Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности автоселекции популяций микроорганизмов при длительном непрерывном культивировании

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Закономерности автоселекции популяций микроорганизмов при длительном непрерывном культивировании"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Логинов Иван Александрович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ АВТОСЕЛЕКЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ НЕПРЕРЫВНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

Красноярск - 2004

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН

Научный руководитель

доктор биологических наук с н с. А. В. БРИЛЬКОВ

Официальные опоненты

доктор физико-математических наук с.н с Ю Л ГУРЕВИЧ

доктор физико-математических наук с.н.с. А. В. ШАШКИН

Ведущая организация

Томский Государственный Университет им. В. В. Куйбышева

Защита состоится 200Г г. в V.о часов на

заседании Специализированного совета Д. 003 007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, Институт биофизики СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан "3" У/Уи^у 200.47.

Ученый секретарь Специализированного

совета к.ф.-м.н. ,/^ Л.Г. Косолапова

33 $4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеммы Непрерывное культивирование является аналогом большинства природных ситуаций' хемостат аналогичен ситуациям, ¡де встречается лимитирование роста недостатком питательных веществ, элементов или микроэлементов; турбидостат отвечает условиям максимально возможного роста при ограничении плотности популяции С точки зрения функционирования открытых систем хемостат и турбидостат - это термодинамические системы, способные находиться в устойчивых стационарных состояниях Причем, в соответствии с классификацией М Эйгена, хемостат соответствует случаю постоянных потоков, а турбидостат -случаю постоянной организации (или постоянных реакционных сил) Таким образом, в руках эксперимешаторов имеются открытые системы двух основных типов развития и для биологии, и для термодинамики Если в таких системах происходят эволюционные изменения, переход от одного стационарного состояния к другому в результате изменения качественных свойств систем (например, в результате процессов мутирования и отбора), то главные характеристики этих генетических перестроек в популяциях, или шагов эволюции, можно измерить, не теряя общности подхода с точки зрения как биологии, так и физики. Одним из ярких и наглядных примеров эволюционных переходов в таких открытых системах является микроэволюционная перестройка популяции плазмидосодержащего штамма бактерий при длительном непрерывном культивировании, где имеет место потеря плазмид клетками и автоселекция бесплазмидного штамма, более активного чем исходная форма Используя плазмидсодержащие штаммы бактерий как удобный объект для изучения переходов из одного стационарного состояния в другое в результате микроэволюционных перестроек можно получить существенное дополнение термодинамической теории открытых биологических систем с целью дальнейшего изучения общих закономерностей биологического развития.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является изучение общих закономерностей микроэволюции микробных популяций в открытых системах на примере автоселекции плазмидсодержащих штаммов бактерий и фенолразрушающих микроорганизмов при длительном непрерывном культивировании.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. С помощью математической модели проанализировать и сравнить закономерности автоселекции плазмидсодержащих бактерий при непрерывном культивировании в турбидостате и хемостате.

2. Изучить в экспериментах закономерности автоселекции геноинженерного штамма бактерий Е coli К-12 MG1655, содержащего в составе плазмид клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), при культивировании в рН-стате

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ . БИБЛИОТЕКА I

3 i

3 Изучить закономерности автоселекции фенолразрушающих микроорганизмов в обоих тинах открытых систем при длительном непрерывном культивировании в хемостате и турбидостате (рН-стте).

Практическая значимость работы

Результаты работы могут быть использованы для описания динамики генно-инженерных штаммов микроорганизмов, содержащих плазмиды, используемых в биотехнологическом производстве Основываясь па результатах работы можно оценить устойчивость ожидаемых стационарных состояний в непрерывной культуре микроорганизмов при различных ограничениях их роста, наиболее вероятное их направление и скорости автоселекции бесплазмидных вариантов при длительном культивировании микроорганизмов. Результаты работы целесообразно использовать при интенсификации на основе непрерывных культур микроорганизмов процессов микробиологического производства, очистки сточных вод, при разработке эффективных способов селекции новых штаммов, обладающих ценными свойствами, в частности, повышенной экономичностью использования субстратов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Остаточная концентрация субстрата у популяции бесплазмидного штамма, заместившего исходную плазмидсодержащую популяцию в турбидостате возрастает, и таким образом, классический хемосташый критерий микроэволюции и конкурентоспособности популяций, основанный на снижении остаточной конценфации субстрата, не является универсальным и в турбидостате не работает.

2. В экспериментах по автоселекции генноинженерного штамма бактерий Е coli К-12 MG1655, содержащего клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), в рН-стате показано, что в процессе замещения плазмидного штамма бесплазмидпым возрастает и остаточная концентрация, и поток энергетического субстрата, использованного популяцией Нии,

3 Более общим критерием микроэволюции микробных популяций в обоих типах открытых биологических систем (в хемостате и в турбидостате) является возрастание потока энергетического субстрата Н„сп, использованного популяцией

Апробация работы Результаты работы докладывались на Международном Байкальском Микробиологическом Симпозиуме IBSM-2003 «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2003), на Международном симпозиуме COSPAR-2004 (Франция, Париж), на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на конференции молодых ученых Института биофизики СО РАН (Красноярск 2002), на объединенном семинаре лаб. Экологической биофизики, лаб Экологической биотехнологии и лаб УБГ, на семинарах лаборатории УБГ,

Публикации. Список публикаций включает три статьи в рейтинговых журналах (Доклады РАН, Вестник КГУ, серия физико-математические науки),

две статьи в трудах международных конференций и тезисы на конференциях и биофизическом съезде РАН (Воронеж, 2004)

Работа была поддержана грантами Красноярского краевого фонда науки № 13G031, № 11F007M, № 12F007M, № 8tsl 11

Структура работы Диссертация состоит из введения, трех 1лав, выводов и списка литературы Работа изложена на 118 страницах, содержит 22 рисунка, и 5 таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает 115 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении охарактеризована научная проблема и подходы к ее решению, сформулирована цель и задачи исследования

В Первой главе делается литературный обзор использования методов управляемого культивирования микроорганизмов для изучения динамических процессов развития популяций Даны описания периодического и непрерывного методов культивирования микроорганизмов (хемостат. турбидостат), а так-же математическое описание происходящих динамических процессов Анализируются работы авторов, внесших наибольший вклад в развитие теоретических и прикладных аспектов непрерывного культивирования, в особенности, процессов автоселекции популяций микроорганизмов в проточных условиях Отмечается, что для изучения эволюционных процессов, происходящих в популяциях микроорганизмов, метод непрерывного культивирования является наиболее удобным (по сравнению, например, с периодическим культивированием), поскольку в классических периодических процессах невозможно строго количественно связать параметры физиологического состояния культуры и внешней среды Управляемое непрерывное культивирование микроорганизмов позволяет получить стационарное состояние, в котором физиологическое состояние микроорганизмов и параметры среды стабилизируются так, что могут бьль однозначно связаны К тому же при непрерывном культивировании можно застабилизировать рост популяции в любой точке по восходящей ветви S-образного роста популяции, в том числе и в экспоненциальной фазе, задавая нужную степень лимитирования роста популяции недостатком лимитирующего субстрата.

Анализируется классический критерий развития, как смешанных культур, так и монокультур микроорганизмов при непрерывном культивировании в хемостате. Как известно, математический анализ и многочисленные экспериментальные данные показывают, что в процессе автоселекции в хемостате остаточная концентрация субстрата у выигравшего в конкуренции вида микроорганизмов должна уменьшаться (Herbert et al., 1956, Moser, 1958; Hsu et al., 1977; Печуркин, Терсков, 1975), рис.1 Однако, будет ли справедлив этот критерий для процессов автоселекции в турбидостате, неизвестно. Для систем типа турбидостата экспериментальная проверка данного критерия до сих пор не проводилась.

Рис 1 Снижение остаточной концентрации субстрата, лимитирующего рост популяции микроорганизмов, в процессе микрозволюции при длительном культивировании в хемосгате (схема)

Рассмотрены некоторые подходы и математические модели, описывающие динамическое развитие открытых биологических систем В частности, подчеркивается несоответствие между выводами теории неравновесных термодинамических систем (Николис, Пригожин, 1979; Эйген, 1973, Эбелинг и др, 2001; Зотин и др, 1999) и экспериментальными закономерностями микроэволюции биологических популяций (Лотка, 1925, Одум, 1975; Печуркин, 1978, 1982, 1989 Е^ и др., 2002). Из неравновесной термодинамики известно (теорема Пригожина), что скорость производства энтропии при переходе открытой системы из одного стационарного состояния в другое должна уменьшаться Однако, в соответствии с энергетическими принципами развития надорганизменных систем (см., Печуркин, 1982) в открытых биологических системах при переходе из одного стационарного состояния в другое, например, в процессе мутаций и естественного отбора, поток энергетического субстрата, захваченного популяцией, должен возрастать Из микробиологии известно, что теплопродукция микробной популяции как открытой биологической системы пропорциональна потоку использованного энергетического субстрата. Если, в свою очередь, скорость теплопродукции определяет скорость производства энтропии (см , например, Зоти и др, 1999; Рубин, 2000) то в процессе развития открытых биологических систем скорость

производства энтропии должна возрастать , а не уменьшаться, как по Пригожину.

Удобным объектом для изучения закономерностей микроэволюционных перестроек в биологических популяциях являются плазмидсодержащие штаммы микроорганизмов. В работе рассмотрены общие сведения о плазмидах, их свойствах, а также возможные причины потери плазмид клетками.

Во Второй главе описываются используемые в работе штаммы микроорганизмов, методы периодического и непрерывного культивирования, методики определения концентрации биомассы, субстратов и других параметров, статистические методы обработки экспериментальных данных, установления стационарного состояния в непрерывной культуре, состав питательных среды и их приготовление.

Третья глава состоит из трех частей. Для изучения общих закономерностей микроэволюции в первой части была построена и проанализирована математическая модель авюселекции плазмидсодержащих штаммов микроорганизмов при непрерывном культивировании в турбидостате.

Математическая модель развития образовавшейся бесплазмидного варианта микроорганизмов (А") при совместном культивировании с исходным плазмидным штаммом (X*) в турбидостате записывается аналогично модели Моно-Герберта для непрерывной культуры (Herbert D. et al., 1956) с регулятором скорости протока питательной среды (Гуревич, 1966)-

где удельная скорость протока D задается в соответствии уравнениям пропорционально регулятора плотности популяции в турбидостате; Дь к -постоянные коэффициенты, причем Д|>0, к>0, DqJk«Xu; л{1 - заданное значение плотности популяции в турбидостате, S0 - заданное значение концентрации субстрата во входной среде; удельные скорости роста плазмидной ц"(5) и бесплазмидной р. (S) популяций полагаются зависимыми от концентрации субстрата по Моно ц+=ц |i =ц ,„S/(fCs+S)-, ц+„, yCm,

К' i, К i, У, Y - постоянные коэффициенты,

С помощью модели (1) можно выявить основные закономерности действия естественного отбора в непрерывной культуре микроорганизмов при лимитировании их роста недостатком субстрата Здесь предполагается, чю в процессе спонтанной потери плазмид клетками образуется некоторое количество бесплазмидных клеток определенною класса X с измененными характеристиками Y и //', причем плотность бесплазмидной популяции достаточна для того, чтобы описывать динамику ее развития детерминистской

X' =W{S)-Dyr Х~ = ЬГ (S)-DW

S = D(Sa-S)'^X,/Y' -м'Х-/)-

(1)

моделью Вероятность потери плазмид клетками, будем полагав настолько малыми, что вклад процесса потери плазмид в дальнейшее совместное развитие обеих популяций можно не учитывать Отметим также, что предлагаемая модель описывает развитие популяций микроорганизмов в пространственно однородных условиях, т.е. в реакторе идеального смешения

Очевидно, что в процессе автоселекции можно ожидать замещение плазмидной популяции более экономичными бесплазмидными вариантами. Анализ модели показывает, что условием устойчиво1 о выигрыша бесплазмидного варианта является:

/Г(£-)<0, (2)

те. для устойчивого выигрыша бесплазмидного варианта в конкуренции с плазмидным необходимо и достаточно, чтобы при стационарной концентрации субстрата удельная скорость роста плазмидного штамма была меньше скорости его вымывания В принципе, это условие не зависит от того как изменяется экономический коэффициент V бесплазмидного варианта Однако, в случае образования менее экономичных вариантов теоретически возможна остановка протока питательной среды. Для того чтобы этого не произошло необходимо, чтобы выполнялось неравенство:

8о>Хо!Г-Оо/кГ (3)

Соотношение экологических свойств плазмидного и бесплазмидного вариантов, а также значения параметров управления 5п и Хп в турбидостате, необходимые и достаточные для устойчивого закрепления бесплазмидного штамма и элиминации плазмидного, следует из системы неравенств.

X >0

• .5 > 0 (4)

X )<£> = /< («■)

Из последнего неравенства данной системы получаем ограничения на экологические свойства видов для устойчивого выигрыша бесплазмидного варианта'

5 - = (5)

Это условие выполняется всегда, если зависимость |.Г(5) располагается выше, чем при всех значениях концентрации субстрата 5

Если в турбидостате поддерживается постоянной суммарная плотность популяций, то при замещении плазмидного варианта более экономичным бесплазмидным должно иметь место увеличение остаточной концентрации

субстрата, что не соответствует хемостатному критерию Теоретически можно ожидать совместное сосуществование плазмидной и бесплазмидной популяции. Это не противоречит принципу конкурентного исключения, поскольку в турбидостате помимо конкуренции за субстрат есть еще второй плотностнозависимый фактор - скорость протока. В случае их совместного сосуществования зависимости скоростей роста от концентрации субстрата |i(S) должны пересекаться. Пересечение кривых возможно только при изменении у бесплазмидной популяции сродства к лимитирующему субстрату. Никаких оснований ожидать возникновение таких вариантов в процессе автоселекции нет. Более того, в работах некоторых исследователей показано, что при потере плазмид сродство к субстрату не изменяется (Wouters е. al., 1983). Поэтому сосуществование возможно только теоретически, а кривые зависимостей скоростей роста |i(S) у плазмидного и бесплазмидного штаммов не пересекаются.

Во второй части третьей главы описаны эксперименты по автоселекции плазмидсодержащего штамма бактерий Е coli К-12 MG1655, содержащего рекомбинантную плазмиду pGLO, в состав которой входят клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), выделенные из медузы Aeguorea victoria. Плазмида обуславливает устойчивость к ампициллину и зеленую флуоресценцию (^тач=508 нм) при освещении фиолетовым светом (A.max-420 нм).

Одним из условий культивирования было обеспечить максимальную экспрессию клонированных генов белка GFP. Для этого в качестве энергетического субстрата использовалась арабиноза как индуктор арабинозного промотора, под контролем которого клонирован ген gfp Принципиальный план автоселекцмонных экспериментов был следующим (см. результаты на рис. 2).

В начале плазмидсодержащая популяция бактерий (100% плазмидных клеток) росла в селективных условиях при добавлении в среду ампициллина в концентрации 0,25 г/л до установления стационарного состояния. В качестве источника углерода и энергии на этом этапе использовалась глюкоза. Это исключало экспрессию клонированных генов GFP и, соответственно, снижало вероятность потери плазмид клетками.

На втором этапе производилась замена среды с глюкозой на аналогичную среду с арабинозой. Условия культивирования были подобраны так, чтобы остаточная концентрация субстрата в культиваторе примерно равнялась 1 г/л, что позволяло достигнуть высокого уровня экспрессии клонированных генов зеленого флуоресцентного белка.

На третьем этапе после достижения стационарного состояния на среде с арабинозой была прекращена подача ампициллина в ферментер, что позволяло появляться и существовать в популяции более активным бесплазмидным

Bpowci

Рис 2 Замещение плазмидсодержащего штамма Escherichia coli MG1655 (pGLO (Ар, GFP)) бесплазмидным вариантом при длительном непрерывном культивировании в турбидостате I -доля плазмидсодержащих и бесплазмидных клеток в популяции бактерий, %, 11 - динамика концентрации биомассы в турбидостате, г/л, III - возрастание остаточной концентрации субстрата в ферментере в турбидостате в процессе замещения, г/л, IV - возрастание удельной скорости разбавления среды, ч , V - возрастание потока энергетического субстрата (арабинозы), использованного популяцией бактерий, Н,х„ , г/г час

вариантам которые дальше н процессе автоселекции замешали исходную плазмидсодержащую популяцию

Как видно из полученных результатов в процессе автоселекции выигрывал бесппазмидный штамм обладающий бопьшей удельной скоростью роста, и большей экономичностью использования энергетического субстрата арабинозы (рис 2). По прошествии 60 часов культивирования (начало отсчета идет после прекращения подачи ампицилпипа) при высевах на агаризовапные среды в чашках Пегри не наблюдалось ни одной зеленой колонии Подобное же быстрое замещение плазмидных штаммов бесплазмидными, связанное с большой разницей в скорое1я\ рост популяций, наблюдалось и в случае меньших уровней экспрессии клонированных генов Как видно из рисунка 2. в приведенном случае различия в скороеiих роста штаммов составили почти в три раза.

Как и ожидалось, в процессе автоселекиии в pll-стате произошло увстиченис остаточной концентрации субстрата (рис 2). И. таким образом, можно с полной уверенностью \1верждать. что критерии развития открытых биологических систем, связанные с уменьшением остаточной концентрации субстрата у видов, выигравших в конкуренции в открытых системах с постоянными потоками (те хемостатные критерии) не применимы к системам с постоянной организацией турбиюстатиси о типа. Тогда существует ли содержательный критерий развит» в таких системах?

В соответствии с энергетическими принципами развития надорганизменных систем в оi крытых системах при переходе из одного стационарного состояния в другое поток энергетического субстрата, использованного популяцией, должен BOipaciaib (рис. 3) На рис т изображены два возможных случая перехода открытой системы из одного стационарного состояния в другое Переход характеризуется с точки зрения потока использованного энергетического субстрата и скорости производства энтропии В интервале t0t ■ - стационарное состояние, интервал 1)Ь - область неустойчивости, при t>b возникаем новое стационарное состояние.

В нашем случае при непрерывном культивировании первое стационарное состояние соответствует развитию плазмидсодержащей популяции бактерий При появлении бесплазмидных вариантов происходит замещение плазмидиого штамма бесплазмидным, нас iу нас i новое иационарное сооояние

В соответствии с математической моделью автоселекции плазмидсодержащих штаммов (система !) в первом С1ационарном соиоянии поток использованного энергетического субстрата определяется кинетическими коэффициентами роста плазмидсодер/кащей популяции.

н -пч с,

о > = ——-

Во втором стационарном состоянии поток использованною энергетического субстрата определяется следующим выражением.

Для того чтобы выяснить какой из критериев будет определять направление процесса автоселекции популяции плазмидсодержащего штамма при условии постоянства плотности популяции в турбидостате, необходимо

определить знак неравенства между ——— > ———.

Н

Нш

н

II

Нт

dS dt

dS dt

t

»

Рис 3 Изменение потока использованного энергетического субстрата и скорости производства энтропии при переходе от одного стационарного состояния к другому в процессе микроэволюции в открытых биологических системах (схема)

I - В соответствии с основными положениями неравновесной термодинамики (Николис. Пригожин 1979 Эбелинг и др , 2001)

И - В соответствии с энергетическими принципами развития надорганизменных биологических систем (Печуркин 1982)

С помощью математической модели 1 при Do=0, k=8 с помощью метода наименьших квадратов по данным, полученным из эксперимента по автоселекции плазмидсодержащего штамма Ecoli К-12 MG1655, были получены следующие значения кинетических коэффициентов роста плазмидной и бесплазмидной популяции- ц+=0,08±0,01; Y+=0,37±0,03, =0,ЗОЮ,02; Y~-0,47±0,02. Такие значения кинетических коэффициентов соответствуют возрастанию потока энергетического субстрата, использованного популяцией, т.е. Н„и, в процессе автоселекции возрастает, как показано на рис.2, З.И.

В третьей части третьей главы описаны эксперименты по автоселекции при непрерывном культивировании фенолразрушающих микроорганизмов, использующих токсичный субстрат (фенол) как единственный источник углерода и энергии Микробная ассоциация, обладающая способностью деградировать фенол, состоящая из 5 видов дрожжей и одного вида бактерий, была получена из образцов почвы, загрязненной отходами крупных деревообрабатывающих комплексов (опилки и щепа, многолетние накопления в почве) вблизи г Лесосибирск в среднем течении р Енисей в Центральной части Красноярского края.

Штамм дрожжей, определенный как Candida tropicalis, был выделен при длительном культивировании (около 30 генераций) ассоциации микроорганизмов на минеральной среде с фенолом в хемостате S()=500 мг/л при скорости разбавления среды D=0, 055 ч*' Штамм бактерий, определенный как Rhodococcus sp , был выделен при длительном культивировании микробной ассоциации в рН-стате, при высокой концентрации фенола S«"-3000 мг/л, S в культуре 400 мг/л После успешной автоселекции эти штаммы С tropicalis и Rhodococcus sp культивировали в хемостате и в рН-стате для определения их кинетических характеристик (табл 1, рис 4, 5)

Концентрация фенола мг

Рис 4 Непрерывное культивирование дрожжей Сат1Ша Iгорн.и1и в хемостате и рН-стате на средах с разными концентрациями фенола ¡1) - стационарные состояния в хемотате; (2) - то же в рН-стате, (3) - теоретическая кривая, рассчитанная по формуле Холдейна

Культивирование микроорганизмов проводили в конических колбах на качалке и в ферментере с рабочим объемом 600 мл. Для получения штаммов микроорганизмов с высокими кинетическими характеристиками, оценки их способности деградировать токсичные экополютанты, такие как фенол, в наших экспериментах использованы методы автоселекции активных форм в

условиях непрерывного культивирования. С этой целью нами испытаны методы непрерывного культивирования с обратной связью (рН-стат), позволяющие проводить процессы автоселекции штаммов-деструкторов и их ассоциаций в условиях длительного развития при высоких концентрациях токсикантов в среде, и в хемостате при низких концентрациях фенола в среде

Стационарные состояния при культивировании дрожжей С tropicalis в хемостате при различных скоростях разбавления среды приведены на рис.4 При D= 0,3 -0,4 час 1 небольшие флуктуации в скорости разбавления, причиной которых могли быть, например, вариации объема культуры или случайные изменения скорости протока, приводили к резкому возрастанию концентрации фенола в культуре и, в конечном счете, к вымыванию культуры. Таким образом, наши экспериментальные данные подтверждают теоретические выводы о невозможности проведения селекции деградирующих фенол микроорганизмов при высоких концентрациях фенола в среде в хемостате, поскольку стационарные состояния в этом случае не устойчивы.

Рис 5 Периодическое и непрерывное культивирование бактерий Rhodotoctus sp в рН-стате при субстратном ингибировании роста фенолом (1) периодическое культивирование в колбах на качалке, (2) - стационарные состояния в рН-стате, (3) - теоретическая кривая, рассчитанная по формуле Холдейна

Для исследования субстратного ингибирования роста дрожжей фенолом использовали непрерывное культивирование в рН-стате (рис 4, 5). Общепризнанно, что микроорганизмы, обладающие высокой катаболической активностью, или другими словами, те, у которых выше отношение ¡amj/Ks для данного субстрата, растут быстрее в таких условиях и, как правило, более приемлемы для целей биоремедиации (Watanabe et al, 1996; Whiteley and Bailey, 2000). Тем не менее, это положение пока еще не было доказано на достаточно

большом экспериментальном материале. Более того, в отношении высоко!оксичных загрязнителей окружающей среды, таких как фенол и его производные, это может быть даже неверно Так, например, было показано, что штаммы бактерий и их сообщества, обладающие высокой фенол-деградирующей способностью, были менее конкурентоспособными, чем штаммы, которые имели низкую фенолразрушающую активность после их интродукции в активный ил, содержащий фенол (Watanabe et al, 1996; Whiteley and Bailey, 2000).

Действительно, и в наших экспериментах штамм бактерий Rhodococcus sp , победивший в конкуренции при длительном культивировании микробной ассоциации в рН-стате при высокой концентрации фенола в культуре S=400 мг/л, обладал, однако, более низким значением этого показателя (.ima\/Ks по сравнению с другими видами (см табл. 1) Таким образом, грамотная селекция активных штаммов-деструкторов токсичных поллютантов и их ассоциаций должна проводиться в условиях, соответствующих их дальнейшему успешному применению

Таблица. 1

Коэффициенты модели Холдейна при использовании микроорганизмами фенола как субстрата

Микроорганизмы час 1 мг/л K, мг/л Цш../Ks S* мг/л Литература

Acinetobacter sp 0 290 091 1100 0 319 100 Jones e а. 1973

Pseudomonas putida 0 567 2 38 106 0 0 238 160 Der Yang, Humphrey 1975

Pseudomonas putida 0 534 1 00 470 0 0 э34 21 7 Hill,Robinson 1975

Pseudomonas putida DSM 548 0 436 6 19 54 1 0 070 18 3 Monteirolea 2000

Acinetobactei Iwoffi 0 703 23 90 583 2 0 029 1180 Borighem,Veieecken, 1981

Сферические бактерии активного ила 0 260 25 40 173 0 0010 66 3 Pawlowsky, Howell 1973

Ни гчатые бактерии активного ила 0 223 3 86 934 5 0 038 74 0 Pawlowsky Howell 1973

I richosporon CLitaneum 0 464 1 66 380 0 0 290 25 1 Der Yang, Humphiey, 1975

Ralstonia eutropha 0410 2 00 350 0 0 20з 26 5 Leonarde a , 1999

Rodococcus sp 0 866 ±0,024 31 01± 2,34 342 7± 18,9 0 028 ±0 005 103 09± 2 63 Настоящая работа

Candida tropicalis 0,561 ±0,019 2,42 +0.14 687,4± 95,7 0,232 ±0 068 40 77 ±3 19 Настоящая работа

Известны несколько моделей, представляющих интерес для описания субстратного ингибирования роста микроорганизмов фенолом (Edwards, 1970) Ни одна из моделей, как показали многочисленные проверки, достоверно не выделяется среди других по точности описания экспериментальных данных Среди моделей встречаются и эмпирические, и таким образом, теоретически обоснованные модели никак не лучше описывают субстратное ингибирования

роста микроорганизмов в сравнении с эмпирическими (Alagappan and Cowan, 2001. I uong, 1987) Однако модель Холдейна-

ц = цт,ч S/(Ks - S - S2/K,), (6)

содержит лишь три параметра и поэтому была выбрана нами как более предпочтитепьпая для описания ингибировапия роста микроорганизмов и збы i ком су бс i pa I а - фенола

Исследовать субстратное ингибирование роста микроорганизмов в хемоетате нево¡можно, так как чемостат в этом случае неустойчив В наших экспериментах для этого был применен четойчивый метод культивирования -pH-ciai (см рис 4 и 5, правые по.ювины кривой Холдейна) В свою очередь, в рН-стате очень трудно исследовать лимитирование роста микроорганизмов низкими концентрациями субстрата фепопа. это быпо проветено при периодическом культивировании в копбач (см рис 5 зевая половина кривой Холдейна)

Коэффициенты модели Холдейна (6). определенные при использовании микроорганизмами фенола как субстрата в хемостатных и рП-статпых экспериментах вместе с аналогичными данными других исследователей сведены в табл 1 Из данных приведенных в табл 1 видно, что для болыиинс!ва фенодрафушающич микроорганизмов кришческая конценфлция феном в к\пьт\ре (S* - ^чЦ ) товольно низка, что и является причиной неустойчивости стационарных состоянии в хемоетате при относительно невысоких (по сравнению с цпич) скоростях разбавления среды, но при достаточно высоких концентрациях фенола во входной среде (см. рис 4 и 5) Величины кинетических параметров роста популяций микроорганизмов таковы, что ингибирование ич роста субстратом - фенолом является преобладающим факюром \же при ею конценфации 10 mi 'ч и более в культ>ре

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1 Построена и проанализирована математическая модель автоселекции генноинженерных пчазмидсодержащих ипаммов баюерий при непрерывном культивировании в чемостате и турбидостате.

2 Анализ математической модели автоселекции пеоабильныч генноинженерных штаммов микроорганизмов в турбидостаге покрывает, что остаточная концентрация субстрата у популяции бесплазмидного штамма, заместившего исходную плазмидеодержащую попчляцию в ¡урбидостате, может и возрастать, и таким образом, классические хемостатные критерии микроэволюции и конкуренюснособносш популяций, основанные на снижении остаточной концентрации субстрата или большем наклоне зависимое in p.(S) \ победившею вида, не являкпея универсальными и в турбидостате не работают.

3 В жсперимен iax по лзюселекции i енноинженерши о ипамма бактерий Е coli К-12 МО 1655 содержащего клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GlrP) б ташиде pGLO, при культивировапии в pll-статс покачано, что поток энергетического субората, использованного гюпупяцией, возрастает

4 Результаты проведенных экспериментов и расчетов по математическим моделям подизерж laioi. что а) бопее общим критерием микро эволюции популяций явчяек_я возрастание поюка энергическою субстрата //„<„, использованного популяцией победившею в процессе авгоселекции ппамма. б) козраыанне поюка энер|eiическо!о cyocipaia. захваченного популяцией, можно считать общим критерием развития обоих типов откры I ых биоло! ических сис Iем (в хемос iaiе и в |урбидос i лie)

5 Показано что в резу 1ыате автоселекции при непрерывном ку пьтивировапии можно получить активные штаммы и сообщества микроорганизмов, использующих токсичные су6стра!ы, двух типов В хемостате отбираются штаммы с высокой полнотой использования токсичного субстрата до предельно низких конценграций в среде, такие как дрожжи С tropicalis При селекции в рН-стате выделены штаммы бактерий Rhodococcus sp с высокой деградирующей способностью прояв 1яюшейся при высоких концентрациях токсичною субстрат фепо.ы вереде

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ло1Инов И А, Брилькон А В (2004) Маюмашчеекое моделирование микроэволюции попупяиий микроорганизмов в открытых биологических сисчемах Вестник КГУ Сер физико-математические науки 5,90-98

2 Ьрильков Л В Логинов II \ Морозова LB. Печуркин НС. (2004) ЗакономерноеI и микроэвочюции микробных популяций в ожрьиых системах Доклады Академии паук (принята к печати)

3 Логинов И А, Брильков А В (2004) Математическое моделирование автосепекции микробных популяции при субстратном ингибировании их роста в непрерывной культуре Вестник КГУ Сер физико-математические науки (принят к печат)

4 Глпусов ВВ. Морозова ЬЕ, Логинов И А (2004) Изучение нестабильности плазмидных штаммов Escherichia Coli. содержащих клонированные в плазмидах гены оиолюминесцентной системы фоюбактерий. при низких 1емпературах ку ныивирования в хемостате Биотехиология (принята к печати)

л Логинов И А Ма1емашческое мочелирование поиуляционной неустойчивости плазмид В кн НКСФ-2000 Сборник тезисов докладов научной конференции студентов физиков - Красноярск КГУ. 2000 с 43

6. I A.Loginov. A.V Brilkov Prospccts of using continuous cultivation foi rapid selection of microbial strain-destructor of toxic pollutants In international baikal symposium on microbiology (IBSM-2003) «Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs» Irkutsk-Russia September 8-13,2003 p 85-86

7. Логинов И.А Брильков А В Математическое и экспериментальное моделирование процессов биологического развития на примере микроэволюции рекомбинантных штаммов бактерий при непрерывном культивировании III Съезд биофизиков России Тез Докл Воронеж 2004 с 354 8 Brilkov А V , Loginov 1.А , Morozova Е V Pechurkin N.S Experimental specification of open systems evolution physical punciples. In COSPAR, 19-21 July 2004, Paris (France) — 1 p

Подписано в печать Тираж 60 экз.

20.12.2004 Заказ № 436

Отпечатано на ризографе КГТУ 660074, Красноярск, ул. Киренского, 26.

»-25 9 4

РНБ Русский фонд

2006-4 f

9384 <

i

i

г