Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов Escherichia coli: от Mu-зависимой "случайной" интеграции до сайт-специфических перестроек хромосомы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов Escherichia coli: от Mu-зависимой "случайной" интеграции до сайт-специфических перестроек хромосомы"

На правах рукописи

Мннаева Наталья Игоревна

«Развитие методов конструирования бесплазмидных

рекомбинантных штаммов Escherichia coli: от Mu-зависимой "случайной" интеграции до сайт-специфических перестроек хромосомы»

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

QU34Эри ^ —

- Москва 2008 -

003456618

Работа выполнена в лаборатории №4 Закрытого Акционерного общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент И.В. Бирюкова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.C. Миронов ФГУП ГосНИИгенетика

кандидат биологических наук,

Л.В. Генинг

Институт молекулярной генетики РАН

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «У^? » 008 года в 14— на заседании

Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан « /5» ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Г.Г. Заиграева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Конструирование бесплазмидных безмаркерных бактериальных штаммов-продуцентов биологически активных веществ является необходимым условием их дальнейшего использования в современном биотехнологическом производстве.

В настоящее время появляется все больше данных о том, что наличие в бактериальных клетках плазмид может негативно сказываться на жизнеспособности клеток, а именно: значительно изменять клеточный метаболизм, замедлять рост бактерий, что во многих случаях нежелательно при создании промышленных штаммов-продуцентов (Sauer U., 2001; Brownlie L. et al, 1990). Несомненный интерес к созданию нового поколения бесплазмидных штаммов-продуцентов обусловлен определенными запретами на использование плазмид в крупных микробиологических производствах по соображениям их возможного нежелательного распространения среди микроорганизмов окружающей среды. Кроме того, обычно, продуценты конструируются с помощью последовательных хромосомных модификаций, при которых требуется проведение многократных интеграций генетического материала в бактериальную хромосому, что вызывает ряд проблем, связанных с ограниченным набором селективных маркеров и законодательным граничением на их применение. Поэтому усовершенствование генно-инженерного инструментария, предназначенного для конструирования "есплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов, является актуальным и рактически значимым.

Исходя из наметившихся тенденций в современной биотехнологии, оздаются бесплазмидные безмаркерные штаммы-продуценты биологически ктивных веществ, образование которых в естественных условиях является езультатом скоординированной деятельности нескольких ферментов. Как равило, конструирование таких штаммов-продуцентов требует решения пецифических проблем, таких как: манипулирование множеством генов, оддержание индивидуального уровня экспрессии или регулируемого контроля кспрессии каждого из этих генов. Такие штаммы конструируют с помощью оследовательных хромосомных модификаций, включающих делеции или амены небольших участков генома, а также встраивания протяженных рагментов ДНК с генами/оперонами. Для осуществления первых двух казанных типов модификаций в случае продуцентов, создаваемых на основе таммов Е. coli, лучшим способом является разработанная несколькими сследовательскими группами /Л ed/ET-зави с и мая рекомбинация небольших рагментов ДНК с бактериальной хромосомой (Zhou J.G, 2003). Для нтеграции протяженных фрагментов используют различные системы на снове транспозонов и фага-Mu - для инсерций в случайную точку генома Herrero М. et al, 1990; de Lorenzo V., Timmis K.N., 1994; Lamb erg A et al., 2002; хвердян В.З. и др., 2007), или сайт-специфической рекомбинации актериофагов (X, <р80 и др.) - для интеграции в соответствующие уникальные

участки attB (Haldimc.nn A., Wanner B.L., 2001). Кроме того, возможно объединение нескольких разработанных систем в одной стратегии. Например: сайт-специфическая встройка кассеты может быть проведена в предварительно интегрированный случайным образом рекомбинационный сайт (Huang L.C. et al, 1997) или маркированная кассета может быть интегрирована случайным образом с последующим вырезанием селективного маркера с помощью сайт-специфической рекомбинации (Peredelchuk M.Y., Bennet G.N., 1997) При детальном рассмотрении предложенных методов можно обнаружить ряд недостатков, которые могут ограничивать их применение для конструирования штаммов-продуцентов. В связи с этим представлялось актуальным разработать новую стратегию конструирования, использующую достоинства известных систем и обеспечивающую возможность прецизионного дизайна всех планируемых модификаций.

Цель и задачи работы. Диссертационная работа посвящена разработке нового генно-инженерного инструментария для направленной модификации бактериального генома при создании бесплазмидных рекомбинантных штаммов Е. coli.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. конструирование mini-Mu-транспозонов с Mnt/Xis-вырезаемыми маркерами устойчивости к антибиотикам для селективного отбора интегрантов, содержащих целевые гены в составе бактериальной хромосомы;

2. разработка нового генно-инженерного инструментария, использующего сайт-специфические системы рекомбинации фагов ср80 и X для интеграции рекомбинантных плазмид с целевыми генами в бактериальную хромосому и последующего вырезания векторной части этих плазмид, соответственно:

• конструирование библиотеки штаммов с различной локализацией искусственных <р80-attB сайтов в бактериальной хромосоме;

• конструирование специализированного интегративного вектора;

3. применение нового метода для интеграции модельной кассеты в бактериальную хромосому.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана новая система, позволяющая интегрировать генетический материал (гены или опероны) в определенные несущественные точки хромосомы Е. coli. Данная система является удобным генно-инженерным инструментарием, прикладным назначением которого является конструирование бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов биологически активных веществ на основе Е. coli.

Осуществлено конструирование библиотеки штаммов Е. coli с различной локализацией искусственных ф80-attB сайтов в бактериальной хромосоме и нового <р80-интегративного вектора, содержащего в своем составе XattL/R сайты для вырезания векторной части плазмиды из бактериальной хромосомы после интеграции генетического материала. Продемонстрировано применение нового

метода для интеграции целевого гена в заранее определенные области бактериальной хромосомы. Показана зависимость уровня экспрессии гена, интегрированного в разные точки хромосомы, от удаленности выбранной точки от oriC.

Разработанная система была успешно использована в работах НИИ «Аджиномото - Генетика» при конструировании высокопродуктивных штаммов-продуцентов различных аминокислот.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы (три из которых в журналах, рекомендованных ВАК), 1 тезисное сообщение в материалах научной конференции. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ молодых сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2008), на международной научной конференции, посвященной 40-летию ГосНИИгенетика (октябрь 2008). Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре ЗАО "АГРИ" и секции по молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП ГосНИИгенетика в октябре 2008 года.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на 108 страницах, включая _17 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 184 источника, в том числе 5_на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Создание эффективного инструментария для интеграции генетического материала в бактериальную хромосому при конструировании бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов биологически активных веществ является актуальной задачей для биотехнологии на протяжении многих лет. Достаточно долгое время не существовало универсальной системы интеграции генетического материала в хромосому. Поэтому в каждом конкретном случае конструирования определенного бесплазмидного безмаркерного штамма-продуцента исследователям необходимо было разрабатывать сложную генетическую стратегию, для реализации которой требовалось много времени и сил. В качестве одного из примеров такой стратегии мы описываем использованную нами систему на основе mini-Mu для интеграции в бактериальную хромосому искусственно созданного оперона aroG4-serA5-serC, где ген serC использовался в качестве генетического селективного маркера, при конструировании бесплазмидного штамма-продуцента L-триптофана.

1. Применение mini-Mu системы для интеграции целевых генов в бактериальную хромосому.

При конструировании целевого штамма была использована известная система, осуществляющая интеграцию mini-Mu в случайные точки бактериальной хромосомы. Элементами этой Mu-зависимой системы (Ахвердян В.З. и др., 2007) являются две совместимые плазмиды, имеющие относительно нестабильные репликоны, что позволяет после проведения интеграции целевых генов в бактериальную хромосому «излечить» клетку от ранее введенных в нее плазмид. Первая из двух - это плазмида-помощник рМНЮ, которая содержит в своем составе ген транспозазы и ген термочувствительного репрессора бактериофага Mu, что позволяет осуществлять термоиндуцибельный синтез фаговой транспозазы в бактериальной клетке. рМНЮ маркирована KmR. Вторая - интегративная плазмида на основе pMDV3 (Зименков Д.В. и др., 2004), содержащая mini-Mu-транспозон, фланкированный концевыми фрагментами ДНК фага Mu (Mu-L и Mu-R). Тем самым при активации транспозазы осуществляется репликативная транспозиция mini-Mu в бактериальную хромосому. Для обеспечения удобства последующего селективного отбора клонов, содержащих интегрированную в бактериальную хромосому копию mini-Mu, в состав этого транспозона искусственно вводят маркер устойчивости к антибиотику. Однако законодательное ограничение на присутствие в геноме промышленных штаммов-продуцентов генов устойчивости к антибиотикам заставляло исследователей в прикладных целях искать альтернативные возможности отбора интегрантов.

Так в нашей работе мы использовали в качестве генетического маркера аллель serC дикого типа, комплементирующий мутантный фенотип реципиентного штамма Е. coli TG 1 -serC-тЬ]-123 O/Tn 10. Использованный нами реципиентный штамм содержал мутацию в гене serC, сцепленную с Тп 10 и

имел фенотип Ser' TcR. Кроме того, вследствие полярного эффекта, мутация в гене serC вызывала нарушение экспрессии гена агоА, находящегося в одном опероне с serC, что являлось причиной мутантного фенотипа Aro'. Таким образом, выбранный нами реципиентный штамм для нормального роста на минимальной среде нуждался в добавках Ser (50 мкг/мл), Тгр (50 мкг/мл), Phe (50 мкг/мл), Туг (50 мкг/мл), ПАБК (5 мкг/мл), пиридоксина (5 мкг/мл).

В ходе выполнения работы для интеграции в хромосому был сконструирован искусственный оперон. В состав оперона входили два гена: ген serA5, кодирующий D-3-фосфоглицерат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.95), устойчивую к ретроингибированию серином, и ген aroG4, который кодирует 3-дезокси-0-арабино-гептулозонат-7-фосфат синтетазу (ЕС 2.5.1.54), устойчивую к ретроингибированию фенилаланином. Кроме того, в состав интегрируемой кассеты в качестве генетического маркера входил ген serC дикого типа, кодирующий фермент 3-фосфосерин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.52).

