Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента"

□03485739

Гришин Дмитрий Викторович

Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбннантного штамма-продуцента

Специальность: 03.00.23 - «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-3 ДЕК 2009

Москва-2009

003485739

Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) Федерального агентства по образованию РФ, на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология».

Научный руководитель: - Никитин Александр Викторович,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппонеиты: - Миронов Александр Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор -Бибикова Маргарита Васильевна, доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии РАСХН»

С

Защита состоится 2009 г. в ¡2 "часов на заседании объединенного

диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им.Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9, ауд. 443.

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном цешре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан « 2.0 ■» 2009г.

Учёный секретарь диссертационного совета

ДМ 212.204.13

кандидат технических наук / — ШакирИ.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Фермент лактаза (р-галактозидаза), расщепляющий лактозу молока имеет особое значите в раннем детстве, так как дисахарид лактоза, содержащийся в молоке является основным источником галактозы, которая участвует в синтезе галактоцереброзидов, необходимых для нормального развития ЦТ 1С и сетчатки глаза. Уменьшение количества лактозы и производных её гидролиза может послужить развитию синдрома мальабсорбции (СМА), который выражается, в частности, в недостаточности лактазы и в сопряжённом с этим состоянием лактозонепереносимости [Ладодо К.С., 2000]. Наиболее эффективным способом профилактики и лечения СМА, является промышленное создание безлактозных продуктов, либо приём ферментных препаратов (мезофильная р-галактозидаза), расщепляющих лактозу.

Получение безлактозных молочных продуктов до сих пор остаётся достаточно трудоёмким процессом, базирующимся на длительном осаждении белка обезжиренного молока, растворении осажденного белка в щелочи или растворах щелочных солей и последующей распылительной сушке, после которой экстракцией специально подобранными растворителями удаляют собственно лактозу.

Получение ферментных препаратов для гидролиза р-галактозидов также сводится к трудоёмкой химической очистке фермента, приводящей к его инактивации. Кроме того для использования в пищевой промышленности и медицине фермент должен нормироваться посодержанию ряда веществ, используемых для иммобилизации и элюции. Также, использование мезофильных ферментов, ограничено в тех случаях, когда производственный процесс необходимо проводить при повышенной температуре (выше 60°С).

Принципиально новым подходом к получению препаратов р-галактозидаз с улучшенными характеристиками является биотехнологический приём, называемый fusion - технологией или технологией слитных (химерных) конструкций, когда в одной рамке трансляции объединяются генные последовательности разных белков [Miller, R. С., Kilbiirn, D. G. et al., 1989; Gurvits,

l

I. В., УеШак1уогекауа в. А. е1 а1., 2007]. Использование подобной технологии позволило создать фермент, обладающий улучшенными свойствами: повышенной термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с биологически совместимыми субстратами, такими как декстран [СауаЫо Б. й а1., 2005].

Положения, выносимые на защиту. 1. Рекомбинагггная белковая конструкция ДСД-сп-р-ГАЛ содержащая декстрансвязывающий домен и каталитическую последовательность фермента термостабильной Р-галактозидазы и её штамм-продуцент. 2. Разработка методов очистки рекомбинангаых белков, основанная на сочетании использования термостабильности целевого продукта и его декстрансвязывающих свойств. 3. Созданный плазмидный вектор с регуляторными областями и геном химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ. 4. Декстран-белковый комплекс на основе белка ДСД-сп-р-ГАЛ и декстранового сорбента для гидролиза бета-галактазидов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось создание гибридной (химерной) рекомбинантной белковой конструкции ДСД-сп-р-ГАЛ, имеющей декстрансвязывающий домен и активность термостабильной бета-галактозидазы, её штамма-продуцента и исследование физико-химических свойств данного белка.

В соответствии с поставленной целью в процессе работа предстояло решить следующие основные задачи:

1. Получение мутантного гена ДСД го Лексолол7ос тезеп1его1с1е.<; со спейсером на С-конце.

2. Создание генной последовательности химерного белка ДСД-сп-р-ГАЛ. с геном ДСД и геном термостабильной р - галактозидазы из ТкегтоапаегаЬасХег акапоИсш, объединёнными через спейсер.

3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающего эффективную экспрессию химерного рекомбипангного белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

4. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп-Р-

ГАЛ.

5. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

6. Оптимизация условий получения комплекса декстрана и белка ДСД-сп-Р-

ГАЛ. для гидролиза бета-галактозидов.

Научная новизна. На базе концепции слитных генно-инженерных конструкций впервые был спланирован и сконструирован рекомбинантпый плазмидный вектор рвО-Ю, позволяющий осуществлять индуцированный биосинтез гибридного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, обладающего одновременно декстрансвязывающими свойствами и активностью фермента термостабильной р-галактозидазы.

Впервые были получены бактериальные продуценты конструкции ДСД-сп-р-ГАЛ Е.соИ[рСП-10], обеспечивающие экспрессию целевого белка на уровне 10% от тотального белка клеток.

Впервые была предложена высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ на декстрановом сорбенте, основанная на уникальных свойствах декстрансвязываницего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 90%.

Практическое значение работы. Разработанная схема получения штамма-продуцента химерного белка ДСД-сп-(3-ГАЛ, а также способ очистки и иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применение в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов для профилактики синдрома мальабсорбции. Также комплекс данной белковой конструкции с декстраном может быть использован в пищевой промышленности при реализации схем получения безлактозных продуктов.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 14 октября 2009г. на заседании кафедры ЭиПБ МГУИЭ. Основные результаты исследований были представлены на ХП Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7-14 сентября 2009, С 17., на VI Молодёжной науч. конф. «Биотехнология в

3

растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 5 апреля 2006 г. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, отражающих основное содержание работы.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 125 страницах; содержит 28 рисунков и 5 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждений, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 110 наименований и приложений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Создание бактериальных штаммов продуцентов белка ДСД-сп- В-ГАЛ

1.1. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего клонирование гена и экспрессии» белка LacZThEh

Одним из наиболее значимых ферментов в группе гликозилгидролаз является термостабильная ß - галакгозидаза из Thermoanaerobacter ethanolicus, кодируемая геном LacZThEh (ß-ГАЛ). Данный фермент способен продолжительно действовать при высоких температурах (65-80°С) и в широком диапазоне pH 5,0-7,5 [Volkov I. Yu. et al., 2005]. Поэтому ген этого белка был выбран в качестве одного из объектов наших исследований. Биоинформационные последовательности ß -галактозидазы аннотированы в банке данных UniProt под номером Y08557. Т.к. плазмида pQELacZThEh (pR624, любезно предоставлена сотрудниками, лаборатории МДиПС ВНИИСБ Сергиенко О.В. и Анисимовой C.B.) с геном ß -галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus ранее уже была получена на базе коммерческого вектора серии pQE, то нашей задачей, на данном этапе, явилось создание продуцента способного обеспечить эффективность клонирования и экспрессии гена дашюго белка в клетках Е. coli.

Плазмида pQELacZThEh была трансформирована в клетки Е. coli DH5a методом электропорации. Была изучена экспрессия генов белка ß - галактозидазы нпамма Е. coli DH5a (pQELacZThEh), что являлось одним из важнейших условий предстоящей генно-инженерной работы. Индукция экспрессии гена проводилась по стандартному протоколу фирмы Quagene. Однако изучение экспрессии с помощью электрофореза в 12% ПААГ по Лэммли показало отсутствие белковых

4

полос ожидаемого молекулярного веса. На основе анализа данных литературы, был сделан вывод о том, что эффективность гетеролошчной экспрессии гена белка LacZThEh в Е. coli оказалась более успешной при включении в состав среды LB, на время индукции ЮмМ СаС12, ЮтМ МпС12, увеличении доли индуктора Ull i Г с 0,1 до 0,5 мМ, а также при изменении времени индукции с 3 ч (при 37°С) до 15 ч (при комнатной температуре). В результате проделанной работы, нам удалось получить эффективный продуцент позволяющий выделил, в препаративных количествах методом щелочного лизиса плазмидную ДНК, с геном термосгабилыюй ß -галактозидазы, а также обеспечивающий экспрессию белка LacZThEh (ß-ГАЛ) на уровне 10 -15% от тотального белка штамма.

1.2. Создание бактериальиого штамма-продудента, обеспечивающего экспрессию белка DBD(Gly-Ser)5

1.2.1. Получение и клонирование гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides

ДСД (DBD - dextran binding domain) или декстрансвязывающий домен относится к группе карбогидратсвязывающих модулей (КСМ) это часть комплекса гидролитических внеклеточных ферментов ряда бактерий. В данном случае особый интерес представляет каталитический домен декстраисахаразы из Leuconostoc mesenteroides. Этот белковый домен интересен своей способностью специфически связываться с различными формами декстрана. Известно, что бактерии рода Leuconostoc {Leuconostoc Iactis, Leuconostoc dextraniewn и Leuconostoc mesenteroides) используются в пищевой промышленности в качестве заквасочных культур при производстве молочнокислых продуктов и квашеной капусты, поэтому в качестве источников микроорганизмов рода Leuconostoc могут служить различные пищевые продукты молочнокислого брожения.

Образцы квашеной капусты и простокваши суспендировались в жидкой селективной питательной среде (сахароза 100г/л; дрожжевой экстракт 2,5 г/л; К2НР04 5 г/л; (NH4)2S04 0,2 г/л; MgS04x7H20 0,2 г/л; NaCl 1,0 г/л.) в которую засевались порции соответствующего образца. Далее, после 18 ч. инкубации (26°С, 150 об/мин), аликвоты из выращиваемого объёма переносились на 2% агаризованную питательную среду того же состава и инкубировались в течение 48 ч. при 26°С [Dimic G. R-, 2006]. Целевые колонии, образованные бактериями рода

Leuconostoc имели вид слизистых опалесцирующих капель. После скрининга, изолированные клоны выращивались в жидкой селективной среде, для последующего выделения хромосомной ДНК методом. Ген декстрансвязывающего домена был получен благодаря ПЦР, с помощью прямого и обратного праймеров (искусственно введённые сайты рестрикгаз подчёркнуты), фланкирующих генную последовательность ДСД, при этом в качестве ДНК матрицы использовалась хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides, выделенная методом фенол-хлороформной экстракции. В работе использовались олигонуклеотиды, синтезированные в ЗЛО «Сшггол» и ЗАО «Евроген»:

GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCACaAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAA

Ncol BamHI

RavGBD AGACTAAGATCTGGCTGACACAGCATTTCCATTÄTTATCAAA Bglll

Для клонирования продукт амплификации встраивался в коммерческий вектор pQE6 (Quageen, USA), методом лигирования полученных рестрикционных фрашентов по сайтам рестрикции Ncol, Bglll/BamHI. Затем полученная плазмидная ДНК (pQEDBD) (Рис. 1.) выделялась из трансформантов методом щелочного лизиса, после чего нуклеотидная последовательность целевого гена была подтверждена с помощью рестрикционного анализа и секвенирования на автоматическом секвеиаторе.

Promoter SD Mat. Peptide Terminator —

Рис. 1. - Организация генно-инженерной конструкции с геном ДСД (DBD) в плазмиде pQEDBD.

1.2.2. Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД из

Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-коиде.

1.2.2.1. Получение гена ДСД из Ьеисопо81ос mesenteroides со спейсером на С-конце и создание экспрессиояных векторов, содержащих ген белка РВР(С1у-

Декстрансвязывающий домен, используемый в наших исследованиях должен быть пространственно удалён от бета-галактозидазы, что требует наличия ряда отличий от ДСД, аннотированного во Всемирном генбанке. Прежде всего, отличие заключается в необходимости присутствия на С-конце аминокислотной последовательности белка глицин-серинового спейсера (С1у-8ег)5, который необходим для пространственного разделения различных функциональных доменов. Создание гена ОВВ(С1у-8ег)5 или иначе ДСД-сп, кодирующего белок ДСД и глищщ-сериновый спейсер (сп), осуществлялось в два этапа методом «праймеропосредованной прогулки», при этом происходило постепенное наращивание С-концевой спейсерной последовательности для чего были спланированы следующие корректирующие праймеры:

(ШЛИЕ ССАСССССАТ6СА1(КСАТССАСАААТСАСТАТТАТСААТТАССА6АТСЙТААА

RevDBn-l: 5' -GGAGCCAGAACCCGGGGATCTTGCTGACAC-3'

ReVDBo-2: 5' -AACTAAGCTTÄGATCTGGCGCCAGAACCGGAACCAGAGCCGGAGCCAGAACC- 3'

На первом этапе «праймеропосредованной прогулки» использовались праймеры ОВВ111; и Кеупв[)-1, на втором - вВВ! и Яеусвс-2, последний спланирован внахлёст с Ясу0во-1. В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали плазмидную ДНК рСЗЕБВБ в ко!щентрации 0,3 мг/мл.

Seri5.

Hcol

BamHI

HindXII Bglll

Promoter SD Mat. Peptide Spacer Terminator

Рис. 2. - Организация генно-инженерной конструкции рОЕВВОйр.

Далее, по сайтам рестрикции Ncol и Hindlll скорректированный ген ДСД, был интегрирован в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA), в процессе чего была сконструирована экспрессионная плазмида pQEDBDsp (Рис. 2.). В результате манипуляций был получен плазмидный вектор содержащий скорректированный ген ДСД с С-концевым спейеером.Идентичность клонированного в составе вектора pQEDBDsp гена ДСД-сп (размер гена ~ 500 н.н.) была подтверждена с помощью ПЦР (рис. 3), посредством использовавшихся ранее прямого (GBD11F) и обратного праймеров (Revgal), при тех же параметрах ГПДР.

Рис. 3. - Электрофорез ПЦР продуктов в 1% агарозном геле.

¡.Отрицательный контроль (MQ, Тац полимераза 5 ед.ак); 2.0трицательный контроль (pQE6, Taq полимераза 5ед.ак); 3. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп, проба №1 (500 п.н.); 4. ГПДР продукт гена белка ДСД-сп, проба №2 (500 п.п.); 5. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп, проба №3 (500 п.н.); 6. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп, проба №4 (500 п.н.); 7. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп, проба №>5 (500 п.н.); 8. Маркер мол. веса (100 Ь.р.).

1.2.3. Создание бактериальных продуцентов белка DBD(Gly-Ser)5.

Плазмида pQEDBD(GIy-Ser)5 (или pQEDBDsp) была трансформирована в клетки Е. coli DH5a методом электропорации. Была проверена возможная экспрессия генов химерного белка в штамме Е. coli DH5a. с помощью ИПТГ. j Анализ экспрессии на основании электрофореза в 17% ПААГ по Лэммли показал Присутствие белковых полос ожидаемого молекулярного веса 16 кДа с уровенем экспрессии 25-30% от тотального белка клетки (Рис. 4.).

Рис. 4. - Анализ экспрессии белка ДСД-сп в клетках Е. coli DH5a. (электрофорез в 12% ПААГ по Леммли). I) Маркер молекулярного веса, лизоцим 14 кДа, 2) Е-

соЧ DH5a. [pQEDBDsp], образец№1, индукция - 16,0 кДа,

3) Е. coli DH5a. IpQEDBDsp], образец№2, индукция - 16,0

кДа, 4) Е. coli DH5a. ipQEDBDsp], образец№1, до

индукции, 5) Е. coli DH5a [pQEDBDsp], образец№2, до

индукции.

1.3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающею экспрессию химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ в цитоплазме клеток Е. coli.

1. 3. 1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка ДСД-сп-В-

ГАЛ.

Для создания экспрессионной плазмиды pQEDBDspLaeZThEh (далее pGDIO) с геном целевого химерного белка ДСД-сп-рТАЛ было осуществлено лигирование плазмидной конструкции с геном термостабильной бета-галактозидазы pQELacZThEh гидролизованной эндонуклеазами рестрикции BamHI/Bgll и плазмидного вектора с геном ДСД со спейсером pQEDBDsp, гидролизованной рестриктазами Bglll/Bgll. Процессы дальнейшего лигирования. молекулярного субклонирования в E.coli DH5a и выделения плазмидной ДНК проводились по стандартным методикам [Маниатис Т. и др.. 1984].

Идентичность клонированного в составе вектора pGD-10 гена ДСД-cn-ß-ГАЛ размером 2683 п.н. была подтверждена с помощью рестрикционного скрининга, секвенирования на автоматическом секвенаторе MegaBacelOOO iAmersham Bioscience corp.. США) (ЗАО Евроген), а также посредством полимеразно-цепной реакции, в присутствии прямого (GBD11F) и обратного ираймеров (Revgal):

GBD11F 5' CCACCGCCftTGGRTGSRATCCACAAATCAGTÄTTATCAÄTTAGCAijATGGTARA 3' Revgal. 5' GAGAAGACGRAAGGGCCTATAACGCCTATTTTTATASGTTAAAATS 3'

1 2 3 4 5 6 7 Пл

{

л.»

Рис. 5. - Электрофорез ПЦР продуктов в 1% агарозном геле.

1. ПЦР продукт гена белка ДСД-еп-Р-ГА.П. проба (268? п.н.); 2.

Отрицательный контроль (рОЕб. Тач полимераза): 3. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп-Р-ГАЛ. проба №2*(2683 п.н.); 4. Отрицательный контроль (рС?Е6, Тач полимерам); 5. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп-(3-ГАЛ. проба №3 (2683 п.н.); 6. Отрицательный контроль (рОЕб. Тац полимераза); 7. Маркер мол. веса (фаг лямбда ЕсоШ/НцкШЬ

J; ш&шшныьшяш.

! е - i ■ кй ! - • Щ

Параметры амплификации: 95°С - 5 мин; (94°С - 20с, 67 °С - 30с, 72°С -2,5мин.)х30; 72°С - 5мин; 10°С - хранение. Режим амплификации - точный. Продукты амплификации детектировались в 1% агарозном геле (Рис.5). Таким образом была получена экспрессионная конструкция с геном целевого химерного белка (Рис. 6.).

Promoter SD DBD Spacer LacZThEh Terminator

Рис. 6. - Организация генно-инженерной конструкции pGDlO.

1.3.2. Создание бактериальных продуцентов гена белка ДСД-сп-В-ГАЛ.

Плазмида pGDIO была трансформирована в клетки Е. coli DH5a методом мектропорации. Была проверена возможная экспрессия генов химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ с помощью ИГПТ. Анализ экспрессии посредством электрофореза в 12% ПЛАТ' по Лэммли показал присутствие белковых полос ожидаемого молекулярного веса 102,3 кДа, однако, при этом уровень экспрессии был достаточно низок (менее 5% от тотального белка штамма). Известно, что уровень экспрессии многих белков варьирует в различных штаммах Е. coli. Также время индукции влияет на количество продуцируемого белка. Очевидно, что проверка возможного повышение уровня экспрессии белка ДСД-сп-ß-FAJI с помощью данных подходов просто необходима в рамках данной работы.

1.3.3. Оптимизация условий экспрессии белка ДСД-сп-Р-ГАЛ 1.3.3.1. Оптимизация времени индукции.

Для оптимизации индукции целевого белка в клетках нггамма продуцента мы варьировали время индукции (с 2 часов при 37 °С до 15 часов при комнатной температуре). В результате проведенных экспериментов оказалось, что увеличение времени индукции до 15 ч вызывает повышение уровня экспрессии (Рис.7.). Очевидно, что изменение времени индукции является одним из решающих факторов влияющим на уровень экспрессии целевого белка.

1.3.3.2. Оптимизация количества индуктора.

По данным литературы известно, что хромосомная ДНК клеток Th. Ethanolicus и L. mesenteroides имеет много сходного с клетками Е. coli, по количеству GC пар азотистых оснований. Для клеток Е. coli характерным является наличие примерно 60% GC.

Рис. 7. - Электрофорез в 10% ПААГ в присутствии SDS.

1. Штамм DH5a - до индукции, 2. Штамм DH5a [pGDIO] - до индукции, 3. Штамм DH5a - индукция,

4. Штамм DH5a [pGDIO] - индукция, 5. Штамм DH5a до индукции; термолиз (75°С, 45 мин), 6. Штамм DH5a [pGDIO] - до индукции; термолиз (75°С, 45 мин), 7. Штамм DH5a IpGDIO] - индукция; термолиз (75°С, 45 мин), 8. Штамм DH5a -индукция; термолиз (75°С, 45 мин), 9. Маркер мол. веса (Taq полимераза, 94,5кДа).

Таким образом, полученный нами химерный белок имеет оптимальные для £ coli кодоны и трансляция гена данного белка в этих клетках предельно эффективна. Поэтому, кроме времени индукции на этот процесс может значительно повлиять в основном лишь конечная концентрация индуктора. Как и в § 1.1. было показано значительное улучшение продукции белка при увеличении количества индуктора ИПТГ с минимальных конечных, значений 0,1 мМ до максимальных - 0,5мМ.

1.3.3.3. Оптимизация ионного состава ростовой среды.

Анализ экспериментальных данных из § ). 1., показывает то, что эффективность гетерологичной экспрессии гена белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, также должна быть выше в присутствии ионов двухвалентных металлов (Са2+ и Мп2+), как уже было отмечено ранее это, вероятно, связано с тем, что данные ионы находятся в составе простетических групп фермента, определяя правильный фолдинг (нространственную укладку) конечного белкового продукта.

В соответствие с полученными данными в состав ростовой среды LB, на время индукции включали ЮмМ СаСЬ, ЮтМ МпС12 и 0,5 мМ ИПТГ, а также увеличили время индукции с 3 до 15 ч., при этом была получена экспрессия рекомбинантного белка на оптимальном уровне 10% от тотального белка клетки. Таким образом, был создан штамм-продуцент белка ДСД-сп-ß-rAJl и были оптимизированы условия его экспрессии.

2. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп-р-

ГАЛ.

2.1. Анализ растворимости и термостабильности белка ДСД-сп-6-ГАЛ в лизатах клеток Е. coli штамма РН5а.

Рис. 8. - Анализ растворимости белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, экспрессия в Е. coli DH5a в 10% ПААГ с SbS. 1. Штамм Е. coli DH5a индукция, без термолизиса, 2. Штамм DH5a IpGDIO] - до индукции, без термолизиса, 3. Штамм DH5a [pGDIO] -индукция, без термолизиса, 4. Штамм DH5a IpGDIO] супернатант, индукция, термолизис (75°С, 45 мин), 5. Шгамм DH5a [pGDIO] - супернатант, до индукции, термолизис (75°С, 45 мин), 6. Штамм DH5a [pGDIO] - осадок, до индукции, термолизис (75"С, 45 мин), 7. Штамм DH5a [pGDlOJ -осадок, индукция, термолизис (75°С, 45 мин). 8. Маркер мол. веса (Taq полимераза, 94,5кДа).

IKJKM

Для анализа физико-химических свойств белка ДСД-сп-р-ГАЛ была изучена его растворимость в клетках Е. coli штамма DI 15а (Рис. 8.). Суть метода заключается в изучении распределения целевого белкового продукта между осадком и супернатантом, после термолизиса и последующего осаждения. Изучение растворимости белка ДСД-сп-р-ГАЛ в клетках Е.coli штамма DH5a показало, что химерный белок синтезируется на 70% в растворимой форме (Рис.8, трск№4).

Поскольку одной из функциональных составляющих полученного белка является аутентичная аминокислотная последовательность термостабильного

фермента бета-галакгозидазы, поэтому функция термостабильности является доминантной и переходит на химерный белок в целом. Для доказательства этого предположения клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции и термолизу в течение 45 мин. при 75°С с последующим осаждением в поле центробежных сил, после чего собирали супернатант (растворимая фракция белка). Т.к. растворимость белка при термолизе составила порядка 70 %, это говорило о его выраженной термостабильности (рис 7; 8).

2. 2. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-В-ГАЛ в лизатах клеток Е. coli штамма РН5а.

Благодаря термостабильности полученного белка для изучения его свойств не требовалось прибегать к сложным системам очистки. Осадок клеток был заморожен, затем ресуспендирован в рабочем буфере «В» (10 мМ Tris-HCl, рН7.4; MgCl2 10 мМ; ZnCl2 1 мМ ; EDTA 1 мМ; ß-меркапгоэтанол 1 мМ; 0.1% Tween 20; 0.1% (v/v) Triton Х100) с лизоцимом в концентрации 1мг/мл, после чего был повторно заморожен при -70°С, что способствовало более полному и мягкому разрушению клеточных структур для освобождения целевого продукта. После дашшх манипуляций лизат клеток был прогрет в течение 45 мин. при 75°С и после осаждения при центрифугировании в супернатанте присутствовал целевой белок в достаточном количестве для изучения его ферментативной активности. Из литературных источников известно, что наиболее высокую удельную активность после лактозы фермент ß-галактозидаза проявляет на бесцветном химическом субстрате ОНФГ, который в её присутствии гидролизуется до галактозы и окрашенного в желтый цвет о-нитрофенила, количество которого можно измерить на спектрофотометре по поглощению при 420 нм. Экстраполируя эти данные на полученный химерный белок ДСД-сп-р-ГАЛ было решено изучить субстратную специфичность и его ферментативную активность на хромогенном гомологе лактозы - ОНФГ. При этом аликвоты супернатанта с нашим белком инкубировались в присутствии ОНФГ (4 мг/мл) в течение 1.5 мин., 30 мин., 1 ч., 2 ч. при 25, 55 и 75°С, при широком диапазоне pH (4,5 - 9,0). В ходе развития желтого окрашивания реакция прерывается добавлением инакгаватора IM Na2C03. В каждой пробирке с соответствующим разведением белка измеряем оптическую

плотность при Х= 420 нм. Измеряемая величина складывается из поглощения о-нитрофенола (420нм) и рассеяпия света клетками (бООнм) [100]. Используя эти данные, можно вычислить истинное поглощение о-нитрофенола, или - в условных единицах - активность фермента в 1мл раствора (а), по следующей формуле:

t*V*D

' r "wo

где D420- измеренные значения для реакционной смеси, D«» отражает плотность клеточной суспензии перед определением, 1000 - из расчёта того, что при полной индукции получается около 1000 ед. активности, t - время реакции в мин. и « -объём культуры, взятой для определения, в мл. Эта величина пропорциональна увеличению количества о-нитрофенола в 1 мин. на одну бактериальную клетку [Craven GJR. et al., 1965]. Таким образом, была изучена удельная р-галактозидазная активность белка ДСД-сп-Р-ГАЛ в динамике, которая составила 5 ед.ак./мкл, при этом было доказано, что максимальная его активность сохранялась в широком диапазоне рН, даже в ходе 2-х часовой инкубации при 75°С.

23. Хроматографвгческое выделение белка ДСД-сп-В-ГАЛ и изучение его декстрансвязывающих свойств.

Данное исследование являлось чрезвычайно важным этапом работы, т.к. оно позволило не только получить рекомбинантный белок ДСД-сп-р-ГАЛ в препаративных количествах, но и изучить его декстрансвязывающие свойства. Для планирования стратегии хроматографической очистки белка на ион ообмешшках был необходим расчёт изоэлекгрической точки и изучение аминокислотного состава нашего белка. Изоэлектрическая точка белковой конструкции была определена посредством программы для обработки биоинформационных последовательностей DNASIS v 2.5 Hitachi Software Endgineering Co., Ltd. и находилась в пределах 5,54. Кроме того, данный пакет программ позволил осуществить трансляцию нуклеотидной последовательности, что дало возможность изучить аминокислотный состав полученного белка: пол ожител ьчозаряженны е аминокислоты - Arg (R) - 4%; His (H) - 3,4%; Lys (К) - 6,8%; отрицательнозаряженные аминокислоты - Asp (D) - 7,4%; Cys (С) -1,0%; Glu (E) -6,8%; Туг (Y)-5,9%.

2.3.1. Катионообмениая хроматография

Выбор катионообменной хроматографии обусловлен достаточно высоким содержанием в целевом белке положительнозаряженных аминокислотных остатков. Ионообмен проводили на катионообменной смоле CM-Toyopearl (Tosoh Bioscience LLC). Элюированный градиентом соли (ОМ - 1,0 М NaCl в рабочем буфере) белок обессоливали посредством гельфильтрации на полистирольном сорбенте HW50-Toyopearl (Tosoh Bioscience LLC) после чего он был осаждён высаливанием с помощью ЗМ (NH^SC^ с последующим досаждением в поле центробежных сил (10 мин., при 4000 об/мин). После измерения массы полученного белкового осадка его растворяли в конечном буфере Buf.B (рН7,4), до конечной концентрации 1 мг/мп.

2.3.2. Изучение декстрансвязывающих свойств целевого белка.

; j I

I : -i ь t.^óc.

Рис.9 - Изменение оптической плотности (OD) от времени контакта сорбента с I раствором белка.

I

j Сорбционную активность исследуемого белка по отношению к декстрану

j проводили в статических условиях, для чего сорбент (декстран Sefhadex G75) в количестве 0,5 г смешивали с 5 мл раствора белка в Buf.B, полученного после катионообменной хроматографии (1,0 мг/мл). Сорбент оставляли в контакте с раствором на 0,5-6,0 часа (37°С) при перемешивании. Затем, суспензию помещали в микроколонку "(100x10мм), продолжая инкубацию. При этом периодически элюировали самотёком по 1 мл раствора через нижний штуцер микроколонки, провода определение содержания в пробах остаточного белка методом Бредфорд с

использованием калибровочных кривых [Bradford М.М., 1976]. OD растворов изучали методом колориметрии по изменению оптической плотности при длине волны 595 нм. На рис. 9. показана зависимость оптической плотности от времени контакта образца сорбента с раствором белка, на графике видно, что оптическая плотность исследуемых образцов (элюатов) со временем уменьшается, что говорит о способности химерного белка, за счёт наличия в нём декстрансвязывающего домена сорбироваться на декстране.

Рис. 10 - Изотерма адсорбции исследуемого белка.

Оптимальное время адсорбции белка составляет около 4-6 час. Дальнейшее контактирование сорбента с раствором белка не дает существенных изменений оптической плотности.

I

Адсорбционную емкость сорбентов определяли по формуле:

(2) ;

т

\ I

где Сн - начальная концентрация белка в растворе, мг/л;

I

Ск - конечная концентрация белка в растворе, мг/л;

т - навеска сорбента, г; I

I

V - объем раствора белка, л.

Изотерма адсорбции образца белка, рассчитанная исходя из экспериментальных данных показана на рис.10.

Степень связывания белка из раствора определяли по формуле:

а - —-С-*100% (3)

Си

Проведенные исследования показали, что степень связывания белка декстраном составила о ~ 62%, что говорило о эффективности аффинного связывания рекомбинантного белка ДСД-сп-р-ГАЛ с декстраном.

3. Изучение степени очистки белка Ж'Д-сн-и-1 АЛ посредством аффинной хроматографии на декстране.

На колонку (100x10мм) с сорбентом (декстран Sefliadex G75) уравновешенную Ви/.В наносили 2 мл лизата клеток с белком. Сорбент оставляли в контакте с лизатом на 4,0 часа (37°С). Затем, колонку отмывали от клеточного дебриса тремя объёмами рабочего буфера, аффинно связавшийся на сорбенте белок злюировали с колонки градиентом NaCl 0-ЗМ.

При скорости элюирования 20 см3/ч проводили сбор фракций (X = 250 нм). Для выявления целевой фракции наносили по 12 мкл каждой на 12% ПААГ в присутствии SDS с окраской по Кумасси. Далее, после объединения фракций с максимальным количеством белка освобождались от NaCl при помощи гельфильтрации. На следующем этапе белок концентрировали высаливанием до концентрации 1мг/мл. На конечном этапе производилось сравнительное исследование степени очистки белка в 10% ПААГ, после катионообменной и аффинной хроматографии (рис.11).

Рис. 11. - Сравнение методов очистки белка, в 12% ПААГ с SDS.

1. Штамм К coli DH5a - индукция (2мкл),

2. Штамм DH5a [pGDIO] - индукция, после хроматографии на СМ-Toyopearl, 3. Штамм DH5a [pGDIO] - индукция, после аффинной хроматографии на декстране, 4. Штамм Е coli DH5a - до индукции (4мкл).

ЛСД *<п - ß-ГАЛ

Сравнительное исследование показало высокую константу связывания химерного белка с декстраном в широком диапазоне ионной силы (О-ЗМ ЫаС1), а также преимущества 1а§-аффминой хроматографии на декстране над катионообменной, т.к. степень очистки в первом случае составила 90%, что на 2025% выше, чем после катионообмена.

4. Сравнение зависимости ферментативной активности белков ДСД-сп-Р-ГАЛ и 1,асгТЬЕЬ от времени, рН и температуры.

На данном этапе исследования, относительно положительного контроля, в качестве которого выступала термостабильная бета-галактозидаза ТкегтоапаегоЬаЫег егкапоНсш (LacZThEh), были получены графические зависимости активности очищенного рекомбинантного фермента ДСД-сп-Р-ГАЛ от таких физических характеристик как температура, время и рН среды (рис.12). При этом, за 100% активности была принята активность бега-галактозидазы Ьас/1ЪЕЬ.

рассчитанная при 15 мин. инкубации

к UcZTta. ДСДлЫ"»Л

р" т

ее

субстратом ОНФГ.

jotsao МО so 60 40 20 0

к дедспычл

8 10 12 fin* (не)

И Я » SS ts 70 7S W ts » 9S 180 l°C

Рис.12 - Сравнительные графические зависимости (а) - активности белка ЛСЛ-сп-В-ГАЛ я тег>моста5нлшой В-галактознлазы LacZIhEh от концентрации водородных ионов: (б) - активности бежа ЛСЛ-сп-В-ГАЛ н теомостабилшон Бггалакгазндазы LacZIhEh от температуры; (в) - активности бежа ЛСЛ-сп-Б-ГАЛ и теямостабильной В-галактознлазы LacZIhEh от времени (65-70°С: рН7.4).

В опыте были определены зависимости активности ферментов от величины рН, времени и температуры. При этом было установлено, что максимальная активность фермента ДСД-сп-р-ГАЛ смещена относительно контроля в щелочную область (Ьас7ТЬЕЬ ) и наблюдается в диапазоне рН 7,0 - 8,0. При этом 70% и более активности сохранялось при рН 6,8- 8,2 (рис. 12а.).

Тип графической зависимости активности химерного фермента от его температурного оптимума сходен с таковым у положительного контроля, однако при этом, также наблюдается незначительное смещение линии графика относительно контрольного фермента (Ъас2'1ЪЕЬ).

При этом температурный оптимум полученной нами белковой конструкции незначительно уступал контролю и варьировался в пределах 60 - 75°С (рис.126.). В соответствие с полученными данными, рекомбинантный белок ДСД-сп-рТАЛ. по своей стабильности во времени, имел незначительные преимущества перед контрольным образцом, сохраняя высокие показатели активности после 5-ти часовой инкубации (при оптимальных для него условиях: 65-70°С: рН 7.4), однако по прошествии этого периода, практически дублировал данные полученные для контроля (рис.12в.).

5. Оптимизация условий получения комплекса декстрана и рекомбинантного белка ДСД-сп-д-ГАЛ,

Завершающим этапом данной работы явилось создание модельной колоночной системы для ферментации бета-галактозидов, на базе комплекса декстрана и рекомбинантного белка ДСД-сп-р-ГАЛ,

Рис. 13. - Анализ лактазной активности комплекса декстрана и белка ДСД-сп-р-ГАЛ, посредством тонкослойной хроматографии.

1. К! (-) отрицательный контроль 1% лактоза. 2. К2 (-) отрицательный контроль 6% лактоза. 3. К! (+) положительный контроль смесь галактозы и глюкозы 5%. 4. К2 (+) положительный контроль смесь галактозы и глюкозы 6%. 5. Опытный образец (лактоза (1%) + декстран-белковый комплекс). 6. Опытный образец (лактоза (6%) + декстран-белковый комплекс).

Использование в составе химерной конструкции ДСД позволяет не только эффективно выделить и очистить белок от примесей штамма продуцента, но и иммобилизовать его на декстране посредством аффинного взаимодействия декстрансвязывающего домена. Принимая в расчёт данные, полученные в

исследованиях, проведённых на предыдущих этапах, для исследований была выбрана колонка (100x10мм), которая заполнялась сорбентом (декстран Sefhadex G75) и уравновешивалась Buf.B. На колонку наносили 2 мл раствора белка (1 мг/мл), оставляя белок в контакте с сорбентом в течение 4,0 часов (37°С). Затем, колонка отмывалась тремя объёмами рабочего буфера, который полностью удалялся с последующим подсушиванием комплекса в колонке, после чего через колонку с декстран-ферментпым комплексом последовательно пропускались растворы 1 и 6% лактозы, (t=60-65°C). Собранные элюаты с продуктами расщепления лактозы оценивались посредством тонкослойной хроматографии (ПТСХ-АФ-А-УФ "Merck") (рис.13). На следующем этапе через расконсервированную колонку, при тех же условиях, были пропущены растворы ОНФГ (0,4мг/мл) и Xgal (1мг/мл). После прохождения через декстран-белковый комплекс, в ходе гидролиза хромогенных субстратов, образовывающийся в случае ОНФГ - 2-нитрофенол, окрашивал элюат и декстран в колонке в насыщенный жёлтый цвет, в то время как накапливающийся в результате гидролиза Xgal - 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго, придавал декстрану и элюату голубой оттенок. Пропускание через колонку 50 объёмов раствора лактозы и ОНФГ при скорости элюции 10 см3/ч и температуре 65°С не приводило к значительному снижению эффективности ферментативного гидролиза бета-галактозидов, при этом значения расчётной удельной активности в опытах приближались к первоначальному уровню и в пересчёте на массу фермента в декстран-белковом комплексе соответствовали 3-5 ед/мкг, это следовало из того расчета, что адсорбционная ёмкость, исследованная ранее составляла 6,2 мг белка на 1г сорбента, т.е., учитывая реальный коэффициент гидратации сорбента (15-20 мл/г) - 0,2 - 0,4 мкг белка на 1 мкл водного декстрана. Также в процессе проведённых нами исследований была рассчитана константа Михаэлиса-Ментен фермента в декстран-белковом комплексе, составившая Э^хЮ"4. Было установлено, что свободный химерный белок за период десятичасовой инкубации при 65-70°С, рН 7,4 и оптимальном ионном составе терял 50% своей активности, в то время как эта же белковая конструкция, но иммобилизованная на декстране утрачивала лишь 5-10% своей удельной активности. Таким образом, суммируя полученные данные тонкослойной хроматографии и хромогенного проточного гидролиза можно говорить о том, что

полученный нами рекомбинантный химерный белок ДСД-еп-р-ГАЛ способен оставаться в стабильном комплексе с декстраном и в течение длительного времени осуществлять гидролиз различных бета-галактозидов.

По результатам настоящей работы нами были поданы две заявки на патент.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1) Разработан способ получения гибридного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, отличающегося наличием аутентичной последовательности декстрансвязывающего домена, объединённой через глицин-сериновый спейсер с последовательностью термостабилыюй бета-галакгозидазы

2) Сконструирована экспрессионная плазмида pGD-Ю, кодирующая химерный белок ДСД-сп-р-ГАЛ.

3) Создан штамм E.coli [pGD-10J - продуцент белка ДСД-сп-р-ГАЛ. Оптимизированы условия индукции и синтеза химерной белковой конструкции, вследствие чего был достигнут уровень экспрессии целевого белка 10% от общего белка Е. coli.

4) Определены физико-химические показатели и удельная фермеотативная бета-галактозидазная активность гибридного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ.

5) Получен комплекс декстрапа и белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, который может быть использован в качестве компонентной базы для ферментативного гидролиза различных бета-галактозидов в пищевой промышленности и медицине.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

1) Гришин Д.В. Характеристика термостабильных гистоноподобных белков из разных биологических источников. В сб. тезисов: VI Молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», М., Россия, 5 апреля 2006, С 7-9.

2) Гришин Д.В. Разработка новой химерной белковой конструкции дня гидролиза бета-галактозидов // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т 54. -

3) Гришин Д.В., Никитин A.B. Перспективы профилактики и лечения синдрома мальабсорбции // Антибиотики и химиотерапия. — 2009. - №3-4, С 49-51.

4) Гришин Д.В., Никитин A.B. Создание химерной белковой конструкции для твердофазного гидролиза бета-галактозидов и изучение её физико-химических свойств // Естественные и технические науки. - 2009. - № 5, С 131-133.

5) Гришин Д.В., Никитин A.B., Бирюков В.В. Создание новой рекомбипантной белковой конструкции для ферментативного гидролиза бета-галактозидов . В сб. тезисов: ХП Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС- ТИБОХ, Владивосток, 7-14 сентября 2009, С 17.

С. 3-7.

Гришин Дмитрий Викторович

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 16.11.2009 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1,5 пл. Тираж 100 экз. Заказ №1745

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Краснопрудная, вл.13. т. (499) 264-30-73 www.firaiablok.ru

Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гришин, Дмитрий Викторович

Список принятых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1. Характеристика синдрома мальабсорбции.

2. Обзор методов конверсии лактозы в пищевой промышленности.

3. Общая характеристика ферментов класса гликозилгидролаз.

3.1. Общая характеристика ферментов класса Р-галактозидаз.

3.1.1. Мезофильные Р-галактозидазы.

3. 1.2. р-галактозидазы термофильных микроорганизмов.

4. Технология слитных генно-инженерных конструкций в науке и практике.

4.1. Общая характеристика метода.

4.2. Современный взгляд на применение химерных белков.

4.2.1. Fusion - технология и биокатализ.

4.2.2. Создание рекомбинантных антител.

4.2.3. Субъединичные генно-инженерные вакцины.

4.2.4. Химерные белки для оптимизации аффинной хроматографии.

5. Декстрансвязывающий домен и его биологические источники.

6. Иммобилизованные ферменты.

7. Цели и задачи работы.

Глава П. Материалы и методы.

1. Материалы.

1.1. Химические реагенты.

1.2. Составы используемых буферов.

1.3. Бактериальные штаммы и ростовые среды для бактериальных культур.

1.4. Используемые коммерческие плазмидные векторы и синтетические олигонуклеотиды.

1.4.1. Коммерческие плазмидные векторы.

1.4.2. Синтетические олигонуклеотиды.

2. Методы молекулярного клонирования в бактериях.

2.1. Бактериальные штаммы и используемые среды.

2.2. Клонирование плазмидной ДНК в бактериях.

2.2.1. Молекулярные методы получения генно-инженерных конструкций.

2.2.2.Получение компетентных клеток штаммов E.coli.

2.2.2.1 .Подготовка клеток к электропорации.

2.2.2.2. Проведение электропорации.

2.3. Выделение хромосомной ДНК методом фенол-хлороформной экстракци

2.4. Анализ клонированных генов.

2.5. Полимеразная цепная реакция (ПНР).

2.6. Источники клонируемого материала.

3. Метод изоляции культур Leuconostoc mesenteroides.

4. Используемые методы очистки белков.

4.1. Катионообменная хроматография.

4.2. Гельфильтрация.

5. Метод количественного определения белка (метод Мэрион Бредфорд).

Глава Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Создание бактериальных штаммов продуцентов белка ДСД-сп- Р-ГАЛ.

1.1.Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего клонирование гена и экспрессию белка LacZThEh.

1.2.Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию белка DBD(Gly-Ser)5.

1.2.1. Получение и клонирование гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides.

1.2.2. Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.

1.2.2.1. Получение гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С конце.

1.2.2.2. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка DBD (Gly-Ser)5.

1.2.3. Создание бактериальных продуцентов белка DBD(Gly-Ser)5.

1.3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающего экспрессию химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ в цитоплазме клеток Е. coli.

1. 3. 1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка ДСД-сп-р-ГАЛ.'.

1.3.2. Секвенирование аутентичных нуклеотидных последовательностей гена белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

1.3.3. Создание бактериальных продуцентов гена белка ДСД-сп-Р-ГАЛ.

2. Оптимизация условий экспрессии белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

2.1. Оптимизация времени индукции.

2.2. Оптимизация количества индуктора.

2.3. Оптимизация ионного состава ростовой среды.

3. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп-Р-ГАЛ.

3.1. Анализ растворимости белка ДСД-сп-р-ГАЛ в лизатах клеток Е. coli штамма DH5a.

3. 2. Изучение термостабильности белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

3.3. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-Р-ГАЛ в лизатах клеток Е. coli штамма DH5a.

4. Хроматографическое выделение белка ДСД-сп-р-ГАЛ и изучение его декстрансвязывающих свойств.

4.1. Определение изоэлектрической точки ДСД-сп-р-ГАЛ.

4.2. Катионообменная хроматография.

4.3. Изучение декстрансвязывающих свойств целевого белка.

4.4. Изучение степени очистки белка ДСД-сп-р-ГАЛ посредством аффинной хроматографии на декстране.

5. Сравнительная характеристика влияния различных физических факторов на исследуемый белок.

6. Создание модельной системы для ферментации бета-галактозидов на базе декстрана и рекомбинантного белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента"

Актуальность проблемы. Известно, что недостаточность фермента (3-галактозидазы (лактазы), расщепляющей лактозу молока имеет особое значение в раннем детстве, так как дисахарид лактоза, содержащийся в молоке является основным источником галактозы, которая в свою очередь участвует в синтезе галактоцереброзидов, необходимых для нормального развития ЦНС и сетчатки глаза, вследствие чего уменьшение количества лактозы и производных её гидролиза нежелательно, особенно в детском возрасте. Между тем 15-20% населения Земли стабильно подвержено синдрому мальабсорбции (СМА), который выражается, в частности, в лактозонепереносимости и сопряженных с этим явлением последствиях [1].

Наиболее радикальным и эффективным способом профилактики и лечения СМА, является промышленное создание безлакгозных продуктов, либо приём ферментных препаратов (мезофильная р-галактозидаза), расщепляющих лактозу, которые назначаются вместе с молоком и молочными продуктами, однако, при этом наблюдается инактивация фермента протеазами желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и его скорый унос, вследствие физиологической перистальтики ЖКТ [2], а кроме того отсутствие оптимальной системы очистки фермента приводит к ряду негативных моментов, речь о которых пойдёт далее.

В современной биотехнологической практике одно из наиболее важных мест принадлежит ферментам и ферментным системам, которые широко используются в различных отраслях промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Известно, что большинство ферментов, являясь веществами белковой природы, неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям и к воздействию различных химических реагентов. Решить эти проблемы для ряда промышленных отраслей помогает создание на основе новейших биотехнологических приёмов, иммобилизованных ферментов.

Принципиально новым подходом к получению таких препаратов как Р-галактозидазы с улучшенными характеристиками является внедрение методов биотехнологии и генной инженерии. С использованием этих методов возможно создание различных ферментов, в том числе и Р-галактозидаз, обладающих повышенной термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с биологически совместимыми субстратами (декстран) [3]. Это значительно облегчало бы процесс очистки фермента, что важно не только в свете возможности использования данного иммобилизованного на декстране фермента в качестве медицинского препарата, но и при оптимизации процессов конверсии лактозы в пищевой промышленности, в частности для создания безлактозных молочных продуктов [4].

Получение подобных ферментных препаратов становится возможным при использовании штаммов бактерий, трансформированных плазмидной ДНК, несущей ген р-галакгозидазы с улучшенными свойствами [5].

В настоящее же время используемые в мировой научной и промышленной практике штаммы E.coli продуценты, экспрессируют ферменты способные быть иммобилизованными в основном только химическими методами, что, может повлечь за собой значительную инактивацию целевого белкового продукта [6].

Положения, выносимые на защиту. 1. Созданный плазмидный вектор с регуляторными областями и геном химерного белка ДСД-сп-р-ГАЛ. 2. Рекомбинантная белковая конструкция ДСД-сп-р-ГАЛ содержащая декстрансвязывающий домен и каталитическую последовательность фермента термостабильной р-галактозидазы и её пггамм-продуцент. 3. Стратегия очистки рекомбинантных белков, основанная на сочетании использования. термостабильности целевого продукта и его декстрансвязывающих свойств. 4. Декстран-белковый комплекс на основе белка ДСД-сп-Р-ГАЛ и декстранового сорбента для гидролиза бета-галактазидов.

Научная новизна. Концепция разработки слитных генно-инженерных конструкций, позволила нам создать плазмидный вектор с геном химерного белка и экспрессироватъ сам белок ДСД-сп-Р-ГАЛ, обладающий одновременно декстрансвязывающими свойствами и активностью фермента термостабильной Р-галактозидазы. Так же была предложена стратегия аффинной очистки рекомбинантного белка и получения декстран-белкового комплекса на базе данного двудоменного белка, а также изучены возможности его практического использования.

Практическое значение работы. Технологическая схема получения химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, а также способ очистки и иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применение в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов дня профилактики синдрома мальабсорбции (недостаточности фермента лактазы). Также данный декстран-белковый комплекс может быть использован в пищевой промышленности при реализации схем получения безлактозных продуктов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гришин, Дмитрий Викторович

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1) Разработан способ получения гибридного белка ДСД-сп-|3-ГАЛ, отличающегося наличием аутентичной последовательности декстрансвязывающего домена, объединённой через глицин-сериновый спейсер с последовательностью термостабильной бета-галактоз ид азы

2) Сконструирована экспрессионная плазмида pGD-Ю, кодирующая химерный белок ДСД-сп-р-ГАЛ.

3) Создан штамм E.coli [pGD-10] - продуцент белка ДСД-сп-р-ГАЛ. Оптимизированы условия индукции и синтеза химерной белковой конструкции, вследствие чего был достигнут уровень экспрессии целевого белка 10% от общего белка Е. coli.

4) Определены физико-химические показатели и удельная ферментативная бета- галактозидазная активность гибридного белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

5) Получен комплекс декстрана и белка ДСД-сп-р-ГАЛ, который может быть использован в качестве компонентной базы для ферментативного гидролиза различных бета-галактозидов в пищевой промышленности и медицине.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бета галактоз идаза является одним из первых ферментов, ставших объектами исследования учёных в различных областях биологической науки, по этой причине изучение её свойств и возможных направлений её использования, задействующих данный фермент казались уже исчерпанными. Однако генная инженерия и /гш'оя-технология как молодое направление биотехнологии позволили нам разрушить данный стереотип. В различных отраслях современной науки остаются ещё не решенными проблемы, где подобный фермент в рекомбинантном виде мог бы найти широкое применение. К данным проблемам относятся как собственно синдром мальабсорбции, выражающийся в недостаточности лактазы и в сопряжённых с этим состоянием паталогических последствиях, так и сложная схема получения безлактозных продуктов и ферментных препаратов лекарственного назначения, что сводится к трудоёмкой химической очистке фермента, приводящей к его инактивации, а также проникновению химических реагентов, используемых для элюции, в пищевой продукт и организм человека. Кроме того, используемые в настоящее время лактазы, являются преимущественно мезофильными, что ограничивает их применение в тех случаях, когда производственный процесс необходимо проводить непрерывно при высоких температурах, к примеру при пастеризации, - процессе одноразового нагревания жидкостей или пищевых продуктов, обычно до 60-70°С, в течение 15-30 минут.

Принципиально новым подходом к получению препаратов |3-галактозидаз с улучшенными характеристиками является технология слитных (химерных) рекомбинантных конструкций, когда в одной рамке трансляции объединяются генные последовательности разных по своей функциональности белков. Использование подобной технологии позволило нам осуществить создание фермента, обладающего улучшенными свойствами: повышенной термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с биологически совместимым субстратом (декстран), что призвано значительно облегчить процесс очистки белка, что важно не только в свете возможности использования данного иммобилизованного на декстране фермента в качестве медицинского препарата с пролонгированным действием, но и при оптимизации процессов конверсии лактозы в пищевой промышленности, в частности при создании безлактозных молочных продуктов.

Благодаря выше описанным генно-инженерным приёмам нами был получен ген декстрансвязывающего домена (ДСД) из Leuconostoc mesenteroides с глицин-сериновым спейсером на С-конце; была спланирована и создана генная последовательность химерного белка на базе гена ДСД со спейсером и гена термостабильной Р - галактозидазы из Thermoanaerobacter Ethanolicus; Впервые были получены эффективные бактериальные продуценты конструкции ДСД-сп-р-ГАЛ E.coli DH5a, обеспечивающие экспрессию целевого белка на уровне 10% от тотального белка клеток, а также были изучены физико-химические свойства и ферментативная активность рекомбинантной конструкции ДСД-сп-Р-ГАЛ. Следствием вышеописанных манипуляций явилось создание системы для гидролиза бета-галактозидов на базе комплекса декстрана и нашего белка.

Так же была предложена высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантного белка на декстрановом сорбенте, основанная на уникальных свойствах декстрансвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 90%. Впервые получен в препаративных количествах высокоочшценный рекомбинантный белок ДСД-сп-Р-ГАЛ, а также декстран-белковый комплекс для эффективного гидролиза бета-галактозидов. Благодаря данным тонкослойной хроматографии и хромогенного проточного гидролиза можно утверждать о том, что созданный химерный белок ДСД-сп-р-ГАЛ имеет более высокие показатели удельной активности при иммобилизации на декстрановом сорбенте, с которым способен оставаться в стабильном комплексе и в течение длительного времени осуществлять гидролиз различных бета-галактозидов.

Таким образом, разработанная схема получения химерного белка ДСД-сп-р-ГАЛ, а также способ очистки и иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применение в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов для профилактики синдрома мальабсорбции, связанного с недостаточностью фермента лактазы; также комплекс данной белковой конструкции с декстраном может быть использован в пищевой промышленности при реализации новых схем получения безлактозных продуктов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гришин, Дмитрий Викторович, Москва

1. Ладодо К.С. Руководство по лечебному питанию детей. М.: 2000. -384 с.

2. Чубарова А.И., Гераськина В.П., Кыштымов М.В. и др. Эффективность применения ферментотерапии и диетотерапии при лактазной недостаточности у новорожденных // Вопросы детской диетологии. 2003. - № 4. - С. 21-24.

3. Cavataio, F., Guandalini, S. Cow's milk allergy. In: Essential pediatric gastroenterology, hepatology, & nutrition. / F. Cavataio, S. Guandalini // S. Guandalini, ed. New York: McGraw-Hill. -2005. P. 175-192.

4. Кунижев C.M., Шуваев В.А., ЬСимова Э.Т. Низколактозные и безлактозные молочные продукты: Обзорная информация // Обзор. АгроНИИТЭИММП. 1988. - 30 с.

5. Zverlov, V.V., Fokina, N.A., Velikodvorskaya, G.A. Sequence P~ galactosidase gene Thermoanaerobacter ethanolicus. 1996. - EMEL ac. №Y08557

6. Березин И.В., Клячко Н.П., Левашов A.B. Иммобилизованные ферменты. -М.: Высшая школа, 1987.-160 с.

7. Мухина Ю.Г., Чубарова А.И., Гераськина В.П. Современные аспекты проблемы лактазной недостаточности у детей раннего возраста // «Вопросы детской диетологии» 2003.- т. 1, № 1. - С. 50 - 56.

8. Корниенко Е.А., Митрофанова Н.И., Ларченкова Л.В. Лактазная недостаточность у детей раннего возраста // «Вопросы современной педиатрии» 2006.- т. 5, №4. - С. 25 - 46.

9. Мухина Ю.Г., Чубарова А.И., Боровик Т.Э., Рославцева Е.А. и др. «Рабочий протокол по диагностике и лечению лактазной недостаточности у детей» // изд. Научного центра здоровья детей РАМН 2005. - № 1. - С. 38-46.

10. Чубарова А.И., Гераськина В.П., Кыштымов М.В., Потапова О.В., Попова И.Д., Дьяконова Г.В. Эффективность применения ферментотерапии и диетотерапии при лактазной недостаточности у новорожденных // Вопросы детской диетологии — 2003. т. 1, № 4. — С. 21-25.

11. П.Тихомирова О.В., Бехтерева М.К. Диетическая коррекция функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта у детей грудного возраста после перенесенных острых кишечных инфекций // Педиатрия 2007. - № 2. - С. 65-69.

12. Фотометрическое измерение массовых концентраций бета-галакгазидазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания / под ред. Оншценко Г.Г.. Москва. 2003. С. 2-11.

13. Тепел А. Физика и химия молока: учеб. для вузов. — М.: Пшцепромиздат, 1979. 465 с.

14. Твердохлеб, Г.В., Диланян З.Х., Чекулаева JI.B. Технология молока и молочных продуктов. -М.: Агро ripомиздат, 1991. -463 с.

15. Шуваев В.А., Кунижев С.М„ Омельянчук П.А. Исследование процесса экстракции лактозы из сухого обезжиренного молока // Вестник СевКавГТУ 2003. - Вып. 6. - С. 15-24.

16. Шуваев В.А., Харитонов В.Д., Грановский В.Я., Кунижев С.М., Евдокимов И.А., Гацулина М.М. Способ производства сухого безлакгозного молочного продукта // Бюл. Открытия. Изобретения — 1986. -№33.- С.6—7.

17. Эдельстен Д., Фриис П., Меерзон М.Ф. Новый вид сухого обезжиренного молока с пониженным содержанием лактозы // Международный молочный конгресс 1982. - т. 1, кн. 1. - С.8-10.

18. Шуваев В.А., Кунижев С.М., Лагошина С.А., Лельчук Ю.В. Способ получения сухого безлакгозного молока // Бюл. Открытия. Изобретения 1987. -№27. - С.11-13.

19. Bora, К. Changes in physico-chemical properties of goat milk due to boiling and simmering processes Indian/ K. Bora, J. Singh, G. Goyal // J. Anim. Sci. 1990. - V. 60, №1,-P. 112-114.

20. Coveney, J. Goat's milk and infant feeding/ J. Coveney, I. Darnton // J. Aust. 1985. - V. 143. - P.508-511.

21. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты. M.: Мир, 1982. - т.З. - 906 с.

22. Henrissat, В. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities/ B. Henrissat // J. Biochem. 1991. - V. 280. - P. 309—316.

23. Henrissat, В., Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases/ B. Henrissat, A. Bairoch // J. Biochem. 1996. - V. 316. - P. 695-696.

24. Волова Т.Г. Биотехнология. Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. - 252 с.

25. Sheridan, P. P., Characterization of a Salt-Tolerant Family 42 р-Galactosidase from a Psychrophilic Antarctic Planococcus Isolate and Brenchley/ P. P. Sheridan, E. Jean // Appl. Environ Microbiol. 2000. -V.66. - P. 2438-2444.

26. Corral, J. Cloning and characterization of a P-galactosidase encoding region in Lactobacillus coryniformis CECT 5711/ J. Corral, O. Banuelos, J. Adrio, J. Velasco // Appl. Microbiology and Biotechnology. 2006. - V. 73, №3. - P. 640-646.

27. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.: Наука, 1975. - 389 с

28. Tanthanuch, W., Chantarangsee, M. Genomic and expression analysis of glycosyl hydrolase family 35 genes from rice (Oryza sativa L.) / W.Tanthanuch, M. Chantarangsee, J. Maneesan, J. Ketudat // BMC Plant Biology. -2008. -V.84, №8. P. 1-17.

29. КонР.М., Рот K.C. Ранняя диагностика болезней обмена веществ, пер. с англ. М.: Мир, 1986. - с. 281- 450.

30. Зубова Н. Н., Савицкий А. П. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих // Успехи биологической химии. —2005. т. 45. - С. 391—454.

31. Лодыгин А. Д., Рябцева А. Б. Лакгосахароза и галактоолигосахариды — новые перспективные пребиотики из лактозосодержащего сырья // Сборник научных трудов СевКавГТУ, серия «Продовольствие». -2006. -№2.

32. Ramesh, M. Thermophilic Fungi: Their Physiology and Enzymes/ M. Ramesh, G. Bharadwaj, K. Mahalingeshwara II J. Microbiolodgy and Molecular Biolodgy Reviews. 2000. - P. 461-488.

33. Tischer, W., Immobilization of Enzymes. In Enzyme Catalysis in Organic Synthesis / W. Tischer // VCH-Verlag Weinheim. 1995. - P. 73-87.

34. Гдик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология (принципы и применение). М.: Мир, 2002. - С. 158-330.

35. Комаров С. Биохимики прогнозируют свойства химерных белков // Информнаука: науч. пед. интернет-журн. 12.01.06 URL: http://http://www.informnauka.ru (дата обращения: 20.02.2008).

36. Friedhandler, L., Berk, J.E. Affinity characteristics of amylase-binding substance (s) prepared from macroamylase complexes/ L. Friedhandler, J.E. Berk, E. Wong // Clin. Chem. 1974. - V.20, №1. - P. 5-22.

37. Keefe, A.D., Wilson, D.S. One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-afmity strptavidin-binding peptide, the SBP-tag / A.D. Keefe, D.S. Wilson, B. Seelig, J.M. Szostak // Protein Expr Purif. 2001. - V.23. - P. 440-446.

38. Jungbauer, A., Hahn, R. Engineering protein A affinity chromatography / A. Jungbauer, R. Hahn // Curr. Opin Drug Discov Devel. 2004. - V.7, №2.-P. 248-256.

39. Wilson, M.J., Freedman, R.B., Fitton, J.E. Recovery, Refolding and Purification a2 -Interferon / M.J. Wilson, R.B. Freedman, J.E. Fitton // Biochemical Society Transactions 1988. - V.76, №1. - P. 58-60.

40. Vaillancourt, P. E. E. Coli Gene Expression Protocols/ P. E. Vaillancourt // Humana Press 2003. - V. 205. - P. 119-140.

41. Tuan, R. S. Recombinant Gene Expression Protocols / R. S. Tuan// Methods in Molecular Biology 1997. - V. 62. - P. 3-62.

42. De Marco, A., Casatta, E., Savaresi, S., Geerlof, A. Recombinant proteins fused to thermostable partners can be purified by heat incubation / A. De Marco, E. Casatta, S. Savaresi, A. Geerlof // J. of Biotechnology -2004. -V. 107.-P. 125-133.

43. Koerdt, A., Paulick, A., Mock, M. MotX and MotY are required for flagellar rotation in Shewanella oneidensis MR-1/ A. Koerdt, A. Paulick, M. Mock, K. Jost, M. Thormann // J. Bacterid 2009. - P. 10-23.

44. Льюин, Б. Гены / Пер. с англ.- М.: Мир, 1987. 544 с.

45. Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н., Титова Г.А., Акопиан Т.А., Левицкий С.А., Говорун В.М. Экспрессия генов белков мембраны включения IncB и IncC Chlamydia trachomatis в Escherichia coli. // Биохимия -2006. т.71, №3. - С. 333-340.

46. Maski, К., Masuda, R., Tacase, К. Stability of the molten globule state of a domain-exchanged chimeric protein between human and bovine a-lactalbumins / K. Maski, R. Masuda, K. Tacase, K. Kawano, K. Nitta // Protein Engineering 2000. - V. 13. - P. 1-4.

47. Яненко A.C. Биокаталические процессы в органическом синтезе: состояние и перспективы развития // Биотехнология 2009. - № 2. -96 с.

48. Шелдон Р.А. Экологический фактор, или окружающая среда как стимул эволюции промышленной химии // Перевод Г.В.Низовой, «Химия и жизнь ХХ1век». - 1999. - №4. - С. 4-9.

49. Madrid (ES) (All Except US). ES / ES.; (ES) (US Only); Publication Date: 28.08.2003.

50. Goyal, A., Batra, J. K. Inclusion of a form-sensitive spacer enhances the cytotoxicity of ribotoxin restrictocin containing recombinant single-chain immunotoxins/ A. Goyal, J. K. Batra // Biochem. J. 2000. - V. 345, -P.247-254.

51. Белозоров А. П. Лекарственные препараты гуманизированных антител. // интернет-журн. «Провизор», 20.05.1998. URL: http: // www.provisor.com.ua /archive/2007/N20/antitelo20.php. (дата обращения: 15.01.2009)

52. Shepherd, P., Dean, Ch. Monoclonal antibodies / P. Shepherd, Ch. Dean // Practical Approach. Edited by Oxford University Press. 2000. - 479 p.

53. Фибих X. Получение моноклональных антител путем слияния клеток. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - С. 15-37.

54. Janda, K.D. New strategies for the design of catalytic antibodies / K.D. Janda // Biotechnol. Prog. 1990. - №6. - P. 178 - 181.

55. Arnon, R., Ben-Yedidia T Old and new vaccine approaches / R. Arnon // Int. Immunopharmacol. 2003. -V.3,№8. - P. 1195-1204.

56. Dertzbaugh, M.T. Genetically engineered vaccines: an overview / M.T. Dertzbaugh // Plasmid 1998. - V. 39. - P. 100-113.

57. Ada, G. Overview of vaccines/ G. Ada // Methods in molecular medicine -2003. -V.87. -P. 1-17.

58. Studier, F.W:, Rosenberg, A.H. Use. of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned1 genes. / F. W. Studier, A. H. Rosenberg, J. J. Dunn,

59. J. W. Dubendorff// Methods: Enzymol. Companion Methods. 1990. -P.60-89.

60. Liljeqvist, S., Stahl, S. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines / S. Liljeqvist., S. Stahl. //J.Biotechnol. 1999. - V.73, №1. -P. 1-33.

61. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems / K. Terpe // Appl. Microbiol. Biotechnol. Review 2003. -V. 60. - P. 523-533.

62. Lichty, J.J., Malecki, J.L., Agnew, H.D. Comparison of affinity tags for protein purification / J.J. Lichty, J.L. Malecki, H.D. Agnew, D. J. Michelson-Horowitz, S. Tan. // Protein Expr Purif. 2005. - V.41, №1. -P. 98-105.

63. Karpeisky, M.Y., Senchenko, V.N., Dianova, M.V., Formation and properties of S protein complex with S peptide containing fusion protein /

64. M.Y. Karpeisky, V.N. Senchenko, M.V. Dianova // FEBS Lett. 1994. -V.339. - P.209-212.

65. Spinell, D. M., Gibbons, R. J. Influence of Culture Medium on the Glucosyl Transferase and Dextran-Binding Capacity of Streptococcus mutans 6715 Cells / D. M. Spinell, R. J. Gibbons, // J.Infection and Immunity - 1974. -V. 10. - P. 1448-1451.

66. Freedman, M. L., Guggenheim, B. Dextran-induced aggregation in a mutant of Streptococcus sobrinus 6715-13 / M. L. Freedman, B. Guggenheim // J. Infection and Immunity -1983. V.41, №1. - P. 264274.

67. Morisaki, H., Igarashi, Т., Yamamoto, A., Goto, N. Analysis of a dextran-binding domain of the dextranase of Streptococcus mutans / H. Morisaki, T. Igarashi, A. Yamamoto, N. Goto // Letters in Applied Microbiology. -2002. V.35. - P.223-227.

68. Ахметова Л.И., Перевалова Е.Ю., Розанова C.M. Бактерии рода Leuconostoc: клиническое значение, идентификация, чувствительность к антибиотикам // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2001. - №1, т.З. - С. 48-53.

69. Funane, К., Ookura, Т., Kobayashi; М. Glucan Binding Regions of Dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F / K. Funane, T. Ookura, M. Kobayashi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. -V. 62.-P. 123-127.

70. Kobayashi, M., Mihara, K., Matsuda, K. Dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F: characterization of the enzyme bound to Sephadex gel / M. Kobayashi, K. Mihara, K. Matsuda // Agric. Biol. Chem. 1986. - P.551-557.

71. Патент RU 2273662 C2, CI2N1/20, A23C9/12, C12R1/01, опубл. 10.04.2006 г.

72. Dimic, G. R. Characteristics of the Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides strains from fresh vegetables/ Gordana R. Dimic // ARTEFF. 2006. - V.37. - C. 3-11.

73. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. M.: Наука, 2000. - 830 с.

74. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. - 704 с.

75. QIAGEN protocols: Sample & Assay Technologies, Analyzing Gene Expression and Regulation., 2003 2009. - http: I! wwwl.qiagen.com/literature/brochures/Category.aspx?ID = 301.

76. Morstadt, L., Bohm, A., Stollar, В., Engineering and characterization of a single chain surrogate light chain variable domain / L. Morstadt, A. Bohm, D. Yuksel, K. Kumar, B. Stollar // Protein Sci. 2008. - V.17, №3. - P. 458^165.

77. Cao H., Expression, Purification, and Biochemical Characterization of the Antiinflammatoiy Tristetraprolin: A Zinc-Dependent mRNA Binding Protein Affected by Posttranslational Modifications / H. Cao // Biochemistry. 2004. - V.43, №43. - P. 13724-13738.

78. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli / F. Baneyx // Curr Opin Biotechnol. 1999. - V.10, №5. - P.411-21.

79. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - С.450.

80. Cave, H., Bingen., E., Elion, J., Denamur, E. Differentiation of Escherichia coli strains using randomly amplified polymorphic DNA analysis/ H. Cave, E. Bingen, J. Elion, E. Denamur // Res. Microbiol. 1994. - V.145. -P.141-150.

81. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике/ под редакцией Алиханяна С.И. М.: Мир, 1976. - С. 324-327.

82. Stupak, Е.Е., Stupak, I.V. Inheritance and state switching of genetic toggle switch in. different culture growth phases / E.E. Stupak, I.V. Stupak // FEMS Microbiol. Lett. 2006.- V. 258.- P. 37-42.

83. Craven, G.R., Steers, Jr.E., Anfinsen, C.B. Purification, composition and' molecular weight of the J3-Galactosidase of Escherichia coli K12 / G.R.

84. Craven, Jr.E. Steers, C.B. Anfinsen // J. Biol. Chem. 1965. - V.240. - P. 2468-2477.

85. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V.72. - P.248-254.

86. Шапкин Н.П., Жамская H.H., Скобун A.C. Адсорбция белков и жиров из сточных вод пищевых предприятий на природных сорбентах // Известия Вузов. Пищевая технология — 2001. №4. - С.36-38.

87. Тарасевич Ю.И. Природные сорбенты в процессах очистки воды. -Киев: «Наукова думка», 1981. —278 с.

88. Бобровник Л.Д., Семененко В.З., Федорова Н.С. Влияние поверхностных свойств осадков на адсорбцию несахаров в процессе II сатурации и сульфитации // Сахарная промышленность 1987. - № 2. -С. 18-20.

89. Кагановский A.M. Адсорбционная технология очистки сточных вод. Киев: "Техника", -1983. с. 10-24.

90. Сова В.В., Кусайкин М.И. Выделение и очистка белков: Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков по курсу «Химия и биохимия белков и ферментов» Владивосток: изд-во Дальневост. ун-та, 2006. - 42 с.

91. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М.: Мир, 1965. - 508 с.

92. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография / Перевод под ред. В.Г. Березкина. М.: Мир, 1981. - т. 1; 2. -1100с.