Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение бактерий рода Lactobacillus, перспективных для силосования кормов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение бактерий рода Lactobacillus, перспективных для силосования кормов"

Академия наук Беларуси Институт микробиологии

На правах рукописи

БУРЯКО Инна Александровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА ЬАСТОВАИЬШЗ , ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДНЯ СИЛОСОВАНИЯ КОРЮВ

Специальность 03.00.07 - микробиология ,

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1991

Работа выполнена в Институте микробиологии Академии на; Беларуси.

Научный руководитель - доктор биологических наук

Т. Г. Зименко.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор 1. И. Воробьева;

кандидат биологических наук Е. В. Гриц.

Ведущее учреждение - Всесоюзный научно-исследовательск институт сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург

защита состоится 1991 г. в ча

сов.на заседании специализированного совета К 006.09.01 в Институте микробиологии АН Беларуси по адресу: 220057, г.Ки ул.. Жодинская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институ микробиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Н. В. ОБРАЗ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лактобациллы - одна из основных групп микроорганизмов, осуществляющих ферментацию в растительной массе при спонтанном силосовании кормов. Бактерии рода Lactobacillus являются также основным компонентом большинства бактериальных заквасок для регулирования процесса силосования.

G целью повышения качества корма и сокращения потерь при силосовании используются многие приемы, в том числе внесение в зеленую массу различных добавок - ферментируемых углеводов, бактериальных заквасок, хшл.ческих консервантов, ферментных препаратов и др.

В последние года заметно возрос интерес к бактериальным закваскам, что во многом определяется их экологической безопасностью и эффективностью применения при силосовании растительного сырья.

В Беларуси на долю силоса приходится более 30% заготавливаемых кормов, что обусловливает необходимость производить его ежегодно в объеме не менее 12 млн. тонн. Погодные условия республики, часто неблагоприятные для заготовки кормов, диктуют необходимость максимального увеличения приготовления силоса с использованием консервантов. Целесообразно создание эффективных бактериальных заквасок, чему должны предшествовать соответствующие научные исследования. Такие исследования частично осуществлены в ходе выполнения настоящей работы.

Интенсивное применение азотных удобрений и, как следствие, накопление избыточного нитратного азота в сельскохозяйственной продукции делает актуальным изучение воздействия молочнокислых бактерий на нитраты. Научно-практический интерес представляет также исследование влияния биологических и химических консервантов на процесс силосования растительной массы с повышенным содерданг.ем нитратного азота.

Определяющим этапом в создании бактериальной закваски является подбор эффективных штаммов. Принципиальное значение имеет постоянная селекция продуктивных форм молочнокислых бактерий для производственного силосования (Першина, 1983). Наряду с конструированием усовершенствованных генетических вариантов микроорганизмов актуальным остается отбор натуральных штаммов, которые, в отличие от созданных методом генной инженерии, не нуждаются в защите от конкуренции и не несут потенциальной эколо-

гической.опасности (Заварзин,1987; Hies ,1983; Johnston, I9S5; Wiese , I98S). В связи с этим целесообразно выделение из природных источников штаымов молочнокислых бактерий и, в первую очередь, доминирующих в микробном ценозе качественного силоса представителей рода Lactobacillus , изучение их физиолого -биохимических свойств с учетом современного состояния таксономии этой группы микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - выделение и изучение штаммов бактерий рода Lactobacillus , перспективные для силосования различного растительного сырья. В задачи работы входило:

- выделение из растительных источников штаммов рода Lactobacillus;

- изучение физиолого-бпохимических свойств, идентификация выделенных штаммов;

- отбор культур, перспективных для силосования разного растительного сырья, е том числе с высоким содержанием нитратного азота;

- изучение эффективности отобранных штаммов в процессе силосования различного растительного сырья (влияние на микробиологические, биохимические процессы, сохранность питательных веществ с:;лос^)*в сравнении с другими консервантам-«:.

Научная новизна работы. Создана коллекция бактерий рода Lactobacillus , выделенных из силосуемых кормов Беларуси, представленная различными штаммами практически всех встречающихся в подобных субстратах видов, которые могут быть использованы в качестве эталонов при идентификации лактобацилл и как компоненты силосных заквасок. У некоторых штаммов найдена редкая для лактобацилл способность восстанавливать нитраты.

Ре?ультаты изучения видового состава бактерий рода Lactobacillus , выделенных из силосуемых кормов, позволяют дополнить список обнаруживаемых в подобных субстратах микроорганизмов видами L. vaccinoBtercus и L. yaraanashiensis . Установлено доминирование, в процессе ферментации кукурузы, злаковых трав от начала сбраживания до созревания силоса гетерофермен-тативных обяигатных и факультативных видев лактобацилл, что необходимо учитывать при их дифференциации и при подборе штаммов для заквасок.

На основе литературных данных и результатов собственных исследований разработан ключ для дифференциации бактерий рода

Lactobacillus .выделяемых из микрофлоры силоса, значительно упрощающий и ускоряющий процесс идентификации.

Полученные данные углубляют знания о биологии молочнокислых бактерий, дополняют их сведениями о нитратредуктазной активности' бактерий рода Lactobacillus , подтверждают принципиальную возможность использования способных к нитратредукции штаммов для силосования растительного сырья с целью снижения содержания нитратов при сохранении высокого качества получаемого корма. Установлена целесообразность преимущественного использования бактериальных консервантов в сравнении с химическими при силосовании растении с повышенным содержанием нитратов.

Практическая ценность работы. Получены и предложены к использованию для силосования кормов штаммы Lactobacillus plan-tarura 3766 и К9, обладающие высокой активностью роста и кисло-тообразования, антагонизмом к возбудителям порчи силоса, широким спектром сбраживаемых у:ушводов и способностью к редукции нитратов. Использование заквасок на основе отобранных штаммов при заготовке силоса в хозяйствах Могилевской, Витебской областей позволило получить корм I класса.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Республиканской конференции "Проблемы идентификации микроскопических грибов и других микроорганизмов" (Неринга, 1987); Конференции молодых ученых по проблемам биохимии, физиологии и молекулярной генетики микроорганизмов (Пущино-на-Оке, ИБФЫ АН СССР, 1988); Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых по проблемам эволюции и систематики прокариот (Пущино-на-Оке, ИБШ АН СССР, 1988); 1У Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых и специалистов-микробиологов "Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов" (Ташкент, 1989): Всесоюзной конференции "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных"(Ташкент, 1989); Всесоюзной конференции "Микробиологические процессы при промышленной переработке сельскохозяйственного сырья" (Пущино-на-Оке , 1990); Всесоюзной конференции "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, получено положительное решение ВНИИГПЭ на выдачу авторского свидетельства об изобретении.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 156

страницах машинописи, из которых Ю6 страниц текста, 36 таблиц. 14 рисунков; сптоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Список литературы включает 183 источника, в том числе 78 - зарубежных авторов.

Место проведения работы. Работа выполнена в лабораториях микробиологии почв и биохимии микроорганизмов Института микробиологии АН Беларуси; идентификация бактерий рода Lactobacillus цроведена■под руководством к.б.н. В.Л.Беликовой. Оптическая активность молочной кислоты определена в Институте микробиологии им. А. Кирхенштейна Латвийской АН, нитратредуктазная активность лактобацилл - в лаборатории трансформации азота и углерода почвенными микроорганизмами ВКИКСХМ. Зоотехнический анализ силосуемой массы в соответствии с договорами о творческом сотрудничестве выполнен в Отделе промышленного кормопроизводства БСХА и на кафедре кормления сельскохозяйственных животных Витебского ветеринарного института.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы на основании результатов исследований отечественных и зарубежных авторов кратко изложены следующие вопросы: молочнокислые бактерии рода Lactobacillus как основной компонент микрофлоры силоса, биологические свойства и идентификация этих микроорганизмов, микробиологические и ферментативные процессы в силосуемой массе и их регулирование.

Объекты и методы исследований

Объекты исследований. В работе использовали чистые культуры молочнокислых бактерий, выделенные в ходе настоящей работы из сообщества эпифитной микрофлоры и силосов, а также музейные штаммы, предоставленные несколькими коллекциями страны: Всесоюзной коллекцией микроорганизмов (штаммы бактерий родов Lactobacillus и Enterococcus ), коллекцией Института микробиологии и вирусологии АН КазССР (штаммы бактерий родов Lactobacillus, streptococcus, Pxopionibactexiujn), коллекцией Института микробиологии и вирусологии АН УССР (штамм бактерий рода Lactobacillus ).

Объектами изучения служили также закваски, приготовленные

ha основе отобранных лактобацилл; силосуемые растения (кукуруза, клевер красный, люпин кормовой, овсяница тростниковая, галега) ; силос разных вариантов и сроков хранения.

Методы исследований. Чистке культуры молочнокислых бактерий выделяли методом глубинного посева на плотные питательные среды с добавлением в качестве источника углеводного питания глюкозы, - растворимого крахмала, ксилозы и 'арабинозы, внесением 10-12 % этанола для подавления гнилостной микрофлоры (Квасников, Несте-ренкс, 1975).