В качестве матрицы для амплификации структурной части гена aroG4 была использована плазмида pAROG4 (Kikuchi Y. et al, 1997). Использованные праймеры содержали сайты расщепления рестриктазами Xbal и Smal на 5'-концах олигонуклеотидов. В качестве вектора для клонирования амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента ДНК с геном aroG4 использовали рекомбинантную интегративную плазмиду pMDV3, в которую предварительно был клонирован BglII-XbaI-фрагмент ДНК с промотором Ptoc.,dcai (0/íi(.4dear Р(ш/0/ас) (Машко C.B. и др., 2001) и XbaI-EcoRI-фрагмент полилинкера.

На следующем этапе работы рекомбинантная плазмида pMDV-aroGV была использована в качестве вектора для клонирования структурной части гена serA5. Этот ген был получен в результате ПЦР-амплификации, в качестве матрицы структурной части гена serA5 использовали плазмиду pGH5 {Патент US 6180373). Встраивание фрагмента в состав векторной плазмиды происходило по участкам расщепления рестриктазами Smal и SacI, сайты узнавания которыми были предусмотрены в составе олигонуклеотидных праймеров. Кроме того, в 3 '-нетранслируемой области s er А 5 был введен также дополнительный сайт расщепления рестриктазой Sali, который использовали в дальнейшем для встраивания фрагмента Р¡pp-serC. Фрагмент Рipp-serC был получен в результате лигирования по сайту расщепления рестриктазой Xbal двух фрагментов ?¡pp и serC, амплифицированных с хромосомы штамма MG1655 (htpp://mol. genes, nig.ac.jp/ecoli) с использованием праймеров, содержащих на 5'-концах сайты расщепления рестриктазами Sall/Xbal и Xbal/Sacl, соответственно. Структура полученной в ходе этих экспериментов рекомбинантной интегративной плазмиды pMDV-aroG4-serA5-serC, способной интегрировать расположенный между участками Mu-attL - Mu-atîR целевой фрагмент ДНК в состав бактериальной хромосомы (при наличии в клетке дополнительной плазмиды-помощника рМНЮ с геном Ми-интегразы), схематично представлена на рисунке 1.

В данной работе именно ген serC в составе, полученной таким образом, рекомбинантной плазмиды использовали в качестве селективного маркера для отбора клонов-интегрантов реципиентного штамма с фенотипом Ser+

содержащих в хромосоме интегрированный фрагмент ДНК с генами аго04, зегА5и ¡егС, фланкированный участками Ми-аиЬ и Ып-аиЯ.

Рисунок 1.

Схема конструирования интегративной плазмиды pMDV-aroG4-serA5-serC.

Селективный отбор целевых клонов проводили на минимальной среде М9 с глюкозой и добавками: Trp, Phe, Туг, ПАБК в необходимых концентрациях, но без добавления в среду Ser и пиридоксина. В результате интеграции кассеты было получено несколько десятков независимых клонов, имевших фенотип - Ser+, TcR, Aro", которые по данным ПЦР-анализа содержали в составе своей хромосомы целевой фрагмент ДНК с генами aroG4, serAS, serC и одновременно сохраняли мутантный serC-aroA-оперон в месте его природной локализации в геноме. Для нескольких независимых клонов-интегрантов были определены координаты точек интеграции кассеты в хромосоме (Зименков Д.В. и др., 2004). Один из этих штаммов (с точкой интеграции - 2.933.542) был использован нами в дальнейшей работе. Необходимо отметить, что после интеграции кассеты в бактериальную хромосому, реципиентный штамм сохранил мутантный фенотип Aro" и нуждался в восстановлении фенотипа дикого типа путем замены участка хромосомы, содержащего мутантный оперон serC-aroA на соответствующий участок хромосомы дикого типа при помощи Р1-трансдукции. Целевые клоны-трансдуктанты отбирали на минимальной среде с глюкозой и проверяли на отсутствие устойчивости к Тс.

Bjül Xbai ,„ , Smal S»cl

\&/ x\_ю^

Как видно из приведенного выше описания, использованная нами система интеграции одной кассеты представляла трудоемкий многоступенчатый процесс и обладала рядом существенных недостатков, делающих ее трудноприменимой при создании штаммов-продуцентов биологически активных веществ. Первое ограничение для практического использования этой системы связано с неспецифичностью Mu-интеграции (Wang X., Higgins P., 1994) и необходимостью определять координаты точек интеграции для каждой интегрированной кассеты. Без этого невозможно целенаправленное конструирование штаммов-продуцентов, предполагающее выбор только тех точек, итеграция в которые не вызывает изменений в экспрессии каких-либо существенных генов. Использование в качестве селективного маркера гена, комплементирующего мутантный фенотип, такого как s er С, так же является очевидным недостатком рассмотренной выше интегративной системы, т.к. вызывает необходимость подбора специального штамма-реципиента, имеющего мутантный фенотип. При использовании таких маркеров становится невозможным последовательное совмещение нескольких копий одной и той же кассеты, имеющих разные точки интеграции, из независимо полученных интегрантов с помощью Р1-трансдукции. А при совмещении нескольких кассет с разными селективными маркерами требуется наличие в штамме реципиенте нескольких соответствующих каждому из маркеров мутаций. Введение в штамм-продуцент дополнительных мутаций может негативно отразиться на его свойствах, поэтому после каждого акта интеграции кассеты необходимо восстановление статуса «дикого типа» мутантного гена. В связи с этим актуальным является использование системы вырезаемых маркеров.

1.1. Замена селективного маркера serC в интегрированной кассете ¥,ac-ïaroG4-serA5-serC на вырезаемый маркер CmR с помощью Red-

системы фага >..

Относительно недавно несколькими исследовательскими группами были разработаны методы интеграции генетического материала в бактериальную хромосому на основе IRed/RecET-зависимой рекомбинации (Murphy К.С., 1998, Zhang Y. et al, 1998; Murphy K.C.et al, 2000; Zhou J.G. al, 2003; Court D.L. et al, 2002; Copeland N.G. et al, 2001). Замену генетического маркера serC в интегрированной в бактериальную хромосому кассете Рlac->aroG4-serA5-serC на «вырезаемый» антибиотический маркер планировали осуществить с помощью одного из этих методов, основанного на Red-зависимой рекомбинации фага X и разработанного под руководством проф. Б.Л. Ваннера (Datsenko К.А., Wanner B.L., 2000). В качестве маркера в данной системе можно использовать практически любой функционально активный ген устойчивости к антибиотику. Матрицей для амплификации такого маркера может служить одна из многочисленных бактериальных плазмид или один из транспозонов, содержащих ген антибиотической устойчивости, экспрессия даже одной копии которого обеспечивает клетке устойчивость к антибиотику. В нашей работе в качестве матрицы для амплификации вырезаемого маркера мы использовали специально сконструированную плазмиду pMWl 1 %-(XattL-CmK-7.attR) (Каташкина Ж.И. и др., 2005). В этой плазмиде эффективно и конститутивно

экспрессирующийся под транскрипционным контролем одного из ранних промоторов А2 бактериофага Т7 ген cat фланкирован искусственно созданными сайтами XattL и KattR. Эти сайты обеспечивают принципиальную возможность вырезания маркера после селективного отбора целевых интегрантов с помощью Int/Xis-зависимой системы рекомбинации фага )., как показано ранее (Peredelchuk & Bennett, 1997).

Используя плазмиду-помощник pKD46 из системы, разработанной под руководством Б.Л. Ванера, которая имеет в своем составе гены, кодирующие белки фага X - Exo, Bet и Gam, непосредственно обеспечивающие рекомбинацию, в состав интегрированной кассеты Рiac->aroG4-serA5-serC, находящейся в хромосоме штамма E.coli TGI, вместо гена serC был введен ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm), cat, под транскрипционным контролем промотора Т7А2, фланкированный участками XattL/R. Фрагмент ДНК, содержащий маркер устойчивости к Cm, был амплифицирован методом ПНР с праймеров, имеющих на 5'-концах участки (36 н.п.), гомологичные участкам хромосомы, фланкирующим область модификации (область serC в интегрированной кассете ?mc-^aroG4-serA5-serC) (рис.2).

Mu-attL

Ptacld serAS serC aroGi „ Pfec

Mu -attL

Mu -attR

АЛЛ»

замена гена serC на вырезаемый маркер с использованием XRed-зависимой интеграции

Ptacld serAS

aroG4 hittR cat "M}jittL

Mu -attR

>ЛЛЛ

ЛЫУХ15-заяисимое вырезание антибиотического маркера

Рисунок 2.

Замена селективного маркера serC на вырезаемый ген cat, кодирующий устойчивость к хлорамфениколу.

Интеграция маркера в заданное место была подтверждена с помощью метода ПЦР. Штамм TGl-CmR, содержащий в хромосоме кассету Рtac->aroG4-serA5-(XattL-CmK-XattR) был использован в дальнейшем как донор этой кассеты, маркированной CmR, для переноса в другие штаммы, включая штамм-

продуцент триптофана, с помощью Р1 -зависимой трансдукции. Отбор целевых трансдуктантов проводили на среде, содержащей хлорамфеникол. Структурную целостность интегрированной кассеты подтверждали проведением соответствующей ПЦР. Удаление маркера из бактериальной хромосомы проводили с помощью /.-Int/Xis-зависимой системы.

Несмотря на достаточно высокую эффективность самого процесса интеграции генетического материала с помощью mini-Ми системы и возможность интегрировать достаточно протяженные фрагменты ДНК, применение этого метода при конструировании рекомбинантных штаммов ограничено из-за неспецифичности интеграции генетического материала в бактериальную хромосому и необходимости определения точек интеграции. С другой стороны, XRed/RecET не может полностью заменить mini-Ми систему, например, в случае интеграции генов, гомологи которых содержатся в бактериальной хромосоме, так как при такой интеграции возможны непредсказуемые перестройки хромосомы. Таким образом, несмотря на высокую эффективность и специфичность интеграции, свойственную ARed/RecET-зависимой системе, она позволяет осуществить только часть ДНК модификаций, необходимых при конструировании современных штаммов-продуцентов биологически активных веществ. В связи с этим возникла необходимость в разработке новой системы, максимально учитывающей недостатки описанных выше методов и позволяющей интегрировать достаточно протяженный генетический материал в строго определенные несущественные точки хромосомы E.coli.

2. Разработка новой стратегии интеграции генетического материала на основе сант-спецфической системы рекомбинации.

В различных лабораториях для интеграции/вырезания кассет применялась система на основе элементов сайт-специфической рекомбинационной системы фага X (Yu D. et al., 2000; Каташкина и др., 2005). Разработан также метод сайт-специфической интеграции генов в природные attB-сайты Е. coli для фагов ср80, Р21, Р22, НК022 (Haldimann A., Wanner B.L., 2001). В этом методе, первоначально, кассеты клонируются в pir+ штамме (для репликации плазмиды с условно-репликативным ori необходим Pir-белок, кодируемый геном pi г) на условно-репликативных интегративных CRIM плазмидах (conditional replication, integration and modular) с селективным маркером и соответствующими a/iP-сайтами. Плазмида-помощник, содержащая в своем составе ген, кодирующий белок Int, используется для интеграции полученной рекомбинантной молекулы ДНК в attB-сайт реципиентного штамма, который не поддерживает репликацию CRIM-плазмиды. Вторая плазмида-помощник содержит в своем составе гены int и xis, и используется для вырезания CRIM-плазмид из хромосомы. Все плазмиды-помощники сконструированы на базе термочувствительного репликона, что позволяет легко удалить их из клеток посредством культивирования бактерии при повышенной температуре.

Идея нового метода для конструирования бесплазмидных безмаркерных рекомбинантных штаммов заключалась в использовании сайт-специфической системы рекомбинации фага (р80 для интеграции целевых фрагментов ДНК

(генов/оперонов) в заранее определенные несущественные области бактериальной хромосомы. В процессе конструирования нашей системы мы модифицировали элементы сайт-специфической системы интеграции, разработанной проф. Банером (Haldimann А„ Wanner B.L., 2001) для встраивания генетического материала только в природный ф80-а#Б сайт. Предлагаемый нами метод на первом этапе предусматривал интеграцию искусственных ср80-attB сайтов в различные точки бактериальной хромосомы при помощи XRed-зависимой системы с последующей интеграцией в эти сайты целевых фрагментов ДНК. Собственно интеграция обеспечивалась двумя сайт-специфическими рекомбинационными процессами: первый - это интеграция рекомбинантной ДНК с помощью ср80-системы, и второй - это вырезание с помощью /Jnt/Xis-системы части интегративного вектора, фланкированной XattL/R-camsMi\, для удаления селективного маркера и ориджина репликации. Набор из CRIM-плазмиды и плазмид-помощников для ср80 сайт-специфической рекомбинации был любезно предоставлен нам проф. Б.Л. Банером. В настоящей работе эти плазмиды использованы наряду с плазмидой pKD46 для Red-рекомбинации и сайт-специфической системы рекомбинации фага X. Новый метод схематически представлен на рисунке 3 .

Рисунок 3.

Схема нового метода для конструирования бесплазмидного безмаркерного рекомбинантного штамма.

А: делеция природного ср80-аиВ сайта с помощью /Лес1-рекомбинации. Б: /Лес1-интеграция ф80-1п1;/Х1Б-вырезаемого маркера в выбранные локусы хромосомы штамма МС-А(<р80-а«В). В: вырезание маркера с использованием ф80- 1т/Х1з -системы. Г: (р80-1пИависимая-интеграция СШМ плазмиды с целевой кассетой в различные ф80-аиВ сайты. Д: конструирование немаркированного штамма посредством л-М/Х^з-зависимого вырезания векторной части интегративной плазмиды.

А.

сг

прнродныи

МС1655

О

МС1055 Д(ф80-я«В)

делеция природного ф80-мВ сайта в хромосоме

Ф80-ДЯ/,

В.

М1ес1-зависимая интеграция (р80-1т/Х)з-вырезаемого маркера в различные точки хромосомы 1\Ю1655 Д(ф80-аиВ)

1ооо5о.

|=>

О ООО о

<?80-1МВ

ф80-1п1/Х1з-зависимое вырезание маркера

Г.

шь

ф80-аиР

ооооо

маркер

Ш1К

ф80-интеграция кассеты в библиотеку штаммов с различной локализацией у&О-аПВ сайтов

д.

ЫгЛОЙБ-зависимое вырезание векторной части интегративной плазмиды с маркером и ориджином репликации

2.1. Конструирование штаммов с различной локализацией ф80-attB сайтов.

Для интеграции искусственных ср80-attB сайтов мы выбрали гены, нарушение которых в результате естественного встраивания IS-элементов (в нашем случае IS5.7 - IS5.10) не приводило к ухудшению жизнеспособности клеток. Поэтому интеграция в эти точки искусственных кассет так же не должна нарушать жизненно-важные гены. То обстоятельство, что IS-элементы распределены по хромосоме MG1655 случайным образом (Blattner F.R. et al., 1997) (рис.4) и находятся на разном расстоянии от oriC, позволяло нам рассчитывать на возможность моделировать уровень экспрессии одной и той же кассеты интегрированной в разные точки хромосомы, в зависимости от ее расположения относительно oriC. Мы предполагали, что уровень экспрессии одной и той же кассеты будет зависеть от ее расположения на б-подобной структуре реплицирующейся хромосомы и эффекта «дозы гена»: кассеты, расположенные ближе к oriC будут экспрессироваться более эффективно, чем кассеты, расположенные около области терминации репликации хромосомы (Sousa С. et al, 1997). Кроме того, выбранные нами точки расположены достаточно далеко относительно друг друга, поэтому интегрированные в них кассеты могут быть объединены в одном штамме путем последовательных актов Р1 -транс дукции.

SpS* IS" is5-8 IS5.9 IS5.10 IS5.11

О 10 20

30 40

9 60

70

80 90

J_L

100

oriT

oriC

минуты

Рисунок 4.

Расположение ISS-элементов в хромосоме MG1655.

Разработанный нами метод был реализован в несколько этапов. На первоначальном этапе в штамме MG1655 был удален природный ф80-attB сайт, расположенный на 28 минуте хромосомы, с помощью ^Red-рекомбинации между хромосомой E.coli MG 165 5 и фрагментом ДНК, содержащим >.-Int/Xis-вырезаемый маркер CmR. Для амплификации с помощью метода ПЦР фрагмента ДНК, содержащего маркер, в качестве матрицы использовали плазмиду рМ\У118-(Хя#£-Стк-Хя/?Л). Вырезание маркера CmR из хромосомы посредством /.-Int/Xis-системы проводили, как описано в (Peredelchuk M.Y., Bennett G.N., 1997; Каташкина и др., 2005). После Red-зависимой рекомбинации и вырезания маркера модификацию ДНК подтверждали методом ПЦР. Полученный бесплазмидный штамм MG-A((p80-a«£) был использован как реципиент для введения новых искусственных ф80-attB сайтов, которое осуществлялось через следующие этапы:

1. конструирование рекомбинантной плазмиды pMWattphi, содержащей кассету (ф%0-ctttL) KinR-> (ip80-aitR), на основе плазмиды pMW118-Sce-Kan, используемой в качестве вектора (рис.5);

2. использование полученной рекомбинантной плазмиды pMWattphi в качестве матрицы для ПЦР-амплификации фВО-ЬИ/ХЬ-вырезаемого маркера, фланкированного последовательностями в 36 нуклеотов, гомологичными выбранным локусам на хромосоме MG1655;

3. ^.Red-зависимая интеграция маркеров в хромосому штамма МС-Д(ф80-attB) для создания серии маркированных штаммов с подтверждением правильности полученной структуры с помощью ПЦР;

4. конструирование серии немаркированных штаммов М0-ф80-а«в (i) путем излечивания каждого полученного маркированного штамма от маркера KmR посредством ф80-1т/Х1з ситемы;

5. тестирование новых штаммов MG-фВО-attB (i) и MG1655 (в качестве контроля) на возможность интеграции/вырезания CRIM-плазмиды рАН162 по стандартному протоколу (Haldimann A., Wanner B.L., 2001) с использованием ф80-1п1- и ф80-1т/Х1з - плазмид-помощников, соответственно. Эффективность интеграции/вырезания в или из искусственных ySO-attB сайтов была практически такой же, как и в природный а«В-сайт'.

Р <«*«л \\repA

pMWl 18-Sce-Km

lad

TrrnB

EcoRI

ВатШ ton

pMWattphi

attL ф80

TrrnB

attRif 80

Рисунок 5.

Структура плазмид: А. pMWl 18-8се-Кап и Б. рМ\УайрЫ.

Следует отметить, что маркированная часть созданной библиотеки штаммов была успешно использована для оценки потенциальных точек интеграции при конструировании реального штамма-продуцента. Для этого

' Хотя эффективность вырезания CRIM-плазмид из всех проверяемых сайтов была 15-30% (а не 100%, как описано в {Haldimann A., Wanner B.L., 2001)), получение немаркированных клонов не является проблемой. Эффективность вырезания с помощью /.-Int/Xis системы в тех же самых условиях была значительно выше и составила 80%.

соответствующий маркированный ср80-аПВ сайт вводили в хромосому штамма-продуцента с помощью Р1-трансдукции, и оценивали его влияние на такие важные свойства продуцента, как ростовые характеристики и продуктивность. Немаркированная («излеченная») библиотека штаммов МС-ф80-а»В (¡) была использована в качестве реципиентов для интеграции СММ плазмиды, содержащей целевую кассету.

2.2. Конструирование ф80-интегративной СММ плазмиды с М^Жв-вырезаемой «векторной частью».

Для интеграции целевой кассеты в штаммы М0-(р80-а«5 (¡), различающиеся по локализации искусственных ф80-а«£ сайтов, был сконструирован интегративный вектор на основе СШМ-плазмиды, содержащей <р80-аиР сайт, любезно предоставленной нам проф. Б.Л. Банером. Как видно из рисунка 6, исходная СШМ-плазмида, содержащая в своем составе клонированный в МСБ фрагмент ДНК может быть интегрирована в любой из искусственных ср80-аНВ сайтов, расположенных в бактериальной хромосоме. Однако, после интеграции целевого фрагмента, удаление антибиотического маркера и векторной части плазмиды предложенная структура не предусматривает. В связи с этим, исходная плазмида рАН162 была модифицирована нами таким образом, чтобы обеспечить возможность вырезания векторной части плазмиды, содержащей селективный антибиотический маркер и ориджин репликации, из бактериальной хромосомы после сайт-специфической интеграции рекомбинантной ДНК. Нами были сконструированы новые ср80-подобные СШМ-плазмиды с Ып1/Х1з-вырезаемой векторной частью.

