemaeker P., Goossens H., Pot B., Vandamme P., Swings J., Haesebrouck F.,

283. Devriese L.A. Enterococcus villorum sp. nov., an enteroadherent bacterium associated with diarrhea in piglets // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V.51. -N.2. - P.393^100.

284. Vandamme P., Pot B., Gilis M., De Vos P., Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. 1996. V.60. -N.4. - P.407-438.

285. Vaughan E.E., van den Bogaard P.T.C., Catzeddu P., Kuipers O.P., de Vos W.M. Activation of silent gal genes in the lac-gal regulon of Streptococcus thermophilus//J. Bacteriol. -2001. V.183. -N.2. - P. 1184-1194.

286. Veljovic K., Terzic-Vidojevic A., Vukasinovic M., Strahinic I., Begovic J., Lozo J., Ostojic M., Topisirovic L. Preliminary characterization of lactic acid bacteria isolated from Zlatar cheese // J. Appl. Microbiol. 2007. -V.103. —N.6. - P.2142-2152.

287. Ventura M., O'Flaherty S., Claesson J. Genome-scale analyses of health-promoting bacteria: probiogenomics // Nat. Rev. Microbiol. 2009. - V.7. -N.l. - P.61-71.

288. Ventura M. and Zink R. Rapid identification, differentiation, and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V.68. -N.12. - P.6429-6434.

289. Walter, J. The microecology of lactobacilli in the gastrointestinal tract / In G. W. Tannock (ed.), Probiotics & prebiotics: scientific aspects / 2005. -Caister Academic Press. Norfolk. - United Kingdom. - P.51-82.

290. Ward L.J., Brown J.C., Davey G.P. Two methods for the genetic differentiation of Lactococcus lactis ssp. lactis and cremoris based on differences in the 16S rRNA gene sequence // FEMS Microbiol. Lett. -1998. V. 166. - N. 1.- P. 15-20.

291. Welman A. and Maddox S. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges // Trends Biotechnol. 2003. - V.21. - N.2. -P.269-274.

292. Welman A.D. and Maddox I.S. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges // Trends Biotechnol. 2003. - V.21. -N.2.-P.269-274.

293. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. - V.18. -N.2. - P.7213-7218.

294. Whilei R.A., Hardie J.M. Streptococcus vestibularis sp. nov. from the human oral cavity // Int. J. Syst. Bact. 1988. - V.38. -N.4. - P.335-339.

295. Whiley R.A., Beighton D. Current classification of the oral streptococci // Oral Microbiol. Immunol. 1998. - V.13. -N.4. - P.195:216.

296. Williams J. G., Kubelik A. R., Livak K. J., et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful genetic markers // Nucleic Acids Res. 1990. - V.18. -N.3. - P.6531-6535.

297. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. - V.51. - N.2. -P.221-271.

298. Wolf G., Arendt E.K., Pfahler U., Hammes W.P. Heme-dependent and heme-independent nitrite reduction by lactic acid bacteria results in different N-containing products // International journal of food microbiology. 1990. - V.10. -N.l. -P.323-329.

299. Wright G.D. The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic diversity//Nat. Rev. Microbiol. 2007. - V.5. -N.3. - P. 175-186.

300. Wright G.D. Q&A: Antibiotic resistance: where does it come from and what can we do about it? //BMC Biol. 2010. - V.20 -N.8. - P.123-129.

301. Yoon J.H, Kang S.S., Cho Y.G., Lee S.T., Kho Y.H., Kim C J., Park Y.H. Rhodococcus pyridinivorans sp. nov., a pyridine-degrading bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - V.50. -N.2. - P.2173 - 2180.

302. Yother, J., Trieu-Cuot, P., Klaenhammer, T.R., de Vos, W.M. Genetics of streptococci, lactococci, and enterococci: review of the Sixth International Conference // Journal of Bacteriology. 2002. - V.184. - N.22. - P.6085-6092.

303. Young J.M. Implications of alternative classifications and horizontal gene transfer for bacterial taxonomy // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. -V.51. — N.3. - P.945-953.

304. Zhang W., Yu D., Sun Z., Chen X., Bao Q., Meng H., Hu S., Zhang H. Complete nucleotide sequence of plasmid plac36 isolated from Lactobacillus casei Zhang//Plasmid. 2008. - V.60. -N.2. - P.131-135.

305. Zhang Z., Schwartz S., Wagner L. and Miller W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences // J. Comput. Biol. 2000. - V.7. - N.l. - P.203-214.

306. Zourari A., Accolas J. P., Desmazeaud M. J. Metabolism and biochemical characteristics of yogurt bacteria. A review // Lait. 1992. V.72. - N.3. - P. 1-8.1. БЛАГОДАРНОСТИ

307. Выражаю глубокую благодарность и признательность всем участникам совместных исследований.

Информация о работе

Ботина, Светлана Геннадиевна
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы