Использование рекомбинационной инженерии для прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli

Крылов, Александр Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование рекомбинационной инженерии для прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование рекомбинационной инженерии для прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli"

0046

6282

Крылов Александр Александрович

«Использование рекомбинационной инженерии для прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli»

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ЛЕН 2010

-Москва 2010-

004616282

Работа выполнена в лаборатории №4 Закрытого Акционерного общества «Науч исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент И.В. Бирюкова

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор C.B. Машко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.П. Вейко ФГУП ГосНИИгенетика

доктор биологических наук, доцент Л.И. Патрушев

Институт биоорганической химии РАН

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится «21» декабря 2010 года в 14— на заседа! Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный науч исследовательский институт генетики и селекции промышлею микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан «_ /У » ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Т.Д. Воюшин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время приоритетным для биотехнологии является конструирование бесплазмидных, безмаркерных бактериальных штаммов-продуцентов. Интеграция в хромосому генов, кодирующих целевые рекомбинантные белки или ферменты, катализирующие необходимые метаболические превращения, коренным образом решает проблемы, связанные со стабильным наследованием целевых плазмид [Friehs, 2004] и их отрицательным влиянием на жизнеспособность клеток [Sauer, 2001; Brownlie u др., 1990], а также удовлетворяет законодательному запрету на использование в промышленности плазмидных штаммов-продуцентов в ряде стран. Смещение приоритета метаболической инженерии на бесплазмидные системы экспрессии целевых генов привело к необходимости адаптации классических и разработки новых молекулярно-биологических подходов конструирования на основе современного инструментария модификации хромосомы.

Escherichia coli является удобным микроорганизмом для разработки таких подходов. В настоящее время создан разнообразный генно-инженерный инструментарий для модификации хромосомы Е. coli. Например, метод Red/RecET-зависимой рекомбинационной инженерии (Recombination mediated genetic engN neering = Recomhineering) позволяет инактивировать целевые гены путем деле-ции «с сохранением открытой рамки считывания» гена-мишени, заменять регу-ляторные области и проводить сайт-специфический мутагенез кодирующих участков [Sawitzke и др., 2007]. Разработаны методы интеграции протяженных фрагментов ДНК в случайные [Ахвердян и др., 2007] и в строго определенные участки генома Е. coli [Minaeva и др., 2008]. В тоже время штаммы Е. coli традиционно используют в биотехнологическом производстве в качестве промышленных продуцентов рекомбинантных белков, органических кислот, витаминов, этанола и аминокислот, а также относительно новых продуктов - бутанола, 1-3-пропандиола, лейкопина, полифенолов и растительных флаваноидов [Wendisch и др., 2006; Patnaik, 2008; Demain и др., 2008]. Поэтому все разработанные на данном виде бактерий подходы конструирования приобретают практическую значимость. Необходимо также отметить, что многие из перечисленных методов, исходно разработанных для Е. coli, постепенно адаптируются для работы с другими микроорганизмами, такими как Salmonella [Husseiny и Hensel, 2005; Karlinsey, 2007], Shigella [Shi и др., 2003; Ranallo и др., 2006], Yersinia [Derbise и др., 2003; Lesic и др., 2004], Pseudomonas [Lesic и Rahme, 2008], Pantoea [Katashkina и dp, 2009]. Следовательно, разработка новых подходов оптимизации экспрессии генов в Е. coli позволяет надеяться на их будущую универсальность.

Цель и задачи работы. Диссертационная работа посвящена разработке новых молекулярно-биологических подходов прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli на основе рекомбинационной инженерии.

В ходе работы решались следующие задачи:

•прецизионная модификация локусов хромосомы Escherichia coli посред- ч ством применения Red-зависимой интеграции «вырезаемого» маркера; "i

•оптимизация экспрессии генов биосинтетических путей на поздних стадиях культивирования бактериальных штаммов путем использования метаболически регулируемых промоторов Pho регулона;

•разработка метода оптимизации экспрессии дистально расположенных цистронов в искусственных оперонах на основе TGATG-оверлаппонов;

• исследование возможности применения конвергентной транскрипции для эффективного подавления экспрессии целевых генов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что рекомбинационная инженерия позволяет прецизионно маркировать целевые генетические локусы, для удобства их переноса в другие штаммы, с последующим удалением маркера, тем самым, осуществлять конструирование штаммов, не содержащих генов устойчивости к антибиотикам.

Показано, что промоторы Pho регулона Е. coli, ?рн0л и Ppms, могут быть использованы для повышения уровня экспрессии целевого биосинтетического гена на поздних стадиях роста бактерий на комплексной среде с глюкозой, если растворимый неорганический фосфат является фактором ограничения роста биомассы.

Разработан метод оптимизации экспрессии дистально расположенных цистронов в искусственных оперонах посредством создания трансляционного сопряжения между цистронами.

Разработана модификация метода регулируемого подавления экспрессии генов путем организации встречной транскрипции, повышающая его эффективность за счет Rho-зависимой антитерминации.

Разработанные в ходе выполнения диссертации методы и подходы апробированы на модельных системах и успешно использованы в экспериментах по метаболической инженерии продуцентов аминокислот, имеющих значение для индустриальной биотехнологии.

Публикации н апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в ведущих рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 2 сообщения в материалах международных научных конференций (Prague, Czech Republic, 2006; Lisbon, Portugal, 2009), оформлена заявка на патент РФ №2008105793. Материалы диссертации докладывались автором на конкурсе работ молодых сотрудников ЗАО «АГРИ» (Москва, 2009). Апробация диссертации состоялась на совместном семинаре ЗАО «АГРИ» и секций «молекулярная биология» и «генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП ГосНИИ-генетика (Москва, 2010).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на /А5~ страницах, включая 2-Г~рисупков и таблицы. Список цитируемой литературы содержит 2.05~ источника, в том числе 8 на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Red-зависимое маркирование целевых локусов хромосомы

Конструирование нового штамма - это процесс последовательного введения новых модификаций и мутаций в геном исходного штамма. В практике конструирования нового штамма часто возникает необходимость переноса в его геном известной мутации, не имеющей легко тестируемого фепотипического проявления. Безусловно, классическая генетика микроорганизмов имеет разнообразные методы «маркирования» таких мутаций для их последующего селективного переноса. Например, можно использовать представительные коллекции штаммов, содержащих в известных позициях генома транспозоны с генами устойчивости к антибиотикам [Singer, et ah., J989]. Однако эти подходы достаточно трудоемки и длительны, особенно на этапе удаления использованного маркера из генома целевого штамма после переноса мутации. Использование инструментария рекомбинационной инженерии позволяет революционным образом модифицировать процедуру переноса таких мутаций, обеспечивая существенные преимущества. Первым преимуществом является возможность выбора точки интеграции маркера, обеспечивающей эффективную ко-трансдукцию маркера с целевым локусом. Второе - предварительный выбор точки позволяет избежать негативных последствий интеграции маркера на функциональность окружающих генетических единиц. Третье - метод предусматривает использование «вырезаемого» маркера [Каташкина и др., 2005], что значительно облегчает конструирование безмаркерных штаммов.

Эффективность модифицированного подхода была продемонстрирована в данной работе на примере создания штамма MG1655 с улучшенными ростовыми характеристиками.

1.1 Получение штамма MG1655 с улучшенными ростовыми характеристиками

Штамм Е. coli MGI655 с полностью установленной последовательностью генома [Blattner и др., 1997] представляет значительный интерес для метаболической инженерии в качестве исходного штамма для дальнейших модификаций. Однако некоторые из имеющихся в этом штамме мутаций (ilvG, ф-50, rph-1) в определенных условиях негативно влияют на рост бактерий, важнейший параметр для метаболической инженерии. В частности, следствием мутации rph-1 (делеция одной пары оснований в 3'-конце кодирующей части гена грК) является приблизительно 100 кратное снижение уровня экспрессии ниже расположенного гена ругЕ, приводящее к частичной ауксотрофности по пири-мидинам и снижению скорости роста на минимальных средах [Jensen, 1993]. Известно, что данная мутация свойственна не всем лабораторным штаммам Е. coli [Jensen, 1993; Gaal и др., 1997]. Так другой лабораторный штамм TG1 содержит ген rphM, а известные для этого штамма мутации (supE, hsd, thi, Д(lac-proAB)) локализованы на значительном от гена rph расстоянии [Sambrook и Rüssel, 2001]. Поэтому, было решено перенести локус rph-pyrE хромосомы TG1 с помощью PI трансдукции в штамм MG1655, предварительно маркировав его с использованием метода Red-зависимой рекомбинации.

Для этого в точку на хромосоме TG1 между генами yicC и dinD, имеющую позицию 3.815.639 по геному Е. coli MG1655 [GenBank U00096] и находящуюся па расстоянии 1737 нуклеотидов от места мутации rph-1, был интегрирован ген хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), обеспечивающей устойчивость клеток к хлорамфениколу, фланкированный сайтами XattL/R. Наличие данных сайтов позволяло на последнем этапе конструирования быстро и прецизионно удалить маркер посредством механизма XInt/Xin сайт-специфической рекомбинации с образованием на его месте последовательности XattB длинной в 31 нуклеотид.

Полученный таким образом штамм Е. coli TG\-\yicC-XattR-cat-XattL-dinD] был использован в качестве донора для PI трансдукции маркера устойчивости к хлорамфениколу (CmR) в MGI655. Ко-трансдукция гена rpW в MG1655 была доказана с помощью специфической ПЦР (MAMA-PCR [Cha и др., 1992]) (см.

Рисунок 1. Электрофоретическое разделение в агарозном геле (1,6%) фрагментов ДНК, амплифицированных с хромосом штаммов: MG1655, MG1655-[rphwl,CmR] и TGI. Дорожки 1,3,5- rptí", 2, 4, 6 - rph-1

Использованные праймеры: прямые

5'-ctacaatggattcgattcccct-3' - rph-1 5'-tacaatggattcgattCcccct-3' - rphw' комплиментарный зоон.п. 5'-agaagctggtggaaaacgg-3'

200н.п.

После удаления маркера Стя А. 1п1/Х1Б рекомбиназой из хромосомы нового штамма и подтверждения структуры грИ*" секвенированием, был исследоваи рост клеток штамма М01655-[/у?Л™'] на минимальной среде с глюкозой (Глк). Показано, что замена мутантного локуса грЬ-1 ругЕ в хромосоме Мв1655 на соответствующий локус «дикого типа» приблизительно на 20 % (от 0,56 час"1 до 0,69 час"1) увеличила скорость роста нового штамма по сравнению с исходным 1уЮ1655 (см. рис. 2). Полученные нами данные согласуются с имеющимися литературными данными \Soupene и др., 2003].

2 т

Рисунок 2. Кинетика роста штаммов МО 1655 (■) и М01655-[гркт] (о) на минимальной среде с Глк

0 2 4 6 8

Время, ч

Таким образом, типичная задача по переносу исходно немаркированных мутаций была успешно решена, благодаря использованию современных методов, основанных на механизмах Независимой гомологичной и Х1п1/Х1з-зависимой сайт-специфической рекомбинации. Несомненными достоинствами использованного подхода является также быстрота проведения процедуры и полностью охарактеризованная структура модифицированной области хромосомы.

2. Метаболически регулируемая активация экспрессии целевых генов

Одной из основных проблем современной метаболической инженерии является снижение продуктивности клеток штаммов-продуцентов при переходе в стационарную фазу роста за счет существенного снижения их метаболической активности [Hengge-Лroms, 1996]. В связи с этим, особый интерес представляют подходы, обеспечивающие регулируемую активацию экспрессии целевых генов в стационарной фазе роста клеток.

Известно, что одним из ключевых ферментов биосинтеза ароматических аминокислот является З-деокси-э-арабино-гептулозонат 7-фосфат синтетаза (ОАНРБ, ЕС 2.5.1.54). В нашем распоряжении имелся штамм-продуцент ь-фенилаланина (ь-РЬе), ОУ269-2, \Doroshenko и др., 2010]. В его хромосоме наряду с тремя генами агой, агор и агоН, кодирующими ЭАНРЗ, чувствительные к ретроингибированию ь-РЬе, ь-тирозином (ь-Туг) и ь-триптофаном (ь-Тгр), соответственно \Pittard, 1996], присутствовал также мутантный ген агоС4, продукт которого устойчив к ретроингибированию ь-РЬе \Kikuchi и др., 1997]. Гены агой и агоС4 находились под транскрипционной регуляцией нативного промотора Ратос- Измерение активности ОАНРБ в экстрактах клеток штамма ОУ269-2, выросших на комплексной среде в условиях ограничения роста биомассы при истощении неорганического фосфата (Р1), выявило: (г) ее приблизительно двукратное падение на поздних стадиях культивирования (см. рис. 3); (//) пренебрежимо малый вклад в общую активность двух других изоферментов, АгоР и АгоН (данные не представлены) и (ш) примерно одинаковую активность АгоО и Аго04 (см. рис. 3).

5 7

Время, ч

Рисунок 3. Временной профиль активности ОАНРБ в клетках штамма 0\'2б9-2 измеренной без (■) и с добавлением (□) Ь-РЬе (5 мМ).

Также было обнаружено, что истощение Pj в среде в процессе культивирования клеток, приводящее к активации Pho регулона [Wanner, 1996; Hsieh и Wanner, 2010] и возрастанию активности щелочной фосфатазы E.coli (PhoA) (см. рис. 4А), происходило, когда оптическая плотность культуры не превышала 70% от максимально достигаемого значения (см. рис. 4Б).

5 4

Рисунок 4. Временные профили культивирования клеток штамма DV269-2, отражающие:(А) потребление Р; (□) и активность PhoA (■); (Б) потребление Глк (•), рост клеток (А) и накопление L-Phc (о)

Кроме того, были основания полагать, что AroG не вносит существенного вклада в накопление L-Phe клетками штамма DV269-2 при суперпродукции этой аминокислоты из-за ретроингибирования фермента «дикого типа» [Doro-shenko и др., 2007]. Действительно, делеция гена aroG в штамме DV269-2, полученная методом Red-зависимой рекомбинации, не повлияла на накопление L-Phe новым штаммом ((4,7±0,3) г/л). Поэтому мы ожидали, что введение в геном штамма DV269-2 вместо aroG второй копии aroG4 под транскрипционным контролем одного из промоторов Pho регулона Е. coli приведет к увеличению уровня активности DAHPS на поздней стадии роста клеток и, следовательно, к повышению уровня продукции L-Phe.

2.1. Конструирование VphBÄipslS-aroG4 методами рекомбинационной инженерии

На первом этапе в штамме М01655-[Дф80а//0па1|уе] вместо гена aroG с помощью Red-зависимой интеграции был введен фрагмент, содержащий маркер устойчивости к канамицину (KmR), окруженный сайтами ф80attL/R. Затем данный маркер был удален с помощью ф801Ш/Х1з рекомбиназы, и в образовавшийся сайт ф80atlB с помощью ф80 сайт-специфической интеграции была интегрирована плазмида pAH162-[aroG4]. Вся процедура была проведена согласно предложенной Минаевой и соавт. стратегии прецизионной интеграции протяженных участков ДНК в хромосому Е. coli [Minaeva и др., 2008]. Полученная конструкция содержала беспромоторную копию гена aroG4 вместо гена aroG в бактериальной хромосоме. На следующем этапе методом ПЦР были получены два фрагмента, содержащие «вырезаемый» маркер CmR и один

из промоторов Pho регулона: Рpi,0a или P/;v,.y [Taschner et al, 2004]. Фрагменты были интегрированы с помощью Red-зависимой гомологичной рекомбинации перед геном aroG4. Полученные штаммы MG\655-[aroG::PplmA-aroG4, Дф80а«0пми.е] и MGl655-[aroG::Pps,s-aroG4, Дф80а«5пай»е] использовали в качестве доноров для PI трансдукции структур ?phaAiPsts-aroG4 в штамм DV269-2. XInt/Xin зависимое удаление маркера из хромосом штаммов DV269-2-[PphoAip.MS-aroG4] завершило процедуру введения второй копии гена aroG4 под контролем Pj-индуцибельных промоторов (см. рис. 5).

Рисунок 5. Существенные компоненты промоторов ?pstS и PPhoA- РНО-бокс (прямоугольник), сайт связывания белка IHF (овал), последовательность области «-10» (подчеркнута) содержащая С в позиции -13, существенная для связывания с as [Taschner и др., 2006]. Сайт XattB остается после Wnt/Xin-зависимого удаления маркера CmR. Trg,,¡¡ и TL3, терминаторы транскрипции из интегративной плазмиды рАН162 [Minaeva и др., 2008]

2.2. Характеристика новых штаммов Х)\2(>')-2-\\,г1и,Л!1пЛ-агоС4\

Измерение активности ОДИРБ в экстрактах клеток штаммов БУ269-2-[Рр>юлРхб-агоС4] продемонстрировало эффект метаболической активации экспрессии введенной копии агой4 (см. рис. 6).

FÍtb

Рисунок 6. БАИРБ активность в клетках штамма \iV269-2 содержащего: А агоС4 (□), РрШ-агоС4 (■) и РР^агоС4 (в)

Время, ч

Повышение уровня активности ОАНРБ на поздних стадиях культивирования клеток привело к увеличению накопления Ь-РИе соответствующими штаммами (см. таб. 1).

Таблица 1

Максимальный рост и накопление L-Phe штаммами-продуцентами

Штамм мах ОП600пм L-Phe, г/л

DV269-2 28±1 4,8±0,3

DV269-2-[MroG] 27±1 4,7±0,3

DV269-2-[P phoA-aroG4] 30±1 6,1 ±0,3

DV269-2-[P pslS-aroG4] 31±1 6,7±0,3

Известно, что промотор Р/>s,s единственный из изученных промоторов Pho регулона, который узнается комплексом кор-фермента РНК полимеразы Е. coli (Е) как с а70, так и с as субъединицей [Taschner и др., 2006]. Поэтому его использование для поддержания высокого уровня транскрипции на поздних стадиях культивирования выглядит более перспективным. Действительно, двумерный электрофорез белков, выделенных из клеток штамма DV269-2-[P/,J/i-aroG4] после длительного (>40 ч) культивирования, наглядно продемонстрировал, что количество белка AroG4, ген которого в данном штамме находился под контролем Рpsis, остается практически неизменным, а доли таких белков, как PhoA и глутамат дегидрогеназы (GdhA), гены которых транскрибируются лишь Ео70, уменьшаются в препаратах клеточных белков на поздних стадиях ферментации (см. рис. 7).

Рисунок 7. Двумерный гель-электрофарез белков клеток штамма ВУ269-2-[Рр5,ь-агов4] на 20ч и 40ч в условиях длительного культивирования

-pl 5.3

Таким образом, использование современного инструментария рекомбина-ционной инженерии, позволило нам эффективно повысить уровень биосинтеза целевого продукта за счет искусственно обеспеченной транскрипции ключевых биосинтетических генов с метаболически регулируемых промоторов, активных в стационарной фазе роста клеток. Отметим, что использование промоторов РЬо регулона, особенно промотора Р^ может быть целесообразно в случаях длительного культивирования клеток на комплексных средах в условиях ограничения роста биомассы количеством исходно добавленного неорганического фосфата.

3. Повышение уровня экспрессии дистальных цистронов искусственных оперонов за счет эффекта трансляционного сопряжения

Практика конструирования искусственных оперонов из отдельных цистронов в метаболической инженерии давно существует и весьма успешна. Однако имеются многочисленные примеры, когда для таких искусственных оперонов наблюдаются полярные эффекты, приводящие к снижению уровня экспрессии дистальных цистронов [Smolke u Keasling, 2002]. Проблема обостряется при переносе искусственных оперонов с плазмидных систем в хромосому, так как при этом копийность генов, входящих в состав оперона, значительно снижается.

Для преодоления этих трудностей нами был разработан метод оптимизации экспрессии дистальных цистронов посредством организации в хромосоме искусственных «TGATG-оверлаппонов» [Машко и др., 1984; Schoner и др., 1984]. Метод основывается на явлении трансляционного сопряжения [Oppenheim и Yanofsky, 1980], суть которого заключается в ре-инициации трансляции дистального цистрона 30S субъединицами рибосом, терминирующихся на стоп-кадоне проксимального цистрона. Тем самым нивелируется зависимость инициации трансляции последующего гена от вторичной структуры межцистронной области, и снижается вероятность возникновения полярного эффекта.

3.1. Оценка эффективности экспрессии генов оперона Vtac.\ütix-aroG4-serA5

В нашей лаборатории был сконструирован искусственный оперон Ptoc-idear aroG4-serA5, кодирующий устойчивые к ретроингибированию варианты ключевых ферментов пути биосинтеза L-Trp, находящихся под контролем искусственного, ИПТГ индуцибельного промотора Рц,с-иы [Машко и др., 2001; Скоро-ходова и др., 2006]. Интегрированный в хромосому MG1655 оперон был маркирован в дистальной области «вырезаемым» CmR для облегчения его переноса в другие штаммы с помощью PI трансдукции.

Клетки штамма АВ3257{lacF1, Aro"), получившие оперон ¥<ас-\лы-aroG4-serA5 в результате PI трансдукции, при высеве на минимальную среду восстанавливали способность к синтезу ароматических соединений даже без индукции ИПТГ. Отметим при этом, что уровень репрессии транскрипции с Ptoc.¡deai в штаммах с lacF* составляет около 10% от уровня максимальной дерепрессии [Машко и др., 2001]. В клетках штамма Е. coli TGI (/ас/0), куда оперон также был перенесен с помощью PI трансдукции, уровень активности DAHPS при росте на среде без ИПТГ не отличался от контрольных значений в исходном штамме TG1 (0,22+0,23) ед/мг, и значительно возрастал в условиях индукции (1,08 ед/мг). Исходя из известных данных об удельной ферментативной активности очищенного AroG (67 ед/мг [Simpson и Davidson, 1976]), уровень накопления AroG/AroG4 в условиях индукции можно оценить в ~1,6% от суммарных клеточных белков. Таким образом, полученные данные свидетельствовали о высоком уровне экспрессии первого в опероне гена aroG4. В тоже время, уровень экспрессии дистального цистрона, serA5, был явно ниже. Так для клеток штамма MGieSSilacF1, Ser"), содержащих данный оперон, ауксотрофность по Ser частично комплементировалась лишь в условиях индукции оперона: в присутствии ИПТГ наблюдался достоверный рост клеток на минимальной среде,

но более слабый, чем у клеток контрольного штамма MG1655, а без добавления ИПТГ рост практически отсутствовал.

Секвенирование оперона показало отсутствие мутаций в гене serA5. Удаление маркера CmR с сохранением за serAS лишь XattB перед тандемом р-независимых терминаторов транскрипции фага fd, которые, как правило, обеспечивают стабилизацию мРНК [Makrides, 1995], не повлияло на эффективность экспрессии гена serAS. Хотя компьютерный анализ [Reuter и Mathews, 2010] четко не выявил вторичных структур РНК, маскирующих SD последовательность гена serA5, единственным объяснением наблюдаемого низкого уровня его экспрессии был полярный эффект, возникающий вследствие неэффективной инициации трансляции. Повысить ее эффективность предполагалось, обеспечив сопряжение трансляции гена serAS с геном aroG4, по механизму сопряжения цистронов в природных оперонах.

3.2. Оптимизация экспрессии serAS путем преобразования структуры оперона

Для проведения модификации оперон P,ac.iiM[-aroG4-serA5 был перенесен трансдукцией в штамм BW25113 [Datsenko и Wanner, 2000] с последующим XInt/Xis-зависимым удалением дисталыюго маркера CmR. In vitro, двумя раундами ПЦР амплификации, был получен ДНК фрагмент, на одном фланге которого содержался участок природного сопряжения между генами rplC и rpID, (условно rplD'), кодирующими рибосомальные белки L3 и L4, и область гомологии к гену aroG4, а на другом — участок природного сопряжения между генами trpE и trpD (условно VгрЕ), кодирующими две субъединицы одного фермента, и область гомологии к гену serAS. Использование последовательности природного трансляционного сопряжения rplCD является ключевым моментом подхода Особенность данной группы природных межцистронных участков заключается в расположении терминирующего кодона проксимального гена перед SD последовательностью дистального цистрона (см. рис. 8). Такая структура обеспечивает сопряжение без дополнительной модификации З'-концевого участка кодирующей последовательности проксимального гена.

trpED рИСунок 8. Межцистронные участки неко-'rpDC Т0РЫХ паР трансляционно-сопряженных генов Е. coli и их существенные компо-rpICD ненты: терминирующий кодон прокси-rpIDW мального гена (подчеркнут), SD-rpIWB последовательность (жирный курсив) и hisGD ATG-кодон дистального гена (жирный hisDC шрифт) hisCB

В центральной части полученного in vitro фрагмента находился маркер CmR, окруженный сайтами XattL/R для его последующего ¡ünt/Xin-зависимого удаления. Сайты XattL/R были ориентированы таким образом, чтобы после удаления маркера остающийся в хромосоме XattB не содержал в открытой рам-

CAGGAGACTTTCTGATG С GAGSGGAAATCTGATG GCACGAGGGTAAATG

TAAGGAGATAGCAATG GAGGAGATGC'1'GGCATGA TAAGTCGGAGGAGTAATACAATG

ATGGAGTGATCGCCATG CTTAAGGAGCAAGCATGA GCGGAGCAAGTTTGA

ке считывания, начинающейся с АТСг/,щ и заканчивающейся ТОА,ф£, терминирующий кодон. Описанный фрагмент ДНК был прецизионно интегрирован с помощью Яес1-системы в оперон, в область между генами аго04 и БегА5. Наличие маркера позволяло переносить частично модифицированный оперон в различные штаммы трансдукцией. Удаление маркера из области модификации приводило к образованию трицистронного оперона ?1с,с^ел\-агоС4-{1'рЮ'-'каиВ-'1грЕ)-зегА5, в котором трансляция гена ¡егА5 через сопряжение с искусственно образованным промежуточным цистроном (грЮ'-"КаиВ-ЧгрЕ) становилась сопряженной с трансляцией гена агоС4 (см. рис. 9).

сц1

амплифицированный фрагмент ДНК грЮ'АсшК-ссИ-ХаШ-'ГгрЕ

Рт;м \attL

область '1грЕ

(Чес1-зависимая интеграция

Р шЫЛ<,,-агоС4-$егЛ5

2Т,а

/.а ПВ

агов4 Хаии са1 ' Р™ \attL эегА5

} # 4 ............................ .

область грЮ'

Р„м-агоС4-{грЮ'-и1ПК-си1-Ха111-'ГгрЕ)-5егА5

область ЪрЕ \gttB

/ЦщЖз-зависимое удаление Сш"-маркера

ыш агоС4 ♦ 1 вегА5

2Т»

?,„м-"г"С4-(гр10 '-шиВ- '1грЕ)-яегА5

1аПВ . \attB область грЮ' область 'прЕ

область грЮ' ХаПВ область ЧгрЕ

----------ме1А1а11сиРЬсА1а01пУг.1^сп1сЬуь.:у;.с.1 г«а111«ми(йп61»йй:ёйё**'*--

Рисунок 9. Схема конструирования трансляционно-сопряженного трицистронного оперона 'Р1ас^ы\-аго04-{1-рЮ'-\аПВ-'1грЕ)-зегА5

3.3. Оценка уровня экспрессии гена serAS в трицистронном опероне

Модифицированный оперон Pk,c.M-aroG4-(rplD'-\attR-cat-XattL-'trpE)-serAS был введен с помощью PI трансдукции в штамм MGlóSS^ac.T', Ser"). Напомним, что изогенный штамм с Ptac.\A^\-aroG4-serA5 был способен к достоверному росту на минимальной среде только в условиях полной индукции опе-рона ИПТГ. Вновь полученный штамм, содержащий маркированный оперон Piac-idearüroG4-(rplD'-XatíR-cat-XattL-'írpE)-serA5 имел фенотип Ser" независимо от присутствия ИПТГ в срсде. Однако, после удаления маркера с помощью XInt/Xin-рекомбиназы штамм с трицистронным опероном, Рk,c.\¿^\-aroG4-{rplD'-XattB-'trpE)-serA5, был способен к заметному росту на минимальной среде даже в отсутствии ИПТГ. Этот качественный тест однозначно указывал на существенное повышение уровня экспрессии serA5 в результате модификации исходного оперона.

Для количественной оценки уровня биосинтеза SerA5 препараты клеточных белков из штаммов E.coli BW25113, содержащих модифицированный и исходный опероны, разделяли двумерным электрофорезом (см. рис. 10). Идентификацию зон AroG/AroG4 и SerA/SerA5 проводили с помощью масс-спектрометрии, а количественное определение синтезированного белка проводили с помощью денситометрии прокрашенного геля. Этот метод не позволял различить AroG и AroG4, а также SerA и SerA5, поэтому из суммарных значений интенсивностей пятен AroG/AroG4 и SerA/SerA5 вычитали значения, характерные для штамма BW25113, содержавшего только нативные гены aroG и ser А. В условиях индукции уровень синтеза AroG4 в двух штаммах практически совпадал и составлял -1,5% от определяемых клеточных белков, что соответствовало данным по активности DAHPS. Уровень же SerA5 существенно отличался (см. рис. 10).

Рисунок 10.

Результат двумерного электрофореза клеточных белков и фрагменты гелей, полученных для штаммов на основе Е. coli BW25113 с интегрированными оперонами: (A) ?lacAin\-aroG4-serA5, ИПТГ' (Б) ?шЫАЫ-агоС4-serA5, ИПТГ+ (В) Ptoc.ideal-aroG4-(rplD '-XattB- 'trpE)-serA5, ИПТГ+

Так, в клетках с исходным двуцистронным опероном рассчитанное молярное соотношение АгоС4 и 8егА5 составляло примерно 100/10, в то время как в клетках с модифицированным трицистронным опероном оно достигало примерно 100/25.

(kl»i

100 75

i ч; »

«V» ! '

i •• •

Wf*

Atoó*

~pl 4,5 4,6 5,0 5,5

fes*""*

• г

1 AroG T <

Таким образом, использование современного инструментария рекомбина-ционной инженерии позволило нам оптимизировать экспрессию дистального цистрона искусственного оперона за счет организации трансляционного сопряжения с эффективно транслируемым проксимальным геном. Заметим, что при соблюдении общего принципа разработанного метода можно варьировать нук-леотидную последовательность вводимого в межцистронную область фрагмента ДНК. Так в качестве «вырезаемого» маркера можно использовать ген устойчивости к любому антибиотику, фланкированный сайтами других специфических рекомбиназ (например, FRT- для FIp [Datsenko и Wanner, 2000; Huang и др., 1997], loxP- для Сге [Аhier и Suyemoto, 1999; Buchhoh и др., 1996]), а также использовать другие природные межцистронные последовательности. Важно отметить, что данный метод может применяться для организации более сложных, чем бицистронные, генетических элементов. Примеры таких модификаций в настоящее время получены в нашей лаборатории при создании промышленпо значимых продуцентов ароматических аминокислот.

4. Снижение уровня экспрессии генов за счет искусственно организованной встречной транскрипции

В современной метаболической инженерии крайне востребованы методы, осуществляющие регулируемое снижение экспрессии генов («gene silencing»). Данные методы являются хорошей альтернативой инактивации «нежелательного» гена путем его делеции, особенно в случаях, когда экспрессия гена нежелательна для целевого синтеза, но важна для жизнеспособности клетки [Nakashima и др., 2006]. В прокариотах для решения этой задачи, как правило, используют метод, основанный на взаимодействии между мРНК и анти-смысловой (anti-sense) РНК (асРНК) [для обзора см. Brantl, 2002]. Однако такие искусственные регуляторы пока проигрывают в эффективности природной регуляции экспрессии генов, основанной на том же молекулярном механизме [Kim и Cha, 2003; Ji и др., 2004; Кеттег и Neubauer, 2006]. Организация встречной по отношению к целевому гену транскрипции является одним из альтернативных методов. Его эффективность впервые была продемонстрирована в 80-е годы [Ward и Murray, 1979, Elledge и Davis, 1989]. Кроме того, в виду обнаружения в бактериях большого числа коротких асРНК, транскрипция которых конвергентна синтезу соответствующих мРНК, в современной литературе обсуждается возможность широкого использования регуляции такого рода в xipupojie[Dornenburg и др., 2010]. Тем не менее, к моменту начала данного исследования в современной метаболической инженерии встречная транскрипция как метод снижения уровня экспрессии генов-мишеней не использовалась.

Представляло интерес исследовать возможность применения данного подхода с помощью современных методов модификации бактериальной хромосомы, основанных на рекомбинационной инженерии.

4.1. Конструирование штаммов Е. coli для исследования эффектов встречной транскрипции

Для организации встречной транскрипции в качестве гена-мишени был выбран ген pykF, кодирующий одну из двух пируваткиназ Е. coli [Ponce и др.,

1995], ключевого фермента гликолиза, эффективно синтезирующегося в быстро растущих клетках [Blee/ig, 1996]. Для качественной оценки уровня экспрессии гена pykF был сконструирован модельный штамм Е. coli MG1655, содержащий делеции генов рукА, кодирующего вторую пируваткиназу, и edd-eda, кодирующих ферменты пути Энтнера-Дудорова, полученные с помощью Red-зависимой рекомбинации. Модельный штамм АК001 = MG1655-[àpykA, A(edd-eda)] являлся реципиентом для всех последующих модификаций.

Уровень экспрессии гена pykF оценивали фенотипически, используя тест «рост/отсутствие роста» на минимальной среде с рибозой (Риб). В этих условиях, на фоне инактивации генов рукА и edd-eda, образование пирувата (см. рис. 11), а, следовательно, и рост клеток практически полностью зависел от активности белка PykF [Ponce и др., 1995].

Рисунок 11. Схема биосинтеза пирувата в Е. coli из рибозы (Риб) и глюкозы (Глк). Отмечены только упомянутые в тексте гены. 6PG = глюконат-6-фосфат, F6P = фрук-тозо-6-фосфат, G6P = глюкозо-6-фосфат, GAP = глицеральдегид-3-фосфат, KD6PG = 2-кето-З-дезокси глюконат-6-фосфат, MAL = малат, ОАА = оксалоацетат, R5P = рибо-за-5-фосфат, ЦТК = цикл трикарбоновых кислот, Х5Р = ксилозо-5-фосфат

В геном штамма АК001 дистальнее предполагаемого Rho-независимого терминатора транскрипции pykF (Т'рукг) [Kingsford и др., 2007] с помощью Red-зависимой рекомбинации был интегрирован фрагмент ДНК с регуляторной областью XPl/Ol (Pl), обеспечивающей встречную, по отношению к pykF, транскрипцию. Известно, что транскрипция с Pl негативно регулируется репрессо-ром XCI [Ptashne, 1992], а в условиях дерепрессии Pl является одним из наиболее «сильных» промоторов, узнаваемых РНК полимеразой E.coli [Deuschle и др., 1986; Liang, 1999]. В состав интегрированного фрагмента ДНК входил также существенный для N-зависимой системы анти-терминации транскрипции фага I. участок nutL, расположенный по ходу транскрипции с Pl [Ptashne, 1992]. Полученный таким образом штамм, АК002, использовали для дальнейшей модификации.

С помощью рекомбинационной инженерии, была проведена замена nutL на последовательность анти-терминатора транскрипции рибосомального оперона rrnG (ATrma) [Albrechtsen и др., 1991]. Предполагалось, что в полученном таким образом штамме АК003 транскрипция с Pl будет защищена от Rho-зависимой терминации [Epshtein и др., 2010; Albrechtsen и др., 1990]. Также в хромосомы

штаммов АК002 и АК003 между Рь Л'ь-АТт/0 и ТрукР был прецизионно интегрирован эффективный Шю-зависимый терминатор транскрипции, гЬо а [Вгои'п и др., 1982]. Соответствующие штаммы были обозначены как АК004 и АК005. Положение по отношению к гену рукР введенных функциональных элементов приведено на рисунке 12.

13, Ьр

Pl-Ayma-rho_a>T^F<-pykF

5' -. . . ataaaaaaaqcqcccatcagqqcqct-tcqa ta ta . У-. . .tt:'. v.i.t.t egcgqgtagt ^ccqcgas|gct a ta I: ■

♦ 1 »22

pt2 P>1 I ! r*- _С

0.3 0,2 0t1

_+ ЬохВ 4__bOXA

5'-cgccgctgagaaaaagcgaagcggcaqtgctcttta|

, ЬухС

aca3tttatcagacaatqtgtgtgggfcac-t-3'

Рисунок 12. (А) схема расположения промотора Pl относительно Rho-независимого терминатораpykF (Тpyk^)[Kingsford и др., 2007]\ позиция интегрирования анти-терминатора rrnG (АТгп,с) вместо nutL по ходу транскрипции с Pl: а также последовательность Ию-зависимого терминатора (rho_a)[ Brown и др., 1982]. Участок "kattB остается после XInt/Xin-зависимого удаления маркера. (Б) Приведена: нуклеотидная последовательность T/J>№ демонстрирующая GC-богатый ивертированый повтор (стрелки) и Т-богатый участок; структура Pl [Giladi и др., 1992, 1996], включающая промоторы PL1 и PL2, сайты связывания с IHF (LI, L2), и операторные участки связывания с XCI (OlI, (\2, Ol3); струк-

тура ATт,а, включающая элементы box А, boxB, boxC [Li и др., 1984]. Способность ЬохВ формировать шпилечную структуру отмечена стрелками

4.2. Изучение конститутивного режима встречной транскрипции

Клетки экспериментальных штаммов серии АК были проверены на способность расти на агаризованной среде с Риб или Глк в качестве единственного источника углерода. Рост клеток штаммов АК000 и АК001 с инактивирован-ным pykF или с pykF" в этих условиях полностью совпадал с ожидаемым [Ponce и др., 1995] (см. табл. 2). Незначительный рост клеток штамма АК000 (àpykF) на Риб видимо был обусловлен образованием пирувата за счет активности ферментов пути Ppc-Mdh-Mez [Siddiquee и др., 2004; Kurata и др., 2007]. Способность к росту штамма АК000 на Риб была условно принята за «-».

Таблица 2

Рост полученных штаммов на минимальной среде с различными источниками углерода и уровень активности РукР в клеточных экстрактах

Штамм Описание Сравнительный рост па: Акт. PykF, мЕд/мг

глюкозе рнбозе

АКООО MG1655-[Aoyi:F, АрукА, A(edd-eda)] +++ - н. д.

АК001 MG1655-[Ap;wb), Д(edd-eda)] ++++ ++++ 590±30

АК002 AKOOHPL-^TMFÎ-M/I +++ - 10±5

АКООЗ +++ - 10±5

АК004 AK001-[Pl-/"/îo a->Tmw<rpykF\ ++++ +++ 480±20

АК005 AKOOl-[PL-A7rr„G-rho_ a ->TnvkF<rpykF\ +++ - 10±5

Клетки штаммов АК002 и АК003, содержащие структуры Рь и Рь-АТгга& демонстрировали близкий к РукР" фенотип, что соответствовало также следовым значениям активности РукР в экстрактах клеток, выращенных в жидкой минимальной среде с Глк. В обоих случаях уровень этой активности не превышал 5% от активности РукР в клетках АК001 с геном рукР"'. Таким образом, конститутивная встречная транскрипция с Рь приводила к существенному снижению экспрессии рукР, независимо от наличия или отсутствия последовательности АТт;0 в составе синтезируемой асРНК. Однако роль этого специфического анти-терминатора проявлялась в случае введения Шю-зависимого терминатора ориентированного на встречную транскрипцию. Эффективность подавления экспрессии рукР драматически падала в штамме АК004 с интегрированным гИо а, но оставалась высокой в штамме АК005 с Рь-АТт&-г\ю_а из-за присутствия в составе асРНК специфического анти-терминатора.

Для штаммов АК001, АК002, АКООЗ, выращенных на минимальной среде с Глк, проанализировали транскрипты участка структурной части гена рукР методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Эксперимент проводился в соответствии с представленной на рис. 13А схемой.

а с а. =г с

Р*(9) П(6,9)

П(8,9)

Р*(6>

П(7,9) ~"~РV)

П(6,4)

р-(6)

РукР

П_(4,6)_

Р-(2) р'-(3)"

р "*йТ ..........

Б П(1,5) П(2,5) П(3,5) П(4,5)

П(3,5)

Р'(5)

В П(4,6)П(6,4)

(1120 Ьр)(1120 Ьр) <--X.--------->

АК001 АК002

Рисунок 13. (А) Схема ОТ-11ЦР анализа транскриптов из

штаммов АК001, АК002, АК003. Ам-плимеры П(/г/') получались после обратной транскрипции с прай-мера Р*(/) и последующего ПЦР с добавлением праймера Р*(/'). Амплимеры, соответствующие (Б) мРНКм„ и (В) мРНК/у№ и асРНК из штаммов АК001 и АК002. (Г) Амплимеры, соответствующие асРНК из штаммов АК002 и АК003.

Г П(7,9) П(8,9) П(6,9)

(340 Ьр) (414 Ьр) (1199 Ьр)

АК002 АК003

Для штаммов АК002 и АК001 в определяемых количествах присутствовала мРНК;^ , по размеру соответствующая 90% кодирующей части гена. Однако более длинные транскрипты удалось зарегистрировать только в клетках штамма АК001 (см. рис. 13Б). При этом, в штамме АК002 присутствовала асРНК, соответствующая по длине 85% З'-концевой части рукР (см. рис. 13В). Данный факт позволил предположить, что снижение уровня экспрессии рукР обусловлено уменьшением доли полноразмерных молекул мРНК^-/, из-за искусственно организованной встречной по отношению к рукР транскрипции в клетках АК002.

Также анализ ОТ-ПЦР выявил, что в клетках штамма АК003 присутствует более длинная асРНК, чем в клетках штамма АК002 (см. рис. 13Г). Это, по-видимому, указывало на существование преждевременной диссоциации «встречных» РНК полимераз с ДНК матрицы за счет Юго-зависимой термина-ции. Введение же АТ„.„С снижало эффективность терминации встречной транскрипции.

4.3. Изучение регулируемого снижение уровня экспрессии гена pykF

Для осуществления регуляции подавления экспрессии pykF в хромосому MG1655 посредством ф80-зависимой сайт-специфической интеграции была введена кассета, несущая ген термочувствительного репрессора A.CIts857 [Ptashne, 1992] и гибридный ген его '-cat под контролем XPr/Or (PR) [Магико и др., 1989]. Далее интегрированная кассета была перенесена с помощью Р1 транедукции в штаммы АК000, АК.001, АК002, АК003. Полученные при этом штаммы получили название АК006, АК.007, АК008, АК009, соответственно. Хорошо известно [Ptashne, 1992], что постепенное повышение (с 30 до 42°С) температуры культивирования бактерий с геном Ac/ts857 приводит сначала к частичной, а затем к полной инактивации репрессора CI и дерепрессии транскрипции с PR и PL промоторов. Как было показано ранее, в результате экспрессии гибридного гена его'-cat происходит образование как белка-гибрида Сго'-Cat, так и полноразмерной и функционально активной хлорамфениколацетил-трансферазы (Cat) [Машко и др., 1989]. Измерение активности Cat в экстрактах полученных штаммов позволило оценить уровень дерепрессии транскрипции с промотора PL.

Клетки исследуемых штаммов предварительно выращивали на минимальной среде с Риб в условиях репрессии PL (30°С), и, следовательно, нормальной экспрессии pykF. Затем выросшие клетки пересевали на свежую среду того же состава и культивировали при 30, 37 и 42°С. Два последних температурных режима соответствовали условиям частичной и полной дерепрессии транскрипции с Pl промотора, соответственно.

температура,°С

АК009 Л * *

Рост клеток штаммов АК009 и АК008 сильно отличался при 42°С. Так для клеток АК009, содержащих PL-ATm,o, он совпадал с ростом изогенного штамма АК006 с ДpykF. Клетки же АК008, не содержащие анти-терминатор rrnG, демонстрировали промежуточный между PykF~ и PykF фенотип. На 30 и на 37°С, рост обоих штаммов АК009 и АК008 практически не отличался от роста клеток штамма АК007 с геном pykF** (см. рис. 14).

Эффективность регулируемого подавления экспрессии гена-мишени оценивали также по изменению ферментативной активности PykF в клетках после дерепрессии встречной транскрипции (см. рис. 15А).

АК006

Рисунок 14. Эффект регулируемого температурой подавления экспрессии рукР. Рост экспериментальных штаммов, несущих ген \clts857 на агаризованной минимальной среде с Риб.

АК007 * * ф

АК008

CL -D

I ш s н

0,3 0,25

1 0,2 ~ro

О 0,15 л к о

о 0,1

m 5

Ё 0,05 го

АК006

АК007

АК008

АК009

37 Т.'С

Рисунок 15. Активности белков (A) PykF и (Б) Cat в экстрактах клеток штаммов AK-серии, культивируемых при различных температурах

Так во всех исследованных штаммах AK-серии, содержащих Ar/ts857, наблюдалось практически одинаковое возрастание активности Cat, а, следовательно, происходила индукция транскрипции с промоторов MVPr при переносе клеток на повышенную температуру (см. рис. 15Б). Однако изменение активности PykF для разных штаммов было различным. Уровень активности оставался практически неизменным для штамма АК007 с геном pykFпри культивировании на всех температурах. В то же время достоверное снижение активности наблюдалось в случае индукции встречной транскрипции в штаммах АК008 и АК009. (на Рис. 15 представлены результаты, полученные через 3-3,5 часа после повышения температуры). При этом в штамме АК009 уровень активности PykF снижался быстрее, чем в штамме АК008, что было особенно заметно при небольших временах термоиндукции (данные не представлены).

Результаты проведенного исследования подтверждают показанную ранее [Ward и Murray, 1979, Elledge и Davis, 1989] высокую эффективность подавления экспрессии гена-мишени путем организации встречной транскрипции. Однако впервые явно демонстрируют критический момент практической реализации такого подхода - чувствительность встречной транскрипции к преждевременной терминации по Rho-зависимому механизму. Для преодоления этого момента предложена стратегия защиты встречной транскрипции системой Rho-зависимой анти-терминации. Эффективность данной модификации метода продемонстрирована на примере подавления экспрессии гена pykF. В настоящее время искусственно организованная встречная транскрипция, устойчивая к Rho-зависимой терминации, активно используется в нашем институте для метаболически регулируемого подавления экспрессии различных генов-мишеней.

Выводы.

1. На примере модификации хромосомы Е. coli MG 1655 и создания штаммов с улучшенными ростовыми характеристиками показано, что реком-бинационная инженерия позволяет прецизионно маркировать целевые генетические локусы для удобства их трансдукции. В дальнейшем введенный селективный маркер может быть удален с помощью сайт-специфической рекомбинации, и, тем самым, осуществлено конструирование штаммов, не содержащих генов устойчивости к антибиотикам.

2. В результате конструирования новых штаммов продуцентов L-фенилаланина впервые в практике метаболической инженерии показано, что промоторы Pho регулона Е. coli, Ррш и P/uya могут быть использованы

■ для повышения уровня экспрессии биосинтетического гена aroG4 и увеличения накопления аминокислоты на поздних стадиях культивирования клеток при росте бактерий на комплексной среде с глюкозой, когда исходно добавленный неорганический фосфат является фактором ограничения роста биомассы.

3. При оптимизации продуцента L-триптофана разработан и апробирован новый способ конструирования искусственных оперонов с трансляцион-но-сопряженными генами в бактериальной хромосоме. Метод включает конструирование in Vitro оперона с эффективно транслируемым проксимальным цистроном; интеграцию оперона в хромосому Е. coli; модификацию оперона в хромосоме путем интеграции специального «переходника» с вырезаемым селективным маркером в межцистронную область с последующим удалением маркера.

4. На модели гена pykF Е. coli, регуляторной области XPL/0L, белка-регулятора CIts857 и анти-терминатора транскрипции ATт,а разработана новая стратегия регулируемого снижения уровня экспрессии целевого гена в результате организации с помощью рекомбинационной инженерии его конвергентной транскрипции, устойчивой к Rho-зависимой термина-ции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. А.Ю. Гулевич, А.Ю. Скороходова, В.Ю. Ермишев, А.А. Крылов, Н.И. Минаева, З.М. Полонская, Д.В. Зименков, И.В. Бирюкова, С.В. Машко. «Новый метод конструирования оперонов с транс-ляционно-сопряженными генами в бактериальной хромосоме», Молекулярная Биология. 2009;43(3):1-11

2. Гулевич А.Ю., Скороходова А.Ю., Ермишев В.Ю., Минаева Н.И., Зименков Д.В., Крылов А.А., Бирюкова И.В., Машко С.В. «Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно-сопряжённые гены», Заявка на патент РФ №2008105793, 2008

3. И.В. Бирюкова, А.А. Крылов, Е.М. Киселева, Н.И. Минаева, С.В. Машко <сКонструирование на основе E.coli К-12 MG1655 нового штамма с улучшенными ростовыми характеристиками для экспериментов по метаболической инженерии», Генетика. 2010; 46(3):349-355

4. Krylov АА, Airich LG, Kiseleva ЕМ, Minaeva N1, Biryukova IV, Mashko SV. «Conditional silencing of the Escherichia coli pykF gene results from artificial convergent transcription protected from Rho-dependent termination», J Mol Microbiol Biotechnol. 2010;18(1):1-13

5. Doroshenko VG, Tsyrenzhapova IS, Krylov AA, Kiseleva EM, Ermi-shev VY, Kazakova SM, Biryukova IV, Mashko SV «Pho regulon promoter-mediated transcription of the key pathway gene aroG (Fbr) improves the performance of an L-phenylalanine-producing Escherichia coli strain», Appl Microbiol Biotechnol. 2010;88:1287-1295

6. Gulevich A., Zimenkov D., Skorokhodova A., Minaeva N., Krylov A., Ivanov D., Doroshenko V., Biryukova I., Mashko S. «Improvement of the performances of aromatic amino acids producing E. coli strains could be achieved due to enhancement of PekA and/or Pgl activity», 10th Intern. Sympos. on the Genetics of Industrial Microorganisms, Prague (Czech Republic), 24-28 June, 2006, P387

7. Krylov A.A., Airich L.G., Doroshenko V.G., Biryukova I.V., Mashko S.V. «Metabolically engineered E. coli gene expression: Efficient conditional gene silencing can be achieved using artificial convergent transcription protected from Rpo-dependent termination», Intern. Conf. on Environmental, Industrial and Applied Microbiology, Lisbon (Portugal), 2-4 December, 2009, P415

Подписано в печать: 17.11.2010

Заказ № 4573 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крылов, Александр Александрович

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи работы.

Научная новизна и практическая значимость работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Рекомбинационная инженерия.

1.2 Применение инструментария рекомбинационной инженерии в метаболической инженерии.

1.2.1 Модификация структурной части гена.

1.2.2 Искусственная активация экспрессии генов.

1.2.3 Оптимизация экспрессии генов искусственных оперонов.

1.2.4 Искусственное снижение экспрессии генов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Штаммы.

2.2 Плазмиды.

2.3 Среды.

2.4 Олигонуклеотиды.

2.5 Проведение ПЦР.

2.6 ПЦР тест для определения структуры грк.

2.7 ПЦР с обратной транскрипцией.

2.8 Генно-инженерные и микробиологические методики.

2.9 Р1 трансдукция.

2.10 Определение активностей ферментов в клеточных экстрактах.

2.11 Электропорация/(электротрансформация вектором рАН 162) клеток Е. соН.

2.12 11ео-зависимая интеграция фрагментов ДНК в бактериальную хромосому

2.13 ф80-зависимая интеграция фрагментов ДНК в бактериальную хромосому

2.14 Двумерный гель-электрофорез.

2.15 Определение концентрации аминокислот.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Red-зависимоб маркирование целевых локусов хромосомы.

3.1.1 Природа мутации rph-1 и поиск вариантов rpti"1.

3.1.2 Маркирование и трансдукция локуса rph-pyrEva TGI в MG1655.

3.1.3 Определение скорости роста штамма MG16552-1/77^].

3.2 Метаболически регулируемая активация экспрессии целевых генов.

3.2.1 Анализ параметров культивирования штамма DV269-2.

3.2.2 Конструирование pph0a/psts-arog4 методами рекомбинационной инженерии.

3.2.3 Характеристика новых штаммов DV269-2-[PPh0A/Psts-aroG4].

3.3 Повышение уровня экспрессии дистальных цистронов искусственных оперонов за счет эффекта трансляционного сопряжения.

3.3.1 Оценка эффективности экспрессии генов оперона Ptoc-,deai-aroG4-serA5.

3.3.2 Оптимизация экспрессии serA5 путем преобразования структуры оперона.

3.3.4 Оценка уровня экспрессии гена serA5 в трицистронном опероне.

3.3.5 Изучение влияния изменения уровня экспрессии serA5 на продукцию l-Trp.

3.4 Снижение уровня экспрессии генов за счет искусственно организованной встречной транскрипции.

3.4.1 Конструирование штаммов Е. coli для исследования эффектов встречной транскрипции.

3.4.2 Изучение конститутивного режима встречной транскрипции.

3.4.3 Изучение регулируемого снижение уровня экспрессии генаpykF.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование рекомбинационной инженерии для прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli"

Актуальность проблемы. В настоящее время приоритетным для биотехнологии является конструирование бесплазмидных, безмаркерных бактериальных штаммов-продуцентов. Интеграция генов, кодирующих целевые ре-комбинантные белки или ферменты, катализирующие необходимые метаболические превращения, в хромосому коренным образом решает проблемы, связанные со стабильным наследованием целевых плазмид [Friehs, 2004] и их отрицательным влиянием на жизнеспособность клеток [Sauer, 2001; Brownlie и др., 1990], а также удовлетворяет законодательному запрету на использование в промышленности плазмидных штаммов-продуцентов в ряде стран. Смещение приоритета метаболической инженерии на бесплазмидные системы экспрессии целевых генов привело к необходимости адаптации классических и разработки новых молекулярно-биологических подходов конструирования на основе современного инструментария модификации хромосомы.

Escherichia coli является удобным микроорганизмом для разработки таких подходов. В настоящее время создан разнообразный генно-инженерный инструментарий для модификации хромосомы Е. coli. Например, метод Red/RecET-зависимой рекомбинационной инженерии (Recombination mediated genetic engineering = Recombineering) позволяет инактивировать целевые гены путем делеции «с сохранением открытой рамкихчитывания» гена-мишени, заменять регуляторные области и проводить сайт-специфический мутагенез кодирующих участков [Sawitzke и др., 2007]. Разработаны методы интеграции протяженных фрагментов ДНК в случайные [Ахвердян и др., 2007] и в строго определенные участки генома Е. coli [.Minaeva и др., 2008]. В тоже время штаммы Е. coli традиционно используют в биотехнологическом производстве в качестве промышленных продуцентов рекомбинантных белков, органических кислот, витаминов, этанола и аминокислот, а также относительно новых продуктов - бутанола, 1-3-пропандиола, лейкопина, полифенолов и растительных флаваноидов [Wendisch и др., 2006; Patnaik, 2008; Demain и Adrio, 2008]. Поэтому все разработанные на данном виде бактерий подходы конструирования приобретают практическую значимость. Необходимо также отметить, что многие из перечисленных методов, исходно разработанных для Е. coli, постепенно адаптируются для работы с другими микроорганизмами, такими как Salmonella [Husseiny и Hensel, 2005; Karlinsey, 2007], Shigella [Shi и др., 2003; Ranallo и др., 2006], Yersinia [Derbise и др., 2003; Lesic и др., 2004], Pseudomonas [Lesic и Rahme, 2008], Pantoea [Katashkina и dp, 2009]. Следовательно, разработка новых подходов оптимизации экспрессии генов в Е. coli позволяет надеяться на их будущую универсальность.

Цель и задачи работы. Диссертационная работа посвящена разработке новых молекулярно-биологических подходов прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli на'основе рекомбинационной инженерии.

В ходе работы решались следующие задачи:

• прецизионная модификация локусов хромосомы Escherichia coli посредством применения Red-зависимой интеграции «вырезаемого» маркера;

• оптимизация экспрессии генов биосинтетических путей на поздних стадиях культивирования бактериальных штаммов путем использования метаболически регулируемых промоторов Pho регулона;

• разработка метода оптимизации экспрессии дистально расположенных цистронов в искусственных оперонах на основе TGATG-оверлаппонов;

Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что ре-комбинационная инженерия позволяет прецизионно маркировать целевые генетические локусы, для удобства их переноса в другие штаммы, с последующим удалением маркера, тем самым, осуществлять конструирование штаммов, не содержащих генов устойчивости к антибиотикам.

Показано, что промоторы Pho регулона Е. coli, VphoA и VpstS, могут быть использованы для повышения уровня экспрессии целевого биосинтетического гена на поздних стадиях роста бактерий на комплексной среде с глюкозой, если растворимый неорганический фосфат является фактором ограничения роста биомассы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Крылов, Александр Александрович

выводы

На примере модификации хромосомы Е. coli MG 1655 и создания штаммов с улучшенными ростовыми характеристиками показано, что рекомбинацион-ная инженерия позволяет прецизионно маркировать целевые генетические локусы для удобства их трансдукции. В дальнейшем введенный селективный маркер может быть удален с помощью сайт-специфической рекомбинации, и, тем самым, осуществлено конструирование штаммов, не содержащих генов устойчивости к антибиотикам.

В результате конструирования новых штаммов продуцентов L-фенилаланина впервые в практике метаболической инженерии показано, что промоторы Pho регулона Е. coli, РpiwA и Р^^, могут быть использованы для повышения уровня экспрессии биосинтетического гена aroG4 и увеличения накопления аминокислоты на поздних стадиях культивирования клеток при росте бактерий на комплексной среде с глюкозой, когда исходно добавленный неорганический фосфат является фактором ограничения роста биомассы.

При оптимизации продуцента L-триптофана разработан и апробирован нот вый способ конструирования искусственных оперонов с трансляционно-сопряженными генами в бактериальной хромосоме. Метод включает конструирование in vitro оперона с эффективно транслируемым проксимальным цистроном; интеграцию оперона в хромосому Е. coli', модификацию оперона в хромосоме путем интеграции специального «переходника» с вырезаемым селективным маркером в межцистронную область с последующим удалением маркера.

На модели гена pykF Е coli, регуляторной области AiVOL, белка-регулятора CIts857 и анти-терминатора транскрипции ATmiG разработана новая стратегия регулируемого снижения уровня экспрессии целевого гена в результате организации с помощью рекомбинационной инженерии его конвергентной транскрипции, устойчивой к Rho-зависимой терминации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крылов, Александр Александрович, Москва

1. Albert H., Dale EC., Lee E. h Ow DW. «Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant lox sites placed in the plant genome» Plant J., 1995; 7:649-59.

2. Albrechtsen B., Ross BM., Squires C. h Squires CL. «Transcriptional termination sequence at the1 end of the Escherichia coli ribosomal RNA G operon: complex terminators and antitermination» Nucleic Acids Res., 1991; 19:1845-52.

3. Albrechtsen B., Squires CL., Li S. h Squires C. «Antitermination of characterized transcriptional terminators by the Escherichia coli rrnG leader region» JMolBiol., 1990;213:123-34.

4. Alper MD. h Ames BN. «Positive selection of mutants with deletions of the galchl region of the Salmonella chromosome as a screening procedure for mutagens that cause deletions» J. Bacteriol., 1975; 121:259-266.

5. Altier C. h Suyemoto M. «A recombinase-based selection of differentially expressed bacterial genes» Gene., 1999; 240:99-106.

6. Amundsen SK. h Smith GR. «Interchangeable parts of the Escherichia coli recombination machinery» Cell, 2003; 112(6):741-4.

7. Arraiano CM. h Maquat LE. «Post-transcriptional control of gene expression: effectors of mRNA decay» Mol. Microbiol, 2003; 49:267-276.

8. Baba T., h AP- «Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, singlegene knockout mutants: the Keio collection» Mol Syst Biol., 2006; 2:2006.0008

9. Bailey JE. «Toward a science of metabolic engineering» Science, 1991; 252:1668-75.

10. Bhandari P. h Gowrishankar J. «An Escherichia coli host strain useful for efficient overproduction of cloned gene products with NaCl as the inducer» J Bacteriol., 1997; 179:4403-6.

11. Bikard D., Julie-Galau S., Cambray G. h Mazel D. «The synthetic integron: an in vivo genetic shuffling device» Nucleic Acids Res., 2010; 38:e 153.

12. Biskri L., Bouvier M., Guerrout A., Boisnard S. h Mazel D. «Comparative study of class 1 integron and Vibrio cholera superintegron integrase activities» J. Bacteriol., 2005; 187:1740-1750.

13. Blattner FR., h Ap. «The complete genome sequence of Escherichia coli K-12»Science, 1997; 277:1453-1474.

14. Bledig SA., Ramseier TM. h Saier MH Jr. «Frur mediates catabolite activation of pyruvate kinase (pykF) gene expression in Escherichia coli» J Bacteriol., 1996; 178:280-3.

15. Blomfield IC., Vaughn V., Rest RF. h Eisenstein BI. «Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSCIOl replicon. « Mol. Microbiol., 1991; 5:1447-1457.

16. Bloor AE. h Cranenburgh MR. «An efficient method of selectable marker gene excision by Xer recombination for gene replacement in bacterial chromosomes» Appl. andEnviroment. Microbiol, 2006; 72:2520-2525.

17. Boberek JM., Stach J., Good L. «Genetic evidence for inhibition of bacterial division protein FtsZ by berberine», PLoS One, 2010; 5:e 13745

18. Bonekamp F., Clemmesen K., Karlström O. h Jensen KF. «Mechanism of UTP-modulated attenuation at the pyrE gene of Escherichia coli: an example of operon polarity control through the coupling of translation to transcription» EMBO J., 1984;3:2857-61.

19. Brantl S. «Antisense-RNA regulation and RNA interference» Biochim BiophysActa, 2002; 1575:15-25.

20. Brantl S. «Regulatory mechanisms employed by cis-encoded antisense RNAs» Curr Opin Microbiol., 2007; 10:102-9.

21. Brown S., Albrechtsen B., Pedersen S. h Klemm P. «Localization and regulation of the structural gene for transcription-termination factor rho of Escherichia coli» JMol Biol., 1982; 162:283-98.

22. Brownlie L., Stephenson JR. h Cole JA. «Effect of growth rate on plasmid maintenance by Escherichia coli HB101(pAT153)» J Gen Microbiol, 1990; 136(12):2471-80.

23. Buchholz F., Ringrose L., Angrand PO., Rossi F. h Stewart AF. «Different thermostabilities of FLP and Cre recombinases: implications for applied site-specific recombination» Nucleic Acids Res., 1996; 24:4256-62.

24. Capaldo FN., Barbour SD. «The role of the rec genes in the viability of Escherichia coli K12» Basic Life Sci. 1975; 5A:405-418

25. Cha RS., Zarbl H., Keohavong P. h Thilly WG. «Mismatch amplification mutation assay (MAMA): application to the c-H-ras gene» PCR Methods Appl., 1992;2:14-20.

26. Cherepanov PP. n Wackernagel W. «Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant» Gene, 1995; 158:9-14.

27. Copeland NG., Jenkins NA. h Court DL. «Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics» Nat Rev, 2001; 2:769-779.

28. Costantino N. h Court DL. «Enhanced levels of A, Red-mediated recombinants in mismatch repair mutants» Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 2003; 100:15748-15753.

29. Court DL., Sawitzke JA. h Thomason LC. «Genetic engineering using homologous recombination» Annu Rev Genet, 2002; 36:361-388.

30. Cox MM. h Lehman IR. «Enzymes of general recombination» Annu. Rev. Biochem., 1987; 56:229-262.

31. Cox RS 3rd, Surette MG. h Elowitz MB. «Programming gene expression with combinatorial promoters» Mol Syst Biol, 2007; 3:145.

32. Dabert P., Smith GR. «Gene replacement with linear DNA fragments in wild-type Escherichia coli: enchancement by Chi sites» Genetics. 1997; 145:877889

33. Dale EC. h Ow DW. «Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome» 1991; 88:10558-10562.

34. Deana A. h Belasco JG. «Lost in translation: the influence of ribosomes on bacterial mRNA decay» Genes Dev., 2005; 19:2526-33.

35. Demain A.L., h Adrio J.L. «Contribution of microorganisms to industrial biology» Mol. Biotechnol., 2008; 38(l):41-55.

36. Derbise A., Lesic B., Dacheux D., Ghigo JM. h Carniel E. «A rapid and simple method for inactivating chromosomal genes in Yersinia» FEMS Immunol Med Microbiol., 2003; 38(2): 113-6.

37. Deuschle U., Kammerer W., Gentz R. u Bujard H. «Promoters of Escherichia colt a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures» EMBO J., 1986; 5: 2987-94.

38. Dohet C., Wagner R. h Radman M. Methyl-directed repair of frameshift mutations in heteroduplex DNA. , 1986; 83:3395-339.

39. Dornenburg JE., Devita AM., Palumbo MJ., Wade JT. «Widespread Antisense Transcription in Escherichia coli» MBio, 2010; 1(1) pii:e00024-10.

40. Doroshenko V., Airich L., Vitushkina M., Kolokolova A., Livshits V. h Mashko S. «YddG from Escherichia coli promotes export of aromatic amino acids» FEMS Microbiol Lett., 2007; 275:312-8.

41. Doroshenko VG., Shakulov RS., Kazakova SM., Kivero AD., Yampolskaya ТА. и Mashko SV. «Construction of an L-phenylalanine-producing tyrosine-prototrophic Escherichia coli strain using tyrA ssrA-like tagged alleles» BiotechnolLett., 2010; 32:1117-21.

42. Ehrt S., и др. «Controlling gene expression in mycobacteria with anhydrotetracycline and Tet repressor» Nucleic Acids Res., 2005; 33:e21.

43. El Karoui M., Amundsen SK., Dabert P., Gruss A. «Gene replacement with linear DNA in electroporated wild-type Escherichia coli» Nucleic Acids Res. 1999; 27(5):1296-9

44. Elledge SJ. и Davis RW. «Position and density effects on repression by stationary and mobile DNA-binding proteins» Genes Dev., 1989; 3:185-97.

45. Ellis HM., Yu D., DiTizio Т. и Court DL. «High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides» Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2001; 98(12):6742-6746.

46. Epshtein V., Dutta D., Wade J. и Nudler E. «An allosteric mechanism of Rho-dependent transcription termination» Nature. ,2010; 463:245-9.

47. Farmer WR. и Liao JC. «Improving lycopene production in Escherichia coli by engineering metabolic control» Nat Biotechnol., 2000; 18:533-7.

48. Figge J., Wright C., Collins CJ., Roberts TM. и Livingston DM. «Stringent regulation of stably integrated chloramphenicol acetyl transferase genes by E. coli lac repressor in monkey cells» Cell, 1988; 52:713-22.

49. Frank DN. и Pace NR. «Ribonuclease P: unity and diversity in a tRNA processing ribozyme» Annu. Rev. Biochem., 1998; 67:153-180.

50. Friehs K., Plasmid copy number and plasmid stability. In: New Trends and Developments in Biochemical Engineering. Edited by Scheper TH. том 86. Berlin, Heidelberg: Springer, 2004, стр. 47-82

51. Gaal T., Bartlett MS., Ross W., Turnbough CL. Jr h Gourse RL. «Transcription regulation by initiating NTP concentration: rRNA synthesis in bacteria» Science., 1997; 278:2092-7.

52. Giladi H.; Igarashi K., Ishihama A. h Oppenheim AB. «Stimulation of the phage lambda pL promoter by integration host factor requires the carboxy terminus of the alpha-subunit of RNA polymerase» JMolBiol., 1992; 227:985-90.

53. Giladi H., Murakami K., Ishihama A. h Oppenheim AB. «Identification of an UP element within the IHF binding site at the PL1-PL2 tandem promoter of bacteriophage lambda» JMolBiol., 1996; 260:484-91.

54. Goldstein MA. h Doi RH. «Procaryotic promoters in biotechnology» Biotechnol. Annu. Rev., 1995; 1:105-128.

55. Gollub E., Zalkin H. h Sprinson DB. «Assay for 3-deoxy D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate synthase» Methods Enzymol, 1970; 17A:349-350.

56. Gottesman S., Roche E., Zhou Y. h Sauer RT. «The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system» Genes Dev. , 1998; 12:1338-1347.

57. Griffith KL. h Grossman AD. «Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP» Mol Microbiol. , 2008; 70:1012-25.

58. Grilly C., Strieker J., Pang WL., Bennett MR. h Hasty J. «A synthetic gene network for tuning protein degradation in Saccharomyces cerevisiae» Mol Syst Biol., 2007; 3:127.

59. Grindley NDF., Whiteson KL. h Rice PA. «Mechanisms of site-specific recombination» Annu. Rev. Biochem. , 2006; 75:567-605.

60. Hallet B. h Sherratt DJ. «Transposition and site-specific recombination: adapting DNA cut-and-past mechanism to a variety of genetic rearrangements» FEMS Microbiology Reviews, 1997; 21:157-178.

61. Hasan СМ. и Shimizu К. « Effect of temperature up-shift on fermentation and metabolic characteristics in view of gene expressions in Escherichia coli» Microb Cell Fact, 2008; 7:35.

62. Hengge-Aronis R. «Regulation of gene expression during entry into stationary phase» В Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, создатель FC Neidhardt, 1497-1512. Washington: ASM, 1996.

63. Herbst В., Kneip S. и Bremer E. « pOSEX: vectors for osmotically controlled and finely tuned gene expression in Escherichia coli» Gene, 1994; 151:137-42.

64. Hsieh YJ. и Wanner BL. «Global regulation by the seven-component Pi signaling system» Curr Opin Microbiol., 2010; 13:198-203.

65. Huang LC., Wood EA. и Cox MM. «Convenient and reversible site-specific targeting of exogenous DNA into a bacterial chromosome by use of the FLP recombinase: the FLIRT system» JBacteriol, 1997; 179:6076-83.

66. Husseiny MI. и Hensel M. «Rapid method for the construction of Salmonella enterica Serovar Typhimurium vaccine carrier strains» Infect Immun., 2005; 73(3): 1598-605.

67. Hutchison CA. 3rd, Phillips S., Edgell MH., Gillam S., Jahnke P. и Smith M. «Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence» J Biol Chem, 1978; 253:6551-60.

68. Jacob F., Perrin D., Sánchez С., Monod J. и Edelstein S. «The operon: a group of genes with expression coordinated by an operator» C.R.Acad. Sci. Paris , 1960; 250:1727-1729.

69. Jensen KF. «The Escherichia coli K-12 "wild types" W3110 and MGI655 have an rph frameshift mutation that leads to pyrimidine starvation due to low pyrE expression levels» J Bacteriol., 1993; 175:3401-7.

70. Jensen PR. h Hammer K. «Artificial promoters for metabolic optimization» BiotechnolBioeng., 1998; 58:191-5.

71. Ji Y., Yin D., Fox B., Holmes DJ., Payne D. h Rosenberg M. «Validation of antibacterial mechanism of action using regulated antisense RNA expression in Staphylococcus aureus» FEMS Microbiol Lett., 2004; 231:177-84.

72. Kammann M., Laufs J., Schell J. h Gronenborn B. «Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR)» Nucleic Acids Res, 1989; 17:5404.

73. Karlinsey JE. «lambda-Red genetic engineering in Salmonella enterica serovar Typhimurium» Methods Enzymol., 2007; 421:199-209.

74. Karu AE., Sakaki Y., Echols H. h Linn S. «The y protein specified by bacteriophage X. Structure and inhibitory activity for the RecBC enzyme of Escherichia coli» J. Biol. Chem., 1975; 250:7377-7387.

75. Kastelein RA., Berkhout B., van Duin J. «Opening the closed ribosome-binding site of the lysis cistron of bacteriophage MS2» Nature, 1983; 305:741-3

76. Katashkina JI., Hara Y., Golubeva LI., Andreeva IG., Kuvaeva TM. h Mashko SV. « Use of the lambda Red-recombineering method for genetic engineering of Pantoea ananatis» BMC Mol Biol, 2009; 10:34.

77. Kemmer C. h Neubauer P. «Antisense RNA based down-regulation of RNaseE in E. coli» Kemmer C, Neubauer P., 2006; 5:38.

78. Khosla C., Curtis JE., Bydalek P., Swartz JR. h Bailey JE. «Expression of recombinant proteins in Escherichia coli using an oxygenresponsive promoter» Biotechnology, 1990; 8:554-558.

79. Kikuchi Y., Tsujimoto K. h Kurahashi O. «Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli» Appl Environ Microbiol., 1997; 63:761-2.

80. Kim JY. h Cha HJ. «Down-regulation of acetate pathway through antisense strategy in Escherichia coli', improved foreign protein production» Biotechnol Bioeng., 2003; 83:841-53.

81. Kingsford CL., Ayanbule K. h Salzberg SL. «Rapid, accurate, computational discovery of Rho-independent transcription terminators illuminates their relationship to DNA uptake» Genome Biol., 2007; 8:R22.

82. Kolodner R., Hall SD. h Luisi-DeLuca C. «Homologous pairing proteins encoded by the Escherichia coli recE and recT genes» Mol. Microbiol, 1994; 11:2330.

83. Kornberg A. «Inorganic polyphosphate: toward making a forgotten polymer unforgettable» JBacteriol, 1995; 177:491-6.

84. Kurata H., Zhao Q., Okuda R. h Shimizu K. «Integration of enzyme activities into metabolic flux distributions by elementary mode analysis» BMC Syst Biol., 2007; 1:31.

85. Kuroda A. «A polyphosphate-lon protease complex in the adaptation of Escherichia coli to amino acid starvation» Biosci Biotechnol Biochem., 2006; 70:325-31.

86. Kuzminov A. «Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda» Microbiol Mol Biol Rev, 1999; 63(4):751-813.

87. Lacour S. h Landini P. «SigmaS-dependent gene expression at the onset of stationary phase in Escherichia coli: function of sigmaS-dependent genes and identification of their promoter sequences» JBacteriol., 2004; 186:7186-95.

88. Landy A. «Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination» Annu Rev Biochem, 1989; 58:913-49.

89. Landy A. «Mechanistic and structural complexity in the site-specific recombination pathway of Int and FLP» Curr. Opin. Genet. Dev., 1993; 3:699-707.

90. Larson MH., Greenleaf WJ., Landick R. h Block SM. «Applied force reveals mechanistic and energetic details of transcription termination» Cell, 2008; 132:971-82.

91. Lee SK. h Keasling JD. «A propionate-inducible expression system for enteric bacteria» Appl Environ Microbiol., 2005; 71:6856-62.

92. Lesic B. h Rahme LG. «Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa» BMC Mol Biol., 2008; 9:20.

93. Levchenko I., Seidel M., Sauer RT h Baker TA. «A specificity-enhancing factor for the ClpXP degradation machine» Science, 2000; 289:2354-2356.

94. Li SC., Squires CL. h Squires C. «Antitermination of E. coli rRNA transcription is caused by a control region segment containing lambda nut-like sequences» Cell, 1984; 38:851-60.

95. Liang S., Bipatnath M., Xu Y., Chen S., Dennis P., Ehrenberg M., Bremer H. «Activities of constitutive promoters in Escherichia coli» J Mol Biol., 1999; 292:19-37.

96. Lloyd RG. h Buckman C. «Identification and genetic analysis of sbcC mutations in commonly used recBC sbcB strains of Escherichia coli K-12» J. Bacteriology. 1985; 164:836-844

97. Lovett ST., Hurley RL., Sutera VA. Jr., Aubuchon RH. h Lebedeva MA. «Crossing over between regions of limited homology in Escherichia coli. RecA-dependent and RecA-independent pathways» Genetics, 2002; 160(3):851-9.

98. Lusetti SL. h Cox MM. «The bacterial RecA protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks» Annu Rev Biochem, 2002; 71:71-100.

99. Makrides SC. «Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli» Microbiol Rev, 1996; 60:512-538.

100. Malcovati M. h Valentini G. «AMP- and fructose 1,6-bisphosphate-activated pyruvate kinases from Escherichia coli» Methods Enzymol, 1982; 90 Pt E: 170-9.

101. Maresca M., Erler A., Fu J., Friedrich A., Zhang Y. h Stewart AF. «Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination» BMC Mol Biol, 2010; 11:54.

102. Mashko SV., h flp. «TGATG vector: a new expression system for cloned foreign genes in Escherichia coli cells» Gene, 1990; 88:121—126.

103. Masuda K., h Ap. «Efficient production of the C-terminal domain of secretory leukoprotease inhibitor as a thrombin-cleavable fusion protein in Escherichia coli» Protein Eng., 1996; 9:101-6.

104. McGinness KE., Baker TA. h Sauer RT. «Engineering controllable protein degradation» Mol Cell, 2006; 22:701-7.

105. Miksch G., h pjp. «Libraries of synthetic stationary-phase and stress promoters as a tool for fine-tuning of expression of recombinant proteins in Escherichia coli» JBiotechnol., 2005; 120:25-37.

106. Modrich P. h Lahue R. «Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and cancer biology» Annu Rev Biochem, 1996; 65:101-33.

107. Morita M., h flp. «Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae Ol biotype El Tor» Microbiol Immunol., 2008; 52:314-7.

108. Murphy KC. «X Gam protein inhibits the helicase and chi-stimulated recombination activities of Escherichia coli RecBCD enzyme» J. Bacteriol, 1991; 173:5808-5821.

109. Murphy KC. «Use of bacteriophage X recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli» J Bacteriol, 1998; 180:2063-2071.

110. Murphy KC., Campellone KG. h Poteete AR. «PCR-mediated gene replacement in Escherichia coli» Gene, 2000; 246:321-330.

111. Murphy KC. h Marinus MG. «RecA-independent single-stranded DNA oligonucleotide-mediated mutagenesis» F1000 Biol Rep. , 2010; 2:56.

112. Muyrers JPP., Zhang Y., Testa G. h Stewart AF. «Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination» Nucleic Acids Res, 1999; 27:1555-1557.

113. Nakagawa Y., Yugi K., Tsuge K., Itaya M., Yanagawa H. h Sakakibara Y. «Operon structure optimization by random self-assembly» Nat Comput., 2010; 9:173-181.

114. Nakashima N., Tamura T. h Good L. «Paired termini stabilize antisense RNAs and enhance conditional gene silencing in Escherichia coli» Nucleic Acids Res, 2006; 34:el38.

115. Nash HA. «Site-specific recombination: integration, excision, resolution, and inversion of defined DNA segments. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium:CQ\\u\av and Modular Biology» 1996; 2:2363-2376.

116. Nielsen PE., Engholm M., Berg RH., Buchardt O. «Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide» Science, 1991; 254:1497-500.

117. Nishizaki T., Tsuge K., Itaya M., Doi N. h Yanagawa H. «Metabolic engineering of carotenoid biosynthesis in Escherichia coli by ordered gene assembly in Bacillus subtilis» Appl Environ Microbiol., 2007; 73:1355-61.

118. Oka T., h /ip. «Synthesis and secretion of human epidermal growth factor by Escherichia coli» Proc Natl Acad Sci USA, 1985; 82:7212-7216.

119. Oppenheim DS. h Yanofsky C. «Translational coupling during expression of the tryptophan operon of Escherichia coli» Genetics., 1980; 95:78595.

120. Oxer MD., Bentley CM., Doyle JG., Peakman TC., Charles IG. h Mako IJ. «High level heterologous expression in E. coli using the anaerobically-activated nirB promoter» Nucleic Acids Res, 1991; 19:2889-2892.

121. Patnaik R. «Engineering complex phenotypes in industrial strains» Biotechnol. Prog., 2008; 24(1 ):38-47.

122. Peredelchuk MY. h Bennett GN. «A method for construction of E. coli strains with multiple DNA insertions in the chromosome» Gene., 1997; 187:231-8.

123. Pestka S., Daugherty BL., Jung V., Hotta K., Pestka RK. «Anti-mRNA: specific inhibition of translation of single mRNA molecules» Proc Natl Acad Sci USA, 1984; 81:7525-8

124. Pfleger BF., Pitera DJ., Smolke CD. h Keasling JD. «Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes» Nat Biotechnol., 2006; 24:1027-32.

125. Pittard AJ. «Biosynthesis of the aromatic amino acids» В Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, создатель FC Neidhardt, 458484. Washington, DC: ASM, 1996.

126. Ponce E., Flores N., Martinez A., Valle F. и Bolívar F. «Cloning of the two pyruvate kinase isoenzyme structural genes from Escherichia coli: the relative roles of these enzymes in pyruvate biosynthesis» J Bacterioi, 1995; 177:5719-22.

127. Poteete AR. «What makes the bacteriophage lambda Red system useful for genetic engineering: molecular mechanism and biological function» FEMS Microbiol Lett. ,2001; 201:9-14.

128. Poulsen P., Bonekamp F., Jensen KF. «Structure of the Escherichia coli pyre operon and control of pyre expression by a UTP modulated intercistronic attenuation» EMBO J., 1984; 3:1783-90.

129. Ptashne M. A Genetic Switch. Cambridge: Blackwell Scientific Publications, 1992.

130. Rabilloud T. Proteome research : Two dimensional gel electrophoresis and identification methods (principals and methods). N.Y.: Springer, 2000.

131. Radding CM. «Homologous pairing and strand exchange in genetic recombination» Annu. Rev. Genet., 1982; 16:405-437.

132. Ranallo RT., Barnoy S., Thakkar S., Urick Т. и Venkatesan MM. «Developing live Shigella vaccines using lambda Red recombineering» FEMS Immunol Med Microbiol., 2006; 47(3):462-9.

133. Reuter JS. и Mathews DH. «RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis» BMC Bioinformatics., 2010; 11:129.

134. Reyrat JM., Pelicic V., Gicquel В. и Rappuoli R. «Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis» Infect Immun. , 1998; 66:4011-7.

135. Russell CB., Thaler DS., Dahlquist FW. «Chromosomal transformation of Escherichia coli recD strains with linearized plasmids». J. Bacteriology. 1989; 171:2609-2613

136. Saiki RK., h ^p. «Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia» Science, 1985;230:1350-4.

137. Salmon K., Hung SP., Mekjian K., Baldi P., Hatfield GW. h Gunsalus RP. «Global gene' expression profiling in Escherichia coli K12. The effects of oxygen availability and FNR »J Biol Chem., 2003; 278:29837-55.

138. Sambrook J. h Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d edition. CSHL Press, 2001.

139. Sauer U. «Evolutionary engineering of industrially important microbial phenotypes», Adv Biochem Eng Biotechnol. 2001; 73:129-69.

140. Sawers G. h Bock A. «Novel transcriptional control of the pyruvate formate-lyase gene: upstream regulatory sequences and multiple promoters regulate anaerobic expression» J Bacteriol, 1989; 171:2485-98.

141. Sawers G. h Jarsch M. «Alternative regulation principles for the production of recombinant proteins in Escherichia coli» Appl Microbiol Biotechnol., 1996; 46:1-9.

142. Sawitzke JA., Thomason LC., Costantino N., Bubunenko M., Datta S., h Court DL. «Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond» Methods Enzymol, 2007; 421:171-199.

143. Schoner BE., Hsiung HM., Belagaje RM., Mayne NG. h Schoner RG. «Role of mRNA translational efficiency in bovine growth hormone expression in Escherichia coli» Proc Natl Acad Sci USA., 1984; 81:5403-7.

144. Schroeckh V., Wenderoth R., Kujau M., Knupfer U. h Riesenberg D. «The use of elements of the E. coli Ntr-system for the design of an optimizedrecombinant expression system for high cell density cultivations» J Biotechnol. , 1999; 75:241-50.

145. Sharan SK., Thomason LC., Kuznetsov SG. h Court DL. «Recombineering: a homologous recombination-based method of geneticengineering» NatProtoc., 2009; 4:206-23.

146. Shaw WV. «Chloramphenicol acetyltransferase from chloramphenicol-resistant bacteria» Meth Enzymol, 1975; 43:737-755.

147. Shearwin KE., Callen BP. h Egan JB. «Transcriptional interference—a crash course» Trends Genet., 2005; 21:339-45.

148. Shen N. h ^p. «Inactivation of expression of several genes in a variety of bacterial species by EGS technology» Proc Natl Acad Sci USA, 2009; 106:8163-8

149. Shi ZX., h Ap. «Identification of alkA gene related to virulence of Shigella flexneri 2a by mutational analysis» World J Gastroenterol., 2003; 9(12):2720-5.

150. Shimada T., Makinoshima H., Ogawa Y., Miki T., Maeda M. h Ishihama A. «Classification and strength measurement of stationary-phase promoters by use of a newly developed promoter cloning vector» J Bacteriol., 2004; 186:7112-22.

151. Shirakawa M., Tsurimoto T. h Matsubara K. «Plasmid vectors designed for high-efficiency expression controlled by the portable recA promoter-operator of Escherichia coli» Gene, 1984; 28:127-32.

152. Siddiquee KA., Arauzo-Bravo MJ. n Shimizu K. «Effect of a pyruvate kinase (pykF-gene) knockout mutation on the control of gene expression and metabolic fluxes in Escherichia coli» FEMSMicrobiol Lett., 2004; 235:25-33.

153. Simpson RJ. h Davidson BE. «Studies on 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase(phe)from Escherichia coli K12. 2. Kinetic properties» Eur JBiochem., 1976; 70:501-7.

154. Singer M., h ffp. «A collection of strains containing genetically linked alternating antibiotic resistance elements for genetic mapping of Escherichia coli» Microbiol Rev., 1989; 53:1-24.

155. Singleton MR., Dillingham MS., Gaudier M., Kowalczykowski SC. h Wigley DB. «Crystal structure of RecBCD enzyme reveals a machine for processing DNA breaks» Nature, 2004; 432:187-93.

156. Smith GR. «Homologous recombination in procaryores» Microbiological reviews, 1988; 52(1): 1-28."

157. Smolke CD., Carrier TA. h Keasling JD. «Coordinated, differential expression of two genes through directed mRNA cleavage and stabilization by secondary structures»^/?/?/. Environ. Microbiol., 2000; 66:5399-5405.

158. Smolke CD. h Keasling JD. «Effect of gene location, mRNA secondary structures, and RNase sites on expression of two genes in an engineered operon» Biotechnol Bioeng., 2002; 80:762-76.

159. Sneppen K., Pedersen S., Krishna S., Dodd I. h Semsey S. «Economy of operon formation: cotranscription minimizes shortfall in protein complexes» MBio, 2010; pii:e00177-10.

160. Soupene E., h ^p. «Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression» J Bacteriol., 2003; 185:5611-26.

161. Spira B., Silberstein N. h Yagil E. «Guanosine 3',5'-bispyrophosphate (ppGpp) synthesis in cells of Escherichia coli starved for Pi» J Bacteriol., 1995; 177:4053-8.

162. Stefan A., Tonelli A., Schwarz F., Hochkoeppler A., «Artificial antisense RNAs silence lacZ in E. coli by decreasing target mRNA concentration» BMB Rep., 2008;41:568-74.

163. Stent GS. Molecular genetics an introductory narrative, S.F.:Free-man&Co, 1971.

164. Stephanopoulos GN., Aristidou AA. h Nielsen J. «Metabolic Engineering: Principles and Methodologies» 1998.

165. Studier FW., Rosenberg AH., Dunn JJ. h Dubendorff JW. «Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes» Methods Enzymol., 1990; 185:60-89.

166. Studier FW. «Protein production by auto-induction in high density shaking cultures» Protein Expr Purif., 2005; 41:207-34.

167. Su SS., Lahue RS., Au KG. h Modrich P. «Mispair specificity of methyldirected DNA mismatch correction in vitro» J. Biol. Chem., 1988; 263:68296835.

168. Su T-Z;, Schweizer H. h Oxender DL. «A novel phosphate-regulated expression vector in Escherichia coli» Gene, 1990; 90:129-133.

169. Taschner NP., Yagil E. h Spira B. «The effect of IHF on sigmaS selectivity of the phoA and pst promoters of Escherichia coli» Arch Microbiol., 2006; 185:234-7.

170. Taylor A., h «High-level expression and purification of mature HIV-1 protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter» Appl Microbiol Biotechnol., 1992; 37:205-10.

171. Tchurikov NA., Chistyakova LG., Zavilgelsky GB., Manukhov IV., Chernov BK., Golova YB. «Gene-specific silencing by expression of parallel complementary RNA in Escherichia coli», J Biol Chem., 2000; 275:26523-9

172. Thaler DS., h «Recombination of bacteriophage lambda in recD mutants of Escherichia coli» Genome, 1989; 31(l):53-67.

173. Tsuge К., Matsui К. и Itaya М. «One step assembly of multiple DNA fragments with a designed order and orientation in Bacillus subtilis plasmid» Nucleic Acids Res , 2003; 31:el33.

174. Wang HH., и др. «Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution» Nature, 2009; 460:894-8.

175. Wang ZW., Law WS. и Chao YP. «Improvement of the thermoregulated T7 expression system by using the heat-sensitive lacl» Biotechnol Prog., 2004; 20:1352-8.

176. Wanner BL. «Gene regulation by phosphate in enteric bacteria» J Cell Biochem, 1993; 57:47-54.

177. Wanner BL. «Phosphorus assimilation and8 control of the phosphate regulon» В Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology, создатель FC Neidhardt, 1357-1381. Washington, DC: ASM Press, 1996.

178. Wendisch VF., Bott M. и Eikmanns J. «Metabolic engineering of Escherichia coli arid Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic ас-ids and amino acid» Curr. Opin. Microbiol, 2006; 9(3):268-274.

179. Wich G., Leinfelder W. и Beckman K. «Microorganisms for the production of tryptophan and process for the preparation thereof». United States Патент 6180373, 2001.

180. Wong QN., Ng VC., Lin MC., Kung HF., Chan D. и Huang JD. «Efficient and seamless DNA recombineering using a thymidylate synthase A selection system in Escherichia coli» Nucleic Acids Res., 2005; 33:e59.

181. Wülfing С. и Plückthun А. «А versatile and highly repressible Escherichia coli expression system based on invertible promoters: expression of a gene encoding a toxic product» Gene, 1993; 136:199-203.

182. Xu Y., Rosenkranz S., Weng CL., Scharer JM., Moo-Young M. и Chou CP. «Characterization of the T7 promoter system for expressing penicillin acylase in Escherichia coli» Appl Microbiol Biotechnoi, 2006; 72:529-36.

183. Yang Y. и Sharan SK. «А simple two-step, "hit and fix" method to generate subtle mutations in BACs using short denatured PCR fragments» Nucleic Acids Res., 2003; 31:e80.

184. Yoo JH. и RajBhandary UL. «Requirements for translation re-initiation in Escherichia coli: roles of initiator tRNA and initiation factors IF2 and IF3» Mol Microbiol., 2008; 67:1012-26.

185. Yu D., Ellis HM., Lee EC., Jenkins NA., Copeland NG., Court DL. «An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli». Proc Natl Acad Sei USA., 2000; 97:5978-83.

186. Zaman MM., Boles TC. «Plasmid recombination by the RecBCD pathway of Escherichiacoli» J. Bacteriology., 1996; 178(13):3840-3845.

187. Zhan J., Ding В., Ma R., Ma X., Su X., Zhao Y., Liu Z., Wu J., Liu H. «Develop reusable and combinable designs for transcriptional logic gates». Mol Syst Biol, 2010; 6:388.

188. Zhang Y., Buchholz F., Muyrers JP. и Stewart AF. «А new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli» Nat Genet, 1998; 20(2):123-128.

189. Zhao X., Shen W., Ben P., Kong Y., Cao H. и Cui Z. «А loop-controlled rrnB PI promoter for high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli» Biotechnoi Lett., 2010; Epub ahead of print.

190. Каташкина Ж.И., Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., и др. «Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме» Молекул. Биол., 2005; 39:823-31.

191. Машко C.B., Лапидус А.Л., Лебедева М.И., и др. «Достижение высокоэффективной экспрессии клонированных генов путем конструирования гибридных оперонов» Докл. АН СССР, 1984; 278:1491-1496.

192. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва: Мир,1976.

193. Патрушев Л.И. Экспрессия генов, Москва: Наука, 2000.

Информация о работе

Крылов, Александр Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Использование рекомбинационной инженерии для прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы