Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль Н-домена белка FruB системы транспорта фруктозы в физиологии бактерии ESCHERICHIA COLIK-12

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль Н-домена белка FruB системы транспорта фруктозы в физиологии бактерии ESCHERICHIA COLIK-12"

, Ой

О

г'1

На правах рукописи

СЕРГЕЕВ КИРИЛЛ ВСЕВОЛОДОВИЧ

РОЛЬ Н-ДОМЕНАБЕЛКА FruB СИСТЕМЫ ТРАНСПОРТА ФРУКТОЗЫ В ФИЗИОЛОГИИ БАКТЕРИИ ESCHERICHIA COLI К-12.

( 03.00.07 - микробиология )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте Эпидемиологии и Микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Т.Н. Большакова

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Бондаренко В.М.

Доктор биологических наук, профессор Бойченко М.Н.

Ведущее учреждение - Московский Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Защита диссертации состоится "р/?"^УУ^^А 997 года в //'часов

на заседании Диссертационного Совета К001.07.01 в Научно-исследовательском Институте Эпидемиологии и Микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул.Гамалеи, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи.

Автореферат разослан Х-/" 1997 г

Ученый секретарь специализированного Совета Доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Проблема адаптации бактерий к изменяющимся условиям внешней среды до настоящего времени остается одним из наиболее актуальных вопросов микробиологии. Энтеробактерии в пищеварительном тракте человека занимают экологическую нишу, характеризующуюся экстремальнымн колебаниями условии обитания. Соответственно, бактерии должны быстро и эффективно адаптироваться к внезапным изменениям внешней среды таким, как рН среды, концентрация кислорода, углерода и азота, присутствие детергентов (желчные кислоты), конкуренция с другими микроорганизмами, наличие фагов и биологически активных веществ и т.д. При этом для бактериальной клетки определяющими являются два условия: узнавание изменений в окружающем их пространстве и быстрое регулирование своего метаболизма в соответствии с происшедшими изменениями. В процессе эволюции бактерии выработали множество механизмов, позволяющих им реагировать на изменения внешних условии. Функционирование бактериальной системы транспорта углеводов [фосфоенолпируват (ФЕП): углевод фосфотрансферазной системы (ФТС)] является одним из способов узнавания изменений во внешней среде и приспособления внутриклеточного метаболизма к изменившимся условиям обитания.

ФТС (РоБИпа е! а1. 1993) - сложная система. ФТС осуществляет ФЕП-зависимое фосфорилирование углеводов в процессе их транспорта. Такие углеводы называются ФТС-субстраты, в отличие ог других субстратов (не-ФТС-субстраты), поступающих в клетку посредством других транспортных систем. Процесс передачи фосфорильной группы с ФЕП на углевод происходит по цепи белковых компонентов ФТС. Общими для всех ФТС-углеводов являются фермент I (Ф1) и низкомолекулярный белок НРг. От них

фосфорильная группа передается на мембранные белки - ферменты НА и НВС (ФПА и ФНВС), которые осуществляют непосредственно транспорт углеводов и их фосфорилирование (Рис.1).

ФЕП Ф1-» НРг -»ФИА* ФНВС-»Углевод

РгиВ-»ФИВСфру-» фруктоза Рисунок 1. Схема переноса фосфорильной группы в фосфотрансферазной реакции от ФЕП на углевод по белкам ФТС.

Одной из отличительных особенностей фруктозной ФТС является то, что она единственная из более чем 20 углеводспецифичных ФТС обладает собственным белком, способным акцептировать фосфат с Ф1, минуя НРг. В этом случае фосфорильная группа с Ф1 переносится на фруктозоспецифичный белок FruB. Белок FruB имеет два сайта фосфорилирования (Geers et al. 1976). Первый сайт, на который акцептируется фосфорильная группа, расположен в С-конце белка и называется домен Н. С этого домена фосфорильная группа переносится на сайт (домен В), находящийся на N-конце белка. Фосфорилированный по В-домену белок FruB является донором фосфата для работы фруктозоспецифичной пермеазы - фермента IIBC. Таким образом, сложный

белок FruB сочетает в себе две активности: псевдо-HPr- активность и

фру Фру

активность фермента НА . ФНВС осуществляет перенос в клетку фруктозы с одновременным превращением ее во фруктозо-1-фосфат, который с помощью фосфофруктокиназы (кодируемой геном fruK) превращается во фруктозо-1,6-бифосфат.

Гены, кодирующие синтез белков фруктозной ФТС (ФФТС), организованы в оперон (fruBKA), который располагается на 47 минуте хромосомной карты Е.соИ. Синтез белков ФФТС подвержен негативной

регуляции со стороны белка-репрессора FruR (ген fruR расположен на 2 -ой

минуте хромосомной карты). Помимо этого, мутация fruS, локализованная в

пределах фруктозного оперона, приводит к конститутивному синтезу белков Фру

FruB и IIBC (продуктов генов fruB и fruA соответственно). В данной работе часть ДНК, детерминирующая синтез Н-домена белка FruB, обозначена как fruH.

Ранее в работах многих исследователей было установлено, что непрерывный поток фосфорильной группы по цепи белковых компонентов ФТС необходим для регуляции многих физиологических процессов в бактериях (см. Гершанович и др. 1987, Postma et al. 1996). В настоящий момент исследованы последствия нарушения В-домена белка FruB (О.Добрынина и др. 1987). Эти нарушения приводят к снижению активности аденилатциклазы (АЦ) и, как следствие, к уменьшению скорости индукции катаболитчувствительных ферментов.

В настоящий момент изучены: нуклеотидная последовательность генов, кодирующих синтез белков фруктозного оперона (Reizer et al 1994), и биохимические свойства белка FruB (Saier et al. 1989). Однако, до сего времени остается неясной роль Н-домена белка FruB в физиологии бактерии Escherichia coli К-12, из-за отсутствия модельных штаммов кишечной папочки, лишенных активности Н-домена данного белка. В этой связи представляется важным заполнить существующий пробел. Цель работы. Целью настоящей работы являлось изучение физиологических последствий повреждения Н-домена белка FruB фруктозной ФТС и роли этого домена в физиологии энтеробактерий. Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

1. Получить мутант E.coli, лишенный псевдо-HPr активности системы переноса фруктозы.

2. Генетически исследовать этот мутант, создать изогенные штаммы.

3. Изучить последствия влияния нарушения Н-домена белка FruB • на способность бактерий сбраживать углеводы, на их ростовые свойства и на подвижность клеток в полужидком агаре.

4. Исследовать последствия нарушения Н-домена на активность ФТС in vivo и in vitro.

5. Изучить последствия нарушения в Н-домене на процесс индукции ферментов.

6. Изучить эффект повреждения Н-домена на активность аденилатциклазы. Научная новизна и практическая ценность работы. Бактериальные штаммы с повреждениями Н-домена белка FruB получены в двух различных штаммах E.coli Kl2, путем вставки в ген fruB транспозона TnPhoA и генома дефектного профага Madllac. Выделенные мутанты были генетически и микробиологически изучены, проведено точное картирование вставки дефектного профага Mudllac в гене fruB. Полученные мутации fruH были совмещены с мутациями как по общему компоненту ФТС (ptsH), так и с регуляторными мутациями фруктозного оперона (fruR,fruS). Показано, что у штаммов, имеющих повреждение Н-домена, отсутствует фруктозоспецифичная фосфотрансферазная активность in vivo и in vitro, помимо этого снижена скорость транспорта глюкозы и увеличено время удвоения биомассы на этом углеводе. Впервые было показано, что обрыв цепи переноса фосфорильной группы по белкам фруктозного оперона приводит к резкому снижению синтеза АЦ, что обусловливает снижение уровня индукции катаболитчувствительных ферментов и нарушение подвижности бактериальных клеток в полужидком агаре.

Таким образом, впервые продемонстрировано, что нарушение в Н-домене белка FruB отражается на протекании многих физиологических процессов в бактериальной клетке.

Результаты, полученные в настоящем исследовании, имеют не только теоретическое, но и практическое значение. Они позволяют изучить роль белков ФФТС в проявлении таких свойств бактериальной клетки, как вирулентность, компетентность и т.д. Полученные в работе данные являются предпосылкой для направленного вмешательства в работу регуляторных систем бактериальной клетки, с целью изменения, например, ее биосинтетических функций. Полученные бактериальные штаммы кишечной палочки могут быть использованы в качестве модели для дальнейших научных исследований.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Материалы изложены на 125 страницах машинописного текста, включают 5 рисунков, 10 таблиц, 6 диаграмм. Список цитируемой литературы содержит 142 названия. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VIII Съезде Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва 1997 год) и на конференции Отдела генетики и молекулярной биологии бактерий НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Материалы н методы исследования.

Бактериальные штаммы. Объектом исследования служили штаммы Escherichia coli К12. Генотип бактерий обозначали согласно общепринятой номенклатуре (Bachmann, 1990). В работе использовано 36 различных генетически маркированных штамма, 15 из них сконструированы в процессе данной работы, остальные получены из отечественных (17 штаммов) и зарубежных лабораторий (4 штамма).

При конструировании штаммов использовали вставку транспозона TnPhoA и дефектный профаг Mudllac. Трансдукционные и конъюгационные скрещивания проводили по общепринятым методикам (Миллер 1976).

Бактериофаги. В работе использовались фаги PI vir > Mu cts62,

Mudllac.

Мультикопийные плазмиды. В работе использовались мультикопийные плазмиды: pPHPr-7, pFPr-б, полученные от д-ра Дж. Ленгелера (Германия).

Среды. В качестве питательных сред использовали L-бульон и L-агар, бульон Хоттингера. Минимальные среды готовили на основе солевой среды М-9 или агара Адамса, используя источник углерода в 0,4 % концентрации и необходимые добавки. Индикаторными средами служили среды ЭМС и Макконки с исследуемыми углеводами в 1% концентрации. Антибиотики использовались в стандартной концентрации.

В разделе "Материалы и методы" приведены описания использованных микробиологических, генетических, биохимических и молекулярно-биологических методов работы с бактериями. Описаны методики измерения скорости транспорта углеводов, а также определения уровня их фосфорилирования в бесклеточных экстрактах. Представлены также методики определения подвижности бактерий в полужидком агаре, определения активности ß-галактозидазы и АЦ. Точное картирование расположения вставки дефектного профага Mudllac проводилось при определении нуклеотидной последовательности денатурированного ампликона хромосомального гена fruB::Mudllac. Синтез и очистку праймеров осуществляли в НПО "Синтол". Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли на приборе GeneCycler, фирмы BioRad и с помощью полимеразы Taql производства Института Молекулярной Генетики РАН.

Определение последовательности нуклеотидов на денатурированном ампликоне проводили методом терминации синтеза ДНК дидезоксипроизводными нуклеотидов по Сангеру (Sanger et al. 1977) в реакции удлинения праймера ДНК-полимеразой бактериофага Т7.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Чтобы исследовать физиологические свойства бактерий кишечной палочки, лишенных активности Н-домена белка FruB, необходимо было получить модели, у которых мутационное повреждение локализовалось бы в той части гена fruB, которая кодирует синтез именно этого домена.

1. Выделение мутантов с повреждением Н-домена гена fruB.

Выделение мутантов с нарушением целостности домена Н было предпринято в бактериях, лишенных НРг (мутанты ptsH) и у которых синтез белков фруктозного оперона был конститутивен. Таким требованиям отвечали мутанты с генотипом ptsHfruR и ptsHfruS. В этом случае белок FruB синтезируется конститутивно, функционально замещает НРг и, несмотря на отсутствие общего компонента ФТС, такие бактерии проявляли фенотип дикого типа, то есть сбраживали как ФТС, так и не-ФТС-субстраты.

На основании этого было предположено, что если у бактерий с таким фенотипом будет поврежден Н-домен гена fruB, то тогда они перестанут утилизировать все как ФТС (глюкозу и фруктозу), так и не-ФТС-субстраты (мальтозу).

Селективная индикаторная среда содержала мальтозу и антибиотики: канамицин в случае использования TnPhoA и ампициллин в случае Mudllac. В результате были отобраны мутанты, резистентные к соответствующему антибиотику и не сбраживающие мальтозу, и другие не-ФТС- и ФТС-(в том числе и фруктозу) углеводы. Мутации были получены в штаммах как с

поврежденным фруктозным ферментом IIBC, так и с интактными фруктозными генами fruB и fruA.

2. Картирование полученных мутаций .

Локализация полученных мутаций в области фруктозного оперона предварительно была установлена в скрещивании с Hfr-штаммом РК191. Hfr-штамм PK 191 характеризуется тем, что он сбраживает все ФТС-углеводы и мальтозу, а начало переноса его хромосомы находится в районе маркера trp, причем перенос происходит по часовой стрелке. Поскольку все реципиенты содержали маркер cdd::TnlO (несущий тетрациклинрезистентность - Тс1), сцепленный с fru генами, а также триптофановый маркер, то после первичного отбора Тгр+ клонов среди них отбирали варианты, способные сбраживать глюкозу и фруктозу и потерявшие маркер Тсг. Среди такого рода рекомбинантов до 15% имели обозначенный фенотип. На основании полученных данных можно сделать заключение, что выделенные мутации находятся в районе локуса cdd::TnlO.

Более точная локализация мутации во фруктозной области была установлена в трансдукционных скрещиваниях с помощью бактериофага PI vir- Штаммы дикого типа, имеющие фенотип TcrKmsGlu+Mal+Fru+, использовались в качестве доноров. Реципиентами служили мутанты fruRptsHfruH::TnPhoA с фенотипом TcsKmrGlu Mal Fru . Было проанализировано 257 тетрациклинрезистентных трансдуктантов. 32 из них восстановили фенотип дикого типа, то есть сбраживали глюкозу, фруктозу и мальтозу и утеряли при этом резистентность к канамицину.

Полученные с помощью фага Mudllac мутанты также были картированы в трансдукционном скрещивании с использованием в качестве доноров мутантов fritAcdd::TnlO и fruBcddr.TnlO. Д- а vvTama (несущие

мутацию fruH25 и fruH41), у которых вставки локализовались во угм-опероне, обладали 34% сцепленности с локусом cddv.TnlO.

В дальнейшем для максимальной точности локализации посадки дефектного профага Mudllac проводили определение нуклеотидной последовательности денатурированного ампликона, полученного с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК мутанта fruH25::MudIlac. Секвенирование позволило установить, что дефектный профаг Mudllac встроен между 895-896 парой нуклеотидов открытой рамки считывания гена fruB. Нахождение профага между этими парами нуклеотидов свидетельствует о встраивании вставки именно в ту часть гена, которая детерминирует синтез Н-домена белка FruB.

3. Экспрессия вставки Mudllac в штаммах с повреждением Н домена

белка FruB.

Получение мутантов со вставкой Mudllac в гене fruB позволило определить степень выраженности вставки в зависимости от наличия в среде фруктозы и от мутационного повреждения гена-регулятора fruR фруктозного оперона. Об этом можно было судить по уровню синтеза ß-гапактозидазы у таких мутантов. Данные по количественному определению ß-галактозидазы приведены в Табл. 1 и позволяют заключить, что в случае мутации fruH25:: Mudllac ген lacZ не подстроен под промотор гена fruB, хотя вставка и находится в той части гена, которая контролирует синтез домена Н белка FruB. В случае мутации fruH41::MudIlac синтез ß-галактозидазы, по-видимому, находится под контролем промотора, однако эффективность работы этого промотора очень низка, хотя синтез фермента и регулируется наличием индуктора и репрессора в клетке (Табл. 1), а вставка находится в той части гена, которая контролирует синтез домена Н белка FruB.

Таблица 1. Влияние фруктозы и мутации fruR на индукцию ß-галактозидазы у мутантов fruH25 и fruH41a)

Генотип

активность ß-галактозидазы (нмоль о-нитрофенола на мг белка в минуту при 27°С)

без фруктозы с 0.4% фруктозы

fruH25 fruR fruH25 fruH41 fruR fruH41

0.220

0.185

0.090

2.65

0.185

0.290

0.099

3.00

а) Бактерии выращивали при 27° в минимальной среде с 0.4% казаминовых кислот.

Изучение выделенных fruH мутантов с помощью мультикопийных плазмид (рРНРг-7 содержала последовательность нуклеотидов, кодирующую только Н-домен белка FruB; pFPr-6 содержала полную последовательность, кодирующую белок FruB) показало, что введение аллеля fruH+ в мутантные клетки, лишенные псевдо-НРг-активности, сопровождалось восстановлением сбраживания фруктозы у всех трансформантов. Однако, они оставались глюкозонегативными на индикаторных средах. Восстановление сбраживания мальтозы наблюдалось только при введении плазмиды рРНРг-7, но не pFPr-6. Таким образом, было показано, что введение аллеля fruit в мутантные штаммы способствовало только частичному восстановлению сбраживания мальтозы и фруктозы.

Заключая раздел о картировании полученных мутаций, можно с уверенностью сказать, что избранная стратеги), по пучения мутантов с

дефектом в той части гена /гиВ, которая детерминирует синтез Н-домена белка, оказалась правильной. Таким образом, удалось выделить именно те мутанты, которые были лишены псевдо-НРг-активности.

Полученные мутанты послужили источником для конструирования изогенных штаммов, использованных для дальнейших исследований.

4. Влияние повреждения Н-домена белка РгиВ на ростовые свойства

бактерий.

Как оказалось, блок потока фосфорильной группы по белкам ФФТС приводил к снижению способности утилизировать различные субстраты. Проверка утилизации проводилась как в минимальной жидкой среде, так и на индикаторной плотной (Табл. 2).

Поскольку бактерии, несущие мутации ],гиН и р1.ч11/гиН, растут с использованием в качестве единственного источника углерода глюкозо-6-фосфат, то они не являются дефектными по ферментам гликолиза. Однако, оказалось, что у бактерий, имеющих только поражение Н-домена белка РгиВ, несколько снижена способность утилизировать субстраты цикла трикарбоновых кислот (лактат, сукцинат, пируват).

Отсутствие псевдо-НРг-активности приводит к неспособности сбраживать только фруктозу, при этом сохраняется сбраживание всех ФТС- и не-ФТС-субстратов (Табл. 2). Бактерии, лишенные как псевдо-НРг-активности ФФТС, так и активности белка НРг, не сбраживают все углеводы. То есть их фенотип подобен фенотипу бактериальных штаммов с отсутствием общих компонентов ФТС - Лр!з.

Таблица 2. Сбраживание углеводов клетками мутантов, лишенных различных компонентов ФФТС.

генотип углевод 1%

глюкоза фрук то-за маль -тоза ма н- лактоз а сорбит дульци т араби-ноза галактоза ацетил ксилит фруктоз а+ глюко-нат

+ + + + . + + + + + + + + +

р1.чН - + • - - - - - - - - - - -

/гиИ + - + + + + + + + + + + +

р1зН/гиН - - - - - - - - - - - - -

Ар1.г - - - - - - - - - - - - -

р1зН/гиВ - - - - - - - + + - - - -

р(вН/ги8 + + + + + - - + + + + + +

ГгиВ + - + + + + + + + + + + +

/гиА + - + + + + + + + + + + +

р1зН/гиА - - - - - - - ■ + + - - - -

/гиИ + + + + + + + + + + н/р + +

ркН/гиЯ + + + + + + - + + + н/р + +

+- сбраживание; - нет сбраживания; н/р - нет роста

Для сравнения в Табл. 2 представлены данные о других мутантах, дефектных по другим компонентам ФТС.

Поражение Н-домена белка FruB приводит к снижению скорости удвоения биомассы бактерий на различных ФТС углеводах и к полному отсутствию роста на фруктозе (Табл. 3).

Таблица 3 . Время удвоения биомассы время удвоения (минуты)

генотип

глюкоза фруктоза манноза манниг сорбит мальтоза

pis' Ш 138 216 198 240 138

fruH 156 >500 360 258 348 138

В совокупности все представленные данные свидетельствуют о том, что повреждение Н-домена приводит к тому, что клетки не сбраживают фруктозу, не могут использовать ее в качестве единственного источника углерода. Помимо этого у мутантов снижается уровень утилизации глюкозы и других ФТС-углеводов, а также субстратов цикла трикарбоновых кислот.

4. фосфотрансферазная активность и транспорт углеводов у бактерий с повреждением Н-домена белка РгиВ.

Блок передачи фосфорильной группы по цепи белков ФФТС вызывает полное отсутствие аккумуляции фруктозы (ОегБсИапоуисЬ е! а1. 1989). Как оказалось, мутантные клетки с дефектом в Н-домене белка РгиВ, выращенные в среде с этим углеводом, полностью утратили способность аккумулировать фруктозу. Следует отметить, что фруктоза добавлялась именно в той концентрации (10-5 М), при которой она транспортируется только через ФФТС (Табл. 4).

Таблица 4. Влияние поражения Н-домена белка FruB на скорость транспорта углеводов в клетки штаммов E.coli.

Скорость транспорта нмоль углеводов /мг белка за 1 мин при37°С

генотип фруктоза аМГ

pt& 19,5 2,8

fruH 0 1,6

ptsHfruH 0 0,9

а) Клетки были выращены в присутствии 0.4% фруктозы в минимальной среде с казаминовыми кислотами.

Одновременно было установлено, что у бактерий, лишенных псевдо-HPr-активности, значительно снижена скорость аккумуляции метил-a-D глюкопиранозида (аМГ) - неутилизируемого аналога глюкозы. У мутантов с поражением как Н-домена белка FruB, так и белка НРг прослеживается резкое падение скорости транспорта аМГ (Табл. 4).

Определение ФЕП-зависимого фосфорилирования углеводов in vitro показало полное отсутствие фосфорилирования фруктозы у штаммов, лишенных активности Н-домена белка FruB, а также снижение уровня фосфорилирования глюкозы и аМГ (Табл. 5).

Приведенные в Табл. 4 и 5 данные свидетельствуют, что отсутствие транспорта фруктозы обусловлено блоком фосфотрансферазной активности ФФТС. Кроме того, нарушение передачи фосфорильного остатка по цепи белков-переносчиков ФФТС, приводит не только к прекращению поступления фруктозы в клетку, но и вызывает снижение фосфотрансферазной активности глюкозной ФТС и, как следствие, к

нарушению транспорта аМГ. Таким образом, поражение Н-домена ведет к полной остановке транспорта и фосфорилирования фруктозы, а также к снижению активности других фосфотрансферазных систем, что подтверждает данные по определению времени удвоения биомассы бактерий на различных ФТС-углеводах.

Таблица 5. ФЕП-зависимое фосфорилирование углеводов в экстрактах из клеток, с дефектом Н-домена белка РгиВ Скорость фосфорилирования ( нмоли фосфата углевода/мг белка в мин при

37°Са))

генотип фруктоза глюкоза аМГ

3.8 31,6 1,1

/гиН 0 11.2 0.3

р1зЩгиН 0 8.3 0.1

а) клетки выращены в среде с 0,4% фруктозой.

5. Изучение влияния полученных мутаций на активность аденилатцнклазы.

АЦ является одним из наиболее важных ферментов бактерий. От уровня активности данного фермента и от количества цАМФ в бактериальной клетке зависят многие физиологические процессы, связанные с активацией транскрипции комплексом цАМФ-СЛР. Ранее было установлено, что мутационное повреждение белка РгиВ в домене В и белка пвсФру вызывает снижение активности АЦ и соответственно снижение уровня цАМФ в бактериальной клетке (СегеЬапоуюШ е1 а1. 1989). Представляло большой интерес выяснение влияния поражения Н-домена белка РгиВ на активность этого фермента.

Для этого была проверена активность АЦ в клетках штаммов несущих тот или иной дефект ФТС (Табл. 6).

Оказалось, что при повреждении Н-домена белка РгиВ наблюдается резкое снижение активности АЦ по сравнению с активностью данного фермента в штамме дикого типа. При этом следует отметить, что активность АЦ определялась в клетках, выращенных в безуглеводной среде.

Таблица 6. Влияние мутаций во^гм-опероне на активность аденилатциклазы.

генотип активность АЦ (пмоль цАМФ / мг белка /

мин при 30° С) 16,6

рЬН 15,8

РгиВ57"' 4.0

/гиН 6,9

рпЩгиН 4,5

ртЩ'гиН 5,7

р1*Н/гиН/ги8 7,5

а) ГгиВ57- мутация, затрагивающая целостность домена В белка Д-иВ.

Исходя из данных приведенных в Табл. 6, видно, что поражение любого домена белка РгиВ приводит к снижению активности АЦ. Ранее было показано (ОегБсИапоуисЬ е1 а1. 1989), что повреждение гена /гиА также приводит к снижению активности АЦ. Таким образом, можно предположить, что целостность генов, кодирующих транспортные белки ФФТС, необходима для нормальной работы АЦ у кишечной палочки.

7. Определение подвижности бактериальных штаммов в полужидком агаре.

Одной из физиологических характеристик кишечной палочки является подвижность клеток в полужидком агаре. Ранее было показано, что снижение подвижности бактерий в полужидком агаре коррелирует с уменьшением уровня внутриклеточного содержания цАМФ (Башг е1 а! 1990).

Таблица 7. Относительная подвижность бактерий в полужидком агаре.

генотип рк// ркИ/гиН /гиН Ар1.к

углевод

б/у 1 0.6 0.3 0.9 0

6/у+цАМФ 1.1 0.7 0.5 0.9 0.4

глюкоза 0.4 0.8 0.3 0.3 0

глюкоза + цАМФ 0.6 0.8 0.3 0.3 0.4

фруктоза 0.8 0.3 0.2 0.5 0

фруктоза +цАМФ 1.3 1.0 0.8 0.7 0.4

мальтоза 0.5 0.7 0.3 0.4 0.1

мальтоза+цАМФ 0.8 1.2 0.6 0.6 0.4

Поскольку у бактерий, имеющих повреждение Н-домена белка РшВ, регистрировалось снижение активности АЦ (Табл. 6), представлялось интересным проверить подвижность у клеток с таким дефектом. В качестве контроля были взяты штаммы как дикого типа (максимальная подвижность), так и с делецией в области (неподвижная культура). За единицу принята подвижность штамма дикого типа в полужидком 0,25 % агаре без углеводных добавок (б/у), за 17 часов инкубации при 30°С (Табл.7).

Как видно из приведенных данных (Табл.7), наблюдается уменьшение подвижности у бактерий, лишенных активности Н-домена белка РгиВ. Подвижность восстанавливается при добавлении в среду цАМФ до концентрации 1мМ. При трансформации бактерий с дефектом Н-домена мультикопийными плазмидами с клонированным в их составе/гиН' аллелем, подвижность мутантных клеток увеличивалась. (Данные не представлены в Табл. 7).

В целом, можно сказать, что для нормальной подвижности клеток необходима целостность Н-домена белка РгиВ. Представленные выше данные по снижению активности АЦ в мутантных клетках хорошо согласуются с данными по подвижности бактерий в полужидком агаре.

8. Влияние поражения Н-домена на скорость синтеза индуцибельных

ферментов.

ФТС регулирует транспорт и катаболизм веществ, не являющихся субстратами ФТС - например, лактозы (Гершанович и др. 1970). Для исследования влияния поражения Н-домена белка РгиВ на индуцибельный синтез катаболитчувствительных ферментов у мутантов определяли дифференциальную скорость синтеза р-галактозидазы. Результаты представлены в Табл.8. Показано, что утрата клетками псевдо-НРг-активности также, как и утрата активности белка НРг сопровождается значительным снижением скорости дифференциального синтеза Р-галактозидазы по сравнению со штаммом дикого типа. У мутантов, лишенных как псевдо-НРг-, так и НРг-активности, скорость индуцнбельного синтеза р-галактозидазы снижена чрезвычайно, сильно (Табл.8). Также показано, что конститутивный синтез белков фруктозного оперона (генотип восстанавливает исходную скорость индуцибельного синтеза и

компенсирует утрату активности белка НРг. Также показано, что при отсутствии как НРг-, так и псевдо-НРг-активности, даже на фоне конститутивного синтеза белков фруктозного оперона наблюдается значительное снижение скорости индуцибельного синтеза р-галактозидазы (бактерии с генотипом р1яН/гиН/ги5).

Таблица 8. Влияние повреждения Н-домена белка РгиВ на дифференциальную скорость синтеза Р-галактозидазы.

генотип активность Р-галактозидазы (нмоль о- нитрофенола на мг белка в минуту при 27°С а))

pts+ 300

ptsH 150

fruH 210

ptsHfruS 300

ptsHfruH 130

ptsHfruHfruS 160

а) клетки выращивались в безуглеводной среде с казаминовыми кислотами. Индукцию проводили добавлением изопропил-р-О-глкжопиранозидом.

Исходя из представленных данных, следует, что, помимо НРг, наличие в клетке интактного белка РгиВ обуславливает индукцию катаболитчувствительных ферментов. Снижение скорости индуцибельного синтеза в случае повреждения только Н-домена белка РгиВ может быть

обусловлено пониженным содержанием цАМФ в клетке.

*******************

• Л

На основании представленных исследований можйо с уверенностью сказать, что белок РгиВ играет важную роль в физиологии бактериальной клетки. Нарушение целостности Н-домена данного белка сказывается не только на нарушении транспорта фруктозы в бактерию, но и на транспорте и

фосфорилированни других ФТС-углеводов и на регуляции многих

физиологических процессов таких, как подвижность, скорость синтеза

индуцибельных ферментов, активность АЦ у энтеробактерий.

Выводы:

1. С помощью транспозона TnPhoA и дефектного профага Mudllac получены мутанты кишечной палочки, лишенные активности Н-домена белка FruB фруктозной фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы.

2. Полученные мутации генетически исследованы, произведено особо точное картирование вставки дефектного профага Mudllac, показавшие наличие мутациив той части гена fruB, которая детерминирует синтез Н-домена белка FruB. Сконструированы серии изогенных штаммов.

3. Мутационное повреждение Н-домена белка FruB приводит к нарушению транспорта, фосфорилирования и утилизации фруктозы в результате блока активности фруктозной фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы. Установлено, что повреждение данного компонента системы сопровождается снижением процесса утилизации углеводов-субстратов фосфотрансферазной системы (глюкозы, маннозы, сорбита, маннита). Показано, что отсутствие псевдо-НРг-активности приводит к снижению активности других специфических фосфотрансферазных систем.

4. Показано, что мутационное повреждение Н-домена белка FruB приводит к снижению активности одного из важнейших ферментов бактерий -аденилатциклазы и, как следствие, к уменьшению уровня цАМФ в бактериальной клетке.

5. Мутационное повреждение Н-домена белка FruB вызывает снижение подвижности клеток E.coli в полужидком агаре. Введение в клетку fruH

аллеля или добавление в среду цАМФ восстанавливает утраченную подвижность мутантных клеток.

6. Мутационное повреждение Н-домена белка FruB приводит к снижению скорости транскрипции катаболитчувствительных генов, что показано на модели лактозного оперона.

7. Установлено, что интактность белка FruB - компонента фруктозоспецифичной фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы - необходима для нормального протекания многих физиологических процессов в бактериальной клетке.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Сергеев К.В., Большакова Т.Н., Добрынина О.Ю., Ерлагаева P.C., Гершанович В.Н.

Векторный метаболизм фруктозы и регуляция генной активности у бактерий. Материалы VII съезда Всероссийского общества Эпидемиологов, Микробиологов и Паразитологов, МоскЕа, 28-31 января 1997 года, Т.1,С. 239-240.

2. Сергеев К.В., Умяров A.M., Добрынина О.Ю., Большакова Т.Н, Гершанович В.Н.

Выделение и свойства мутантов, лишенных псевдо-HPr- активности системы переноса фруктозы у Esherichia coli К-12, 1997 Генетика, Т.ЗЗ, №3, С. 321-327.