Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ацидотолерантные факультативно-анаэробные целлюлолитические бактерии, перспективные для использования в биотехнологии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ацидотолерантные факультативно-анаэробные целлюлолитические бактерии, перспективные для использования в биотехнологии"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

На правах рукописи СМИРНОВА Ирина Эмьевна

АВДДОТОЯЕРАНШЫВ ШШЪТА^ШЮ-АНАЭРОБШЕ ЦШМОЛИШЕСШ ЕАКТЕШ1, ШШШИВНЫЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕШОЛОГШ

03.00.U7 - микробиология

^ ^ А *

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата - 1УЭ2

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии АН Республики Казахстан

Научный руководитель: доктор биологических наук

М.Г.САУБШОВА

Официальные оппоненты! доктор биологических наук,

профессор И.Л.ШВЕНОКДЯ

кандидат биологических наук Н.Н.ГАВРЙЛОВА

Ведущая организация; Новосибирский государственный аграрный

университет

Защита состоится 10 апреля 1992 г. в 14 часов на заседании специализированного совета К 008.01.01, при Инс итут© микробиологии и вирусологии АН Республики Казахстан по адресу: 400100, г.Алма-Ата, ул.Кирова, ЮЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии АН Республики Казахстан, ул.Кирова, 103. .

Автореферат разослан п3 " 1992 года.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук

общая ларактерйой'жа работы

Актуальность проблемы. Ориентация сельского хозяйства на интенсивный путь развития обуславливает необходимость более полной утилизации растительной биомассы и разработки малоотходных технологий. Возможность получения из лигноцелталозных отходов растениеводства кормовых продуктов исследуется многими ученыш в различных странах мира. В качестве продуцентов цэллюлолитичес-ких ферментов для биоконверсии лигноцеллшозных отходов наибольшее внимание привлекают грибы рода ТгШюйегта , менее изучены в этом плане бактериальные организмы.

Институтом микробиология и вирусологии АН Республики Казахстан разработан и внедрен способ получения кормовых продуктов из различных целлюлозосодерааадх субстратов путем их твердофазной, ферментации с использованием целлюлолитических бактерий, отличающийся доступностью и не требующий больших затрат энергии (Илялет-динов и др., 1985; Саубэнова, Пузыревская, 1990). Целлюлолитичео-кйе бактерии используются такие _в составе микробиотиков (Гаври-лова и др.,.1990) и способствуют повышению перевариваемоети корма и увеличению продуктивности сельскохозяйственных животных. Возможность практического применения бактерий в этих случаях основана на наличии у них способности существовать и развиваться при аноксии и кислых значениях рН среды (силос, яелудочно-кяиечный тракт животных). Однако, активное накопление биомассы для использования в практике может быть достигнуто лишь при доотупа кислорода, поэтому-для реализации этих разработок предназначены ацидо-толерантныэ факультативно-анаэробные штамш.

Для обеспечения надежности микробиологического производства представляется необходимым наличие генофонда взаимозаменяемых штаммов - продуцентов. Кроме того, успешное практическое использование представителей этой малоизученной группы микроорганизмов 1ребует углубленного исследования их потенциальных воэмояпостей, что в свои очередь может способствовать применении их в других отраслях биотехнологии.

Поскольку деградация целлюлозных субстратов в природных условиях осуществляется в тесном взаимодействии разных микроорганизмов, особый янгорес представляет доследование механипдав их вячимоотнотенрй о нопю упрэаприпя »етабо.тачэокой активность«).

Цадь и задача исследований. Целью настоящей работы было: создание коллекции факультативно-анаэробных, ацидотолерантных бактерий к их природных ассоциаций; отбор наиболее перспективных штаммов для использования в микробиологической промышленности; выявление возиозшостл регуляции их метаболической активности.

В задачу исследований входило:

1. Выделение целлшолитических бактерий и их природных ассоциаций, определение таксономического положения. Изучение физио-лого-бисхимических особенностей бактерий - продуцентов целлюлаз и их спутников.

2. Исследование механизмов их взаимодействия в смешанных культурах.

3. Вшвление возможности регуляции целлюлазной активности моно-и смешанных культур бактерий.

4. Исследование процесса биоконверсии целлюлозосодеркащаго субстрата.

б. Изучение возможности использования целлшолитических бактерий в других отраслях биотехнологии.

Научная новизна. Выделено и изучено 120 новых штаммов бактерий - продуцентов целлюлаз, исследованы трофические связи цел-лзололитпческих бактерий с их спутниками в природных ассоциациях и экспериментально полученных смешанных культурах, изучены пути повшояия их целлшаэной активности.

Показана принципиальная возможность обогащения полученного кормового продукта каротином, витаминами группы В, свободными аминокислотами за счет использования продуцирующих их целлюло-литических бактерий и азотсодержащими компонентами зг счет фиксации молекулярного азота атмосферы бактериями-спутниками.

В условиях непрерывного культивирования выявлена гетерогенность бактериальной деструкции соломы.

Выделенные целлюлолитичеокие бактерии впервые, напши применение в мели орати вно-удо бри тельных целях в рисосеянии.

Практическая значимость. Создана коллекция бактерий, синтв-вярувдих комплекс целлюлолитяческих ферментов, пригодных дом «иоконвероии целлюлозосодержащих отходов растениеводства (пшеничная и рисовая солома, листья, стебли и кочерыжки кукурузы) в кормовые продукты о повышенной по сравнению о исходным с:даем поедаешоиью, перевариваемосгью и литательноотьй. Наличие среди

них активных продуцентов витаминов группы В, каротина, свободных аминокислот, антимикробных веществ по отношению к патогенной флоре желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных позволяет рассматривать эту группу микроорганизмов как потенциальный источник компонентов микробяотиков.

Выделенные целлтолитическиа бактерии нагали применение в такой отрасли сельского хозяйства как рисосеяние. Разработан способ повышения урожайности риса на засоленных почвах с исполъзова-' нием ацидотолерантных, факультативно-анаэробных целлюлолятических бактерий (положительное решение от 29.01.91 по заявке $ 4849792/13). Штамм бактерий Се11и1отопаа бОсз, показавший наилучшие

результаты передан в Институт почвоведения АН Казахстана для использования в практике.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были доложены на Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск, 1587), на 3~ом международном симпозиуме "Непрерывное культивирование в биотехнологии и охрана окружающей среды" (Чехословакия, 19В7), на Всесоюзной конференции "Микробиологические и биотехпологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата, 1990), на Всесоюзном симпозиуме "микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Нрикасппя" (Оренбург, 1391), на Всесоюзной конференции "Биотехнология и биофизика микробных популяций" (Алма-Ата, 1991).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах, получеао одно положительное решение о выдаче авторского свидетельства.

На защиту выносятся положения:

1. Создана коллекция новых штаммов целлилолитическпх бактерий (факультативных анаэробов), которые в силу своих физиолого-биохимических особенностей - ацидотолерантчооти, апатогенности, термотолерантности, способности к синтезу витаминов группы В, каротиноидов, свободннх аминокислот, антимикробных веществ ~ могут быть использованы для твердофазной ферментации лигноцоллю-лозных субстратов о целью получения кормовнх продуктов и пред-отавляют собой генофонд потенциальных промышленных штаммов.

2. Исследован механизм взаимоотношений целлялолитячосних бактерий и их спутников как в природных ассоциациях, так и в экспериментально полученных смешанных культурах иа уровне обдаад

метаболитами и показана возможность повышения их физиологической активности. .

3. Новые штаммы целлюлолитических бактерий могут быть использованы и в других отраслях биотехнологии, в частности, в почвенно-мелиоратавных целях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела, включающего описание объектов исоле~ дований и методики работы, 15 разделов, содержащих результаты экспериментальных исследований автора, заключения, выводов, шока цитированной литературы (144 отечественных к 100 иностранных) и приложения. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 32 рисунка.

эксгддамшшьш часть

обышы И ¿ШОДЫ ШGjЩu.OBAШ'Щ

Объектами исследований слукшщ целлалолитачес;ше бактерии а их природные ассоциации, выделенные из различных природных истачйййзвАлма-Атинской области: разлагающейся древесины хвойнех и лиственных пород, гниющего опада, кишечных трактов и экскрементов насекомых, разрушающих древесину.

Освобождение от сопутствующей микрофлоры проводили методом повторных пересевов на среду с целлюлозой в качестве единственного источника углерода. Использовала жидкую шш агаризованную среду Гетчинсона о фильтровальной бумагой, а также соломенный и хфахмальный агар.

Для изучения систематического положения целлшолитичеоких бактерий и сопутствующих им микроорганизмов готовили препараты для микроокопирозания, которые окрашивали метиленовой синью по Леффлвру, фуксином Нфейфера. Одновременно определяли размеры клеток, образование спор, цист, жгутиков, окрасу по Граму. Б живых препаратах изучали подвижность и характер движения. Ультраструктуру целлюлолитических бактерий и характер их жгутикования исслодовали на электронном микроскопе марки вз -2500 (ЧССР).

Для характеристики физиолого-биохимических признаков целллкь ..олитических бактерий изучали их способность разжижать желатину, . гадролизовать крахмал, восстанавливать нитраты до нитритов, разрушать агар, образовывать индол, сероводород, каталаау, расти на бэзазотисты* средах и усваивать различныз источники углерода

и азота.

Идентификацию и описание бактерий проводила по определителям Берги ( Вегвеу, 1974) и Н,А.Красильникова (1958).

Устойчивость к антибиотикам изучали методом стандартных индикаторных дисков (Ведьмина и др.,1979),

Витамины определяли микробиологическими методами, основанными на учете интенсивности роста нитаминзавиоишх культур микроорганизмов вокруг агаровых блоков испытуемых штаммов или по мутности этих культур с помощью фотозлектроколориметра (Одинцова, 1957; Толысбаев, Бисенбаев, 1276).

Антимикробный спектр действия целшололитических бактерий исследовали методом агаровых блоков (Егоров, 1980) с применением стандартных тест-организмов.

Качественный и количественный анализ свободных аминокислот бактерий проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (ЧССР).

Азотфиксирущую способность исследовали о помощью ацетиленового метода на газовом хроматографе о водородным плазменным детектором (Умаров, 1986).

Общую целлюлолитическую активность определяли методом ь!аи-дельс-Вебера ( Мап<1е1з, ¡¡аЪег, 1969) по гидролизу фильтровальной бумаги Ватман Л I (полоска 1x6 см), объем смеси 1,5 мл. Гидролиз вели I ч при 50°С и рН 6,5 (0,1 Ы ацетатный буфер).

КЩ-азную активность измеряли по образованию редуцирующих Сахаров при действии фермента культуральной иидкости на 1% раогвор N3 -КМЦ (" Зегтт", <ЙТ) в Течение I Ч при 5и°С и рН 6,5 (и,! ),1 ацетатный буфер).

Продукты гидролиза определяли модифицированным методом Кюпо-ди-Нельсона (Клесов и др., 1960), а Такие фвррицианвдннм метопом при 490 юл ( бИове ел а1,, 1581).

За единицу активности принимали такое количество Вермонта, которое образует I мкшль редуцируицих Сахаров за I ми при действии на субстрат а выражали в ед/мл или ед/г.

Кинетические характеристики роста микроорганизмов получалп при периодическом, полунепрерывном я нойрершзнои (рН-отчтиоц я хемоотатном) культивировали. Периодическое и полунепрврыпнэв культивирование осуществляли на качалка* Ш0-20и об/мян), Прй полунепрерывном культивировании проводили замену у/М обиш

культуральной жидкости свежей питательной средой. Для непрерывного культивирования использовали ¡.туи лабораторную установку ЛУ&-2. Рабочий объем ферментера 80-120 мл. Аэрацию среды проводили о помощью магнитной мешалки и продуванием воздуха над поверхностью жидкости. В ходастате осуществляли постоянный приток среды, рост культуры лимитировали субстратом. В рН-стате обеспечивалось постоянство рН среды и плотности популяций микроорганизмов путем регулирования скорости разбавления среды.

Биомассу микроорганизмов контролировали нефелометрически на йЭКе 56 Ы и выракали в единицах оптической плотности (ота.ед.ОП) или пересчитывали по калибровочной кривой на вес сухой биомассы в 100 мл среды (г/100 мл) и весовым методом после высушивания навески до абсолютно сухого веса. О росте судили также по результатам подсчета числа клеток после разведения суспензии микроорганизмов под мпкроскопо;.; в камере Горя ева-Тома и нутом подсчета колоний на агариэоваяных средах.

для изучения удельной скорости роста (у^ тах ) микроорганизмов использовала метод острых опытов (Иерусалимский, Неронова, 1965; Сахарова, 1970).

Твердофазную ферментацию .целяшюзосодержавдх субстратов (рисовал, пшеничная солома, люцерна, сухие отрйгг?.» листья, стержни кукурузы) проводили по типу силосования с использованием выделенных целлюлолитичёских бактерий. Измельченное сырье смачивали водой до конечной влажности 60-65$ и смешивала о суспензией цел-лгаолатических бактерий Ц*МЭ клеток в 1 мл) йз расчета 10 мл суспензии на 0,7 кг сырья. Массу тщательно утрамбовывали, герметично укупоривали и хранили в течение 30 суток и более. Качество полученного продукта оценивала по биохимическим и органолептичас-квм показателям Цукашик, Тащшшн, 1368), 0 степени деструкция целлкиозы в грубых кормах в процессе ¡твердофазной ферментации судила со изменению содержания целлюлозы я сетиеллтоа (Оболенская И др.,1866; Шарков и др.,1976).

Редуцирующие вещества.в силосной вытяжке определяли по методу Бертрана (Дроздов, Матерайская, 1970).

Величину рН замеряли на электронном "изномере И-130.

Микробиологический анализ силоса проводами путем подсчета численности различных физиологических групп микроорганизмов на ; специфических средах.

резулы'аш исследований и их обсувдние

Выделение и характеристика целлюлолитических бактерий

Выделение цеялшозоразрушающих микроорганизмов проводили из различных источников в Алма-Атинской области. В результате проведенной работы создана коллекция целлюлолитических бактерий, вклю-чакщая более 120 штаммов различной таксономической принадлежности и природных микробных ассоциаций целшололитических бактерий. Для детального изучения было отобрано 20 штаммов, обладающих наиболее высокой целлюлолатической активностью, о чем судили по скорости и степени деградаций фильтровальной бумаги, взятой в качестве единственного источника углерода. Клетки выделенных бактерий имеют различную, в преобладающем большинстве, палочковидную форму разной величины, часто характеризуются выраженным полиморфизмом (о возрастом приобретают кокковидную или иную форму). Подвижные спороносные и неопороносные грамлоложительные клетки легко обесцвечиваются. Морфология клеток сильно зависит от состава питательной среды, возраста культуры, температуры выращивания. Большинство ввделенных бактерий - факультативные анаэробы. Хорошо растут при температуре 16-40°С. Споровые бактерии выдерживают нагревание при 80°С в течение 15 мин. Большинство культур хорошо растет при нейтральном и кислом эначешшх рН. Все культуры развиваются на минеральных средах, где в качестве единственного источника углерода использована целлюлоза (фильтровальная бумага, На -Ki/Щ, солома).

Из собранной коллекции кулыур целлюлолитических бактерий для детального изучения были отобраны три штамма факультативных анаэробов, обладающих следующими свойствами способностью к росту на среде о целлюлозой при низких значениях рИ среды, высокой скоростью синтеза микробной масоы, синтезом целлюлаз и гемицеллюлаз -для прямой биоконверсии лигноцеллшозных оуботратов, комплексом целлюлаз с высокой активноотыо, термостабильностью и прочной адсорбпией аа целлюлозе, отсутствием патогаиноста и токсичности. .

Два ИЗ них относятся к роду Cellulотстав ((J.toaïoten 150 ВА," C.effusa 60 СЗ ) И ОДИН К РОДУ Bacillus (B.eytaseus 21(2) аз ). Отоугствие патогвнности и гоксячнооти установлено в Казахском филиале института Питания АШ СССР. Шгаммы депонированы во

Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики.

Поскольку выделенные целлюяолитические бактерии могут быть иопользованы в кормопроизводстве, представлялось актуальный изучение их способности к синтезу витаминов группы Б и выделению свободных внеклеточных аминокислот.

Все три штамма продуцируют тиамин (Bj) и никотиновую кислоту (РР), c.biaaotea 150, кроме того пантотеновую кислоту <Bg), а B.cytaseus 21 синтезирует пиридоксин (В6). До определении способности чистых культур целлвдплитических бактерий экскретировать свободные аминокислоты в жультуральную жидкость было показано, что превалирующими являются: аспарашновая кислота, треонин, серии, глутаминоваякислота, глицин, аланин и феналаланин, сумма которых составляет, примерно, 60$ от суммы всех аминокислот. Качественный и количественный состав колеблемся в зависимости от видовой принадлежности штаммов дашяояйжичбоких йактарий и от . используемого субстрата. Наибольшее накопление свободных аминокислот как в качественном, так и в количественном отношении отмечается на средах, где источником углерода и энергии сдужит солома. Минимальное значение этого показателя отмечено на средах с Ка-КМЦ. На состав внеклеточных аминокислот зз гчачительной степени влияет видовая принадлежность бактерий. Оба штамма рода ceiiu-lomonaa имеют одинаковый качественный набор аминокислот, который резко отличается от такового у в.cytaseua . Так, если штаммы рода Ceilulomones на среде с глюкозой экскретаровали 8 свободных аминокислот (аспарагиновая кислота, треонин, серии, глутами-новая кислота, глицин, аланин, фенилаланин и гистидин), то в. cytaaeus 21 только три (аспарайшовая кислота, гистидин, аргинин). Аналогичная закономерность в накоплении свободных аминокислот прослеживаетсяв вариантах о другими источниками углерода.

Такимобразом, показана способность чистых культур целлюло-литических бактерий к биосинтезу штатное группы В и экскреции свободных вноклеточнызс аминокислот. При использовании этих штаммов для биоконверсии целлюлозооодерсшдего сырья возможно обогащение корило во го продукта не только фраютаями легкогидролизуемнх полисахаридов, но и другими полезными компонентами, в частности, витаминами-группы В и аминокислотами.

Применение целлшолитичрских с5актерай для биоконверсии лигноцедталоаных отходов о последушш получением кормовых продуктов способствует их массированному введению в желудочно-

кишечный траки сельскохозяйственных зпавотаых и потому необходимо иметь представление о характере их взаимоотношений как с полезной, так и патогенной микрофлорой. Поэтому представляет интерео изучение антагонистических овойств исследуемых штаммов целлхшо-литических бактерий, В качестве тест-культур была использованы 26 организмов, включающих граыпо ложи тельные и грамогряцатолыше бактерии (модели гнилостных и болезнетворных бактерий), дрожжевые организмы, а также актиномицэты и плесневые грибы, Показано, что цедлюлолитические бактерии угнетают рост ряда бактерий и дрожжей. Они антагонистически действуют на гнилостные бактерия, такие как в.зиъииз, в.шуоохаеа , а таете на ряд бактерий, являнцихся моделью возбудителей пневмонии, стафилококкового сепсиса, сибирской язвы и других заболеваний, Нааболеэ широк антимикробный спектр действия у в.сугавеиз 21, Отмечено, что изучаемые штаммы являются антагонистами дрожжей СашИйа пгъюапэ, вызыватацнх тяжелые системные заболевания, а, что важно, нэ угнетают рост и развитие молочнокислых бактерий, являшшхся нэ только основными представителями полезной микрофлоры животных, но и используемых наряду с целлюдолитическима бактериями в процессе биоконверсии лигноцеллюлозиого сырья.

При изучении чувствительности а устойчивости целлшолита-ческих бактерий к антибиотикам было показано, что оба шташа рода Се11и1о1ло'паа устойчивы к пенициллину а мономицину, а с. Маис^еа 150 также к тетрациклину и олеандомицпну, в.су1аяеия устойчив к пенициллину. Остальные антибиотики характеризуются высокой и средней степенью воздействия на цзллюлолитичеокие бактерии.

Биодеградация целлюлозы целдюлолитическими

бактериями на средах с различным источником азота

Целлюлолитические бактерии уоваивают различные источники азота, но интенсивность процесса биоконверсии при этом значка тельно варьирует. Из данных табл.1 шдно, что вое штаммы активно разрушают целшяозу на средах с иитратдай формой изо та, сернокислым аммонием и пептоном. Наиболее высокая активность гидролиза целлюлозы (7У,Б*-06,й5?ь) у штамдов рода с«11и1стоппя отмечена на средах о 1»аШэ и ' (ПН'4);1зо4 ' . У в.оу4паеио 21 максимальную деградацию наблюдали иа средах о органическими

тг

Таблица I

Влияние источников азота аа биодеградацшо целлюлозы целлюлолитическими бактериями

Источник!СодержаниеI Гидролиз целлюлозы. %_

азота |в среде,% | с>а11цва 60 | с.Маио1;еа 150 { В.сугавеиа 21

ИаН03 0,1 22,2 15,3 30,6

0,25 78,3 86,05 72,8

0.5 69,5 70,7 60,05

НаК02 од 43,4 53,4 10,5

0,25 54,3 51,3 13,7

0,5 43,4 51,9 9,07

(нн4)2зо4 0,1 27,9 13,7 27,4

П.2Б — у — - 79.8 83.6 68,9

0,5 60,6 72,4 58,5

ЯН4С1 ОД 28,95 34,1 15,2

0,25 18,4 26,5 17,5

0,5 0 29,2 14,3

Пептон ОД 60,2 66,2 40,5

0,25 77,9 69,0 . 88,4

0,5 80,6 • 83,5 89,6

Мочевина 0,1 72,8 69,7 79,2

Алания 0,1 5 60Д. 56,5 57,5

Тирозин 0,1 53,7. '- 23,6 43,1

Лизин 0,1 54,5 ' 23,7. 58,4

Лейцин 0,1 65,3 25,6 21,1

Триптофан 0,1 56,4 26,4 22,6

источниками ааота - пептоном и мочевиной (89,6$ и 79,255), хотя при ассимиляции нитратной формы азота и сульфата аммония гидролиз целлюлозы был достаточно высоким. Хлорид аммония оказывал угаетащее действие на все штаммы целлюло^тических бактерий. Аминокислоты ассимилируются избирательно. Лейцин и тригтофан усваивается С.Магогеа 150 а в.сугааеиа 21 очень ПЛОХО, чего нельзя сказать о С.е/Хиеа 60. При выращивании на средах о ала-¡шном все культуры развиваются хорошо и при этом наблюдается

энергичная деградация целлюлозы.

Твердофазная ферментация растительного сырья по типу силосования

Ежегодно больше количество растительного сырья теряется з виде отходов пищевой, бумажной промышленности и сельскохозяйственного производства. В то же время они с успехом дагут использоваться как сырье для получения полноценного корма для скота. Наибольший интерес в качестве сырья для получения кормов представляет солома злаковых культур (пшеницы, риса, ячменя,овса).

Исходным сырьем для приготовления корма в наших экспериментах служила солома пшеницы, ряса, сухие стебли, листья и стержни кукурузы, люцерна. В качестве заквасок попользовали различные штаммы целтшиюлятических бактерий, выделенные нами. Данные по твердофазной ферментации по типу силосования пшеничной соломы представлены в табл.2. Результаты анализа полученного корма показали, что все образцы характеризуются высокими биохимическими а органолептагаескима показателями, оптимальной кислотностью и различной структурой. Наибольшее расщепление целлюлозы и накопление молочной кислоты (табл.2) отмечено при использовании Ъ. cytaseus 21.

Кормовой продукт, полученный путем твердофазной «ориентации рисовой соломы, также отличается высокими <5иохпмичеокш.ш и ор-ганолептическивд показателями. В вариантах с целлшолатичоот.!« бактериями тт.8, шт.21, шт.60, ure.ISU по сравнении о контроля!,* заметно увеличивается содержание молочной кислоты. Количество целлюлозы уменьшается на одну треть. Все это приводит к сумезсг— венному размягчению структуры соломы.

Силосование высокобелковых кормовых раотоаий (л:оцернп, вак«, клевер и др.) связано с большими трудностями, lipu силосования таких кормов происходит потеря питатвльнта веществ, которые из-за высокой влажности силоса вытекают те о га о соком. Поэтому их коноервирование целесообразно проводить в сыеои о оухш.ш субстрата»®,в частности, соломой. В нашем эксперименте исио-Изовиш пшеничную солому и люцерну в соотношении Iii. для силосотния использовали различимо штаммы целлшолитичеоких бшггорлР. )1ш-лучыйй вариант силоса был получен о пряменением B.cytft«»mi 2i в качестве закваски. При этом отмечали максимально«? цакопл<:!:по

■ . Таблица 2 Биохимические и органолептикеокне показатели силоса из пшеничной соломы

Показатели! Спон-!Конт4- Экспэвименталъннй силоо

!ное~ i|шт.з[шт.4|шт.7|шт.е|шт.20|шт.21|шт.60]шт.150

!бро- ! 22 j 1 1 1 1 i ! ! _!жение! ! 1 11 1 1 I !

рН 5,6 5,3 5,2 5,3 5,2 5,0 5,3 5,0 5,1 5,0

I 0,04 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 0,02 0,01 0,02 0,02

Свободные органические кислоты,%

молочная 0,41 0,88 0,76 0,81 0,72 1,02 0,98 1,07 0,98 1,05

уксусная 0,86 0,38 0,36 0,29 0,37 0,24 0,30 0,24 0,26 0,28

масляная 0,34 0,28 0,12 О,IS 0,210,110,0-9 O.IO 0.07 0.07

Связанные -

органические

кислоты,%

уксусная- 0,62 0,86 0,82 0,71 0,78 0,54 0,56 0,66 0,52 0,43

масляная 0,40 0,28 0,20 0,31 0,21 0,30 0,17 О 0 0,20

Сумма . ■

органических 1

кислот 2,43 2,80 2,26 2,31 2,50 2,21 2,10 2,07 1,83 2,03

Гемицеллю-

лозы,;:з 32,8 25,7 22,6 23,8 21,4 20,6 21,2 19,2 20,0 19,8 Целлзаяоэа,

% 42,2 23,4 26,5 28,2 27,4 25,6 26,1 24,4 25,1 25,0 Влажность,

% 56,7 60,2 59,9 59,4 .57,6 61,3 60,4 61,5 59,8 60,7

Редуцирую- • ..''"■.

шие вещества, % 0,01 0,21 0,17 0,23 0,21 0,24 0,23 0,25 0,23 0,23

Балах рез- квашеных овощей кий

уксус- ук-нояио- сус-лШ ный

Структура жесткая размягчена значительно

размягчена

молочной кислоты (1,25$), отсутствие масляной кислоты как свободной, так и связанной. Деградация целлюлозы и гемицеллюлоз на 24,455 и 20,0$ превышала таковую в контроле. Полученный кормовой продукт характеризуется и высокими оргаволептичвскиш показателями: запахом квашеных овощей и хлебной опары, размягченной структурой.

Частицы люцерны полностью сохраняют выраженную структуру и обладают немаяущей консистенцией, цвет их был темно-зеленый ила зеленый.

После уборки кукурузы на зерно остаются сухие листья, стебли и стержни, которые практически нигде не используются. Нами изучена возможность повышения кормовой ценности кукурузного сырья путем его силосования о применением целлшолитических бактерий С.МаяоЪеа И МОЛОЧНОКИСЛЫХ 1ас1;оЬга(^ог:!.ит реп1-.оасе1;1сит В(б)~23 (ШЛБ), а также их смеси (1:1). В качестве контроля использовали кукурузное сырье без инокуляции бактериями (спонтанной брожение).

Таблица 3

Биохимические показатели силоса из сухих кукурузных стеблей, листьев и кочерыжек

Показатели ¡Контроль[ Экспериментальный силос

! ! ПМБ ! ит.150 I 1 шт,150 + ]

рН 4,8 4,5 4,7 4,6

Аммиак, % 0,03 0,01 0,01 0,01

Свободные

органические

кислоты,%

молочная 0,43 0,85 1,20 0,73

уксусная 0,60 ■ 0,58 0,45 0,51

,масляная 0,40 0,20 0 . 0

Связанные

органические •

кислоты,%

уксусная 0,63 0,92 0,7о . 0,86

масляная 0,31 0,10 0 0

Сумма кислот 2,37 2,65 2,33 2,10

Целлюлоза,;? 29,7 28,9 23,8 24,6

Гомицелжь 24,64 . 23,7 19,6 19,8

лозы, %

Редуцирукаде вещества,^ 0,18 0,18 0,25 0,2

Как видно из табл.3, кукурузное сырье хорошо консервируется. Значение рН 4,5-4,7 соответствует таковому силоса хорошего качества. Наибольшее накопление молочной кислоты было отмечено в варианте со штаммам С.Магогеа 150, В процессе ферментации в варианте с целлюлола тическими бактериями происходит деградация целлюлозы и гешцеллшоз. Количество этих полисахаридов уменьшилось соответственно на 19,8 и 20,4$ по сравнению о контролем. Цвет опытных вариантов силоса.из кукурузного сырья был светло-коричневым о приятным фруктовым запахом, ила запахом квашеных овощей, в контроле запах резко уксусно-кислый.

Биодеструкция соломы целлшолитическими бактериями в почве и влияние их на почвенные процессы

Известног что в мелиоративно-удобрительных целях практикуется запашка соломы в почву. Эффективность этого приема значительно возрастает цри предварительной бактеризации ее молочнокислыми бактериями (Нелидов и др.,1983, 196а), Однако, молочнокислые бактерии не обладают целлюлазной активностью и их развитие ограничено наличием свободных Сахаров, содержание в ооломе которых не превышает 0,5-0,3$. Поэтому о целью разработки способа регуляции биодеструкции солош в затопляемых почвах совместно с Институтом почвоведения АН Казахстана (С.Н.Нелидов) была научена возможность использования культур целлвдо» литгчеоких бактерий, предназначенных для твердофазной ферментации лигноцеллыяоэных субстратов.

Показано, что мелиоративный аффект инокуядрованной соломы появился в усилении минерализации почванаих растворов а в транзитом выносе токсичных зоной из пахотного горизонта, в результате чего снижается рН засоленных почв, теи самым, увеличивается вшиваемо с л проростков риса. Так, прибавка урожая риса при обработке штаммом в.суЪавеив 21 составила 66,0$, при инокуляции с.в!гиаа 60 - 56,6%, в случав запашки Необработанной соломи прибавка составила 30,1$.

Исследование целлвдазной активности бактерии

В литературе достаточно хорошо освещены вопроси синчадз П.к'них ц»1>; та?, менее изучены в этом плане бактириолышз

организмы. При исследовании динамики синтеза внеклеточных цвллкъ лаз в процессе роста культур установлено, что максимальный уровень активности ферментов у обоях штаммов СеПи1отопаз приходится на 18 ч, а у в.су*ааеиа 21 - на 21 ч культивирования, то есть после достижения культурами стационарной фазы роста (рис.1).

Рис.1. Общая целлюлаэная активность в динамике роста

бактерий. I - C.eifuaa 60; 2 - C.bia*otea ISO; 3 - B.oytaaeus 21«

Изучение зависимости целлалазной активности о; зна^эний рН среды и температуры показало, что максимальная актзвность у обоих штаммов Celiuiomonas i:появляется при значениях pit 7,0 и температуре 45°С, а у в, cytaseug - при рН 6,5 и температуре 50°С. При исследовании влияния источников углерода и азота на биосинтез целлюлаз наиболее интенсивный синтез ферггнтов был оплечен на средах с лшеныной соломой, отрубями ц свеклов-чнш жомом. Так, для штаммов c.effusa 60 и с. biazo-tea 150 максимальаое значение ■ общей целлюлазной активности наблюдала на сгедах о пвлнпчной соломой, тогда как у B.cyteseus 21 на среде с шеничнм отрубади. Из источников азота лучшими для: биосинтеза целлвлаз являются азотнокислые соли натрия я калия, несколько хуке сернокислый аммоний. Наибольшее положительное влияние на целлюлазяую активность из источников фосфора .оказывал одно замещений ^сс^.т катая.

Методом ортогональных датиноких прямоугольников оптимизировали среду для культивирования бактерий и повышения активности синтеза ферментов. В результате была подобрана среда следующего состава (г/л): НаИОд - 2,5; К^НОд - 1,0; 1%Э04 - 0,3; НаС1 -0,4; Реса^ 0,01; кукурузник экстракт - 2%, пшеничная солома -20, вода водопроводная - I л.

При промышленном получении практически важных гидролаз используют субстраты, содержащие специфические индукторы данных ферментов. Так, в производстве целяюлолитических ферментов применяют целлюлозосодержащео сырье - солому, отруби и др. Наш была установлена способность бактерий продуцировать комплекс цеяшшго-литических ферментов на среде, не содержащей специфического субстрата - целлюлозу. В качества неспецифического индуктора использовали лактозу. Отмечено два пика повышения целлюлазной активности: 1-й пик.чер'аз 4Й ч, посла достижения стационарной фазц роста и 2-ой вик - на ? сутки, то есть в фазу замедления скорости роста. Второй пик активности был значительно выше первого и составлял 4,76 ед/мл,

Гетерогенность процесса бактериальной деструкции соломы

Кинетику роста цедатлолатяческих бактерий с.еггива 60 последовали в условиях непрерывного культивирования в режиме рН ста-та на среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии пшеничную солому. Показано, что из-за гетерогенности химической

структуры субстрата его биодесгрукция идет попеременно о подщела-чяванием или подкисленаем культурадьной жидкости,-На рио.2 видно, что начальный период культивирования бактерии характеризуется актиинш ростом при скорости протока 0,3 рЦ-ста? работает по полделачиванию среды культурой, в ферментере поддерживается рН 5,8. мере увеличения периода культивирования и изменения направленности метаболизма бактерий скорость протока снижается и чеоез 5 ч подтитровка средой прекращается, рН в ферментере за ' 20 мин снижается до 5,6 и в дальнейшем процесс идет при подтит-ровке орвдоИ с рН 6,7. Скорость протока постепенно повышается и к 7 ч к)льтивпро&9Нйя достигает 0,19 через 8 ч она вновь гччштот сниматься я к 9ч 25 мин равна кула. Ьнзчекое рН в фер-. '.•■-•ИТ'ПОШП'КП гея т 3& мин до начального (5,8) и начинается

вновь подтитровка средой о более низкиы рН. Процесс происходит о меньшей скоростью роста гаах = 0,17 ч"*1). Далее процесо повторяется как описано выше, йо колебания происходят с меньшей амплитудой (по скорости роста), периодичность при этом учащается. Через 24 ч процесс деструкции исходной порции соломы можно считать законченным. Такой характер утилизации соломы объясняется химической структурой молекулы целлюлозы как первичного поливалентного спирта.

Рис.2* Кинетика роста целлюлолитических бактерий на среде с соломой в условиях рН-статяого культивирования

Некоторые аспекты симбиотического взаимоотношения целлюлолитических бактерий с бактериями - спутниками

В наших исследованиях при длительном тассажироваши целлюлолитических культур на элагтивной средо Сыт получены стойкие мийробные ассициахдаи, состоящие.из чистых кулыур целлкиолити-чеоких бактерий и бактерий-спутников. На кшйдую чистую культуру целлюлолитических бактерий приходится 2-й спутника. Гак правило, сопутствующие бактерии представлены подвихни,и сшрооора^укь щими а яеспорообразуадиш палочками. Установлено, что изучаемк'А симбиоз не является облигатным и все монокультуры орут существовать автономно. Сопутствующая микрофлора по сгоим культураль-ным и морфологическим. признакам была отнесена основном к ро~

дам Bacterium, Pseudompnas и Bacillus,

Показано, что природные ассоциации гораздо интенсивнее деградируют целлюлогу, чем чистые культуры. Биосинтез целявдаз у них возрастает в среднем в 1,5-2 раза по сравнению о чистыми icy ль ту рами целлюлодатических бактерий, накопление биомассы увеличивается на 50-7О/о. Такое положительное влияние бактерий-спутников объясняется не только взаимоотношениями на трофическом уровне (целлюлолнтические бактерии поставляют источник углерода и энергии для бактерий спутников), но и взаимодействием на уровне обмене биологически активными веществами (витаминами группы В, аминокислотами).

Показано, что внутри природной микробной ассоциации как целлюлолитическае бактерии, так и их спутники осуществляют синтез витаминов группы В. Причем этот синтез является взаимовыгодным, так как поставляет необходимые аесиатезируемна витамины как тем, так и другим членам консорциума (табл.4).

Таблица 4

Синтез витаминов группы В целлюлолжтическими бактериями и бактериями-спутниками, мкг/г АСБ

Ъ1аво-{ Бактерии! п. effu-i Бактерии! в.суъа-!Бактерии а 150 {спутники! sa, 60 —- nt

Витамины

С.

tea

Тлашн iij

Пантотгцовая кислота Вд

Никотиновая кислота РР

Ш.ридоксин В6

Био гин В7

Инозит йg

Кооалш,1"н Ь12

I спутники, I } еТМаго-; 4 tea 150 !

{спутники оeua 211 спутники

jo.effu- J iB.oyta-

tea 60 !_t в?ив 21 ,

15,2

19,8

Л70.4 14,e

0 0 0

18,4 12,4 22,6

0 0

12,6 1,96 1,50 0

. О

168,6 О О О О

9,1 28,9

46,2 О

21,4 2,66 2,34 О

О

236,0 О

о о о

43,8 О

36,7 3,94 3,26 0,2О

гежду целлюлолитическими бактериями й их спутниками внутри природной ассоциации существует активное взаимодействие на уровне обмеиа аминокислотами. Отмечено, что целлклолитяческие бактерии в процессе развития веделяют в ореду аминокислоты, которые интенсивно литребляюгоя опытниками. Так, при культивировании на ср 'До о Иь -КЛЦ C.effuea 60 экскретирует 9 аминокислот (трео-

2Г

нин, серин, глуташшовая кислота, пролин, глицин, алании, валин, фенилаланин, гистидии, аргинин), природная ассоциация только три - глутаминовая кислота, гистидин и лизин. Тем самым снимаотся эффект рэтроингибирования при разложении клетчатки л бактерии-спутники получают необходимые для своего развития готовые аминокислоты.

Установлено, что сами бактерии-спутники обладают способностью фиксировать азот атмосферы и снабжать партнеров по ассоциации дополнительным азотом. Уровень азотфиксации бактерий-спутников сильно варьирует. При этом следует подчеркнуть, что у всех изученных природных ассоциаций активность азотфиксации бнла-зна~ чительно выше, чем у чистых культур бак-ерий-спутников. Максимальную азотфиксации отмечали у природной ассоциации в.оу-Ьавеиа 21 (35,8*Ю-5 мги2 /мл ореды/ч),

Автоселекция природной микробной ассоциации целлюлоли-тнческих бактерий в'условиях непрерывного культивирования

С целью изучения возможности управления ростом я целлюлаз-яой активностью природной микробной ассоциации провели ее автоселекцию в условиях хемостата при разных скоростях протока (0,03-0,3 ч-1). На рис.3 видно, что в условиях проточного культивирования максимальная удельная скорость роста составляет ОД ч*"1. Режим хемостата с лимитированием роста по углероду (по-КМЦ) наблюдала щи скоростях протока 0,03-0,1 ч"1. концентрация Ка -КМЦ не ламитиповала рост бактерий при скоросм протока 0,150,30 ч-1 и популяция не вымывалась. Высев бактерий иэ культуры, находящейся в стационарном состоянии (прй каждой изучаемой скорости протока среды), а дальнейшее культивирование в периодических условиях показало, что культура,выделенная из ферментера при скорости протока равной 0,30 ч-*, имела максимальную целлгаоля-тическую активность! которая в три. раза йрзвшала таковую исходной культура.

Отселеквдонированну» ассоциаций бактерий сравнивали с исходной яо накоплению биомасса в периодических условиях. На рйс.4 хорошо видно, что исходная ассоциаций бактерий переходит ч гта-ционарную фазу роста после 20 ч культивирования, биошсса при это« равна 0,42 ед.ОП, в то время как от^йлекционироваш'оя Достигает фазы стационарного роста к 27 ч культгвароваяия при плотности популяций 0,55 ед.ОЕ.

0.2 0.3

Скорость пйотош,час"1

Рис.3. Рост природной ассоциации целлюлолитичеоких бактерий в хемоотате при различных скоростях протока: I — биомасса} 2 - остаточная концентрация На -КМЦ.

24 36 48 60 Ьремя,чосы

Рис.4. >-001 исходной С1) И отоаяекодонирс ванной (2) ь^еоциадий целлшола тнч ее ких бактерий при Периодическом культавйройаяии,

Целлюлозосодержащий субстрат утилизируется отселекциояиро-ванной культурой более полно. Так, при начальной концентрации этого субстрата 3 г/л, остаточная концентрация На -К1.Щ составляла 0,2 г/л, против 0,6 г/л у исходной ассоциации. Однако, повышение активности целлюлазного комплекса не было закреплено наследственно и при дальнейшем культивировании природной ассоциации в периодических условиях показатель активности снижался до исходного.

ВЫВОДЫ

1. Создана колиекция факультативно-анаэробных ацидотолерант^ ных целлшолитических бактерий рода bacillus и Cellulomonas

и их природных ассоциаций, являющаяся генофондом для промышленного производства биомасс, используемых в качестве заквасок при биоконверсии отходов растениеводства в кормовые продукты, а также в составе микробиотиков.

2. Показана возможность обогащения кормовых продуктов, получаемых твердофазной ферментацией целлкдозосодержашх субстратов, аминокислотами, витаминами и другими биологически активными веществами путем использования в качестве заквасок синтезирующих

их целлшолитических бактерий.

3. Выявлена способность бактерии-спутников рода Bnciuus, Pseudomonas, Bacterium к фиксации молекулярного азота атмосферы, что может быть основой получения кормового продукт, обогащенного протеином.

4. Исследован целлюлазный комплекс бактерий л выявлены условия повышения их ферментативной активности.

5. Установлена положительная роль целлюлолитичоских бактерий в повышении мелиоративно-удобрительного действия соломы, запахиваемой под культуру риса. Отобран штамм Cellulomonas effuea CO cs , способствующий повышению урожайности риса на 56,6%.

6. Исследован процесо биоконверсии пшеничной соломы целлю-лолитически;.л бактериями ъ условиях непрерывного культивирования и выявлена его гетерогенность.

7. Изучен механизм взаимодействия целлюлолитических бактерий и их спутников на трофическом уровне и показан", что в с скове их симбиоза наряду с утилизацией продуктов деградации целлюлозы лежит также обмен биологически активными веществам®, такими как витамины группы В и аминокислоты.

8. Показана возможность повышения активности потребления субстратов, скорости накопления биомассы и целлшазной активности природной микробной ассоциации путем автоселекцаи ее в условиях непрерывного культивирования.

список работ, онубликовашшх 110 тйш диссертации

1. Саубенова М.Г., Иузыревская O.U.,'Смирнова И.Э. Гетерогенность процесса бактериальной деструкции соломы // Биофизика микробных популяций: Тез.докл.Всесоюзн.конф, 30 сент.-2 okt.I9ö7.~ Красноярск, 1937.-С.50.

2. Иузыревская Ü.M., Саубенова М.Г., Смирнова И.З., ¡Духана» диева i.i.C., Мамонова 1.0. Автоселекция бактерий на целлюлозосодержащем субстрате // Непрерывное культивирование в биотехнологии и охрана окружающей среды: Гез.докл. 9-го Межд. симп. 9-12 июня, 1937. Прага (ЧССР),130?.

3. Саубенова М.Г., Иузыревская О.Ы., Смирнова И.Э. Автосе-лекцил целлюлолитических бактерий в условиях непрерывного культивирования // Естественная и индуцированная изменчивость микроор-ганизыов.-Алма-Ата: Наука, I988.-C.7-II.

4. Саубенова Ы.Г., Хмелевская Л.К., Конуспаева К.Ш., Смирнова Н.Э. Обогащение молочной сыворотки белком и каротином // Течнолог.ш получения продуктов брожения и микробного синтеза.-Алма-Ата: Наука, I988.-C.I6I-I65.

w. Смирнова И.Э, Синтез целлюлолитических ферментов Bacillus ар. 121 на молочной сыворотке // Биология микроорганизмов и вирусов.-Алма-Ата, Наука, 1989.-С.16-20.

6. Иузыревская О.М., Смирнова И.Э., Галимбаева P.И. Синтез протеина Bacillus ер.и Candida tropicalis при Культивировании на соломе // Использование новых микробных препаратов в народном хозяйства.-Алма-Ата: Наука, 1989,-0.140-143,

7. Хмелевская Л.К,, Смирнова И.Э. Смешанная культура целлзо-ЛОЛ(ТИчесКИХ ферментов Bacillus ар. 121 И Lactobacillus pentoace-ticum штамм В (Ö>-23 для силосования кормов // Микробиологические л биотгшологические основы интенсификации растениеводства

и кормопроизводства: Тез.докл.Всясоюзн.конф. I2-I4 ноябДЗЗО,-Алма-Атг»., ly.iU.-0.91.

Ь, Стриит И.Э. Новая культура целлюлояитичеоких бактерий пдя силеовамия рисовой солот и других грубюс кордов // Ученые

Казахстана - -ельокому хозяйству: Тез.докл. Реслубл. научно-техн. конф. 18-19 окт.1990.-Алма-Ата, 1990.-С.86.

9. Смирнова Н.Э. Некоторые попуяяиконные аспекты устойчивости природной микробной ассоциации целявлолитических бактерий // Биотехнология и биофизика микробных популяций: Тез.докл.Всесо-юзн. конф. 19-22 авгЛ991.-Алма-Ата, I99I.-C.80.

10. Смирнова Й,Э, Безотходное получение растительного кормового продукта с помощью целлюяолатических бактерий // Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспши Тез.Всесоюзн.сйлпоэ. 14-19 октЛ991,-Оренбург, I99I.-C.65.

11. Способ мелиорации засоленных почв под культуру риса: Полож.решение от 29,01,91 по заявке $ 4649792/13 / Нелидов С.Н., Саубенова М.Г., Смирнова И.Э.;приор. 12.07.90,

Подписано " печати 09.03,92г. зак.$291 Л1р.1л0 скэ.

Отпечатано на ротапринте Казинформ ГАПК г.Алма-Ата, пр.Ленина, 38.