Новая плазмида рАН 162-/х1ИЬ-Тск'-}хШЕ (рис.6) имела в своем составе не модифицированный фрагмент из рАН162, включающий <р80-аПР сайт и МСБ, фланкированный бактериальным (^пВ) и фаговым (?. ЛЗ) транскрипционными терминаторами (после интеграции целевой кассеты в хромосому терминатор г%пВ предотвращает сквозную транскрипцию с расположенных перед интегрированной кассетой природных транскрипционных единиц, а терминатор 0,3 защищает хромосомные гены от начавшейся внутри кассеты транскрипции). Фрагмент, включающий антибиотический маркер Тск из ТпЮ и ориджин репликации огЖу, был нами фланкирован "каНЬ/Я сайтами, что позволило удалять векторную часть плазмиды с помощью МшЖв системы. Целевая кассета, при этом, оставалась в хромосоме. Ожидаемые свойства плазмиды рАН162-Ха«/,-Тск-Хя^ были проверены непосредственной интеграцией ее в природный <р80-аНВ сайт хромосомы штамма Мв1655 с последующим Ып^Х1з-зависимым вырезанием маркированной векторной части, фланкированной Х-анЬ/Я сайтами. Из 80 тестируемых клонов, излеченных от АЛпйООэ плазмиды-помощника, более чем 80% не содержали Тск маркер.

I tL3

g attP phiSO B.

«ttR attPphi80 - attP phiSO

Рисунок 6.

А: Структура CRIM плазмиды pAH162.

Б: структура плазмиды pАН 162-7x;ttL-TcR-)j3ttR. Эта новая CRIM-плазмида была использована в качестве вектора для молекулярного клонирования гена cat. С: структура плазмиды pAHl62-'kattL-7cR-'kattR-CmK. Это рекомбинантная плазмида, сконструированная на базе нового CRIM-вектора, которая включает ген cat под транскрипционным контролем промотора А2 фага Т7 в качестве модельного гена для интеграции в хромосому.

2.3. Использование новой системы для множественной интеграции гена cat

в хромосому E.coli.

Как уже упоминалось, новая система разрабатывалась нами для создания безмаркерных бесплазмидных штаммов-продуцентов биологически-активных веществ. Эффективность использования новой системы для интеграции генетического материала в бактериальную хромосому была продемонстрирована нами на модельной системе, где в качестве целевой кассеты мы использовали эффективно экспрессирующийся с промотора Р17А2 ген cat. Эксперимент состоял из нескольких этапов:

1. На первом этапе ген cat был клонирован на плазмиде рАН 162-/*a»Z,-TcR-XattR. В качестве матрицы для ПЦР-амплификации гена cat использовали плазмиду рМ\У118-(Ад//1-Стк-Ад#Л). В этой плазмиде структурная часть гена cat с нативным RBS из Tn9 E.coli находилась под транскрипционным контролем сильного фагового промотора РТ7лг, который распознается РНК

полимеразой E.coli (о70) и работает конститутивно. Для амплификации гена cat использовали праймеры, содержащие в своем составе сайты узнавания для SphI и SacI для клонирования на плазмиде pAH\62-)MttL-TcK-)MttR. В качестве реципиента для амплификации новой плазмиды мы использовали штамм E.coli CCI 18 (kpir+). Трансформанты E.coli CCI 18 Q-pir*), содержащие рекомбинантную плазмиду отбирали на среде с Тс (12,5 мг/мл). Ожидаемая структура плазмиды была подтверждена рестрикционным анализом и методом ПЦР.

2. На следующем этапе рекомбинантная плазмида pAHl 62-lattL-lcK-lattR-CmR была интегрирована в хромосому штаммов MG-ç&O-attB (i) с различной локализацией <p80-attB сайтов и MG1655 с природным ср80-attB сайтом (рис.7).

I PMWuttphi у

■ f <Р80 -úttR

I конструирование библиотеки штаммов с * различной локализацией ф80-attB сайтов

gnd иаВ phiM trs3.7 Y*fJ

Уф! an В phiSO treS 8 narP glcÇ attB phiSO O-sS.5 y¡hQ yhcE irsS 10 attB phiKU ykeG

yhiS trs5.11 aaB phiSO sln

ср80-интеграция кассеты в библиотеку штаммов

ф80nul Хаян ШЯ taA onS XML rgnB Т7А2 cat tL3 ф80-attR .....■ .;,:>-

A-Int/X¡s-3aBHcnM0c вырезание маркера и орилжлиа репликации фНО-at/L rgnB cat tL3 ф80-attB

UttB T7A2

Uh прирвдный ,mg I attB pbi80

Рисунок 7.

Интеграция плазмиды в штаммы с различной

локализацией ф80 -аиВ сайтов.

Отбор клонов-интегрантов проводили на питательной среде, содержащей Тс (12,5 мг/мл). Правильность интеграции проверяли с помощью ПЦР-анализа. 100% отобранных по устойчивости к Тс клонов содержали рекомбинантную плазмиду в составе хромосомы. Таким образом, была получена серия

маркированных штаммов, которые были названы как MG-TcR-cfl/-(i), где (i) варьировалось от 1 до 6 и означало определенную точку интеграции.

3. В отобранных и проверенных с помощью ПЦР-анализа интегрантах на следующем этапе с помощью Wnt/Xis сайт-специфической системы рекомбинации была удалена векторная часть плазмиды, содержащая TcR-маркер и ориджин репликации. Целостность конечной конструкции проверяли методом ПЦР-анализа. Эффективность вырезания маркера с помощью Х- Int/Xis системы составила 80%. В результате была получена серия безмаркерных штаммов MG-ca/-(i) с единичной саГ-кассетой в хромосоме, отличающихся местом локализации этой кассеты.

4. На заключительном этапе мы совместили 2 или 3 сд/-кассеты в хромосоме одного штамма путем последовательных актов Р1-трансдукции, используя в качестве доноров кассет серию маркированных штаммов, с предварительным удалением TcR маркера из реципиентного штамма перед каждым следующим актом Р1-трансдукции. Так cat-кассета из штамма MG-TcR-cat-(i) с помощью Pl-трансдукции была перенесена в штамм MG-caf-(j) (где i^j) с последующим X-Int/Xis удалением Тск-маркера. Полученный немаркированный штамм MG-ca/-(i + j) содержал уже две са/-кассеты в (i) и (j) позициях. Третья кассета была добавлена аналогичным образом. Все этапы по увеличению количества cai-кассет в хромосоме рекомбинантного немаркированного штамма контролировались определением Cat-активности.

Эффективность экспрессии гена cat во всех сконструированных в процессе работы штаммах проверяли непосредственным определением ферментативной активности хлорамфениколацетилтрансферазы. (рис.8, таб. 1). Как и ожидали, уровень экспрессии гена cat коррелировал с расстоянием между точкой его интеграции в хромосому и oriC: штаммы, у которых ген cat расположен ближе к oriC, имели большую Cat-активность. Кроме того, данные, представленные в таблице 1, показывают, что суммарная Cat-активность в мульти-интегрантах коррелирует с количеством копий гена cat в хромосоме.

Подводя итоги, можно сказать, что новый метод достаточно прост в использовании и является модификацией разработанных ранее методов. Совмещение Шес1-системы и двух сайт-специфических рекомбинационных систем в одном методе для конструирования бесплазмидного рекомбинантного штамма с определенной структурой является очевидным решением для устранения недостатков разработанных ранее методов. Такая стратегия может оказаться полезной как для фундаментальных исследований, так и для прикладной микробиологии и биотехнологии.

Таблица 1.

Са^активность в МО-са/-(1) и МО-са?-(Н-]) штаммах.

Результаты были усреднены для трех независимо выращенных культур для каждого штамма; погрешность составляет 5-15%.

штаммы MG-cflf-(i) IS элемент Активность, нмоль/мин*мг

MG-caf-(l) IS 5.7 180±15

MG-cei-(2) IS 5.8 180±15

MG-ce/-(3) IS 5.9 240±30

MG-cai-(4) IS 5.10 280±15

MG-cai-(5) IS5.11 270±15

MG-caf-(6) природный <p80-a/f.B 200±30

штаммы MG-ca/-(i+j)

MG-ca?-(l+2) IS 5.7 IS 5.8 330±15

MG-caf-(l+3) IS 5.7 IS 5.9 420±30

MG-ca/-(2+3) IS 5.8 IS 5.9 420±30

MG-«7i-(l+2+3) IS 5.7 IS 5.8 IS 5.9 520±15

MG-eei-(4+5) IS 5.10 IS 5.11 500±30

MG-caf-(4+6) IS 5.10 природ. ф80-я«5 370±15

MG-cai-(5+6) IS5.11 природ. <р80-я/ГЯ 400±15

MG-ca/-(4+5+6) IS 5.10 IS 5.11 природ. <p80-atfB 540±30

10

30 40 | 5*0 60

70

80 90 100

природным апВ рЬкО '

опТ

13 5.7 15 5.8

15 5 9 В 5 И « 5 Ш

опС

минуты

Рисунок 8.

Экспрессия сШ-гена в штаммах \\С-са1-(\).

Расположение са1-кассет (Т7А2-«?/) в хромосоме показано стрелками. Саь активность МСт-саг-(б) штамма, в котором кассета (Т7А2-саГ) локализована в природном ф80-аПВ сайте, принята за 100%.

Выводы.

1. На основе использования механизмов Red/ET гомологичной рекомбинации и сайт-специфической рекомбинации бактериофагов <р80 и X разработана новая стратегия прецизионной интеграции в хромосому Е. coli фрагментов ДНК, в состав которых могут входить как отдельные генетические элементы, так и целые гены и/или опероны.

2. Для экспериментальной реализации этой стратегии:

• созданы необходимые генетические элементы для Red-зависимого введения искусственных ср80-attB сайтов в любые выбранные точки генома Е. coli, что экспериментально продемонстрировано при создании на основе MG1655 библиотеки из 5 штаммов с различной локализацией уникального ср80-attB в бактериальной хромосоме;

• на основе плазмиды с Pir-зависимым репликоном осуществлено конструирование нового интегративного вектора, содержащего ф80-attP, а потому способного к сайт-специфической интеграции в q>S0-attB сайт бактериальной хромосомы в присутствии функционально активного белкового продукта гена (p80-int, а также XattL/R сайты для возможного A,Xis/Int-3aBHCHMoro удаления векторной части плазмиды из бактериальной хромосомы после интеграции рекомбинантной ДНК.

3. Продемонстрировано применение новой стратегии для ipSO-Int-зависимой интеграции гена cat ,в качестве модельного, в искусственно введенные q>80-attB сайты хромосомы с уровнем экспрессии, зависящим от числа интегрированных копий гена (увеличение числа копий интегрированного гена приводит к возрастанию активности белкового продукта) и от удаленности точки интеграции от участка инициации репликации oriC (интеграция гена вблизи oriC, как правило, обеспечивает повышенный уровень экспрессии).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Зименков Д.В., Скороходова А.Ю., Каташкина Ж.И., Минаева Н.И., Саврасова Е.А., Бирюкова И.В., Дорошенко В.Г., Ахвердян В.З., Машко С.В. «Области хромосомы E.coli, предпочтительные для встраивания генов при использовании системы интеграции на основе фага-транспозона Ми». Биотехнология, 2004, 6, 3-18.

2. Каташкина Ж.И., Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Гулевич А.Ю., Минаева Н.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Машко С.В. «Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме». Молекулярная биология, 2005,39, 823-831.

3. Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Гулевич А.Ю., Минаева Н.И., Бирюкова И.В., Машко С.В. «Введение симметричного Оь^ы в область между «-35» и «-10» гибридного промотора V,rJQiac значительно увеличивает эффективность его репрессии LacI». Биотехнология, 2006, 3, 6-16.

4. N.I. Minaeva, E.R. Gak, D.V. Zimenkov, A.YU. Skorokhodova, I.V. Biryukova, S.V. Mashko «Dual-In/Out strategy for genes integration into bacterial chromosome: a novel approach to step-by-step construction of plasmid-less marker-less recombinant E. coli strains with predesigned genome structure». BMC Biotechnology, 2008, 8:63.

Подписано в печать 11.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1145 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Минаева, Наталья Игоревна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ 5 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гомологичная рекомбинация и ДНК-инженерия.

1.1.1. Гомологичная рекомбинация.

1.1.2. ДНК-инженерия на основе гомологичной рекомбинации.

1.2. Бактериофаг Ми как инструментарий для генной инженерии.

1.2.1. Бактериофаг Ми и его производные.

1.2.2. Интегративные системы на основе бактериофага Ми.

1.3. Методы модификации бактериальной хромосомы с помощью сайт-специфической рекомбинации.

1.3.1. Сайт-специфическая рекомбинация.

1.3.2. Семейства рекомбиназ.

1.3.3 Сайт-специфические рекомбинационные системы, наиболее часто применяемые для модификации бактериального генома.

1.3.3.1. ХегС/ХегБ система.

1.3.3.2. Сге-1ох система.

1.3.3.3. Ыр-й1 система.

1.3.3.4. АЛг^/Хлб система.

1.3.4. Области применения сайт-специфической рекомбинации.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и среды.

2.2. Олигонуклеотиды.

2.3. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.4. Генно-инженерные методики. 57 Со—

2.5. PI-зависимая трансдукция.

2.6. Электротрансформация клеток E.coli.

2.7. Конструирование рекомбинантных плазмид.

2.8. Mu-зависимая интеграция в геном E.coli кассеты, содержащей оперон Ptac-idea\~^aroG4 — serA5 и ген serC в качестве селективного маркера.

2.9. Интеграция 'фрагментов ДНК в бактериальную хромосому, с использованием Red-зависимой системы рекомбинации бактериофага X. Удаление маркера устойчивости из хромосомы.

2.10. Замена гена serC в интегрированной в хромосому штамма TGl-serC-zbj-1230/ТпЮ кассете P/ac.ideaaroG4-serA5-serC на вырезаемый маркер CmR.

2.11. Конструирование штаммов с делецией природного ср80-attB и различной локализацией искусственных ср80-attB сайтов.

2.12. ср80-интеграция CRIM-плазмид.

2.13. Тестирование функциональности искусственных ф80-attB сайтов в штаммах MG-cp80-ató? (i).

2.14. Измерение Cat-активности.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка генно-инженерного инструментария для конструирования бесплазмидных безмаркерных рекомбинантных штаммов.

3.1.1. Применение mini-Mu системы для интеграции целевых генов в бактериальную хромосому.

3.1.2. Замена селективного маркера serC в интегрированной кассете

Vtac-idzdT^aroG4-serA5-serC на вырезаемый маркер CmR с помощью Red-системы фага X.

3.2. Разработка новой стратегии интеграции генетического материала на основе сайт-спецфической системы рекомбинации.

3.2.1. Конструирование штаммов с различной локализацией ср80-attB сайтов.

3.2.2. Конструирование ср80-интегративной CRIM плазмиды с ?Jnt/Xis-вырезаемой «векторной частью».

3.2.3. Использование новой системы для множественной интеграции гена cat в хромосому E.coli. 84 ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов Escherichia coli: от Mu-зависимой "случайной" интеграции до сайт-специфических перестроек хромосомы"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Конструирование бесплазмидных безмаркерных бактериальных штаммов-продуцентов биологически активных веществ является необходимым условием их дальнейшего использования в современном биотехнологическом производстве.

В настоящее время появляется все больше данных о том, что наличие в бактериальных клетках плазмид может негативно сказываться на жизнеспособности клеток, а именно: значительно изменять клеточный метаболизм, замедлять рост бактерий, что во многих случаях нежелательно при создании промышленных штаммов-продуцентов {Sauer U., 2001; Brownlie L. et al, 1990). Несомненный интерес к созданию нового поколения бесплазмидных штаммов-продуцентов обусловлен определенными запретами на использование плазмид в крупных микробиологических производствах по соображениям их возможного нежелательного распространения среди микроорганизмов окружающей среды. Кроме того, обычно, продуценты конструируются с помощью последовательных хромосомных модификаций, при которых требуется проведение многократных интеграций генетического материала в бактериальную хромосому, что вызывает ряд проблем, связанных с ограниченным набором селективных маркеров и законодательным ограничением на их применение. Поэтому усовершенствование генно-инженерного инструментария, предназначенного для конструирования бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов, является актуальным и практически значимым.

Исходя из наметившихся тенденций в современной биотехнологии, создаются бесплазмидные безмаркерные штаммы-продуценты биологически активных веществ, образование которых в естественных условиях является результатом скоординированной деятельности нескольких ферментов. Как правило, конструирование таких штаммов-продуцентов требует решения специфических проблем, таких как: манипулирование множеством генов, поддержание индивидуального уровня экспрессии или регулируемого контроля экспрессии каждого из этих генов. Такие штаммы конструируют с помощью последовательных хромосомных модификаций, включающих делеции или замены небольших участков генома, а также встраивания протяженных фрагментов ДНК с генами/оперонами. Для осуществления первых двух указанных типов модификаций в случае продуцентов, создаваемых на основе штаммов Е. coli, лучшим способом является разработанная несколькими исследовательскими группами Жес1/ЕТ-зависимая рекомбинация небольших фрагментов ДНК с бактериальной хромосомой {Zhou J.G, 2003). Для интеграции протяженных фрагментов используют различные системы на основе транспозонов и фага-Mu - для инсерций в случайную точку генома {Herrero М. et al, 1990; de Lorenzo V., Timmis K.N., 1994; Lamb erg A et al., 2002; Ахвердян В.З. и др., 2007), или сайт-специфической рекомбинации бактериофагов (к, ср80 и др.) - для интеграции в соответствующие уникальные участки attB (Haldimann A., Wanner B.L., 2001). Кроме того, возможно объединение нескольких разработанных систем в одной стратегии. Например: сайт-специфическая встройка кассеты может быть проведена в предварительно интегрированный случайным образом рекомбинационный сайт {Huang L. С. et al, 1997) или маркированная кассета может быть интегрирована случайным образом с последующим вырезанием селективного маркера с помощью сайт-специфической рекомбинации {Peredelchuk M.Y., Bennet G.N., 1997) При детальном рассмотрении предложенных методов можно обнаружить ряд недостатков, которые могут ограничивать их применение для конструирования штаммов-продуцентов. В связи с этим представлялось актуальным разработать новую стратегию конструирования, использующую достоинства известных систем и обеспечивающую возможность прецизионного дизайна всех планируемых модификаций.

ЦЕЛЬ И ЗАДА ЧИ РАБОТЫ

Диссертационная работа посвящена разработке нового генно-инженерного инструментария для направленной модификации бактериального генома при создании бесплазмидных рекомбинантных штаммов Е. coli.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. конструирование mini-Mii-транспозонов с Hnt/Xis-вырезаемыми маркерами устойчивости к антибиотикам для селективного отбора интегрантов, содержащих целевые гены в составе бактериальной хромосомы;

2. разработка нового генно-инженерного инструментария, использующего сайт-специфические системы рекомбинации фагов ср80 и X для интеграции рекомбинантных плазмид с целевыми генами в бактериальную хромосому и последующего вырезания векторной части этих плазмид, соответственно:

• конструирование библиотеки штаммов с различной локализацией искусственных cp80-attB сайтов в бактериальной хромосоме;

• конструирование специализированного интегративного вектора;

3. применение нового метода для интеграции модельной кассеты в бактериальную хромосому.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Разработана новая система, позволяющая интегрировать генетический материал (гены или опероны) в определенные несущественные точки хромосомы Е. coli. Данная система является удобным генно-инженерным инструментарием, прикладным назначением которого является конструирование бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов биологически активных веществ на основе Е. coli.

Осуществлено конструирование библиотеки штаммов Е. coli с различной локализацией искусственных cp80-attB сайтов в бактериальной хромосоме и нового ср80-интегративного вектора, содержащего в своем составе XattL/R сайты для вырезания векторной части плазмиды из бактериальной хромосомы после интеграции генетического материала. Продемонстрировано применение нового метода для интеграции целевого гена в заранее определенные области бактериальной хромосомы. Показана зависимость уровня экспрессии гена, интегрированного в разные точки хромосомы, от удаленности выбранной точки от оНС.

Разработанная система была успешно использована в работах НИИ «Аджиномото - Генетика» при конструировании высокопродуктивных штаммов-продуцентов различных аминокислот.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Минаева, Наталья Игоревна

выводы.

1. На основе использования механизмов Red/ET гомологичной рекомбинации и сайт-специфической рекомбинации бактериофагов ср80 и А, разработана новая стратегия прецизионной интеграции в хромосому Е. coli фрагментов ДНК, в состав которых могут входить как отдельные генетические элементы, так и целые гены и/или опероны.

2. Для экспериментальной реализации этой стратегии:

• созданы необходимые генетические элементы для Red-зависимого введения искусственных ф80-attB сайтов в любые выбранные точки генома Е. coli, что экспериментально продемонстрировано при создании на основе MG1655 библиотеки из 5 штаммов с различной локализацией уникального ф80-attB в бактериальной хромосоме;

• на основе плазмиды с Pir-зависимым репликоном осуществлено конструирование нового интегративного вектора, содержащего ф80-attP, а потому способного к сайт-специфической интеграции в ф80-attB сайт бактериальной хромосомы в присутствии функционально активного белкового продукта гена ф80-г>^, а также XattL/R сайты для возможного A,Xis/Int-3aBHCHMoro удаления векторной части плазмиды из бактериальной хромосомы после интеграции рекомбинантной ДНК.

3. Продемонстрировано применение новой стратегии для ф80-1п1-зависимой интеграции гена cat ,в качестве модельного, в искусственно введенные ф80-attB сайты хромосомы с уровнем экспрессии, зависящим от числа интегрированных копий гена (увеличение числа копий интегрированного гена приводит к возрастанию активности белкового продукта) и от удаленности точки интеграции от участка инициации репликации oriC (интеграция гена вблизи oriC, как правило, обеспечивает повышенный уровень экспрессии).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минаева, Наталья Игоревна, Москва

1. Acroyd J., Symonds. 1983. Evidence for conservative pathway of transposition of bacteriophage Mw. Nature. 303, 84-86.

2. Adler H. et al. 2000. Cloning and mutagenesis of the murine gammaherpesvirus 68 genome as an infectious bacterial artificial cromosome. J. Virol. 74, 6964-6974.

3. Adzuma K., Mizuuchi K. 1988. Target immunity of Mu transposition reflects a differential distribution of MuB protein. Cell. 53, 257-266.

4. Adzuma K., Mizuuchi K. 1991. Steady-state kinetic analysis of ATP hydrolysis by the В protein of bacteriophage Mu. J. Biol. Chem. 266, 6159-6167.

5. Anderson D.G., Kowalczykowski S.C. 1997. The translocating RecBCD enzyme stimulates recombination by directing RecA protein onto ssDNA in a deregulated manner. Cell. 90, 77-86.

6. Angrand P.-O., Daigle N., van der Hoeven F., Scholer H.R., Stewart A.F. 1999. Simplified generation of targeting constructs using ET recombination. Nucleic Acids Res. 27, el6.

7. Arciszewska L.K., Sherratt D.J. 1995. Xer site-specific recombination in vitro. ENBOJ. 14,2112-2120.

8. Arthur A., Sherratt D. 1979. Dissection of the transposition process: a transposon-encoded site-specific recombination system. Mol. Gen. Genet. 175, 267274.

9. Au Т.К., Agrawal P., Harshey R.M. 2006. Cromosomal integration mechanism of infecting Mu virion DNA. J. Bacteriology. 188, 1829-1834.

10. Baba Т., Ara Т., Hasegawa M., Takai Y. et al. 2006. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 1-11.

11. Bao Y., Lies D.P., Fu H., Roberts G.P. 1991. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of gram-negative bacteria. Gene. 109(1), 167-168.

12. Barry G.F. 1988. A broad-host-range shuttle system for gene insertion into the chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 71, 75-84.

13. Baubonis W., Sauer B. 1993. Genomic targeting with purified Cre recombinase. Nucleic Acids Res. 21,2025-2029.

14. Bernet A., Sabatier S., Picketts D.J., Ouazana R., Morle F., Higgs D.R. Godet J. 1995. Targeted inactivation of the major positive regulatory element (HS-40) of the human alpha-globin gene locus. Blood. 86, 1202-1211.

15. Biswas T., Aihara H., Radman-Livaja M., Filman D., Landy A., Ellenberger T. 2005. A structural basis for allosteric control of DNA recombination by lambda integrase. Nature. 435, 1059-1066.

16. Blakely G., Colloms S., May G., Burke M., Sherratt D. 1991. Escherichia coli XerC recombinase is required for chromosomal segregation at cell division. New Biol. 3(8), 789-798.

17. Blakely G., May G., McCulloch R., Arciszewska L.K., Burke M., Lovett S.T., Sherratt DJ. 1993. Two related recombinases are required for site-specific recombination at dif and cer in E. coli K12. Cell. 75(2), 351-361.

18. Blakely G.W., Sherratt D.J. 1994. Interactions of the site-specific recombinases XerC and XerD with the recombination site dif. Nucleic Acids Res. 22, 5613-5620.

19. Blakely G.W., Davidson A.O., Sherratt D.J. 1997. Binding and cleavage of nicked substrates by site-specific recombinases XerC and XerD. J Mol Biol. 265(1), 30-39.

20. Bloor A.E., Cranenburgh M.R. 2006. An efficient method of selectable marker gene excision by Xer recombination for gene replacement in bacterial chromosomes. Appl. and Enviroment. Microbiol. 72, 2520-2525.

21. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitationof microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254.

22. Brownlie L., Stephenson J.R., Cole J.A. 1990. Effect of growth rate on plasmid maintenance by Escherichia coli HB101(pAT153). J. Gen. Microbiol. 136, 24712480.

23. Bruckner R.C., Cox M.M. 1986. Specific contacts between the FLP protein of the yeast 2-micron plasmid and its recombination site. J Biol Chem. 261, 1179811807.

24. Capaldo F.N., Barbour S.D. 1975. The role of the rec genes in the viability of Escherichia coli K12. Basic Life Sci. 5 A, 405-418.

25. Castilho B.A., Casadaban M.J. 1991. Specifity of mini-Mu bacteriophage insertions in a small plasmid. J.Bacteriology. 173, 1339-1343.

26. Chaconas G., Harshey R.M., Sarvetnick N., Bukhari A.I. 1981. Predominant end-products of prophage Mu DNA transposition during the lytic cycle are replicon fusions. J. Mol. Biol 150, 341-359.

27. Chaconas G., Kennedy D.L., Evans D. 1983. Predominant end-products of infecting bacteriophage Mu DNA are simple insertions with no preference for integration of either Mu DNA strand. Virology. 128, 48059.

28. Chaconas G., Gloor G., Miller J.L. 1985. Amplification and purification of the bacteriophage Mu-encoded B transposition protein. J. Biol. Chem. 260, 2662-2669.

29. Chaconas G., Lavoie B.D., Watson M.A. 1996. DNA transposition-jumping gene machine, some assembly required. Curr. Biol. 6, 817-820.

30. Chen Y., Narenda U., Iype L.E., Cox M.M., Rice P.A. 2000. Crystal structure of a Flp recombinase-holliday junction complex: assembly of an active oligomer by helix swapping. Molecular Cell. 6, 885-897.

31. Cherepanov P.P., Wackernagel W. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14.

32. Clark A.J. 1991. rec genes and homologous recombination proteins in Escherichia coli. Biochimie. 73, 523-532.

33. Copeland N.G., Jenkins N.A., Court DL. 2001. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat Rev. 2, 769-779.

34. Court D.L., Sawitzke J.A., Thomason L.C. 2002. Genetic engineering using homologous recombination.AnnuRev Genet. 36, 361-388.

35. Cox M.M., Lehman I.R. 1987. Enzymes of general recombination. Annu. Rev. Biochem. 56, 229-262.

36. Craig N.L. 1996. Transposition. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Modular Biology. Eds Neidhart F.C. et al. Washington: Amer. Soc. Microbiol. 2, 2339-2362.

37. Craigie R., Mizuuchi M., Mizuuchi K. 1984. Site-specific recognition of the bacteriophage Mu ends by the Mu A protein. Cell. 39, 387-394. •

38. Dabert P., Smith G.R. 1997. Gene replacement with linear DNA fragments in wild-type Escherichia coli: enchancement by Chi sites. Genetics. 145, 877-889.

39. Dale E.C., Ow D.W. 1991. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 10558-10562.

40. Darzins A., Kent N.E., Buckwalter M.S., Casadaban M. J. 1988. Bacteriophage Mu sites required for transposition immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 68266830.

41. Fukushige S., Sauer B. 1992. Genomic targeting with a positive-selection lox integration vector allows highly reproducible gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 7905-7909.

42. Gerdes S.Y., Scholle M.D. et al. 2003. Experimental determination and system level analysis of essential genes in Escherichia coli MG1655. J. Bacteriology. 185, 5673-5684.

43. Gopaul D.N, van Duyne G.D. 1999. Structure and mechanism in site-specific recombination. Current Opinion in Structural Biology. 9, 14-20.

44. Grindley, N.D.F. 1994. Resolvase-mediated site-specific recombination. In: Nucleic Acids and Molecular Biology (ed. Eckstein F., Lilley D.M.J.). 236-267. Springer-Verlag, Berlin.

45. Grindley, N.D.F. 1997. Site-specific recombination: synapsis and strand exchange revealed. Curr Biol. 7, R608—R612.

46. Grindley N.D.F., Whiteson K.L., Rice P.A. 2006. Mechanisms of site-specific recombination. Annu. Rev. Biochem. 75, 567-605.

47. Groisman E.A., Casadaban M.J. 1987. Cloning of genes from members of family Enterobacteriaceae with mini-Mu bacteriophage containing plasmid replicons. J. Bacteriology. 169, 687-693.

48. Groth A.C., Calos M.P. 2004. Phage integrases: biology and application. J. Mol. Biol. 335(3), 667-678.

49. Gueguen E., Rousseau P., Duval-Valentin G., Chandler M. 2005. The transpososome: control of transposition at the level of catalysis. Trends in Microbiology. 13, 543-549.

50. Haapa S., Taira S., Heikkinen E., Savilahti H. 1999. An efficient and accurate integration of mini-Mu transposons in vitro: a general methodology for functional genetic analysis and molecular biology application. Nucleic Acids Research. 27, 2777-2784.

51. Hayes F., Sherratt D.J. 1997. Recombinase binding specificity at the chromosome dimer resolution site dif of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 266(3), 525537.

52. Haldimann A., Wanner B.L. 2001. Conditional-replication, integration, excision, and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria. JBacteriol. 183, 6384-6393.

53. Hallet B., Sherratt D.J. 1997. Transposition and site-specific recombination: adapting DNA cut-and-past mechanism to a variety of genetic rearrangements. FEMS Microbiology Reviews. 21, 157-178.

54. Hamilton C.M., Aldea M., Washburn B.K., Babitzke P., Kushner S.R. 1989. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriology. 171, 4617-4622.

55. Harshey R.M., Getzoff E.D., Baldwin D.L. 1985. Primary structure of the phage Mu transposase: homology to Mu repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 76767680.

56. Herrero M., de Lorenzo V., Timmis K.N. 1990. Transposon vectors containingnon-antibiotic resistance selection markers for cloningand stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 172, 6557-6567.

57. Hill F. et al. 2000. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113.

58. Hoess R.H., Ziese M., Sternberg N. 1982. PI site-specific recombination: nucleotide sequence of the recombining sites. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 79, 33983402.

59. Hoess R.H., Abremski K. 1984. Interaction of the bacteriophage PI recombinase Cre with the recombining site loxP. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 81, 1026-1029.

60. Hoess R.H., Wierzbicki A., Abremski K. 1986. The role of the loxP spacer region in PI site-specific recombination. Nucleic Acids Res. 14, 2287-2300.

61. Hsu P.-L., Ross W., Landy A. 1980. The Xphage att site: functional limits and interaction with Int protein. Nature. 285, 85-91.

62. Huang L.C., Wood E.A., Cox M.M. 1991. A bacterial model system for chromosomal targeting. Nucleic Acids Res. 19, 443-448.

63. Huang L.C., Wood E.A., Cox M.M. 1997. Convenient and reversible sitespecific targeting of exogenous DNA into a bacterial chromosome by use of the FLP recombinase: the FLIRT system. J Bacteriol. 179, 6076-6083.

64. Johnson R.C. 1991. Mechanism of site-specific DNA inversion in bacteria. Curr. Opin. Genet. Dev. 1, 404-411.

65. Johonson R.C. 1995. Site-specific recombinases an theire interaction with DNA. In: DNA-protein: structural interactions (ed. Lilley D.M.J.). 141-176. IRL Oxford.

66. Joseph J.W., Kolodner R. 1983. Exonuclease VIII of Escherichia coli. Purification and physical properties. J.Biol. Chem. 258, 10411-10417.

67. Karakousis G., Ye N., Li Z, Chiu S.K., Reddy G., Radding C.M. 1998. The beta protein ofphage lambda binds preferentially to an intermediate in DNA renaturation. J. Mol. Biol 276, 721-731.

68. Kato C., Ohmiya R., Mizuno T. 1998. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62(9), 1826-1829.

69. Kikuchi Y., Tsujimoto K., Kurahashi O. 1997. Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli. App.I Environ. Microbiol. 63, 761-762.

70. Kobryn K., Lavoie B.D., Chaconas G. 1999. Supercoiling-dependent site-specific binding of HU to naked Mu DNA. J. Mol. Biol. 289, 777-784.

71. Kolodner R. et al. 1994. Homologous pairing proteins encoded by the Escherichia coli recE and recTgenes. Mol. Microbiol. 11, 23-30.

72. Komoda Y., Enomoto M., Tominaga A. 1991. Large inversion in Escherichia coli K-12 1485IN between inversely oriented IS3 elements near lac and cdd. Genetics. 129, 639-645.

73. Kowalczykowski S.C., Dixon D.A., Eggleston A.K., Lauder S.D., Rehrauer W.M. 1994. Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 58, 401-465.

74. Kulkarni S.K., Stahl F.W. 1989. Interaction between the sbcC gene of Escherichia coli and the gam gene of phage lambda. Genetics. 123, 249-253.

75. Kuo C., Zou A., Jayaram M. 1991. A DNA-protein complex during attachmentsite synapses in Mu DNA transposition. EMBOJ. 10, 1585-1591.

76. Kushner S.R., Nagaishi H., Clark A.J. 1974. Isolation of exonuclease VIII: the enzyme associated with the sbcA indirect supressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, 3593-3597.

77. Landy A. 1989. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949.

78. Landy A. 1993. Mechanistic and structural complexity in the site-specific recombination pathway of Int and FLP. Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 699-707.

79. Lamberg A., Nieminen S., Qiao M., Savilahti H. 2002. Efficient insertion mutagenesis strategy for bacterial genomes involving electroporation of in vitro-assembled DNA transposition complexes of bacteriophage Mu. Appl. Envirom. Microbiol. 68, 705-712.

80. Lavoie B.D., Chan B.S., Allison R.G., Chaconas G. 1991. Structural aspects of a higher order nucleoprotein complex: induction of an altered DNA structure at the Mu-host junction of the Mu type 1 transpososome. EMBOJ. 10, 3051-3059.

81. Lavoie B.D., Chaconas G. 1996. Transposition of phage Mu DNA. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204, 83-102.

82. Lee E.C., Gumport R.I., Gardner J.F. 1990. Genetic analysis of bacteriophage A, integrase interactions with arm-type attachment site sequences. J.Bacteriology. 172, 1529-1538.

83. Lee J., Jayaram M. 1993. Mechanism of site-specific recombination. J. Biological Chemistry. 268, 17564-17579.

84. Lee G., Saito I. 1998. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216, 55-65.

85. Leslie N.R., Sherratt D.J. 1995. Site-specific recombination in the replication terminus region of Escherichia coli: functional replacement of dif. EMBO J. 14, 1561-1570.

86. Leung P.C., Teplow D.W., Harshey R.M. 1989. Interaction of distinct domains in Mu transposase with Mu DNA ends and an internal transpositional enhancer. Nature. 338, 656-658.

87. Levchenko I., Yamauchi M., Baker T.A. 1997. ClpX and MuB interact with overlapping regions of Mu transposase: implications for control of the transposition pathway. Genes Dev. 11, 1561-1572.

88. Li Z., Karakousis G., Chiu S.K., Reddy G., Radding C.M. 1998. The beta protein of phage lambda promotes strand exchange. J. Mol. Biol. 276, 733-744.

89. Liebart J.C., Ghelardini P., Paolozzi L. 1982. Conservative integration of bacteriophage Mu DNA into pBR322 plasmid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 43624366.

90. Lloyd R.G., Barbour S.D. 1974. The genetic location of the sbcA gene of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 134, 157-171.

91. Lloyd R.G., Buckman C. 1985. Identification and genetic analysis of sbcC mutations in commonly used recBC sbcB strains of Escherichia coli K-12. J. Bacteriology. 164, 836-844.

92. Luetke K.H., Zhao B.P., Sadowski P.D. 1997. Asymmetry in Flp-mediated cleavage. Nucleic Acids Res. 25(21): 4240-4249.

93. Luetke K.H., Sadowski P.D. 1998. DNA sequence determinant for Flp-induced DNA bending. Mol. Microbiol. 29, 199-208.

94. MacWfiams M.P., Gumport R.I., Garher J.F. 1996. Genetic analysis of the bacteriophage X attL nucleoprotein complex. Genetics. 143, 1069-1079.

95. Mac Williams M., Gumport R.I., and Gardner J.F. 1997. Mutational analysis of protein binding sites involved in formation of the bacteriophage lambda attL complex. JBacteriol. 179(4), 1059-1067.

96. Marinus M.G., Carraway M., Frey A.Z., Brown L., Arraj J.A. 1983. Insertion mutations in the dam gene of Escherichia coli K-12. Mol. Gen. Genet. 192, 288-289.

97. Marsic N., Roje S., Stojiljkovic I., Salaj-Smic E., Trgovcevic Z. 1993. In vivo studies on the interaction of RecBCD enzyme and lambda Gam protein. J. Bacteriology. 175, 4738-4743.

98. Matsuura S., Komatsu J., Hirano K., Yasuda H., Takashima K. et al. 2001. Realtime observation of a single DNA digestion by X exonuclease under a fluorescence microscope field. Nucleic Acids Res. 29, E79.

99. McClain M.S., Blomfield I.C., Eisestein B.I. 1991. Roles of fimB and fimE insite-specific DNA inversion associated with phase variation of type 1 fimbriae in Escherichia coli. JBacteriol. 173, 5308-5314.

100. McKenzie G.J., Craig N.L. 2006. Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into Enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event. BMC Microbiology. 6:39.

101. Medberry S.L., Dale E., Qin M., Ow. D.W. 1995. Intra-chromosomal rearrangements generated by Cre-lox site-specific recombination. Nucleic Acids Res. 23, 485-490.

102. Messerle M. et al. 1997. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial cromosome. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 94, 1475914763.

103. Meynial-Salles I., Cervin M.A., Soucaille P. 2005. New tool for metabolic pathway engineering in Escherichia coli: one-step method to modulate expression of chromosomal genes. Applied and Enviromental Microbiology. 71, 2140-2144.

104. Miller J.H. 1972. Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press.

105. Mizuuchi K., Craigie R. 1986. Mechanism of bacteriophage Mu transposition. Ann. Rev. Genet. 20, 385-429.

106. Mizuuchi M., Mizuuchi K. 1989. Efficient Mu transposition requires interaction of transposase with a DNA sequence at the Mu operator: implications for regulation. Cell. 58, 399-408.

107. Mizuuchi M., Baker T.A., Mizuuchi K. 1991. DNase protection analysis of the stable synaptic complexes involved in Mu transposition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 9031-9035.

108. Mizuuchi K. 1992. Polynucleotidyl transfer reactions in transpositional DNA recombination. J. Biol. Chem. 267, 21273-21276.

109. Mizuuchi K. 1992. Transpositional recombination: mechanistic insights from studies of Mu and others elements. Annu. Rev. Biochem. 61, 1011-1051.

110. Muniyappa K., Radding C.M. 1986. The homologous recombination system of phage lambda. Pairing activities of beta protein. J. Biol. Chem. 261, 7472-7478.

111. Murphy K.C. 1998. Use of bacteriophage X recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. JBacteriol. 180, 2063-2071.

112. Murphy K.C., Campellone K.G., Poteete A.R. 2000. PCR-mediated gene replacement in Escherichia coli. Gene. 246, 321-330.

113. Muyrers J.P.P., Zhang Y., Testa G., Stewart A.F. 1999. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 15551557.

114. Muyrers J.P.P. et al. 2000. Point mutation of bacterial artificial chromosomes by ET recombination. EMBO Rep. 1, 239-243.

115. Muyrers J.P.P., Zhang Y., Stewart A.F. 2000. ET-cloning; think recombination first. In Genetic engineering. 22 (ed. Setlow J.K.), 77-98.

116. Muyrers J.P.P., Zhang Y., Buchholz F., Stewart A.F. 2000. RecE/RecT and Reda/Redp initiate double stranded break repair by specofocally interacting with their respective partners. Genes Dev. 14, 1971-1982.

117. Muyrers J.P.P., Zhang Y., Stewart A.F. 2001. Techniques: recombinogenic engineering new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26, 325-331.

118. Myers R.S., Stahi F.W. 1994. % and RecBCD enzyme of Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 28, 49-70.

119. Mythili E., Kumar K.A., Muniyappa K. 1996. Characterization of the DNA-binding domain of beta protein, a component of phage lambda red-pathway, by UV catalyzed crosslinking. Gene. 182, 81-87.

120. Naigamwalla D.Z., Chaconas G. 1997. A new set of Mu DNA transposition intermediates: alternate pathways of target capture preceding strand transfer. EMBO J. 16, 5227-5234.

121. Nakai H., Doseeva V., Jones J.M. 2001. Handoff from recombinase to replisome: insights from transposition. PNAS. 98, 8247-8254.

122. Nefedov M., Williamson R., Ioannou P.A. 2000. Insertion of disease-causing mutations in BACs by homologous recombination in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 28, E79.

123. Ogawa T.H., Wabiko H., Tsurimoto T., Horii T., Masukata H., Ogawa H. 1979. Characteristics of purified recA protein and the regulation of its synthesis in vivo. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 909-915.

124. Payne C.M. et al. 1999. Manipulating large genomic clones via in vivo recombination in bacteria. J. Hum. Hypertens. 13, 845-848.

125. Peredelchuk M.Y., Bennet G.N. 1997. A method for construction of E.coli strains with multiple DNA insertions in the chromosome. Gene. 187(2), 231-238.

126. Posfai G., Koob M., Hradecna Z., Hasan N., Filutowicz M., Szybalski W. 1994. In vivo excision and amplification of large segments of the Escherichia coli genome. Nucl. Acids Res. 22(12), 2392-2398.

127. Posfai G., Kolisnychenko V., Bereczki Z., Blattner F.R. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res. 27, 4409-4415.

128. Poteete A.R., Fenton A.C. 2000. Genetic requirments of phage X Red-mediated gene replacement in Escherichia coli K12. J. Bacteriology. 182, 2336-2340.

129. Poustka A. et al. 1984. Selective isolation of cosmid clones by homologous recombination in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 4129-4133.

130. Radding C.M. 1982. Homologous pairing and strand exchange in genetic recombination. Annu. Rev. Genet. 16, 405-437.

131. Ramirez S.R., Liu P., Bradley A. 1995. Chromosome engineering in mice. Nature. 378, 720-724.

132. Roland L.A.S., Baker T.A. 2001. Differential role of the MuB protein in phage Mu integration vs. replication: mechanistic insights into two transposition pathways. Mol. Microbiol. 40(1), 141-155.

133. Ross W., Landy A., Kikuchi Y., Nash H. 1979. Interaction of int protein with specific sites on lambda art DNA. Cell. 18, 297-307.

134. Russell C.B., Thaler D.S., Dahlquist F.W. 1989. Chromosomal transformation of Escherichia coli recD strains with linearized plasmids. J. Bacteriology. 171, 26092613.

135. Sadowski P.D. 1993. Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops. FASEB J. 7, 760-767.

136. Sadowski P.D. 1995. The Flp recombinase of the 2-microns plasmid of Saccharomyces cerevisiae. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 51, 53-91.

137. Salaj-Smic E., Dermic D., Brcic-Kostic K., Cajo G.C., Trgovcevic E. 2000. In vivo studies of the Escherichia coli RecB polypeptide lacking its nuclease center. Res. Microbiol. 151, 769-776.

138. Sambrook J., Fitsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press; 1989.

139. Sauer B. 1994. Site-specific recombination: developments and applications. Curr. Opin. Biotechnol. 5, 521—527.

140. Sauer U. 2001. Evolutionary engineering of industrially important microbial phenotypes. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 73, 129-169.

141. Schofield M.A., Agbunag R., Miller J.H. 1992. DNA inversions between short inverted repeats in Escherichia coli. Genetics. 132, 295-302.

142. Senecoff J.F., Bruckner R.C., Cox M. M. 1985. The FLP recombinase of the yeast 2-micron plasmid: characterization of its recombination site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.82, 7270-7274.

143. Shapiro J.A. 1979. Molecular model for the transposition and replication of bacteriophage Mu and other transposable elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 1933-1937.

144. Sherrat, D.J. 1995. Mobile genetic elements. Oxford University Press, Oxford, England.

145. Smith G.R. 1988. Homologous recombination in procaryores. Microbiological reviews. 52, 1-28.

146. Smith G.R. 1989. . Homologous recombination in E.coli: multiple pathways for multiple reasons. Cell. 58, 807-809.

147. Smith G.R. 1994. Hotspots of homologous recombination. Experientia. 50, 234241.

148. Smith M.C., Thorpe H.M. 2002. Diversity in the serine recombinases. Mol.Microbiol. 44, 299-307.

149. Sousa C., de Lorenzo V., Cebolla A. 1997. Modulation of gene expression through chromosomal positioning in Escherichia coli. Microbiology. 143, 20712078.

150. Stark W.M., Boocock M.R. 1995. Topological selectivity in site-specific recombination. In: Mobil Genetic Elements (ed. Sherratt D.J.). 101-129. IRL Oxford.

151. Sternberg N. 1990. Bacteriophage PI cloning system for the isolation, amplification and recovery of DNA fragments as large as 100 kilobase pairs. Proc Natl Acad Sci USA. 87, 103-107.

152. Surette M.G., Lavoie B.D., Chaconas G. 1989. Action at a distance in Mu DNA transposition: an enhancer-like element is the site of action of supercoiling relief activity by IHF. EMBOJ. 8, 3483-3489.

153. Surette M.G., Chaconas G. 1989. A protein factor that reduces the negative supercoiling requirement in the Mu strand-transfer reaction is Escherichia coli integration host factor. J. Biol. Chem. 264, 3028-3034.

154. Taylor A.F., Schultz D.W., Ponticelli A.S., Smith G.R.1985. RecBC enzyme nicking at Chi sites during DNA unwinding: location and orientation dependence of the cutting. Cell. 41, 153-163.

155. Telander-Muskavitch K.M., Linn S. 1981. RecBC-like enzymes: the exonuclease V deoxyribonucleases. 233-250. In P.D. Boyer (ed.). The enzymes, vol. 14. Academic Press. Inc., New York.

156. Van Duyne G.D. 2001. A structural view of cre-loxp site-specific recombination. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 30, 87-104.

157. Van Gijsegem F., Toussaint A., Casadaban M. 1987. Mu as genetic tool. Phage Mu. Edited by Symonds N. chapter 14, 215-250.

158. Van de Putte P., Goosen N. 1992. DNA inversion in phage and bacteria. Trends Genet. 8, 457-462.

159. Wang В., Liu L., Groisman E.A., Casadaban M.J., Berg C.M. 1987. High frequency generalized transduction by miniMu plasmid phage. Genetics. 116, 201206.

160. Wang X., Higgins N.P. 1994. "Muprints" of the lac operon demonstrate physiological control over the randomness of in vivo transposition. Mol. Microbiol 12, 665-677.

161. Yang X.W. et al. 1997. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat. Biotechnol. 15, 859-865.

162. Yu В .J., Sung B.H., Koob M.D., Lee C.H, Lee J.H., Lee W.S, Kim M.S., Kim S.C. 2002. Minimization of the Escherichia coli genome using a Tn5-targeted Crq/IoxP excision system. Nature Biotechnol. 20, 1018-1023.

163. Yu D., Ellis H.M., Lee E.C., Jenkins N.A., Copeland N.G., Court D.L. 2000. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 5978-5983.

164. Zhang Y., Buchholtz F., Muyrers J.P.P., Stewart A.F. 1998. A new logic forDNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genetics. 20, 123-128.

165. Zaman M.M., Boles T.C. 1996. Plasmid recombination by the RecBCD pathway of Escherichia coli. J. Bacteriology. 178, 3840-3845.

166. Zhang Y., Muyrers J.P.P., Testa G., Stewart A.F. 2000. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 18, 13141317.

167. Zhou J.G., Hong X., Huang C.F. 2003. Recombineering and its application. Yi Chuan Xue Bao. 30, 983-988. Zhou J.G., Hong X., Huang C.F. 2003. Recombineering and its application. Yi Chuan Xue Bao. 30, 983-988.

168. Каташкина Ж.И., Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Гулевич А.Ю., Минаева Н.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Машко С.В. 2005. Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Молекулярная биология. 39, 823-831.

169. Митькина JI.H. 2003. Транспозиция как способ существования:-фаг Ми. Генетика. 5, 637-656.