Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности автоселекции популяций микроорганизмов при длительном непрерывном культивировании

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Закономерности автоселекции популяций микроорганизмов при длительном непрерывном культивировании"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Логинов Иван Александрович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ АВТОСЕЛЕКЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ НЕПРЕРЫВНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

о 2 ОКТ 2008

Красноярск - 2008

003447728

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН

Научный руководитель

доктор биологических наук профессор А. В. БРИЛЬКОВ

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук в.н.с. В.Г. Губанов

кандидат физико-математических наук с.н.с. А. В. ШАШКИН

Ведущая организация

Томский Государственный Университет им. В. В. Куйбышева

Защита состоится

"Ж*' ¿Я^Ле-Я** 2008 г.

г>Р

часов на

заседании Специализированного совета Д. 003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, Институт биофизики СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан 2008 г.

Ученый секретарь Специализированного

Г """

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Непрерывное культивирование является аналогом большинства природных ситуаций: хемостат аналогичен ситуациям, где встречае1ся лимитирование роста недостатком питательных веществ, элементов или микроэлементов; турбидостат отвечает условиям максимально возможного роста при ограничении плотности популяции. С точки зрения функционирования открытых систем хемостат и турбидостат - это термодинамические системы, способные находиться в устойчивых стационарных состояниях. Причем, в соответствии с классификацией М.Эйгена, хемостат соответствует случаю постоянных потоков, а турбидостат -случаю постоянной организации (или постоянных реакционных сил). Таким образом, в руках экспериментаторов имеются открытые системы двух основных типов развития и для биологии, и для термодинамики. Если в таких системах происходят эволюционные изменения, переход от одного стационарного состояния к другому в результате изменения качественных свойств систем (например, в результате процессов мутирования и отбора), то главные характеристики этих генетических перестроек в популяциях, или шагов эволюции, можно измерить, не теряя общности подхода с точки зрения, как биологии, так и физики. Одним из ярких и наглядных примеров эволюционных переходов в таких открытых системах является микроэволюционная перестройка популяции плазмидсодержащего штамма бактерий при длительном непрерывном культивировании, где имеет место потеря плазмид клетками и автоселекция бесплазмидного штамма, более активного чем исходная форма. Используя плазмидсодержащие штаммы бактерий как удобный объект для изучения переходов из одного стационарного состояния в другое в результате микроэволюционных перестроек можно получить существенное дополнение термодинамической теории открытых биологических систем с целью дальнейшего изучения общих закономерностей биологического развития.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение общих закономерностей микроэволюции микробных популяций в открытых системах на примере автоселекции плазмидсодержащих штаммов бактерий и фенолразрушающих микроорганизмов при длительном непрерывном культивировании.

В соответствии с целью рабо1ы были поС1авлены следующие задачи:

1. Исследовать процесс автоселекции фенолразрушающих микроорганизмов в обоих типах открытых систем при длительном непрерывном культивировании в хемостате и турбидостате (рН-стате).

2. С помощью математической модели проанализировать и сравнить закономерности автоселекции плазмидсодержащих бактерий при непрерывном культивировании при двух режимах: в турбидостате и хемостате.

3. Исследовать в экспериментах процесс автоселекции генноинженерного штамма бактерий Е.соП К-12 М01655, содержащего в составе плазмид

клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), при культивировании в рН-стате.

Практическая значимоеть работы.

Результаты работы могут быть использованы для описания динамики генно-инженерных штаммов микроорганизмов, содержащих плазм иды. используемых в биотехнологическом производстве. Основываясь на результатах работы можно оценить устойчивость ожидаемых стационарных состояний в непрерывной культуре микроорганизмов при различных ограничениях их роста, наиболее вероятное их направление и скорости автоселекции бесплазмидных вариантов при длительном культивировании микроорганизмов. Результаты работы целесообразно использовать при интенсификации на основе непрерывных культур микроорганизмов процессов микробиологического производства, очистки сточных вод, при разработке эффективных способов селекции новых штаммов, обладающих ценными свойствами, в частности, повышенной экономичностью использования субстратов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Остаточная концентрация субстрата у популяции бесплазмидного штамма, заместившего исходную плазмидсодержащую популяцию в турбидостате возрастает, и таким образом, классический хемостатный критерий микроэволюции и конкурентоспособности популяций, основанный на снижении остаточной концентрации субстрата, не является универсальным и в турбидостате не работает.

2. В экспериментах по автоселекции генноинженерного штамма бактерий E.coli К-12 MG1655, содержащего клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), в рН-стате показано, что в процессе замещения плазмидною ш гамма бесплазмидным возрастает и остаточная концентрация, и поток энергетического субстрата, использованного популяцией Нис„.

3. Общим критерием микроэволюции микробных популяций в обоих типах открытых биологических систем (в хемостате и в турбидостате) является возрастание потока энергетического субстрата #,,,„, использованного популяцией.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международном Байкальском Микробиологическом Симпозиуме 1BSM-2003 «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2003), на Международном симпозиуме COSPAR-2004 (Франция, Париж), на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на конференции молодых ученых Института биофизики СО РАН (Красноярск 2002), на объединенном семинаре лаб. Экологической биофизики, лаб. Экологической биотехнологии и лаб. УБГ, на семинарах лаборатории УБГ,

Публикации. Список публикаций включает три статьи в журналах (Доклады РАН, Вестник КГУ, серия физико-математические науки), три статьи в трудах международных конференций и тезисы на конференциях и биофизическом съезде РАН (Воронеж, 2004).

Работа была поддержана фантами Красноярского краевого фонда науки № 13G031, № 11F007M, № 12F007M, № 8tsl 11.

Структура работы Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит 22 рисунка, и 5 таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает 115 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении охарактеризована научная проблема и подходы к ее решению, сформулирована цель и задачи исследования.

В Первой главе делается литературный обзор использования методов управляемого культивирования микроорганизмов для изучения динамических процессов развития популяций. Даны описания периодического и непрерывного методов культивирования микроорганизмов (хемостат. турбидостат), а также математическое описание происходящих динамических процессов. Анализируются работы авторов, внесших наибольший вклад в развитие теоретических и прикладных аспектов непрерывного культивирования, в особенности, процессов автоселекции популяций микроорганизмов в проточных условиях. Отмечается, что для изучения эволюционных процессов, происходящих в популяциях микроорганизмов, метод непрерывного культивирования является наиболее удобным (по сравнению, например, с периодическим культивированием), поскольку в классических периодических процессах невозможно строго количественно связать параметры физиологического состояния культуры и внешней среды. Управляемое непрерывное культивирование микроорганизмов позволяет получить стационарное состояние, в котором физиологическое состояние микроорганизмов и параметры среды стабилизируются так, что могут быть однозначно связаны. К тому же при непрерывном культивировании можно застабилизировать рост популяции в любой точке по восходящей ветви S-образного роста популяции, в том числе и в экспоненциальной фазе, задавая нужную степень лимитирования роста популяции недостатком лимитирующего субстрата.

Анализируется классический критерий развития, как смешанных культур, так и монокультур микроорганизмов при непрерывном культивировании в хемостате. Как известно, математический анализ и многочисленные экспериментальные данные показывают, что в процессе автоселекции в хемостате остаточная концентрация субстрата у выигравшего в конкуренции вида микроорганизмов должна уменьшаться (Herbert et al., 1956; Moser, 1958; Hsu et al., 1977; Печуркин, Терсков, 1975), рис.1. Однако будет ли справедлив этот критерий для процессов автоселекции в турбидостате, неизвестно. Для

систем типа турбидостата экспериментальная проверка данного критерии до сих пор не проводилась.

Рис. 1. Снижение остаточной концентрации субстрата, лимитирующего рост популяции микроорганизмов, в процессе микроэволюции при длительном культивировании в хемостате (схема).

Рассмотрены некоторые подходы и математические модели, описывающие динамическое развитие открытых биологических систем. В частности, подчеркивается возможное несоответствие между выводами теории неравновесных термодинамических систем (Николис, Пригожин, 1979; Эйген, 1973; Эбелинг и др., 2001; Зотин и др., 1999) и экспериментальными закономерностями микроэволюции биологических популяций (Лотка, 1925; Одум, 1975; Печуркин, 1978, 1982, 1989 ЕвН и др., 2002). Из неравновесной термодинамики известно (теорема Пригожина), что скорость производства энтропии при переходе открытой системы из одного стационарного состояния в другое должна уменьшаться. Однако, в соответствии с энергетическими принципами развития надорганизменных систем (см., Печуркин, 1982) в открытых биологических системах при переходе из одного стационарного состояния в другое, например, в процессе мутаций и естественного отбора, поток энергетического субстрата, захваченного популяцией, должен возрастать. Из микробиологии известно, что теплопродукция микробной популяции как открытой биологической системы пропорциональна потоку использованного энергетического субстрата. Если, в свою очередь, скорость теплопродукции

определяе1 скорость производства энтропии (см., например, Зотин и др., 1999; Рубин, 2000) то в процессе развития открытых биологических систем скорость производства энтропии должна возрастать, а не уменьшаться.

Удобным объектом для изучения закономерностей микроэволюционных: перестроек в биологических популяциях являются плазмидсодержащие штаммы микроорганизмов. В работе рассмотрены общие сведения о плазмидах, их свойствах, а также возможные причины потери плазмид клетками.

Во Второй главе описываются используемые в работе штаммы микроорганизмов, методы периодического и непрерывного культивирования, методики определения концентрации биомассы, субстратов и других параметров, статистические методы обработки экспериментальных данных, установления стационарного состояния в непрерывной культуре, состав питательных среды и их приготовление.

Третья глава состоит из трех частей. В первой части третьей главы описаны эксперименты по автоселекции микроорганизмов в двух возможных типах открытых систем: при постоянном потоке питательной среды (в хемостатс) и при постоянной организации (в рН-стате аналоге турбидостата). В качестве объекта исследования выбраны фенолразрушающие микроорганизмы, использующие токсичный субстрат (фенол) как единственный источник углерода и энергии. Микробная ассоциация, обладающая способностью деградировать фенол, состоящая из 5 видов дрожжей и одного вида бактерий, была получена из образцов почвы, загрязненной отходами крупных деревообрабатывающих комплексов (опилки и щепа, многолетние накопления в почве) вблизи г. Лесосибирск в среднем течении р. Енисей в Центральной части Красноярского края.

Штамм дрожжей, определенный как Candida tropicalis, был выделен при длительном культивировании (около 30 генераций) ассоциации микроорганизмов на минеральной среде с фенолом в хемостате Su—500 Mt/л при скорости разбавления среды D=0, 055 ч1. Штамм бактерий, определенный как Rhodococcus sp., был выделен при длительном культивировании микробной ассоциации в рН-стате, при высокой концентрации фенола So=3000 мг/л, S в культуре 400 мг/л. После успешной автоселекции эти штаммы С. tropicalis и Rhodococcus sp культивировали в хемостате и в рН-стате для определения их кинетических характеристик (табл.1, рис.2, 3).

. Культивирование микроорганизмов проводили в конических колбах на качалке и в ферментере с рабочим объемом 600 мл. Для получения штаммов микроорганизмов с высокими кинетическими характеристиками, оценки их способности деградировать токсичные экополлютанты, такие как фенол, в наших экспериментах использованы методы автоселекции активных форм а условиях непрерывного культивирования. С этой целью нами испытаны методы непрерывного культивирования с обратной связью (рН-стат), позволяющие проводить процессы автоселекции штаммов-деструкторов и их ассоциаций в условиях длительного развития при высоких концентрациях токсикантов в среде, и в хемостате при низких концентрациях фенола в среде

0,7 1 0,6 -

« 0,5 ■

1.0,4-

3

/

о

о

100 200 300 400 500 600 700 800 Концентрация фенола мг

Рис.2. Непрерывное культивирование дрожжей Candida tropicalis в хемостате и рН-стате па средах с разными концентрациями фенола: (1) - стационарные состояния в хемостате; (2) - то же в рН-стате; (3) - теоретическая кривая, рассчитанная по формуле Холдейна.

Стационарные состояния при культивировании дрожжей С. tropicalis в хемостате при различных скоростях разбавления среды приведены на рис.4. При D= 0,3 -0,4 час"1 небольшие флуктуации в скорости разбавления, причиной которых могли быть, например, вариации объема культуры или случайные изменения скорости протока, приводили к резкому возрастанию концентрации фенола в культуре и, в конечном счете, к вымыванию культуры. Таким образом, наши экспериментальные данные подтверждают теоретические выводы о невозможности проведения селекции деградирующих фенол микроорганизмов при высоких концентрациях фенола в среде в хемостате, поскольку стационарные состояния в этом случае не устойчивы.

Для исследования субстратного ингибирования роста дрожжей фенолом использовали непрерывное культивирование в рН-стате (рис.2, 3). Общепризнанно, что микроорганизмы, обладающие высокой катаболической активностью, или другими словами, те, у которых выше отношение |ind4/Ks для данного субстрата, растут быстрее в таких условиях и, как правило, более приемлемы для целей биоремедиации (Watanabe et al, 1996; Whiteley and Bailey, 2000). Тем не менее, это положение пока еще не было доказано на достаточно большом экспериментальном материале. Более того, в отношении высокотоксичных загрязнителей окружающей среды, таких как фенол и его производные, это может быть даже неверно Так, например, было показано, что штаммы бактерий и их сообщества, обладающие высокой фенол-деградирующей способностью, были менее конкурентоспособными, чем штаммы, которые имели низкую фенолразрушающую активность после их

интродукции в активный ил, содержащий фенол (Watanabe et al, 1996; Whiteley and Bailey, 2000).

0,8 --

2

0,2 "

3

0,1

о

100

200 300 400 500 600

TOO

800

Концентрация фенола, мг

Рис.3. Периодическое и непрерывное культивирование бактерий Rhodococcus sp в рН-стате при субстратном ингибировании роста фенолом' (1) - периодическое культивирование в колбах на качалке, (2) - стационарные состояния в рН-стате; (3) - теоретическая кривая, рассчитанная по формуле Холдейна

Действительно, и в наших экспериментах штамм бактерий Rhodococcus sp., победивший в конкуренции при длительном культивировании микробной ассоциации в рН-стате при высокой концентрации фенола в культуре S=400 мг/л, обладал, однако, более низким значением этого показателя цгпаЖ., по сравнению с другими видами (см. табл. 1)

Известны несколько моделей, представляющих интерес для описания субстратного ингибирования роста микроорганизмов фенолом (Edwards, 1970). Ни одна из моделей, как показали многочисленные проверки, достоверно не выделяется среди других по точности описания экспериментальных данных. Среди моделей встречаются и эмпирические, и таким образом, теоретически обоснованные модели никак не лучше описывают субстратное ингибирование роста микроорганизмов в сравнении с эмпирическими (Alagappan and Cowan, 2001; Luong, 1987). Однако модель Холдейна:

содержит лишь три параметра и поэтому была выбрана нами как более предпочтительная для описания ингибирования роста микроорганизмов избытком субстрата - фенола.

Ц = Цтах S/(Ks + S + S2/K,),

(1)

Исследовать субстратное иш ибирование роста микроорганизмов в хемостате невозможно, так как хемостат в этом случае неустойчив. В наших экспериментах для этого был применен устойчивый метод культивирования -рН-стат (см. рис. 2 и 3, правые половины кривой Холдейна). В свою очередь, в рН-стате очень трудно исследовать лимитирование роста микроорганизмов низкими концентрациями субстрата фенола, это было проведено при периодическом культивировании в колбах (см. рис. 3, левая половина кривой Холдейна).

Таблица. 1

Коэффициенты модели Холдейна при использовании микроорганизмами фенола как субстрата

Микроорганизмы M™, час"1 Ks мг/л K, иг/л Hmav/Ks S* мг/л Литература

Acmetobacter sp 0 290 091 1100 0319 100 Jonesea, 1973

Pseudomonas putida 0 567 2 38 106 0 0 238 16.0 Der Yang, Humphrey, 1975

Pseudomonas putida 0 534 1 00 470 0 0 534 21.7 Hill,Robinson, 1975

Pseudomonas putida DSM 548 0.436 6 19 54 I 0 070 183 Monteirol e a. 2000

Acmetobacter Iwoffi 0 703 23 90 583 2 0 029 1180 Bonghem,Vereecken, 1981

Сферические бактерии активного ила 0 260 25 40 173 0 0010 66 3 Pawlowsky, Howell, 1973

Нитчатые бактерии активного ила 0 223 5 86 934 5 0 038 74 0 Pawlowsky, Howell. 1973

Trichosporon cutaneum 0 464 1 66 380 0 0 290 25 1 Der Yang, Humphrev, 1975

Ralstoma eutropha 0410 2 00 350 0 0 205 26 5 Leonard e a , 1999

Rodococcus sp. 0 866 +0,024 31 0I± 2,34 342 7+ 18,9 0 028 ±0 005 103 09± 2 63 Настоящая работа

Candida tropicalis 0,561 ±0,019 2.42 ±0,14 687,4± 95,7 0,232 +0 068 40 77 ±3 19 Настоящая работа

Коэффициенты модели Холдейна (1), определенные при использовании микроорганизмами фенола как субстрата в хемостатных и рН-статных экспериментах вместе с аналогичными данными других исследователей сведены в табл. 1. Из данных, приведенных в табл. 1 видно, что для большинства фенолразрушающих микроорганизмов критическая концентрация фенола в культуре (Б* = %;'К5К, ) довольно низка, что и является причиной неустойчивости стационарных состояний в хемостате при относительно невысоких (по сравнению с цтах) скоростях разбавления среды, но при достаточно высоких концентрациях фенола во входной среде (см. рис.2 и 3) Величины кинетических параметров роста популяций микроорганизмов таковы, что ингибирование их роста субстратом — фенолом является преобладающим фактором уже при его концентрации 10 мг/л и более в культуре.

Таким образом, при автоселекции в двух типах открытых систем можно отбирать микроорганизмы обладающие различными свойствами, а

следовательно, грамотная селекция ак1ивных штаммов-деструкторов токсичных поллютантов и их ассоциаций должна проводиться в условиях, соответствующих их дальнейшему успешному применению.

Для изучения общих закономерностей микроэволюции во второй части третьей главы была построена и проанализирована математическая модель автоселекции плазмидсодержащих штаммов микроорганизмов при непрерывном культивировании в турбидостате.

Математическая модель развития образовавшейся бссплазмидного варианта микроорганизмов (X) при совместном культивировании с исходным плазмидным штаммом (Xг) в турбидостате записывается аналогично модели Моно-Герберта для непрерывной культуры (Herbert D. et. al., 1956) с регулятором скорости протока питательной среды (Гуревич, 1966):

JT = [M\S)-D]X+

■X-=[^(S)-D]X- , (2)

[S = D(SB -S)-m+X'/Г - fi'X-/Y-

n \Da + k(X* + X--Xa). n X* +X- >Xa-Djk

L) — \ ПрИ

[0; X^ + X~ < X0 - D0/k

где удельная скорость протока D задается в соответствии уравнениям пропорционально регулятора плотности популяции в турбидостате; D0, к -постоянные коэффициенты, причем D0>0, DJk«X0\ Х0 - заданное

значение плотности популяции в турбидостате, So - заданное значение концентрации субстрата во входной среде; удельные скорости роста плазмидной (S) и бесплазмидной ц (S) популяций полагаются зависимыми от концентрации субстрата по Моно. ' mS/(K+<,+S)', |а"=ц"„15'/(А~?+5); ц"„„ К' s, rCs, Y , Г - постоянные коэффициенты,

С помощью модели (2) можно выявить основные закономерности действия естественного отбора в непрерывной культуре микроорганизмов при лимитировании их роста недостатком субстрата. Здесь предполагается, что в процессе спонтанной потери плазмид клетками образуется некоторое количество бесплазмидных клеток определенного класса X с измененными характеристиками Y и ¡л, причем плотность бесплазмидной популяции достаточна для того, чтобы описывать динамику ее развития детерминистской моделью. Вероятность потери плазмид клетками, будем nonaiaib настолько малыми, что вклад процесса потери плазмид в дальнейшее совместное развитие обеих популяций можно не учитывать. Отметим также, что предлагаемая модель описывает развитие популяций микроорганизмов в пространственно однородных условиях, т.е. в реакторе идеального смешения.

Очевидно, что в процессе автоселекции можно ожидать замещение плазмидной популяции более экономичными бесплазмидными вариантами. Анализ модели показывает, что условием устойчивого выигрыша бесплазмидного варианта является:

и

т.е. для устойчивого выигрыша бесплазмидного варианта в конкуренции с плазмидным необходимо и достаточно, чтобы при стационарной концентрации субстрата удельная скорость роста плазмидного штамма была меньше скорости его вымывания. В принципе, это условие не зависит от того как изменяется экономический коэффициент V бесплазмидного варианта. Однако, в случае образования менее экономичных вариантов теоретически возможна остановка протока питательной среды. Для того чтобы этого не произошло необходимо, чтобы выполнялось неравенство-

Л^о/Г-АДГ. (4)

Соотношение экологических свойств плазмидного и бесплазмидного вариантов, а также значения параметров управления 5г) и Х0 в турбидостате, необходимые и достаточные для устойчивого закрепления бесплазмидного штамма и элиминации плазмидного, следует из системы неравенств:

Х>0

- 5 > 0 . (5)

/(г)<д = /,-(£-)

Из последнего неравенства данной системы получаем ограничения на экологические свойства видов для устойчивого выигрыша бесплазмидного варианта:

5- = - АХ - ) (6)

Это условие выполняется всегда, если зависимость |Г(5) располагается выше, чем при всех значениях концентрации субстрата Б.

Если в турбидостате поддерживается постоянной суммарная плотность популяций, то при замещении плазмидного варианта более экономичным бесплазмидным должно иметь место увеличение остаточной концентрации субстрата, что не соответствует хемостатному критерию. Теоретически можно ожидать совместное сосуществование плазмидной и бесплазмидной популяции. Это не противоречит принципу конкурентного исключения, поскольку в турбидостате помимо конкуренции за субстрат есть еще второй плотностнозависимый фактор - скорость протока. В случае их совместного сосуществования зависимости скоростей роста от концентрации субстрата ц(5) должны пересекаться. Пересечение кривых возможно только при изменении у бесплазмидной популяции сродства к лимитирующему субстрату. Никаких оснований ожидать возникновение таких вариантов в процессе автоселекции

нет. Более того, в работах некоторых исследователей показано, что при потере плазмид сродство к субстрату не изменяется (Wouters с. al., 1983). Поэтому сосуществование возможно только теоретически, а кривые зависимостей скоростей роста р(5) у плазмидного и бесплазмидного штаммов не пересекаются.

В третьей части третьей главы описаны эксперименты по автоселекции плазмидсодержащего штамма бактерий E.coli К-12 MG1655, содержащего рекомбинантную плазмиду pGLO, в состав которой входят клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), выделенные из медузы Aaguorea victoria. Плазмида обуславливает устойчивость к ампициллину и зеленую флуоресценцию (^.тах=508 нм) при освещении фиолетовым светом (^.тах=420 нм).

Одним из условий культивирования было обеспечить максимальную экспрессию клонированных генов белка GFP. Для этого в качестве энергетического субстрата использовалась арабиноза как индуктор арабинозного промотора, под контролем которого клонирован ген gfp.

Принципиальный план автоселекционных экспериментов был следующим (см. результаты на рис. 4). Вначале плазмидсодержащая популяция бактерий (100% плазмидных клеток) росла в селективных условиях при добавлении в среду ампициллина в концентрации 0,25 г/л до установления стационарного состояния. В качестве источника углерода и энергии на этом этапе использовалась глюкоза. Это исключало экспрессию клонированных генов GFP и, соответственно, снижало вероятность потери плазмид клетками.

На втором этапе производилась замена среды с глюкозой на аналогичную среду с арабинозой. Условия культивирования были подобраны так, чтобы остаточная концентрация субстрата в культиваторе примерно равнялась 1 г/л, что позволяло достигнуть высокого уровня экспрессии клонированных генов зеленого флуоресцентного белка.

На третьем этапе после достижения стационарного состояния на среде с арабинозой была прекращена подача ампициллина в ферментер, что позволяло появляться и существовать в популяции более активным бесплазмидиым вариантам, которые дальше в процессе автоселекции замещали исходную плазмидсодержащую популяцию.

Как видно из полученных результатов в процессе автоселекции выигрывал бесплазмидный штамм, обладающий большей удельной скоростью роста, и большей экономичностью использования энергетического субстрата арабинозы (рис. 4). По прошествии 60 часов культивирования (начало отсчета идет после прекращения подачи ампицилина) при высевах на агаризованные среды в чашках Петри не наблюдалось ни одной зеленой колонии. Подобное же быстрое замещение плазмидных штаммов бесплазмидными, связанное с большой разницей в скоростях роста популяций, наблюдалось и в случае меньших уровней экспрессии клонированных генов. Как видно из рисунка 4, в приведенном случае различия в скоростях роста штаммов составили почти в три раза.

Рис. 4. Замещение плазмидсодержащего штамма Escherichia coli MG1655 (pGLO (Ар, GFP)) бесплазмидным вариантом при длительном непрерывном культивировании в турбидостате. I - доля плазмидсодержащих и бесплазмидных клеток в популяции бактерий, %; II - динамика концентрации биомассы в турбидостате, г/л; III - возрастание остаточной концентрации субстрата в ферментере в турбидостате в процессе замещения, г/л; IV -возрастание удельной скорости разбавления среды, ч ; V - возрастание потока энергетического субстрата (арабинозы), использованного популяцией бактерий, Ни„, г/г час

Как и ожидалось, в процессе автоселекции в рН-стате произошло увеличение остаточной концентрации субстрата (рис. 4) И, таким образом, можно с полной уверенностью утверждать, что критерии развития открытых биологических систем, связанные с уменьшением остаточной концентрации субстрата у видов, выигравших в конкуренции в открытых системах с постоянными потоками (т.е. хемостатные критерии) не применимы к системам с постоянной организацией турбидостатного типа.

Поскольку остаточная концентрация в процессе автоселекции в турбидостате может и возрастать, эксперименты такого плана приобретают особый интерес. Будут ли энергетические принципы развития однозначно определять направленность эволюционных переходов в турбидостате как это происходит в хемостате, или они могут нарушаться?

В соответствии с математической моделью автоселекции плазмидсодержащих штаммов (система уравнений 2) в первом стационарном состоянии поток захваченного энергетического субстрата будет определяться кинетическими коэффициентами плазмидсодержащей популяции-

//„„,=д$0-5) =

Соответственно во втором стационарном состоянии поюк захваченного энергетического субстрата будет определяться:

Нисп= Д50 -5) = ^ ^ (5)

И для того, чтобы выяснить, что происходит с потоком энергетического субстрата захваченного популяцией, при условии постоянного числа клеток в

культиваторе, необходимо определить знак неравенства между отношениями:

Ц"

Г и Р-

С помощью математической модели 2 при 00=0, к=8 с помощью метода наименьших квадратов по данным, полученным из эксперимента по автоселекции плазмидсодержащсго штамма Е.соП К-12 М01655, были получены следующие значения кинетических коэффициентов роста плазмидной и бесплазмидной популяции: |х+=0,08±0,01; У =0,37±0,03; ц =0,ЗОЮ,02; У~=0,47±0,02. Такие значения кинетических коэффициентов соответствуют возрастанию потока энергетического субстрата, использованного популяцией, т.е. Нисп в процессе автоселекции возрастает, как показано на рисунке 4.

Совершенно очевидно, что приведенный дискриминационный эксперимент не может служить гарантом абсолютного признания универсальности действия энергетических принципов и критериев. Как известно, для подтверждения истинности концепции необходимо множество подтверждающих примеров, а для ее опровержения достаточно одного -дискриминационного. Определенная ценность нашего примера заключается в

том, что он ставил оцениваемые критерии именно в «условия риска быть проваленными». Они «устояли» и в этих условиях.

Если рассматривать связь между энергетическими принципами и принципами развития открытых систем, развиваемыми в неравновесной термодинамике на основе теоремы Пригожина, то мы придем к некоторому несоответствию. На рисунке 5 изображены два возможных случая перехода открытой системы из одного стационарного состояния в другое. Переход характеризуется с точки зрения потока использованного энергетического субстрата и скорости производства энтропии. В интервале tot: - стационарное состояние; интервал tit2 - область неустойчивости, при t>t2 возникает новое стационарное состояние.

В нашем случае при непрерывном культивировании первое стационарное состояние соответствует развитию плазмидсодержащей популяции бактерий. При появлении бесплазмидных вариантов происходит замещение плазмидного штамма бесплазмидным, наступает новое стационарное состояние.

Рис. 5. Изменение потока использованного энергетического субстрата и скорости производства энтропии при переходе от одного стационарного состояния к другому в процессе микроэволюции в открытых биологических системах (схема).

I - В соответствии с основными положениями неравновесной термодинамики (Николис, Пригожик, 1979; Эбелинг и др., 2001)

II - В соответствии с энергетическими принципами развития надорганизменных биологических систем (Печуркин, 1982)

Для открытых систем надорганизменнош уровня справедливыми являются энергетические принципы развития. Количественный анализ микроэволюционных процессов (хемостат, турбидостат) показал, что они подчиняются требованиям, накладываемыми энергетическими принципами. Это означало интенсификацию процессов во всех случаях микроэволюции. На языке термодинамики это означает все более возрастающий уход от равновесия в погоне за все большим использованием потоков энергии, приходящей извне. Неравновесность возрастает, рассеяние возрастает. И потому, при эволюции таких систем не находится места процессам затухания ни энергетических, ни энтропийных процессов. Результаты, полученные по экспериментальной эволюции рекомбииантных штаммов бактерий, требуют дальнейшего развития термодинамической теории открытых биологических систем, дальнейшего изучения общих закономерностей биологического развития.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Показано, что в результате автоселекции при непрерывном культивировании можно получить активные штаммы и сообщества микроорганизмов, использующих токсичные субстраты, двух типов. В хемостате отбираются штаммы с высокой полнотой использования токсичного субстрата до предельно низких концентраций в среде, такие как дрожжи С. tropicalis. При селекции в рН-стате выделены штаммы бактерий Rhodococcus sp с высокой деградирующей способностью, проявляющейся при высоких концентрациях токсичного субстрата фенола в среде.

2. Построена и проанализирована математическая модель автоселекции генноинженерных плазмидсодержащих штаммов бактерий при непрерывном культивировании в турбидостате. Анализ математической модели показывает, чго остаточная концентрация субстрата у популяции бесплазмидного штамма, заместившего исходную плазмидсодержащую популяцию в турбидостате, может и возрастать, и таким образом, классические хемостатные критерии микроэволюции и конкурентоспособности популяций, основанные на снижении остаточной концентрации субстрата или большем наклоне зависимости |i(S) у победившего вида, не являются универсальными и в турбидостате не работают.

3. В экспериментах по автоселекции генноинженерного штамма бактерий Е coli К-12 MG1655, содержащего клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP) в плазмиде pGLO, при культивировании в рН-стате показано, что поток энергетического субстрата, использованного популяцией, возрастает.

4. Результаты проведенных экспериментов и расчетов по математическим моделям подтверждают, чго возрастание потока энергетического субстрата, захваченного популяцией, можно считать общим критерием развития обоих типов открытых биологических систем (в хемостате и в турбидостате).

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Логинов И.А., Брильков А.В. (2004) Математическое моделирование микроэволюции популяций микроорганизмов в открытых биологических системах. Вестник КГУ. Сер. физико-математические науки. 5, 90-98

2. Брильков А.В., Логинов И.А., Морозова Е.В., Печуркин Н.С, (2005) Закономерности микроэволюции микробных популяций в открытых системах. Доклады Академии наук. 404, №5, 690-693.

3. Логинов И.А., Брильков А.В. (2005) Математическое моделирование автоселекции микробных популяций при субстратном ингибировании их роста в непрерывной культуре. Вестник КГУ. Сер. физико-математические науки 1, 44-49

4. Логинов И.А., Брильков А.В., Печуркин Н.С. (2005) Экспериментальное исследование микроэволгоции микробных популяций в двух основных типах открытых биологических систем (хемостат, турбидостат). Международное рабочее совещание «Происхождение и эволюция биосферы», тезисы докладов, Новосибирск, с. 250

5. Логинов И.А. Математическое моделирование популяционной неустойчивости плазмид. В кн.. НКСФ-2000. Сборник тезисов докладов научной конференции студентов физиков. - Красноярск. КГУ, 2000. с.43.

6. I.A.Loginov, A.V.Brilkov. Prospects of using continuous cultivation for rapid selection of microbial strain-destructor of toxic pollutants. In international baikal symposium on microbiology (IBSM-2003) «Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs» Irkutsk-Russia. September 8-13, 2003. p. 85-86.

7. Логинов И.А. Брильков А.В. Математическое и экспериментальное моделирование процессов биологического развития на примере микроэволюции рекомбинантных штаммов бактерий при непрерывном культивировании. III Съезд биофизиков России Тез.Докл Воронеж 2004. с.354.

8. Brilkov А.V., Loginov I.A., Morozova E.V. Pechurkin N.S. Experimental specification of open systems evolution physical principles. In: COSPAR, 19-21 July 2004, Paris (France) - 1 p

9. Логинов И. А. Особенности энергопотребления открытых биологических систем. Сборник материалов 24 региональной научно-технической конференции «Проблемы строительства и архитектуры» Красноярск 2006, с. 255.

10. Логинов И. А. Математическое моделирование гетерогенности популяций, развивающихся в открытых системах. Сборник материалов 25 региональной научно-технической конференции «Проблемы строительства и архитектуры». Красноярск 2007, с. 426.

Подписано в печать 200Вг. Формат 60 х 841/н,-Печать оперативная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 1¡ОЛ

Ошечагаио и ИПК СФУ. 660041 Красноярск, нр Свободный, 79

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Логинов, Иван Александрович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ПОПУЛЯЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ УПРАВЛЯЕМОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕКОМБИ НАНТНЫХ ШТАММОВ

МИКРООРГАНИЗМОВ

1Л. Общие закономерности роста и развития популяций микроорганизмов при управляемом культивировании

1.2. Нестабильность генноинженерных штаммов микроорганизмов, содержащих рекомбинантные плазмиды, при длительном непрерывном культивировании

1.3. Особенности развития открытых биологических систем

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Используемые культуры микроорганизмов

2.2. Методы культивирования

2.3. Питательные среды и их приготовление

2.4. Анализы

2.5. Математическая обработка экспериментальных данных

Глава 3. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ АВТОСЕЛЕКЦИИ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ПРИ НЕПРЕРЫВНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

3.1 Использование непрерывного культивирования для селекции микробных штаммов-деструкторов токсичных поллютантов

3.2 Математическая модель автоселекции генноинженерных штаммов микроорганизмов при непрерывном культивировании 76 3.3. Экспериментальное исследование автоселекции плазмидсодержащего штамма бактерий Е. со/z К

MG1655 при непрерывном культивировании в рН-стате

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности автоселекции популяций микроорганизмов при длительном непрерывном культивировании"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Непрерывное культивирование является аналогом большинства природных ситуаций: хемостат аналогичен ситуациям, где встречается лимитирование роста недостатком питательных веществ, элементов или микроэлементов; турбидостат отвечает условиям максимально возможного роста при ограничении плотности популяции. С точки зрения функционирования открытых систем хемостат и турбидостат -это термодинамические системы, способные находиться в устойчивых стационарных состояниях. Причем, в соответствии с классификацией М.Эйгена, хемостат соответствует случаю постоянных потоков, а турбидостат - случаю постоянной организации (или постоянных реакционных сил). Таким образом, в руках экспериментаторов имеются открытые системы двух основных типов развития и для биологии, и для термодинамики. Если в таких системах происходят эволюционные изменения, переход от одного стационарного состояния к другому в результате изменения качественных свойств систем (например, в результате процессов мутирования и отбора), то главные характеристики этих генетических перестроек в популяциях, или шагов эволюции, можно измерить, не теряя общности подхода с точки зрения, как биологии, так и физики. Одним из ярких и наглядных примеров эволюционных переходов в таких открытых системах является микроэволюционная перестройка популяции плазмидосодержащего штамма бактерий при длительном непрерывном культивировании, где имеет место потеря плазмид клетками и автоселекция бесплазмидного штамма, более активного, чем исходная форма. Используя плазмидсодержащие штаммы бактерий как удобный объект для изучения переходов из одного стационарного состояния в другое в результате микроэволюционных перестроек можно получить существенное дополнение термодинамической теории открытых биологических систем с целью дальнейшего изучения общих закономерностей биологического развития.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является изучение общих закономерностей микроэволюции микробных популяций в открытых системах на примере автоселекции плазмидсодержащих штаммов бактерий и фенолразрушающих микроорганизмов при длительном непрерывном культивировании.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать процесс автоселекции фенолразрушающих микроорганизмов в обоих типах открытых систем при длительном непрерывном культивировании в хемостате и турбидостате (рН-стате).

2. С помощью математической модели проанализировать и сравнить закономерности автоселекции плазмидсодержащих бактерий при непрерывном культивировании при двух режимах: в турбидостате и хемостате.

3. Исследовать в экспериментах процесс автоселекции генноинженерного штамма бактерий E.coli К-12 MG1655, содержащего в составе плазмид клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), при культивировании в рН-стате.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовались методы математического моделирования динамики численности микробных популяций, экспериментальные методы периодического и непрерывного культивирования плазмидсодержащих штаммов бактерий и фенолразрушающих микроорганизмов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Остаточная концентрация субстрата у популяции бесплазмидного штамма, заместившего исходную плазмидсодержащую популяцию в турбидостате возрастает, и таким образом, классический хемостатный критерий микроэволюции и конкурентоспособности популяций, основанный на снижении остаточной концентрации субстрата, не является универсальным и в турбидостате не работает.

2. В экспериментах по автоселекции генноинженерного штамма бактерий E.coli К-12 MG1655, содержащего клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), в рН-стате показано, что в процессе замещения плазмидного штамма бесплазмидным возрастает и остаточная концентрация, и поток энергетического субстрата, использованного популяцией Нисп.

3. Общим критерием микроэволюции микробных популяций в обоих типах открытых биологических систем (в хемостате и в турбидостате) является возрастание потока энергетического субстрата Htlcn, использованного популяцией.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Результаты работы могут быть использованы для прогнозирования динамики генно-инженерных штаммов микроорганизмов, содержащих плазмиды, используемых в биотехнологическом производстве. Основываясь на результатах работы можно оценить устойчивость ожидаемых стационарных состояний в непрерывной культуре микроорганизмов при различных ограничениях их роста, наиболее вероятное их направление и скорости автоселекции бесплазмидных вариантов при длительном культивировании микроорганизмов. Результаты работы целесообразно использовать при интенсификации на основе непрерывных культур микроорганизмов процессов микробиологического производства, очистки сточных вод, при разработке эффективных способов селекции новых штаммов, обладающих ценными свойствами, в частности, повышенной экономичностью использования субстратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на Международном Байкальском Микробиологическом Симпозиуме IBSM-2003 «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2003), на Международном симпозиуме COSPAR-2004 (Франция, Париж), на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на конференции молодых ученых Института биофизики СО РАН (Красноярск 2002), на объединенном семинаре лаб. Экологической биофизики, лаб. Экологической биотехнологии и лаб. УБГ, на семинарах лаборатории УБГ.

ПУБЛИКАЦИИ. Список публикаций включает три статьи в журналах (Доклады РАН, Вестник КГУ, серия физика), три статьи в трудах международных конференций и тезисы на конференциях и биофизическом съезде РАН (Воронеж, 2004).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Логинов, Иван Александрович

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Показано, что в результате автоселекции при непрерывном культивировании можно получить активные штаммы и сообщества микроорганизмов, использующих токсичные субстраты, двух типов. В хемостате отбираются штаммы с высокой полнотой использования токсичного субстрата до предельно низких концентраций в среде, такие как дрожжи С. tropicalis. При селекции в рН-стате выделены штаммы бактерий Rhodococcus sp. с высокой деградирующей способностью, проявляющейся при высоких концентрациях токсичного субстрата фенола в среде.

2. Построена, и проанализирована математическая модель автоселекции генноинженерных плазмидсодержащих штаммов бактерий при непрерывном культивировании в турбидостате. Анализ математической модели показывает, что остаточная концентрация субстрата у популяции бесплазмидного штамма, заместившего исходную плазмидсодержащую популяцию в турбидостате, может и возрастать, и таким образом, классические хемостатные критерии микроэволюции и конкурентоспособности популяций, основанные на снижении остаточной концентрации субстрата или большем наклоне зависимости |i(S) у победившего вида, не являются универсальными и в турбидостате не работают.

3. В экспериментах по автоселекции генноинженерного штамма бактерий E.coli К-12 MG1655, содержащего клонированные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP) в плазмиде pGLO, при культивировании в рН-стате показано, что поток энергетического субстрата, использованного популяцией, возрастает.

4. Результаты проведенных экспериментов и расчетов по математическим моделям подтверждают, что возрастание потока энергетического субстрата, захваченного популяцией, можно считать общим критерием развития обоих типов открытых биологических систем (в хемостате и в турбидостате).

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

X - плотность популяции микроорганизмов Y — экономический коэффициент использования субстрата Yg - истинный" экономический коэффициент

D — удельная скорость протока питательной среды через культиватор Do, к — постоянные коэффициенты в уравнении пропорционального регулятора плотности популяции в турбидостате S — концентрация лимитирующего рост субстрата в культуре S0 — концентрация субстрата подаваемая в культиватор Sqct - остаточная концентрация лимитирующего рост субстрата S - концентрация лимитирующего рост субстрата в точке пересечения зависимостей скоростей роста плазмидной и бесплазмидной популяции микроорганизмов S* - критическая концентрация фенола S3 - энтропия

Нисп - поток энергетического субстрата использованного популяцией

Ks - константа полунасыщения

К; - константа ингибирования

К - предельная емкость среды р, - удельная скорость роста микроорганизмов

М-max — максимальная удельная скорость роста микроорганизмов

X - корни характеристического уравнения g - число генераций tgen — время генерации

GFP — зеленый флуоресцентный белок - величины относятся к плазмидной популяции микроорганизмов ~ - величины относятся к бесплазмидной популяции микроорганизмов ~ - величины относятся к стационарному состоянию

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Логинов И.А., Брильков А.В. (2004) Математическое моделирование микроэволюции популяций микроорганизмов в открытых биологических системах. Вестник КГУ. Сер. физико-математические науки. 5, 90-98

2. Брильков А.В., Логинов И.А., Морозова Е.В., Печуркин Н.С, (2005) Закономерности микроэволюции микробных популяций в открытых система к. Доклады Академии наук. 404, №5, 690-693.

3. Логинов И.А., Брильков А.В. (2005) Математическое моделирование автоселекции микробных популяций при субстратном ингибировании их роста в непрерывной культуре. Вестник КГУ. Сер. физико-математические науки. 1, 44-49

4. Логинов И. А., Брильков А.В., Печуркин Н.С. (2005) Экспериментальное исследование микроэволюции микробных популяций в двух основных типах открытых биологических систем (хемостат, турбидостат). Международное рабочее совещание «Происхождение и эволюция биосферы», тезисы докладов, Новосибирск, с. 250

5. Логинов И.А. Математическое моделирование популяционной неустойчивости плазмид. В кн.: НКСФ-2000. Сборник тезисов докладов научной конференции студентов физиков. - Красноярск: КГУ, 2000. с.43.

6. I.A.Loginov, A.V.Brilkov. Prospects of using continuous cultivation for rapid selection of microbial strain-destructor of toxic pollutants. In international baikal symposium on microbiology (IBSM-2003) «Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs». Irkutsk-Russia. September 8-13, 2003. p. 85-86.

7. Логинов И.А. Брильков А.В. Математическое и экспериментальное моделирование процессов биологического развития на примере микроэволюции рекомбинантных штаммов бактерий при непрерывном культивировании. III Съезд биофизиков России. Тез. Докл. Воронеж 2004. с.354.

8. Brilkov A.V., Loginov I.A., Morozova E.V. Pechurkin N.S. Experimental specification of open systems evolution physical principles. In: COSPAR, 19-21 July 2004, Paris (France). - 1 p

9. Логинов И. А. Особенности энергопотребления открытых биологических систем. Сборник материалов 24 региональной научно-технической конференции «Проблемы строительства и архитектуры». Красноярск 2006, с. 255.

10. Логинов И. А. Математическое моделирование гетерогенности популяций, развивающихся в открытых системах. Сборник материалов 25 региональной научно-технической конференции «Проблемы строительства и архитектуры». Красноярск 2007, с. 426.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Логинов, Иван Александрович, Красноярск

1. Alagappan G and Cowan RM (2001) Biokinetic models for representing the complete inhibition of microbial activity at high substrate concentrations. Biotechnol Bioeng, 75, 393-405.

2. Anderson E.S. (1968) The ecology of transferable drug resistance in the enterobacteria. Ann Rev Microbiol, 22, 131-180.

3. Anderson, R.M. and May, R.M. (1991) Infectious diseases in humans: dynamics and control. Oxford University Press, New York.

4. Awong, J., Bitton, G. and Chaudhry, G.R. (1990) Microcosm for assessing survival of genetically engineered microorganisms in aquatic environments. Appl Environ Microbiol, 56, 977-983.

5. Bailey, J.E., Da Silva, N.A., Peretti, S.W., Seo, J.H. and Srienc, F. (1986) Studies of host-plasmid interactions in recombinant microorganisms. Ann N Y AcadSci, 469, 194-211.

6. Bailey, J.E., Hjortso, M., Lee, S.B. and Srienc, F. (1983) Kinetics of product formation and plasmid segregation in recombinant microbial populations. Annals of the New York Academy of Sciences, 413, 71-87.

7. Bastos AER, Cassidy MB, Trevors JT, Lee H and Rossi A (2001) Introduction of green fluorescent protein gene into phenol-degrading Alcaligenes faecalis cells and their monitoring in phenol-contaminated soil. Appl Microbiol Biotechnol, 56, 255-260

8. Bennett P.M., Richmond M.H. (1978) Plasmids and Their Possible Influence on Bacterial Evolution. Bact Treatise Structure and Function, 6, 1-69.

9. Bentley, W.E., Mirjalili, N., Andersen, D.C., Davis, R.H. and Kompala, D.S. (1990) Plasmid-encoded protein: the principal factor in the metabolic burden associated with recombinant bacteria. Biotechnol Bioeng, 35, 668-81.

10. Boon N, Top EM, Verstraete W and Siciliano SD. (2003) Bioaugmentation as a tool to protect the structure and function af an activated-sludge microbialcommunity against a 3-cloroaniline shock load. Appl Environ Microbio, 69, 15111520.

11. Borighem G, Vereecken J (1981) Model of a chemostat utilizing phenol as inhibitory substrate. Ecol Modelling, 12, 231-243.

12. Brownlie, L., Stephenson, J.R. and Cole, J. A. (1990) Effect of growth rate on plasmid maintenance by Escherichia coli HB101(pAT153). J Gen Microbiol, 136, 2471-80.

13. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W. and Prasher, D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 263, 802-5.

14. Clarke P.H. (1978) Experiments in microbial evolution. Bact. Treatise Structure and Function, 6, 137-218.

15. Davi ML and F Gnudi (1999) Phenolic compounds in surface water. Water Res, 33, 43213-43219.

16. Demma, A. (2001) The Biological Cost of Antibiotic Resistance Plasmids in Natural Populations of Escherichia coli. Biology department. Emory University, Atlanta, p. 62.

17. Der Yang R, Humphrey AE (1975) Dynamic and steady state studies of phenol biodegradation in pure and mixed cultures. Biotechnol Bioeng, 17, 12111235

18. Duetz, W.A. and van Andel, J.G. (1991) Stability of TOL plasmid pWWO in Pseudomonas putida mt-2 under non- selective conditions in continuous culture. J Gen Microbiol, 137, 1369-1374.

19. Dwivedi C.P., ImanakaT., Aiba S. (1982) Instability of Plasmid-Harboring Strains of E.coli in Continuous culturq-Biotechnology and Bioengineering, 24, 1465-1468.

20. Dykhuizen, D.E. and Hartl, D.L. (1983) Selection in chemostats. Microbiol Rev, 47, 150-168.

21. Edwards VH (1970) The influence of high substrate concentrations on microbial kinetics. Biotechnol Bioeng, 12, 679-712.

22. Fieschko J, Humphrey AE (1984) Statistical analysis in the estimation of maintenance and true growth yield coefficients. Biotechnol Bioeng, 26, #4, 394396.

23. Flower R.G. McCinty L., Morteimans K.E. (1979) Spontaneous mutational specifiently of drug resistance plasmid pKMlOl in Escherichia coli. J. BacterioX, 140, 929-937

24. Ganusov V.V., Brilkov A.V. (2002) Estimating the instability parameters of plasmid-bearing cells. I. Chemostat culture. Journal of Theoretical Biology', 219, 193-205.

25. Godwin, D. and Slater, J.H. (1979) The influence of the growth environment on the stability of a drug resistance plasmid in Escherichia coli K12. J Gen Microbiol, 111,201-210.

26. Gottschalk G (1979) Bacterial metabolism. Springer-Verlag, New York.

27. Guzman, L.M., Belin, D., Carson, MJ. and Beckwith, J. (1995) Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. JBacteriol, 177, 4121-4130.

28. Hansen S.R., Hubbell S.P. (1980) Single-nutrient microbial competition: Qualitative agreement between experimental and theoretically forecasted outcomes. Science, 207 #. 4438, 1491-1493.

29. Helling R.B., Kinney Т., Adams J. (1981) The maintenance of plasmid containing organisms in population of E. Coli. J. Gen. Microbiol, 123, 129-141.

30. Herbert D., Elsworth R., Teling R.C. (1956) The continuous culture of bacteria: A theoretical and experimental study. J. Gen. Microbiol, 14, 601-662.

31. Herbert, D., Phipps, P.J. and Tempest, D.W. (1965) The chemostat: design and instrumentation. Lab Pract, 14, 1150-1161.

32. Hill GA, Robinson GW (1975). Substrate inhibition kinetics: Phenol degradation by Pseudomonas putida. Biotechnol Bioeng, 17, 1599-1615.

33. Hsu S.B. Habbell S.P. Waltman P. (1977) A Mathematical theory for single-nutrient competition in continuous culture of microorganisms. SIAMJ. Appl. Math, 32, 366-383.

34. Jensen J (1996). Chlorophenols in the terrestrial environment. Rev. Environ Contam Toxicol, 146, 25-51.

35. Jones GL, Jensen F, Mckay AJ. (1973) Substrate inhibition of the growth of bacterium ncib 8250 by Phenol. J Gen Microbiol, 74, 139-148.

36. Martin GA, Hempfling WPA (1976) A method for the regulation of microbial populations density during continuous culture at high growth rates. Arch Microbiol, 107, 41-47.

37. McAthey P., Kilbey B.J. (1977) Mutation in continuous culture of Schizosaccharomyces pombe. I. Dependence of tht kinetics of mutation accumulation upon the Growth-limitting nutrilite. Mut. Res, 44, 227-234.

38. McClure NC, JC Fry and AJ Weightman (1991) Survival and catabolic activity of natural and genetically engineered bacteria in a laboratory-scale activated sludge unit. Appl Envirion Microbiol 57, 366-373

39. Monod J. (1950) La technique de culture continue. Ann. Inst. Past, 79: 390410.

40. Monod, J. (1949) The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology, 3, 371-394.

41. Monteirol AA, Boaventura RA, Rodrigues AE (2000) Phenol biodegradation by Pseudomonas putida DSM 548 in batch reactor. Biochem Eng J Aug 1, 6 (1), 45-49.

42. Moser H. (1958) The dynamics of bacterial populations maintained in the chemostat. Washington: Carnegie Ins. of Wash, 1-136.

43. Neidhardt, F.C. and Curtiss, R. (1996) Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. ASM Press, Washington, D.C.

44. Nguyen, T.N., Phan, Q.G., Duong, L.P., Bertrand, K.P. and Lenski, R.E. (1989) Effects of carriage and expression of the TnlO tetracycline-resistance operon on the fitness of Escherichia coli K12. Mol Biol Evol, 6, 213-25.

45. Noack, D., Roth, M., Geuther, R., Muller, G., Undisz, K., Hoffmeier, C. and Gaspar, S. (1981) Maintenance and genetic stability of vector plasmids pBR322 and pBR325 in Escherichia coli K12 strains grown in a chemostat. Mol Gen Genet, 184, 121-124.

46. Novick, A. and Szilard, L. (1950) Description of the chemostat. Science, 112,715-718.

47. Papadopoulos, D., Schneider, D., Meier-Eiss, J., Arber, W., Lenski, R.E. and Blot, M. (1999) Genomic evolution during a 10,000-generation experiment with bacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 3807-3812.

48. Parales RE, Bruce NC, Schmid A and Wackett LP (2002) Biodegradation, biotransformation and biocatalysis (B3). Appl Environ Microbiol, 68, 4699-4709.

49. Pawlowsky U, Howell JA, Chi CT (1973) Mixed culture biooxidation of phenol. III. Existence of multiple steady states in continuous culture with wall growth. Biotechnol Bioeng, 15 #5, 905 916.

50. Pirt, S .J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation. Blacbvell Scientific publications, Oxford.

51. Reynolds, M.G. (2000) Compensatory evolution in rifampin-resistant escherichia coli. Genetics, 156, 1471-1481.

52. Rice C.W., Hempfling W.P. (1985) Nutrient-limited continuous culture in the pH-auxostat. Biotechnol. Bioeng, 27, 187-191.

53. Slater J.H., Godwin D. (1980) Microbial adaptation and selection. Con temp. Microb. Ecol., Proc. 2ndIntern.Symp. Coventry.-L. E.a .137-160.

54. Sniegowski, P.D., Gerrish, P.J. and Lenski, R.E. (1997) Evolution of high mutation rates in experimental populations of E.coli. Nature, 387, 703-705.

55. Sobecky, P.A., Schell, M.A., Moran, M.A. and Hodson, R.E. (1992) Adaptation of model genetically engineered microorganisms to lake water: growth rate enhancements and plasmid loss. Appl Environ Microbiol, 58, 3630-3637.

56. Soda S, Ike M, Fujita M (1998) Effects of inoculation of a genetically engineered bacterium on performance and indigenous bacteria of a sequencing batch activated sludge process treating phenol. J Ferment Bioeng, 86, 90-96.

57. Tempest D.W. (1978) Biochemical significance of microbial growth yields: A reassessment? Trends ofBiochem. Sci, 32, 366-383.

58. Tsien, R.Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem, 67, 509-544.

59. Watanabe K, Yamamoto S, Hino S and Harayama S (1998) Population dynamics of phenol-degrading bacteria in activated sludge determined by gyrB-targed PCR. Appl Environ Microbiol, 64, 1203-1209.

60. Watanabe, K., S. Hino, and N. Takahashi (1996) Effect of exogenous phenol-degrading bacteria on performance and ecosystem of activated sludge. J Ferment Bioeng, 82, 291-298.

61. Whiteley, A.S., and M.J. Bailey (2000) Bacterial community structure and physiological state within an industrial phenol bioremediation system. Appl Environ Microbiol, 66, 2400-2407.

62. Wilson, T. and Hastings, J.W. (1998) Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol, 14, 197-230.

63. Wouters, J.T., Driehuis, F.L., Polaczek, P.J., van Oppenraay, M.L. and van Andel, J.G. (1980) Persistence of the pBR 322 plasmid in Escherichia coli К 12 grown in chemostat cultures. Anionic Van Leeuwenhoek, 46, 353-362.

64. Wu T.T. (1978) Experimental evolution in bacteria. CRC Crit. Rev. Microbiol, 6,# 1, 33-51.

65. Абросов H.C., Ковров Б.Г. (1977) Анализ видовой структуры трофического уровня одноклеточных. Новосибирск: Наука. Сибирское отд-ние, 190 с.

66. Абросов Н.С., Ковров Б.Г., Черепанов О.А. (1982) Экологические механизмы сосуществования и видовой регуляции. Новосибирск: Наука. Сибирское отд-ие, 301 с.

67. Берг JI.C. (1977) Труды по теории эволюции. JL: Наука Бейли Ж., Оллис Д. (1989) Основы биохимической инженерии. М.:Мир, 1,692 с.

68. Белокрысенко С.С. (1978) Генетическое изучение ассоциированной с плазмидой высокой частоты мутации к стрептомицинрезистентности у Escherichia coli. Генетика. 14 №1, 145-153.

69. Брилъков А.В., Печуркин Н.С. (1979) Ингибирование роста Candida mycoderma фенолом и автоселекция резистентных форм при непрерывном рН-статном культивировании. Микробиология 48 № 4, 715-719 Брода П. (1982) Плазмиды. М.: Мир, 224с.

70. Бельков В.В. (1983) Нестабильность рекомбинантных молекул. Генетика, ,19, №10, 1575-1581.

71. Вольтерра В. (1976) Математическая теория борьбы за существование. М.: Наука, 286 с.

72. Гаузе Г.Ф. (1934) Экспериментальное исследование борьбы за существование между Paramecium caudatum и Paramecium surelia и Stilonychia mutilis. Зоол. Журнал, 13 №1, 1-17.

73. Глотов Н.В., Животовский J1.A., Хованов Н.В., Хромов-Борисов Н.Н. (1982) Биометрия. Ленинградский гос. Ун-т им А.А. Жданова-JI., 264 с.

74. Гуревич Ю.Л. (1966) О сравнении двух типов систем осуществления плотностатного режима культивирования микроорганизмов. Управляемый биосинтез. АН СССР Сиб. отд-ние Ин-т физртки -М.: Наука, 45-50.

75. Гуревич Ю.Л. (1984) Устойчивость и регуляция размножения в микробных популяциях. Новосибирск: Наука, 1-161.

76. Дарвин Ч. (1952) Происхождение видов путем естественного отбора. М.:Сельхозгиз. 483 с.

77. Дегерменджи А.Г. (1981) Проблема сосуществования взаимодействующих проточных популяций. Смешанные проточные культуры микроорганизмов. Новосибирск, 26-106.

78. Егорова Н.С. (1976) Практикум по микробиологии. Издательство Московского университета, 59 — 64

79. Зотин И.А., Зотин А.А. (1999) Направление, скорость и механизмы прогрессивной эволюции. Термодинамические и экспериментальные основы. М.: Наука,. 320 с.

80. Квитко К.В. (1974) Относительная роль мутаций и отбора в микробных популяциях. Успехи современной генетики. М.: Наука, 101-114.

81. Корниш-Боуден Э (1979) Основы ферментативной кинетики. Мир, Москва

82. Кох А. (1983) Измерение роста. Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1, 462-511.

83. Лисовский Г.М., Сыпневская Э.К., Ян Н.А. (1969) Экспериментальное моделирование автоселекционных процессов в непрерывной культуре микроводорослей. Биология и культивирование микроорганизмов : Докл. конф. Красноярск, 89-92.

84. Максимов В.Н. (1980) Многофакторный эксперимент в биологии. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 280 с.

85. Мейнелл Г. (1976) Бактериальные плазмиды: М.: Мир, 237 с.

86. Миллер Дж. (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир,436 с.

87. Перт С.Дж. (1978) Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1-331.

88. Печуркин Н.С. (1978) Популяционная микробиология. Новосибирск: Наука, 1-207.

89. Печуркин Н.С., Брильков А.В., Марченкова Т.В. (1990) Популяционные аспекты биотехнологии. Новосибирск: Наука, 1-173.

90. Печуркин Н.С., Терсков И.А. (1973) Автоселекционные процессы в непрерывной культуре микроорганизмов. Сиб. отд-ние, Новосибирск, 64 с.

91. Печуркин Н.С., Брильков АВ, Марченкова Т.В. (1990) Популяционные аспекты биотехнологии. Наука Сиб отд-ние, Новосибирск

92. Станиер. (1956) Эволюционная и физиологическая адаптация, или дарвинизм в микробиологии. Адаптация у микроорганизмов. М.: Изд-во иностр. лит., 17-38.

93. Стейниер Р., Эднльберг Э., Ингрем Дж. (1982) Мир микробов. М.:Мир, 1, 320 с.

94. Урбах В.Ю. (1975) Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 295 с.

95. Химмельблау Д. (1973) Анализ процессов статистическими методами. М: Мир, 957 с.

96. Эйген М. (1976) Самоорганизация материи и эволюция биологических макромолекул. М.: Мир,