Молочнокислые бактеши выращивали на среде USS , сусле (6-7° Баллинга), средах, содержащих растительные отвары, мелассу, молочную сыворотку, растворимый крахмал, ксилозу, арабинозу (Скородумова, 1963; Чуканов, Попенко, 1986; Man , Rogosa,Sharpe, I960). Для создания частично или полностью анаэробных условий использовали микроанаэростатй, вакуумные эксикаторы, высокий слой жидкой среды, вязкие среды, толщу плотной среды.

Для идентификации лактобацилл, проведенной с помощью руководства Берги.(I986-) и разработанного нами ключа (Буряко, Бели -кова и др., 1991), изучали морфолсго-культуральные и физиолого-биохимкческие свойства микроорганизмов общепринятыми методами (Квасников, Кестеренко,1975; Методы общей бактериологии, 1983). Способность к образованию газа из.глюкозы и глюконата натрия устанавлиЕали в модификации, описанной Dicks и Vuuren (I9B7).

Стбор перспективных для силосования кормов штаммов молочнокислых бактерий проводили с использованием составленной поэтапной схемы.

Активность кислстообразования определяли потевцио- (рН) и ■пирометрическим методами (°Т). Концентрацию кислот, этанола в культуральной кидкоетк, COg.N^O, и к,, в газовых фракциях устанавливали хроматографически (Широкова, Евдокимов, 1981)»Антагонистическую активность лактобацилл по отношению к возбудителям порчи силоса определяли методом диффузии в агар (Егоров, 1Э55). Витратредуктазную активность устанавливали на модифицированной среде SBL (Rogosa , 1961). Содержание нитратного и аммиачного азота в культураяьной жидкости определяли с помощью ион-селективных электродов, содержание нитритов - колориметрически (Метаболизм микроорганизмов, 1985).

Количество и качественный состав микроорганизмов разных групп в ценозе зпифитной микрофлоры и в сялосе устанавливали методом разведения суспензий и высева на питательные среды :

мясо-пептонный, мясо-сусловый, 1фахмало~аммиачный агар, сусло -агар с добавлением молочной кислоты, капустный агар с добавле- ' нием 10 % этанола и 2 % СаСОд. Количество каслянокислых и денитрифицирующих бактерий определяли методом предельных разведений на картофельной среде с мелом и среде Гильтая соответственно СТеппер, Шильникова, Переверзева, 1987).

Биохимический анализ зеленой массы растений и силоса проводили с использованием общепринятых методов.

Производственные опыты по силосованию растительного сырья закладывали в хозяйствах Могилевской, Витебской областей в силосных траншеях (хранилищах) или силосных башнях.

Математическую обработку экспериментальных данных выполнили методом дисперсионного и корреляционно-регрессионного анализа на ЭВМ ЕС-1035 (Доспехов, 1985).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

Выделение молочнокислых бактерий из растительных источников

Источниками выделения молочнокислых бактерий служили зеленые растения, измельченная растительная масса, силос разных вариантов.

Численность молочнокислых бактерий в составе эпифитной микрофлоры разных видов силосуемых растений неодинакова: минимальна на овсянице тростниковой, максимальна на кукурузе. В сообществе микроорганизмов филлосферы растений, используемых для приготовления силоса, доминируют аммонифицирующие бактерии (таб.1).

Сравнительное изучение динамики микробиологических процессов разных вариантов кукурузного и злакового силосов показало, что химический консервант БИК-1 оказывает ингибирувдее влияние на молочнокислую микрофлору в фазу смешанного брожения. Внесение в зеленую массу овсяницы тростниковой бактериальных заквасок или химического консерванта способствует преимущественному развитию молочнокислых бактерий в фазу основного брожения, в то время как при спонтанном силосовании (контроль, без внесения консервантов) доминируют аммонифицирующие бактерии. Качество кукурузного силоса спонтанного брожения (контроль), несмотря на сравнительно большое количество молочнокислых бактерий в нем (10®—10^ клеток в I г сухого вещества), значительно хуже, чем в опытных вариантах с внесением консервантов.

Таблица I

Состав эпифитной микрофлоры силосуемых растений

Бактерии

Год Расте- •усваива- Мицели-

отбо- ние молочно- аммони- спорооб-:ющие ми- альные

ра кислые фицирую- разующие:нерадь- грибы и

проб щие :ные фор- дрожжи

*мы азота

1987

1988

колониеобразующих единиц в 1г сухого вещества •Ю1 86,2-Ю6 50,6-Ю3 19,6-Ю6 12,6'Ю2

Овсяница 11,3»

Кукуруза'47,6 Л О5 46,2'Ю7 51-,5*10° 87,0'Ю" Кукуруза" 17,8-Ю6 35,5-Ю7 16,3'Ю2 14,9'Ю6 Люпин 54,4-10^ 30,9-10^ Овсяница 30,0* Клевер 44,6

Ю;

10*

1&,6-Ю8 10,9*10®

47,8 57,3 28,7 67,0 44,7

щ

Ю2

ю4 юг ю4

НСР, ЯСР,

05 01

46,2-Ю4 87,1 «Ю6 67,2*104 12,4-Ю7

11,4'Ю2 6,5Л05 49,3-Ю2

16,9.102 10,7'Ю5 70,1

10й

- не учитывались;

отбор проб: '-в августе, * - в октябре

Анализ полученных данных дает основание считать, что для благоприятного течения процессов брожения в растительной массе наряду с количественным содержанием молочнокислых бактерий существенное значение имеют их физиолого-биохимические свойства.

Из разных растительных субстратов выделены 695 культур молочнокислых бактерий. Кокковидные молочнокислые бактерии выделялись преимущественно из филлосферы растений, измельченной растительной массы, силоса на начальных этапах брожения. Преобладали в микробном ценозе разных вариантов силоса палочковидные формы.

Принадлежность выделенных культур к молочнокислым бактериям определяли по характерным для них округлым, дисковидным, че-чевицеобразным колониям с большей или меньшей зоной растворения мела при глубинном посеве на агаризованные среды с 2 % СаСОд ; грамположительным палочковидным или кокковидным неподвижным ас-порогенным клеткам, а также бродильному типу метаболизма, отсутствию каталазной активности и цих'охромсодержащих дыхательных

систем.

С учетом преобладания в микробном сообществе качественного силоса бактерий рода Lactobacillus и включения их в большинот во силосных заквасок, лактобациллы явились основным объектом ваших исследований.

Идентификация бактерий рода Lactobacillus

Идентификацию бактерий рода Lactobacillus проводили с учетом их современной таксономии, наиболее полно изложенной в руководстве Берги (1986). До вида (подвида) идентифицировали 82 штамма. В процессе работы столкнулись с необходимостью определения большого числа таксономических признаков, что не всегда оправдано из-за их идентичности у некоторых видов. Значительные трудности при идентификации лактобацилл создает обилие видов (более £0) и отсутствие ключа. В связи с этим для видовой дифференциации бактерий рода Lactobacillus на основании литературных данных и результатов собственных исследований нами разработан ключ, который апробирован при идентификации большинства видов лактобацилл, обнаруживаемых в микрофлоре силосуемых кормов (рис. I). Ключ не содержит хемотаксономичес-фюс признаков, изучение которых требует специальной аппаратуры, число фенотипических признаков в нем значительно сокращено в сравнении с их списком в руководстве Берги (1986). Эти преимущества, а также ограниченный набор видов рода Lactobacillus, включающий типичных представителей микрофлоры силосуеыьк кормов, существенно упрощают и ускоряют процесс идентификации лактобацилл. -

При установлении видовой принадлежности выделенных из растительных источников лактобацилл использовали в качестве эталонных штаммы видов рода Lactobacillus , предоставленные нам Всесоюзной коллекцией мшфоорганизмов, многие из которых являются типовыми.

Сравнивая полученные нами результаты видовой дифференциации бактерий рода Lactobacillus с литературными данными,можно заключить, что в изученных образцах силоса обнаружены все типичные для подобных субстратов виды лактобацилл (L. planta-rum, L. coryniformis, L. brevis, L. buchneri,L. casei). Впервые из ми!фобного сообщества силосуемых растений выделены виды L.. vacciaoetercus И L-yamajiashieneis , однако их роль в процессе силосования пока не ясна.

Газ из глюкозы

+ Газ из Иа-глюконата -Ь.уагоапавМ.епв1в

маннит +

- Газ из На-глюконата + Ь.у1г1Девсепа

I - трегалоза + - рибоза

1>.сигуа^в Ь.ааке Ь.согуп1Гогш1в

виЬвр.согупЦСог-ш±в

- КН^ из ь-аргинина + - +45°С + I

- раффиноза +

- рамноза + Ь.саве! виЬвр. свае! Ь.саве! виЬер. гЬзтпоеив

- мелецитоза" +

егтетгЬит

Ii.planta.rum Ь. Ьгеу1в

Ь.ЬисЬпег!

Рис. I. Ключ для идентификации Ьа^оЪасШив врр.

выделяемых из силоса

По характеру метаболизма глюкозы и глюконата натрия иесле дуемые штаммы принадлежат ко всем трем группам лактобацилл: об лигатным гомоферментативным ( L.yamanashienaie ), факультативным гетероферментативным (1. casei eubsp. casei , L. casei subsp. xhannosus, L.coryniformis eubsp. coryniformis, L. plan-tarum) и облигатным гетероферментативным (L. brevis, Ъ. buch -neri, L. ferment usi, L.vaccinostercus). Группа гомоферментатив-ных лактобацилл представлена только одним видом L.yaaanashlen ais , который встречается в силосе редко. Следовательно, с учетом полученных данных и сведений, найденных в литературе , можно сделать вывод об участии в процессе силосования в основном гетероферментативных (облигатных и факультативных) лакто -бацилл.

Бактерии рода Lactobacillus описываются как микроорганизмы, у которых способность к восстановлению нитратов встречается очень редко ( Bergey'e , 1986). По литературным данным нитратредуктазная активность чаще всего обнаруживалась у штаммов вида L. plantarum ( Costilow, Humphreys , 1955 ; iengBton, Вошпа , I960; Rogosa , 1961; Bousset-Patianoff «г al. , 1971; smith , Pelumbo , 1978). Около 20 % лактобацилл, выделенных нами из разных растительных источников , обладают способностью превращать нитраты в нитриты, проявляющейся при внесении 0,5 % инокулята в среды с низким содержанием сбраживаемого углевода и относительно высоким начальным зш чением рН (7,2). Большинство штаммов, обладающих нитратредукт! зной активностью , идентичны виду L. plantarum . Нитратредут рующие штаммы были выявлены также среди представителей L, brevis , L. buchneri , L. vaccinoatercus , L. casei subsp. ri nmosua.

В результате выделения бактерий рода Lactobacillus из сообщества эпифитной микрофлоры и силосуемых кормов, их изучения и идентификации создана разнообразная по видовому составу коллекция, штаммы которой могут быть использованы в качестве эталонов при идентификации выделяемых из растительных источн» ков лактобацилл, а также при подборе культур для силосных зан васок.

Отбор штаммов рода Lactobacillus • перспективных для силосования кормов

Для отбора молочнокислых бактерий использовали поэтапный

йетод по разработанной схеме, включающей выделение культур, их скрининг по активности роста и ацидогенной активности на разныз? питательных средах, спектру сбраживаемых углеводов, антагонистической активности по отношению к возбудителям порчи силоса и на заключительном этапе - проверку эффективности отобранных штаммов при силосовании разного растительного сырья.

Начальный этап включал выделение изолятов из разных растительных субстратов, получение чистых культур, предварительную идентификацию, подтверждающую их принадлежность к молочнокислы»' бактериям. При. подборе etl.'mob для силосования растительного сырья ориентировались на мезофильные микроорганизмы рода Lactobacillus , активно развивающиеся на начальных этапах роста. Всего было выявлено более 400 потенциальных штаммов для силосных заквасок.

Основным |фитерием на утором этапе отбора служили данные об уровне нислотообраъованвя бактерий в MRS , позволяющие судить об активности сбраживания глюкозы в оптимальных условиях. Использование нелинейного корреляционно-регрессионного анализа полученных результатов позволило выявить функциональную зависимость между величиной 'аЦЭДргенезл. изучаемых штаммов и параметрами источника их выделения (видом растительного источника, сроком хранения силоса, характером обработки силосуемой массы), а также морфолого-культуральными особенностями изолята при выделении на агаризованной среде. С исключением из числа рассматриваемых вариантов молочнокислых бактерий, выделенных из филлосферы растений и измельченной растительной массы, для которых ошибки аппроксимации были максимальны, получена квадратичная регрессионная зависимость, которая с высокой степенью вероятности (коэффициент множественной детерминации -80 %) описывает свойства молочнокислых бактерий, изолируемых в разныь сроки из разных вариантов силосуемых кормов. Показано, что для каждого источника (xg) существует свой оптимальный срок (xg 0pt ) выделения штаммов - активных кислотообразовате-лей, что описывается функциональной зависимостью: 116 - 0,225*Х2

ХЗ opt = 2- 0,004

Установлено, что по уровню кислотообразования выделенные культуры существенно различались. Из 125 штаммов, отобранных по высокой ацидогенной активности в MRS , 26 обладают высокой

кислотообразующей способностью на средах, содержащих растительные отвары, мелассу, молочную сыворотку.

Для активного развития культуры молочнокислых бактерий в силосуемой массе одним из необходимых условий является способность микроорганизма сбраживать широкий спектр углеводов. На очередном этапе были отобраны штаммы, способные утилизировать максимум источников углеводного питания, накапливая при этом достаточно большое количество кислот.

Определение антагонистической активности лактобацилл к возбудителям порчи силоса позволило выявить штаммы, тормозящие в значительной степени рост нежелательной в силосе микрофлоры (таб. 2).

Таблица 2

Антагонистическая активность лактобацилл (диаметр зоны отсутствия роста тест-культуры , мм)

1'ест-культура

Штамм лактобацилл

401

К9

376а

3766

Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas sp. Proteus vulgariB Bacillus eubtilia Pénicillium sp. Aspergillus sp.

30-2,6 3*0,3 I0±I,3 8±0,9 5±I,7

4±0,5 15-2,3 10-1,9 I2±2,2

20-3,1

15*1,7 4±0,7 6±0,0

7±I,3 I0±I,7

5±I,0 5±0,8

- рост тест-культур отсутствовал

Интенсивное применение азотных удобрений часто приводит к избыточному накоплению нитратов в сельскохозяйственной продукции. В связи с этим при отборе штаммов лактобацилл, перспективных для включения в состав силосных заквасок, учитывали способность микроорганизмов к редукции нитратов. Модификация условий, способствующих деятельности молочнокислых бактерий по превращению нитратов, позволила многократно сократить сроки эксперимента и обнаружить способность к редукции нитратов у большего числа штаммов - активных кислотообразователей (таб. 3).

По совокупности изученных сеойств среди выделенных и поэтапно отобранных бактерий рода Ьвс^ЬвсШив наибольшей акти-

Таблица 3

Китратредуктазная активность лактобацклл

Среда : Штамм : Н03-, : К02", : рН : со2.

: мкг/мл : мкг/мл : 1 об. %

ВВЬ К9 564,3 с 4,6 2,5

376а 600,8 0 4,6 3,4

3766 600,2 0, 4,4 ' 4,3

377а 600,6 0 ' 4,4 3,1

3776 600,7 0 4,3 2,6

- 600,9 0 7,1 0,2

ВВЬ* К9 408,3 5,9 5,9 3,3

376а 321,9 9,5 5,9; 3,8

3766 320,7 38,7 5,8 5,3

377а 319,4 55,1 5,9 3,6

3776 401,2 48,7 5,9 3,6

— 608,1 0 6,9 0,3

* модифицированная среда ; . с следовое количество ; незасеянная среда

вностыо обладают штаммы 3766 и К9, идентичные виду Ь.р1авгагиш. Установлено, что Ь. р1а1^агиш К9 и 3766 характеризуются достаточно высокими показателями роста и ацидогенной активности при периодическом культивировании (рис. 2).

Использование отобранных штаммов бактерий рода ЬасгоЪаоШив для силосования кормов

Наиболее достоверным показателем эффективности микроорганизмов, отобранных для силосования, служит получение корма высокого класса при использовании их в качестве заквасок.

Для приготовления силосных заквасок на основе отобранных штаммов лактобацилл были отработаны условия культивирования 1. р1ахИ;агшп К9 на среде, содержащей в качестве источников углеводов молочную сыворотку, растворимый 1фахыал; культивирования I. р1аг^агит 3766 на среде, содержащей молочную сыворотку или мелассу; инокулирования полученной микробной суспензией простерилизованного гамма-облучением травяного носителя (Котелев, Островцова и др.). Полученную закваску вносили из

а б

Рис. 2. Кривые роста (•-•),,накопления биомассы (■-■ ), активной (♦-♦ ) и титруемой

-* ) кислотности при периодическом культивировании штаммов ь. р1в1гЬагит К9

м и МВЯ

расчета 100 - 200 г на тонну силосуемого сырья.

Результаты модельных опытов по силосованию кукурузы, выращенной на разных дозах азотных удобрений, показали, что внесение заквасок на основе штаммов plantarían К9 и 3766 позволяет снизить содержание нитратов в еидо<?е при сохранении его высокого качества. Установлено, что использование химических нонг-сервантов ЕИК-1, АИВ-2, БК способствует ингибироранию процесса редукции нитратов в силосе (таб.'4).

Таблица 4

Содержание нитратов в исходной зеленой маесе кукурузы и силосе из нее ( мг/кг сухого вещест!а)

Доза азотных удобрений, кг д.в. на I га

Срок хранения силоса, дни

: 3 : 60 90 : ¡80

Исходная зеленая -

масса 480,1

Силос:

Контроль (без кон-

сервантов) 388,5 330,4 318,7 316,4

ВИК-1, 5 л/т 456,8 478,6 463,5 450,1

К9, 200 г/т 319,9 '282.5 281,2 280,1

3766, 200 г/т 295,0 280.Í 280,7 262,3

Исходная зеленая

масса 891,3

Силос:

Контроль (без кон-

сервантов) 578,3 501,6 380,2 262,1

ВИК-1, 5 л/т 705,2 600,7 . 606,0 520,2

АИВ-2, 6 л/т - 612.0 536,6

БК, 7,5 л/т - «V 64g,2 561,7

Биосил , 20 г/т 562,3 458,5 338,8 25Q.2

К9, 200 г/т 484,7 339,4 281,0 210,9

3766, 200 г/т 474,4 398,6 314,8 234,5

120

200

определение не проводилось

Таблица 5

Биохимическая характеристика силоса из галеги после трех месяцев хранения

: : Сухое :Суыма ор- : Соотношение кислот ¡Аммиачный: Каро- : Азот

: : вещее-:ганических:молоч_ '-уксус- :масля-:аз0Т• % : тин : «играть

Вариант : рН : тво, :кислот, % :ная :ная :ная :от сухого:---

: : % :от сухого :-:вещества ;мг на кг сухого

: : .-вещества : % от суммы : : вещества

Контроль (без кон-

сервантов 6,0 17,6 10,9 60,8 28,9 10,3 0,21 20,3 15,1

ВИК-2, б л/т 4,2 20,7 10,0 66,3 33,6 0 0,01 33,9 18,6

АИВ-2, 6 л/т 4,1 19,9 12,2 73,7 24,7 1,6 0,05 : : 36,3 18,3

БК, 12 л/т 5,4 20,7 7,2 71,8 26,2 2,0 0,08 22,5 18,5

К9, 200 г/т 4,2 20,9 10,1 76,5 23,5 0 0,09 . 58,0 12,5

3766, 200 г/т 4,3 19,8 13,2 77,0 23,0 0 0,09 57,0 13,0

Результатами модельных и производственных опытов доказана фективность использования штаммов L. plantагиш К9 и 3766 и силосовании кукурузы, злаковых трав, бобовых растений, бо-1БО-злаковых травосмесей. Отмечается лучшая сохранность каро-ма, увеличение доли молочной кислоты в силосуемой массе (таб. . Силос с заквасками на основе этих микроорганизмов по сох-яности основных питательных веществ не уступает используемым практике силосования химическим и бактериальным консервантам.

По данным Витебского ветеринарного института, при скармли-1нии бычкам силоса с минэобной закваской на основе L. planta-ш К9 и 3766 получен положительный эффект.

Результаты настоящих исследований позволяют рекомендовать 'аммы Ь. plantarura 3766 и К9 для силосования различного рас-¡тельного сырья. Их высокая эффективность при использовании в 1Честве силосных заквасок убеждает в правильности выбранной :емы отбора перспективных %ля силосования кормов культур исто-юкислых бактерий.

вывода

1. Создана разнообразная по видовому составу коллекция ба-?ерий рода Lactobacillus , выделенных из микрофлоры силосуемых эрмов Беларуси, штаммы которой могут быть использованы в каче-гве эталонов при идентификации выделяемых из подобных субстра-)в лактобацилл, а также при подборе культур для силосных зак-1COK.

2. Предложен ключ для дифференциации лактобацилл, выделяе-к из микрофлоры силосуемых кормов. Ограниченный набор видов и знотипических характеристик, отсутствие хемотакеономических эизнаков в ключе существенно ускоряют и упрощают процесс иден-4фикации. Ключ апробирован при установлении видовой принадлежат : большинства представителей рода Lactobacillus , обнаружи-аемых в микробном ценозе силосуемых кормов.

3. Выделенные штаммы молочнокислых бактерий по морфологи-зским, культуральным, физиолого-биохиыическим свойствам отне-гны к восьми видам - представителям трех групп лактобацилл : Элигатным гомоферментативным (L. yamanashienBie ), факуль-ативным гетероферментативным ( L. caaei subsp. casei, I.easei jbep. rhamnosus, L. coryniformis eubsp. coryniformis, L.plan-irum ) и облигатным гетероферментативным (L. brevia, L. humeri, L. fermentum, L. vaccinoste^cus ).'Виды1>. ysmanaehi -

ensis и L. vaccinostercus из силосуемых кормов выделены впервые*

4. Установлено, что некоторые выделенные из растительных источников штаммы бактерий рода Lactobacillus обладают нитрат-редуктазной активностью, проявляющейся в условиях минимального содержания глюкозы в среде и высокого начального значения рН. Модификация условий, способствующих превращению нитратов молочнокислыми бактериями позволила сократить длительность эксперимента и обнаружить нитратредуктазную активность у большего числа лактобацилл - активных кислотообразователей.

5. На основании скрининга по активности роста, энергии ки-слотообразования, спектру сбраживаемых углеводов, проявлению антагонизма лактобацилл к возбудителям порчи силоса отобраны штаммы L. plantarum К9 и 3766.

6. Использование бактериальных заквасок на основе штаммов lu plantarum К9 и 3766 для силосования кукурузы, выращенной на разных дозах азотных удобрений, способствует снижению содержания нитратов при сохранении высокого качества силоса.

7. В условиях модельных и производственных опытов доказана эффективность использования штаммов L. plantarum К9 и 3766 при силосовании кукурузы, злаковых трав, галеги, бобово-злако-вых травосмесей. Применение заквасок на основе этих микроорганизмов при закладке силоса в хозяйствах Могилевской, Витебской областей способствовало получению корма I класса.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Буряко И.А., Стефанович Л.И., Гребенко В.В. Подбор молочнокислых бактерий для силосования кормов// Микроорганизмы в сельском хозяйстве: Тез. докл. Респ. конф,- Кишинев, 1988. -С. 186-187.

2. Буряко И.А. О классификации молочнокислых бактерий// Эволюция и систематика прокариот: Тр. I Всесоюз. школы-конф. мол. ученых. Пущино, 1988. Деп. в ВИНИТИ 25.01.90. №511-1390.-G. 54-56.

3. Буряко И.А. Эффективность бактериальных препаратов при консервировании растительного сырья// Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов: Тез. докл. 1У Респ. научно-теор. конф. мол. ученых и специалистов-микробиологов.- Тааадчг 1989.- С. 39.

4. Зименко Т.Г., Буряко И.А., Лазарева Г.И. Подбор И

пользование микроорганизмов для консервирования кормов и профилактики диспепсии у телят// Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных: Тез. докл. Всесоюз. конф,-Ташкент, 1989.- Ч.1.- С. 77.

5. Буряко И.А., Богдановская Ж.Н., Гребенко В.В., Стефанович Л.И., Ковалева Г.И., Редько Н.В., Мясников Г .Г., Еанинская Ю.М. Влияние химического и бактериальных препаратов на качество и микрофлору силоса из овсяницы тростниковой// Вопросы полно -ценности кормления сельскохозяйственных животных и качество кормов.- Горки, 1990.- С. 40-^5.

6. Буряко И.А., Стефано.лта Л.И., Богдановская I.H., Ковалева Г.И., Редько Н.В. Выделение и отбор молочнокислых бактерий - компонентов биоконсервантов растительного корма//Микро-бкологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства: Тез. докл. Всесоюз. конф. - . Агма- Ата, 1990.- Сек.1.- С. 15.

7. Стефанович Л.И., Буряко И.А., Богдановская Ж.Н., Гребенко В.В., Ковалева Г.И., Редько Н.В. Микрофлора и качество силоса из разнотравья при внесении биологического консерванта// Микробиологические и биотехнологическиэ основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства: Тзз. докл. Всесоюз. конф,-Алма- Ата, 1990.- Сек. I.- С. 79.

8. Гребенко В,В., Богдановская Ж.Н., Стефанович Л.И., Буряко И.А. Использование биопрепарата для консервирования кормов// Микробиологические и биотехнологические основы интенси- • фикащ'и растениеводства и кормопроизводства: Тез. докл. Всесоюз. кскф,- Алма-Ата, 1990.- Сек. I.- С. 23.

9. Буряко H.A., Беликова В.Л., Зт.'менко Т.Г,, Стефанович Л.И. Идентификация лгктобацилл силоса// Известия АН БССР. Сер. биол. наук.- 1991,- И.- С. 45- 49.

Ю- Буряко И.А., Стефанович Л.И,, Зименко Т.Г., Богдановская Ж.Н., Орлова Л.А., Гребенко В.В., Ковалева Г.И. Консервирование трудно сил о суемых растений с использованием бактериальных заквасок// Микробиология в сельской хозяйстве: Тез. докл. II Респ. конф,- Киэинез, 1991,- С. 103.

II. Заявка на получение авторского свидетельства №4901999/ 13/004801, п/р от 30.05.91. Штамм бактерий Lactobacillus plan-terum 3766, обладающий нитратредуктаэной активностью, и используемый 1фи силосовании кормов/ Буряко И.А., Стефанович Л.И., Гребенко В.В.,Богдановская Ж.Н;,Зиь,енко Т.Г.„Беликова В.Л.и др.