Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli

Ушаков, Вадим Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli"

На правах рукописи

1 ./ А

УШАКОВ Вадим Юрьевич

ÜQ34705G^

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС-СИСТЕМ В SOS-OTBETE У БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI

03.00.07 Микробиология

г 1 О KT 2009

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2009

003478562

Работа выполнена в Лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Пермь

Научный руководитель

доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Кузяев Рафаэль Зиафутдинович кандидат биологических наук Нестерова Лариса Юрьевна

Ведущая организация: Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва

Защита состоится "_"_2009 г. в "__" часов

на заседании диссертационного совета ДМ004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 2446711.

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан "_"_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Жизненный цикл большинства бактерий связан с постоянной сменой параметров окружающей среды: рН, температуры, осмотического давления, а так же с воздействием солнечного излучения и химических веществ. Резкие изменения параметров окружающей среды приводят к стрессам, для адаптации к которым бактерии в процессе эволюции развили молекулярные механизмы, регулируемые на разных уровнях, в том числе и генетическом. Одной из важных систем, вовлеченных в защиту бактерий от повреждения ДНК при воздействии УФ-облучения и химических веществ, является SOS-система. Два регуляторных белка LexA и RecA контролируют SOS-ответ, включающий индукцию более 40 генов, продукты которых участвуют в репликации ДНК, репарации и контроле деления клеток (Friedberg et al., 1995; Fernandez de Henestrosa et al, 2000; Walker, 2000). Репрессор LexA негативно регулирует экспрессию этих генов. При повреждении ДНК белок RecA активируется, связываясь с одноцепочечной ДНК в репликационной вилке, разрезает LexA и снимает репрессию генов SOS-ответа (Walker, 2000; Friedberg et al, 1995). В настоящее время все большее внимание уделяется изучению редокс-регуляции клеточной активности с участием таких тиоловых соединений как глутатион (GSH), тиоредоксин (Тгх) и глутаредоксин (Grx). На возможность редокс-регуляции SOS-ответа указывают опубликованные ранее данные о модуляции экзогенными низкомолекулярными тиолами экспрессии некоторых генов, входящих в SOS-регулон (Claycamp, 1988; Claycamp et al, 1990; Javor et al, 1988; Javor, 1989; Smirnova et al, 1994). Предполагается, что тиолы могут активировать SOS-ответ, участвуя как восстановители в реакциях, приводящих к повышению уровня активных форм кислорода (АФК), способных, в свою очередь, вызывать повреждения ДНК (Park and Imlay, 2003). Другой возможный путь - прямое или косвенное взаимодействие тиолов (в том числе, глутатиона или тиоредоксина) с белком RecA. На последнюю возможность указывает наличие в белке RecA SH-групп, существенных для его активности. Недавно обнаружено, что у Е. coli RecA, как

и ряд других белков, связан с тиоредоксином (Kumar J.K et at., 2004). Однако, в целом, данные по этой проблеме немногочисленны и противоречивы.

Цель настоящего исследования - изучение роли редокс-систем глутатиона и тиоредоксина в SOS-ответе у бактерий Е. coli, индуцированном УФ-облучением и химическими веществами.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние мутаций по компонентам редокс-систем в растущих бактериях Е. coli на такие параметры как удельная скорость роста, выживаемость и частота мутаций.

2. Сравнить уровень индукции SOS-системы у штаммов, мутантных по компонентам редокс-систем, при действии УФ-света, перекиси водорода и митомицина С.

3. Измерить уровень внутриклеточного и внеклеточного глутатиона у штаммов, мутантных по компонентам редокс-систем, при действии УФ-света и перекиси водорода.

4. Исследовать влияние экзогенных тиоловых соединений и SH-реагентов на индукцию SOS-системы у растущих бактерий Е. coli.

Научная новизна. Обнаружено, что у бактерий Е. coli тиоловые редокс-системы глутатиона и тиоредоксина играют важную роль в SOS-ответе, индуцируемом облучением дальним УФ-светом или пероксидом. Выраженность изменений и их направленность зависят от вида мутации и экспозиции.

Впервые обнаружено, что при кратковременном облучении дальним УФ-светом (6 минут) бактерии Е. coli, дефицитные по синтезу тиоредоксина 1 и тиоредоксинредуктазы, проявляют более высокий уровень экспрессии гена sulA, входящего в SOS-регулон и более устойчивы к бактерицидному и бактериостатическому действию дальнего УФ-света по сравнению с клетками родительского типа.

Показано, что у бактерий Е. coli, дефицитных по синтезу глутатиона и тиоредоксинредуктазе, наблюдается более высокая частота индуцированных

мутаций при облучении УФ254 в течение 15 минут по сравнению с клетками родительского типа.

Показано, что мутанты по редокс-системам существенно отличались как между собой, так и от клеток родительского типа по своему ответу на окислительный стресс, вызванный действием экзогенной перекиси водорода. Как и в случае с УФ-облучением, из общего ряда мутантов выделяются бактерии, дефицитные по тиоредоксинредуктазе. Эти мутанты показали самый высокий уровень НгОг-индуцируемого мутагенеза и экспрессии генов sulA и katG, а также повышенную каталазную активность и устойчивость к бактериостатическому действию оксиданта. Обнаружено также, что эти мутанты отличаются высоким базовым уровнем внутриклеточного глутатиона и способностью восстанавливать этот уровень после окислительного стресса. Одновременно эти бактерии имели самый низкий базовый уровень внеклеточного глутатиона.

Впервые показано, что существует прямая связь между уровнем внутриклеточного глутатиона и УФ-индуцированной экспрессией гена sulA.

Теоретическое и практическое значение работы. Данные по устойчивости бактерий к действию УФ-света и перекиси водорода MOiyr быть использованы для совершенствования методов стерилизации в медицине и биотехнологии.

Бактерии Е. coli, дефицитные по синтезу тиоредоксинредуктазы и показавшие высокий уровень Н202- и УФ-индуцированных мутаций, могут быть использованы в научных исследованиях и биотехнологии для получения различных мутантов с полезными свойствами.

Бактерии Е. coli, дефицитные по глутаредоксину и обладающие повышенным экспортом глутатиона, могут быть использованы в биотехнологии для получения этого антиоксиданта без разрушения клеток.

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре физиологии растений и микроорганизмов ГОУ ВПО Пермский государственный университет.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Отсутствие того или иного компонента тиоловых редокс-систем у Е. coli приводит к существенным изменениям в ответе бактерий на облучение дальним УФ-светом, в том числе, в тех параметрах, которые контролируются SOS-системой (экспрессия гена sulA, мутагенез и выживаемость).

2. Облучение бактерий УФ-светом приводит к повышению уровня внутриклеточного глутатиона во всех испытанных штаммах и снижению внеклеточного глутатиона в клетках родительского типа и у бактерий, дефицитных по тиоредоксинредуктазе.

3. Существует прямая связь между уровнем внутриклеточного глутатиона и УФ-индуцированной экспрессией гена sulA.

4. Наибольшие изменения изучаемых параметров характерны для мутантов Е. coli, дефицитных по тиоредоксину 1 и тиоредоксинредуктазе. У этих бактерий при кратковременном облучении дальним УФ-светом наблюдались повышенные уровни экспрессии sulA, а также более высокая устойчивость к бактериостатическому и бактерицидному действию УФ254 по сравнению с клетками родительского типа.

5. Повышенная устойчивость мутантов Е. coli по тиоредоксинредуктазе к действию перекиси водорода связана с высоким уровнем экспрессии генов sulA и kaíG, а также с повышенной каталазной активностью.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были представлены на молодежной конференции УрО РАН «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», г. Пермь (2007); VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет», Пермь - Н.Новгород - Пермь (2008); II конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз 2009», г. Пермь (2009). По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах печатного текста, иллюстрирована 41 рисунком и 5 таблицами; состоит из

введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Список литературы включает 230 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение неспецифического отклика и адаптивной реакции бактерий на различные стрессовые воздействия» (индекс приоритетного направления 4.1.13, номер госрегистрации 01910055305).

Представленные исследования были выполнены при финансовой поддержке гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Список принятых сокращений. ТСК - тиосалициловая кислота, УФ -ультрафиолетовое излучение, ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота, DTT- дитиотреитол, GSH - глутатион восстановленный, GSSG - глутатион окисленный, ssDNA - одноцепочечная ДНК.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы. Объектом исследования служили штаммы бактерий Escherichia coli, представленные в таблице 1.

Таблица 1

Штаммы Е. coli, используемые в исследовании

Штамм Генотип Источник

. DM4000 hisG4 argE3thr-l ara-14 xyl-5 mtl-1 rpsL3l tsx-33 ilv TSsfiA::Mu-dl(bla lac) cam M. Volkert, США

МС1000 ara DI39 S.(araABC-leu)7679 galUgalK A(lac)X74 rpsL thi J. Beckwith, США

RI89 как MC1000, ноphoR Aara-714 leu J. Beckwith

RI319 как RI89, но trxB:: Kanr J. Beckwith

RI336 как RI89, но gshA ::Tn/0 Kanr J. Beckwith

RI363 как RI89, но trxA:: Kanr J. Beckwith

WP812 как RI89, но grxA ::Kanr I. Веск\укЬ

MN131 как RI89, но sulA::lacZ (wt) Данная работа

MN141 как RI336, но sulA::lacZ (gshA) Данная работа

MN151 как RI363, но sulAr.lacZ (trxA) Данная работа

MN161 как RI319, но sulAr.lacZ (itrxB) Данная работа

MN171 как WP812, но sulA::lacZ (grxA) Данная работа

ВМ11 как RI89, но katG::lacZ (wt) Данная работа

ВМ21 как RI319, но katG::lacZ (trxB) Данная работа

ВМ31 как RI336, но katG::lacZ (gshA) Данная работа

ВМ41 как RI3 63, но katG: :lacZ (trxA) Данная работа

Среды и условия культивирования. Бактерии выращивали на минимальной среде М9 (Miller, 1972) с добавлением 0,4 % глюкозы, 0,2 % казаминовых кислот и тиамина (10 мкг/мл). После выхода бактерий в стадию экспоненциального роста культуру помещали в специально сконструированную для этих экспериментов термостатируемую ячейку с магнитной мешалкой и интенсивной продувкой воздухом. Суспензия клеток из ячейки с помощью насоса непрерывно прокачивалась в режиме циркуляции через кварцевую трубку, облучаемую УФ-светом. В качестве источника УФ-излучения использовали ртутно-кварцевую лампу СВД-120. Необходимую длину волны выделяли с помощью интерференционного фильтра с максимумом пропускания в области 254 нм. В экспериментах с применением оксиданта бактерии выращивались в колбах на качалке (150 об/мин). За ростом бактерий следили по изменению поглощения при 670 нм, измеряемому на фотоколориметре КФК-3 (толщина кюветы 5 мм). Обработку Е. coli оксидантом и облучение УФ-светом проводили в середине лог-фазы роста, когда оптическая плотность культуры составляла 0,3 - 0,4 г сухих клеток на литр. Для получения плотной среды в жидкую питательную среду добавляли агар (15 г/л) («Sigma").

Используемые методы. Содержание белка определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951). Уровень экспрессии исследуемых генов в штаммах, несущих слияние промотора соответствующего гена с геном lacZ, оценивали по активности ß-галактозидазы методом Миллера (Miller, 1972).

Содержание живых клеток в культуре определяли методом высева на чашки с LB-агаром и подсчетом выросших колоний. Частоту спонтанных мутаций определяли по признаку устойчивости к рифампицину.

Уровни восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона определяли спектрофотометрически (Tietze, 1969) в последовательности, описанной ранее (Smimova et al., 2000).

Каталазную активность измеряли отдельно для каждой из каталаз-гидропероксидаз HPI и HPII (Visick and Clark, 1997). Каталазную активность определяли по убыли известной концентрации Н2О2 за 1 минуту при 240 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1650PC. Расчет активности проводили по формуле: (1000*Д240 нм/мин)/(43,6*мг белка/мл реакционной смеси). Концентрацию белка определяли по калибровочному графику, построенному по данным, полученным при измерении концентрации бычьего сывороточного альбумина (мг/мл) при 750 нм.

Внутриклеточную концентрацию Н2О2 измеряли с помощью скополетина на спектрофлуориметре Shimadzu RF-I501 (Gonzales-Flecha and Demple, 1997). Концентрацию H2O2 расчитывали по разнице между значениями образцов, обработанных и необработанных каталазой, и выражали в микромолях (цМ) на литр среды.

В работе использовались реагенты, полученные от «Sigma»: казаминовые кислоты, тиамин, фермент глутатионоксидоредуктаза, DTNB, ЭДТА, НАДФН, GSH, NEM, GSSG, ОНФГ, пероксидаза, агар, меркаптоэтанол, дезоксихолат, антибиотики. Остальные реагенты, использованные для приготовления растворов и сред, были отечественного производства, классифицируемые как х.ч.

Статистическая обработка результатов. Обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excell (Microsoft Office 2003, Microsoft Co) и Statistics 6.0 (StatSoft Inc., 2001), вычисляя среднее значение, стандартную ошибку и доверительный интервал. Каждый результат показан как среднее значение не менее чем из трех независимых экспериментов + стандартная ошибка среднего. Для анализа использовался i-критерий Стьюдента. Значение Р < 0,05 использовалось как минимум для определения статистической значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Действие УФ-света на растущие клетки Е. coli

При облучении клеток УФ254 в течение 6 мин заметное падение выживаемости наблюдалось только у клеток родительского типа и мутантов, лишенных глутатиона (gshA). Мутанты по trxB, trxA и grxA оказались более устойчивыми к облучению при этих же условиях (Рис. 1 А). При увеличении экспозиции УФ254 ДО 15 минут выживаемость снижалась у всех штаммов. Наиболее значительное падение этого показателя при длительном воздействии УФ254 было отмечено у бактерий, имеющих мутации по компонентам редокс-системы тиоредоксина (trxB и trxA). Наиболее высоким уровнем спонтанного мутагенеза обладали бактерии, мутантные по синтезу глутатиона (gshA), у остальных штаммов этот показатель был примерно одинаков и составлял 25 - 30x109 клеток (Рис. 1 Б). Кратковременное облучение (6 мин) не оказывало существенного влияния на частоту мутаций во всех испытанных штаммах.

Рис. 1. Выживаемость (А) и мутагенное действие (Б) УФ 254 на бактерии Е. coli, дефектные по редокс-системам. 1 - контроль (без воздействия УФ), 2 -облучение УФ254 в течение 6 минут, 3 - облучение УФ254 в течение 15 минут

Для исследования роли тиоловых редокс-систем в индукции SOS-ответа при действии УФ-света были использованы штаммы, каждый из которых несет мутацию по одной из редокс-систем и генное слияние sulA::lacZ. Экспрессия гена sulA находится под контролем белка RecA, и поэтому штаммы, несущие

слияние Би1А::1ас2, могут использоваться как репортерные для измерения уровня активности БОБ-системы.

Базовые уровни индукции &и1А::1ас2 (без облучения УФ254) в испытуемых штаммах значительно различались между собой: низкими базовыми уровнями характеризовались штаммы, имеющие дефекты в редокс-системе тиоредоксина, максимальный уровень в тех же условиях имели мутанты по глутатиону.

Через 50 мин после начала облучения клеток УФ254 показатели экспрессии ьи1А::1ас2 (отношение Р-галактозидазной активности в облученных клетках к уровню в необлученных) распределялись следующим образом: наибольший показатель экспрессии наблюдался в мутантах 1гхА (11,6) и 1гхВ, (9,8), наименьший - в мутантах gshA (4,6) (Рис. 2).

Время культивирования, мин

Рис.2. Экспрессия sulA::lacZ у бактерий Е. coli, дефектных по компонентам клеточных редокс-систем, при облучении УФ254 в течение 6 минут. Вертикальная линия показывает время окончания облучения.

Учитывая все показатели, среди испытанных штаммов наибольшие изменения наблюдались у мутантов, дефицитных по тиоредоксинредуктазе (trxB). По сравнению с клетками родительского типа эти бактерии показывали повышенные уровни экспрессии sulA::lacZ и индуцированного мутагенеза, а также более высокую устойчивость к бактериостатическому и бактерицидному действию дальнего УФ-света (Табл. 2 А). Наименьшие изменения наблюдались

у мутантов по глутатиону ^ИА) и глутаредоксину (¿гхА). Мутанты по тиоредоксину (¡гхА) занимали промежуточное положение.

Таблица 2.

Сводные результаты исследований

А. Действие УФ-облучения (экспозиция 6 минут)

Штаммы Экспрессия sulArAacZ Частота мутаций Выживаемость Скорость роста GSHm

gshA ++ 0 ++ но

trxB ++ ++ ++ + 0

trxA ■H- 0 ++ + ++

grxA - 0 ++ + 0

Б. Действие перекиси водорода

Штаммы Экспрессия sulA Частота мутаций Выживаемость Скорость роста GSHi„

gshA - 0 - - но

trxB ++ ++ 0 + +

trxA 0 0 0 0 0

grxA 0 но но + 0

Примечание: Знаки обозначают направление изменений параметров после действия УФ-

облучения или перекиси водорода по отношению к изменениям, наблюдаемым в клетках

родительского типа.

«+■» - увеличение параметра;

«-»- снижение;

«О» - отсутствие изменений;

«но» - не определяли.

Направленность изменений глутатиона соответствует данным, полученным через 1 час после начала обработки оксидантом или УФ.

Накопленные к настоящему времени данные указывают на возможность участия глутатиона в адаптации бактерий к экстремальным воздействиям среды (Smirnova and Oktyabrsky, 1994; Смирнова и Октябрьский, 2005). Поэтому представляло интерес выяснить, каким образом облучение УФ254 влияет на

статус глутатиона в исследуемых штаммах и как эти изменения коррелируют с индукцией БОБ-ответа. В необлученных бактериях наиболее высокая концентрация внутриклеточного ОБН (базовый уровень) наблюдалась в мутантах /гхВ, наименьшая - в мутантах, дефицитных по синтезу тиоредоксина (1гхА) и глутаредоксина <£гхЛ) (Рис. 3). После облучения УФ254 в течение 6 мин концентрация общего внутриклеточного глутатиона (СЗНШ) повышалась во всех штаммах, хотя и в разной степени (Рис. 3). В наибольшей степени уровень ОБИш возрастал в мутантах 1псА: в 6,2 раза по отношению к уровню С5НШ в необлученных клетках.

Время культивирования, мин

Рис. 3. Влияние облучения УФ254 (6 мин) на уровень внутриклеточного глутатиона в клетках Е. coli, несущих мутации по редокс-системам. Каждая точка представлена отношением уровня GSHm в облученных клетках к необлученным. Вертикальная линия показывает время окончания облучения.

Измерения внеклеточного глутатиона (GSH0Ut) в указанных выше условиях показали, что в клетках trxB и родительского типа количество глутатиона в среде падает на 29% и 34%, соответственно. Таким образом, УФ-индуцируемое повышение уровня глутатиона в цитозоле этих бактерий может быть связано с уменьшением его экспорта в среду.

На важную роль глутатиона в адаптации Е. coli к УФ-облучению указывают результаты корреляционного анализа, который выявил обратную связь между концентрацией внутриклеточного глутатиона (GSHm) до облучения и базовыми уровнями экспрессии sulA::lacZ и прямую связь между кратностью увеличения концентрации GSH„ и экспрессией sulA::lacZ в клетках после облучения (Рис. 4).

Начапьньйуровекь GSHai, jM&m>/rp.cyx.Beca ХрпвотуватешющмпрщийЯп

А Б

Рис. 4. Корреляционная зависимость между базовыми уровнями активности ß-галакгозидазы и концентрацией GSHin в необлученных бактериях Е. coli (А) и между кратностью увеличения концентрации GSHin в облученных клетках и экспрессией sulA::lacZ в клетках Е. coli через 50 мин после облучения (Б).

Влияние SH-реагентов и тиолсодержащих соединений на SOS-ответ у бактерий Е. coli. В предыдущем разделе показано, что активность генов SOS-системы как в облученных, так и в необлученных клетках Е. coli, в значительной степени зависит от функционирования внутриклеточных тиоловых систем, определяющих редокс-баланс в цитоплазме. Для более полного изучения влияния редокс-статуса на SOS-ответ была проведена серия экспериментов, в которых изучалось действие УФ-света на растущие культуры Е. coli в присутствии экзогенных реагентов, обладающих редокс-активностью.

Представляло интерес изучить также действие дитиолового реагента дитиотреитола (ДТТ), подобного таким природным дитиолам как тиоредоксин и глутаредоксин. Учитывая опубликованные ранее данные и предварительно проведенные нами опыты, бактерии Е. coli MN131 (wt, sulAr.lacZ) обрабатывались дитиотреитолом в концентрации 1 мМ. Внесение ДТТ в среду культивирования (без облучения) не вызывало существенного изменения экспрессии sulA::lacZ (Р > 0,1). Однако, такая обработка клеток дитиотреитолом за 15 минут до облучения приводила к снижению экспрессии sulAr.lacZ, индуцируемой УФ254, в 3,7 раза (Р <0,01) (Рис. 5).

Рис. 5. Влияние дитиотреитола (1 мМ) на экспрессию sulA::lacZ у бактерий Е. coli MN131 (wt, sulA::lacZ) при облучении УФ254 (6 мин).

1 - облучение УФ254 (6 мин); 2 - клетки обработаны ДТТ перед облучением; 3 - контроль (без обработки ДТТ и без облучения УФ254); 4 - клетки обработаны ДТТ. Стрелкой указан момент добавления ДТТ. Вертикальными линиями обозначены моменты начала и окончания облучения.

Известно, что одиночные мутанты по тиоловым редокс-системам характеризуются разной интенсивностью образования дисульфидных связей в различных компартментах Е. coli. Чтобы проверить влияние увеличения дисульфидных связей на активность SOS-системы была проведена серия экспериментов с применением проникающего тиолового реагента диамида. Известно, что диамид способствует окислению GSH с образованием GSSG и существенно повышает уровень дисульфидных связей в цитоплазматических белках (Kosower and Kosower, 1995; Prinz et al., 1997).

6 12 18 24 30 36 42 48 34 Время культивирования, мнн

В наших условиях действие диамида зависело от концентрации реагента. При высоких концентрациях диамид (0,8 мМ) оказывал выраженное токсическое действие, проявляющееся в ингибировании УФ-индуцированной экспрессии зи1А::1ас2 3,6 раза по сравнению с необработанными бактериями. В необлученных клетках родительского типа обработка 0,8 мМ диамида не вызывала достоверного изменения уровня экспрессии $и1А::1ас2. (Рис. 6 А). Предобработка бактерий родительского типа 0,08 мМ диамида стимулировала УФ-индуцируемую экспрессию зи1А::1ас2 на 26% по сравнению с необработанными бактериями. (Рис. 6 Б).

Время культивирования мин Время культивирования, мин

Рис. 6. Влияние диамида 0,8 мМ (А) и 0,08 мМ (Б) на экспрессию sulA::lacZ у бактерий Е. coli MN131 (wt, sulAr.lacZ) при облучении УФ254 (6 мин). 1 - обработка бактерий диамидом и облучение УФ254 (6 мин); 2 -облучение бактерий УФ254; 3 - обработка бактерий диамидом; 4 - контроль. Стрелкой указан момент добавления диамида. Вертикальные линии показывают моменты начала и окончания облучения.

Влияние перекиси водорода на растущие бактерии Е. coli.

При обработке бактерий 5 мМ Н2О2 максимальную выживаемость

проявляли мутанты trxB, минимальную - gshA. Статистически достоверное повышение частоты мутаций (в 7,8 раз) наблюдалось только у Е. coli trxB, лишенных тиоредоксинредуктазы (Рис. 8). Наиболее высокий уровень экспрессии sulA::lac2 при действии Н2О2 обнаружен у мутантов trxB (показатель индукции - 3,8), а наиболее низкий -у gshA (2,0) (Рис. 9 А). Следует

отметить, что подобное поведение этих мутантов было обнаружено нами при воздействии УФг54-

Б ул 1гхВ >гхА

gshA trxB trxA

iL 1 2

1 I.

t-о rt 3"

140 120

60 40 20 ■ 0 -

Ж 1 2

Рис. 8. Выживаемость (А) и мутагенное действие (Б) 5 мМ Н202 на бактерии Е. coli, дефектные по редокс-системам. 1 - контроль (без обработки оксидантом); 2 - клетки обработаны 5 мМ Н2О2 в течение 1 часа.

Время культивирования, мин Время культивирования, мин

Рис. 9. Индукция слияния sulA::lacZ (А) и katG::lacZ (Б) у бактерий Е. coli, дефектных по компонентам тиоловых редокс-систем, при обработке Н202. Стрелкой указан момент добавления оксиданта.

Обработка бактерий Е. coli перекисью водорода может одновременно активировать два регулона. В один из них входят гены, которые участвуют в SOS-ответе (в их числе sulA) и регулируются recA-lexA генной системой (Goerlich et al., 1989). Второй регулон включает в себя гены, участвующие в

защите бактерий от НгОг-индуцируемого окислительного стресса и регулируемые фактором OxyR (Imlay and Linn, 1987). К числу генов OxyR-регулона принадлежит katG, кодирующий каталазу-гидропероксидазу HPI. Этот фермент катализирует разложение H202 в растущих клетках Е. coli. Используя штаммы, несущие одновременно слияние katG::lacZ и мутации по редокс-системам (Табл. 1), мы проверили, во-первых, влияние редокс-статуса клеток на экспрессию генов OxyR-рсгулона и, во-вторых, сравнили влияние изменений редокс-статуса клеток на экспрессию генов, входящих в два разных регулона в ответ на действие одного индуктора (Н202).

Обработка изучаемых штаммов 1 мМ Н2О2 приводила к повышению экспрессии katGr.lacZ в разной степени. Показатели индукции katG::lacZ распределились следующим образом: самое высокое значение было в мутантах trxB (4,5), самое низкое - в мутантах gshA (Рис. 9 Б). Были измерены так же базовый уровень каталазной активности и внутриклеточная концентрация перекиси водорода у изучаемых штаммов при инкубировании без оксиданта (Табл. 3). Как концентрация перекиси водорода, так и каталазная активность в используемых нами штаммах отличались незначительно. Исключение составлял штамм MN161, дефектный по тиоредоксинредуктазе, в котором наблюдалась повышенная активность обоих каталаз HPI и HPII. По-видимому, несмотря на снижение активности той или иной редокс-системы, клетки поддерживают гомеостаз Н2О2. У мутантов trxB это может достигаться за счет повышения каталазной активности.

Таблица 3

Внутриклеточная концентрация перекиси водорода и активность каталаз HPI и HPII в штаммах Е. coli, дефектных

по компонентам редокс-систем

Штамм Перекись Активность Активность

водорода, цМ катал азы HPI каталазы HPII

MN131 (wt) 0,054±0,005 5,01±0,65 8,1 ±0,9

MN141 {gshA) 0,041 ±0,002 4,65±0,42 8,9±2,1

MN161 (trxB) 0,051 ±0,006 19,5±2,7 12,2±1,4

MN151 (trxA) 0,059±0,01 7,95±1,0 8,5±0,4

MN171 (xrxA) 0,039±0,001 6,13±0,84 8,4±0,4

Как и в случае с УФ-облучением, из общего ряда мутантов выделяются бактерии, дефицитные по тиоредоксинредуктазе. Эти мутанты показали самый высокий уровень НгСЬ-индуцируемого мутагенеза и экспрессии sulA::lacZ и katG::lacZ, а также повышенную активность каталаз и устойчивость к бактериостатическому действию оксиданта (Табл. 2 Б). Данные относительно поведения мутантов trxB хорошо согласуются с опубликованными ранее результатами Такемото с соавт., которые, используя другие штаммы Е. coli, показали более высокую (чем у клеток родительского типа) устойчивость к действию пероксида (Takemoto et ah, 1998).

Исследования изменений редокс-статуса и уровня глутатиона показали, что в необработанных оксидантом бактериях наиболее высокий уровень внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSHi„) наблюдался в мутантах trxB, наименьший - в мутантах trxA. Через 20 минут после обработки клеток Н2С>2 уровень внутриклеточного восстановленного глутатиона достоверно снижался лишь в мутантах по редокс-системе тиоредоксина: у бактерий trxB -на 30%, а у trxA - на 55%. У бактерий родительского типа и в клетках, дефицитных по глутаредоксину, уровень GSHm оставался на прежнем уровне. Через 1 час после внесения оксиданта в среду культивирования концентрация GSHin в клетках родительского типа и в мутантах trxA и grxA заметно снижалась, тогда как у trxB, возвращалась к уровню, наблюдаемому в необработанных клетках (Рис. 10 А).

В клетках, культивируемых без добавления Н2О2, наиболее высокая концентрация GSH0Ut была обнаружена у мутантов grxA, а самая низкая - у trxB. Через 20 минут после добавления оксиданта уровень GSH0Ut снижался у всех штаммов, но через 60 мин восстанавливался до исходного уровня, близкого к контрольному (у клеток родительского типа), или значительно повышался (у мутантов trxB и grxA) (Рис. 10 Б).

Рис. 10. Влияние Нг02 на уровень внутриклеточного глутатиона (А) и внеклеточного глутатиона (Б) у бактерий Е. coli, несущих мутации по редокс-системам. 1 - контроль (необработанные клетки); 2 - через 20 мин после обработки Н202; 3 - через 60 мин после обработки Н2О2.

Действие экзогенного глутатиона на экспрессию sulA::lacZ у бактерий, мутантных по синтезу глутатиона. Добавление экзогенного глутатиона к клеткам gshA не влияло на скорость роста клеток в присутствии Н2О2, но повышало базовый уровень экспрессии sulA::lacZ на 12% (Р < 0,05). При обработке мутантов gshA оксидантом в присутствии экзогенного GSH уровень экспрессии sulAr.lacZ повышался на 50% по сравнению с клетками, которые выращивались в присутствии Н2О2, но без добавления GSH. Добавление в культуру, содержащую Н2О2 и GSH, хелатора ионов железа 2,2-дипиридила почти полностью устраняло НгОг-индуцируемую экспрессию sulA::lacZ (Рис. 11). Вероятно, выведение хелатором ионов Fe3+ может останавливать протекание реакции Фентона, в процессе которой образуется гидроксильный радикал, способный повреждать ДНК и индуцировать SOS-ответ.

Влияние митомицина С на растущие бактерии Е. coli. Для исследования влияния мутаций по тиоловым редокс-системам на SOS-ответ была выбрана концентрация 1 цг/мл. Такая обработка не вызывала заметного влияния на рост бактерий, и, в то же время, индуцировала экспрессию sulA::lacZ. Максимальный показатель индукции sulA::lacZ при обработке клеток митомицином С был отмечен у мутантов по тиоредоксину (13,3), минимальный - у мутантов по редокс-системе глутатиона: 5,9 у grxA и 7,2 у gshA,

соответственно (Рис. 12). Подобное распределение показателей индукции яи1А::1ас2 для указанных штаммов наблюдалось в экспериментах с

5 §

" S 1000

20 30 40 S0 СО 70

Время культивирования, мин

Рис. 11. Активность ß-галактозидазы у бактерий Е. coli gshA, несущих слияние sulA::lacZ при различных обработках. 1 - контроль; 2 - добавление 1 мМ Н2О2; 3 - добавление 0,1 мМ 2,2-дипиридила; 4 - добавление 0,1 мМ GSH; 5 - добавление 0,1 мМ GSH + 1 мМ Н2О2; 6 - добавление 0,1 мМ GSH + 1 мМ Н2О2 + 0,1 мМ 2,2-дипиридила. Стрелкой указан момент добавления Н2О2. GSH добавляли в начале культивирования (нулевой момент времени).

Бремя культивирования, мин

Рис. 12. Влияние митомицина С (1 рг/мл) на индукцию слияния sulA::lacZ у бактерий Е. coli, дефектных по компонентам тиоловых редокс-систем. Стрелкой указан момент добавления митомицина С.

использованием других агентов: перекиси водорода и дальнего УФ-света. В то же время, в отличие от перекиси водорода и дальнего УФ-света, при действии митомицина С мутанты trxB показывали такой же уровень индукции как и клетки родительского типа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Каким образом мутации по редокс-системам могут модифицировать ответ Е. coli на обработку УФ-светом и оксидантом? В первую очередь, рассмотрим возможный механизм, посредством которого тиоредоксин (Тгх) и тиоредоксинредуктаза (TR) могут принимать участие в регуляции SOS-ответа. Как известно, тиоредоксины содержат редокс-активный участок Cys-Xl-X2-Cys, который может обратимо окисляться и восстанавливаться. Окисленный тиоредоксин восстанавливается в НАДФН-зависимой реакции, катализируемой тиоредоксинредуктазой. Среди путей, по которым Тгх может участвовать в редокс-регуляции - участие в восстановлении дисульфидных связей в регуляторных белках или образование конъюгатов с этими белками. Восстанавливающая активность Тгх по отношению к транскрипционным факторам примерно в 1000 раз выше, чем у GSH, и это объясняет, почему тиоредоксин более специфичен как редуктант для редокс-регулируемых сигнальных реакций.

Недавно обнаружено, что у Е. coli в числе белков, связанных с тиоредоксином - белок RecA, ключевой регулятор SOS-ответа (Kumar et al., 2004). Известно также, что RecA содержит несколько «существенных» SH-групп, модификация которых приводит к заметным изменениям в его активности (Kuramitsu et al., 1984; Weisemann and Weinstok, 1988).

Если тиоредоксин может участвовать каким-то образом в регуляции активности RecA и, соответственно, SOS-ответа, то почему мутация по тиоредоксинредуктазе оказывает большее влияние на экспрессию RecA-контролируемого гена (sulA), чем сам тиоредоксин? Было показано, что мутация по тиоредоксинредуктазе приводит к накоплению относительно больших количеств окисленного тиоредоксина, который начинает действовать как

оксидаза, окисляющая SH-группы в соответствующих сайтах белков (Prinz et al, 1997). Действительно, в одиночных мутантах Е. coli по тиоловым редокс-системам интенсивность образования дисульфидных связей в цитоплазме распределяется следующим образом (в относительных единицах): trxB - 9.7; trxA - 1.4; gshA - 1.4; grxA - 0.9 и wt - 1.0 (Prinz et al., 1997). Примечательно, что указанное распределение числа дисульфидных связей коррелирует с показателями, отражающими изменения в измеряемых нами параметрах при облучении мутантов Е. coli УФ254 и обработке Н2О2. Это особенно заметно в случае с мутантами по тиоредоксинредуктазе (Табл. 5 А). Учитывая полученные нами результаты и данные других исследователей, можно предположить, что наличие в мутантах trxA, gshA и grxA умеренного, а в случае с trxB - острого дисульфидного стресса, может вносить вклад в их характерное поведение при ответе на облучение.

Повышенная частота УФ-индуцированных мутаций у бактерий trxB также может опосредоваться через влияние окисленного тиоредоксина на активность RecA. Известно, что главный регулятор SOS-ответа белок RecA играет важную роль в SOS-индуцированном мутагенезе (Elledge et al., 1983; Shinagava et al., 1988).

Глутаредоксин (Grx) также имеет в своем составе редокс-акгивную последовательность Cys-Xl-X2-Cys и способен восстанавливать смешанные дисульфиды (Holmgren, 1989). Участие глутаредоксина в процессе обратимого протеин-8-глутатионилирования делает его важным компонентом редокс-регуляции клеточной активности. Известен пример участия глутаредоксина в регуляции ответа бактерий на стресс. При воздействии на Е. coli низких концентраций Н2О2 происходит активация транскрипционного фактора OxyR за счет образования интрамолекулярной дисульфидной связи и конформационного перехода в регуляторном домене. В результате белок приобретает способность активировать транскрипцию генов, участвующих в адаптации Е. coli к последующему действию высоких концентраций пероксида. Обратный процесс - инактивация OxyR происходит путем восстановления дисульфидной связи под действием глутаредоксина 1 в присутствии GSH (Zheng et al., 1998). На возможность участия этого тиола в SOS-ответе, указывает тот факт, что ген

grxA, кодирующий синтез глутаредоксина 1, обнаружен среди генов SOS-ответа, индуцируемых при облучении Е. coli дальним УФ-светом (Courcelle et al., 2001).

Дефицит глутатиона также оказывал существенное влияние на ответ Е. coli к действию УФ-света и Н2О2. Однако по сравнению с мутантами trxB изучаемые параметры в этом случае изменялись в противоположном направлении (Табл. 5 Б).

Таким образом, при пероксидном стрессе и при действии УФ-излучения мутанты trxB и gshA проявили противоположные свойства, и их разная чувствительность к стрессовым воздействиям определяется, в первую очередь, способностью к индукции антиоксидантных генов, входящих в состав OxyR- и SOS-регулонов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что отсутствие того или иного компонента тиоловых редокс-систем у Е. coli, приводило к существенным изменениям в реакции бактерий на облучение дальним УФ-светом, в том числе, в тех параметрах, которые контролируются SOS-системой (экспрессия гена sulA, мутагенез и выживаемость). Выраженность изменений и их направленность зависели от вида мутации и экспозиции.

2. Наибольшие изменения исследуемых параметров обнаружены у мутантов, дефицитных по тиоредоксину 1 и тиоредоксинредуктазе. У этих бактерий при кратковременном облучении дальним УФ-светом наблюдались повышенные уровни экспрессии sulA, а также более высокая устойчивость к бактериостатическому и бактерицидному действию УФ254 по сравнению с клетками родительского типа.

3. Установлено, что облучение бактерий УФ-светом приводило к повышению уровня внутриклеточного глутатиона во всех штаммах и снижению внеклеточного глутатиона в клетках родительского типа и в бактериях, дефицитных по тиоредоксинредуктазе.

4. Выявлена положительная корреляция между уровнем внутриклеточного глутатиона и УФ-индуцированной экспрессией гена sulA в клетках

родительского типа и в штаммах Е. coli, дефицитных по глугатиону, тиоредоксину и тиоредоксинредуктазе.

5. При действии на бактерии Е. coli перекиси водорода из общего ряда мутантов выделяются бактерии, дефицитные по тиоредоксинредуктазе. Эти мутанты показали самый высокий уровень ИгС^-индуцируемого мутагенеза и экспрессии генов sulA и katG, а также повышенную активность каталаз HPI, HPII и устойчивость к бактериостатическому действию оксиданта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ушаков В.Ю. Влияние редокс-статуса клетки на экспрессию SOS-системы Escherichia coli / В.Ю. Ушаков // Сборник материалов студенческой научной конференции. - Пермь, 2005. - С. 49.

2. Смирнова Г.В. Дефекты в редокс-системах глутатиона и тиоредоксина модулируют SOS-ответ в клетках Escherichia coli / Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский, Н.Г. Музыка, В.Ю. Ушаков и др. // Проблемы загрязнения окружающей среды: Тезисы VI международной конференции. - Пермь-Казань-Пермь, 2005. - С. 86.

3. Ушаков В.Ю. Влияние изменений внутриклеточного редокс-статуса на индуцированный ультрафиолетом SOS-ответ в клетках Escherichia coli / В.Ю. Ушаков // Биология - наука XXI века: Тезисы международной конф. молодых ученых. - Пущино, 2007. - С. 216.

4. Ушаков В.Ю. Устойчивость бактерий Escherichia coli , дефектных по компонентам редокс-систем глутатиона и тиоредоксина, к ультрафиолетовому облучению / В.Ю. Ушаков, М.Н. Брысова // Актуальные аспекты современной микробиологии: Тезисы III международной молодежной школы-конференции. -Москва, 2007.-Стр. 118-119.

5. Ушаков В.Ю. Влияние SH-реагентов и тиолсодержащих соединений на SOS-ответ у бактерий Escherichia coli / В.Ю. Ушаков, Г.В. Смирнова // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Тезисы региональной научной конференции молодых ученых. - Пермь, 2007. - С. 113.

6. Октябрьский О.Н. Роль тиоловых редокс-систем в отклике бактерий Escherichia coli на пероксидный стресс / О.Н. Октябрьский, Н.Г. Музыка, В.Ю. Ушаков, Г.В. Смирнова // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - В. 6. - С. 759-765.

7. Ушаков В.Ю. Модуляция SOS-ответа в мутантах Escherichia coli по редокс-системам глутатиона и тиоредоксина / В.Ю. Ушаков // Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения): Тезисы международной научной конференции. - Саранск, 2008 - С. 293-294.

8. Ушаков В.Ю. Влияние кверцетина и хелаторов железа на экспрессию генов SOS-системы у бактерий Escherichia coli / В.Ю. Ушаков // Актуальные аспекты современной микробиологии: Тезисы IV молодежной школы-конференции с международным участием. - Москва, 2008. - С. 70-71.

9. Ушаков В.Ю. Участие тиоловых редокс-систем в адаптации Escherichia coli к облучению дальним УФ-светом / В.Ю. Ушаков, О.Н. Октябрьский, Н.Г. Музыка, Г. В.Смирнова // Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет: Тезисы 6 международной конференции. - Пермь - Нижний Новгород - Пермь, 2008. - С. 61.

10. Ушаков В.Ю. Тиоловые редокс-системы, участвующие в ответе бактерий Escherichia coli на облучение дальним УФ-светом / В.Ю. Ушаков, О.Н. Октябрьский, Н.Г. Музыка, Г. В.Смирнова // Тезисы VII международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. -Пермь, 2008. - С. 262-266.

11. Ушаков В.Ю. Изменения редокс-статуса клетки модулируют SOS-ответ у бактерий Escherichia coli / В.Ю. Ушаков // Тезисы II Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз 2009». - Пермь, 2009. - С.82-84.

12. Октябрьский О.Н. Роль тиоловых редокс-систем в ответе бактерий Escherichia coli на облучение дальним УФ-светом / О.Н. Октябрьский, В.Ю. Ушаков, Н.Г. Музыка, Г.В. Смирнова // Микробиология. - 2009. - Т. 78. -В. 3,-С. 328 -333.

13. Ushakov V.U. Changes in redox state modulate SOS-response in the cells of Escherichia coli / V.U. Ushakov // Abstracts of 13th annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2009". - Kazan, 2009. - P. 71-72.

Подписано в печать 16.09.2009. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1. Формат 60x90/16. Набор компьютерный. Заказ № 183/2009.

Отпечатано в типографии ИД "Пресстайм" Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ушаков, Вадим Юрьевич

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. SOS-система.

1.1. Индукция SOS-ответа.

1.2. Структура и функции белка RecA.

1.3. Функции SOS-системы.

1.4. Связь SOS-системы с другими системами адаптации.

Глава 2. Биологическое действие ультрафиолетового излучения.

Глава 3. Тиоловые редокс-системы бактерий.

3.1. Редокс-система глутатиона.

3.1.1. Распространение глутатиона.

3.1.2. Физико-химические свойства глутатиона.

3.1.3. Ферменты метаболизма глутатиона.

3.1.4. Глутаредоксины.

3.2. Редокс-система тиоредоксина.

3.3. Связь между редокс-системами глутатиона и тиоредоксина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. Объекты и методы исследования.

4.1. Бактериальные штаммы.

4.2. Питательная среда и условия культивирования.

4.3. Определение содержания внутри- и внеклеточного глутатиона.

4.4. Определение активности Р-галактозидазы.

4.5. Определение выживаемости клеток.

4.7. Определение частоты мутаций.

4.8. Определение разрывов ДНК.

4.9. Определение активности каталаз HPI и HPII.

4.10. Определение внутриклеточной концентрации перекиси водорода.

4.11. Статистическая обработка данных.

Глава 5. Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Е. coli.

5.1. Влияние УФ-света на бактерии Е. coli.

5.1.1. Рост бактерий.

5.1.2. Выживаемость и частота мутаций.

5.1.3. Экспрессия гена sulA

5.1.4. Экспрессия гена katG.

5.1.5. Изменения уровня и редокс-статуса глутатиона.

5.1.6. Влияние кверцетина.

5.2. Влияние SH-реагентов и тиолсодержащих соединений на SOS-ответ у бактерий Е. coli.

5.2.1. Тиосалициловая кислота.

5.2.2. а-монотиоглицерин

5.2.3. Дитиотреитол.

5.2.4. Обработка Е. coli gshA' глутатионом.

5.2.5. Диамид.

Глава 6. Роль тиоловых редокс-систем в ответе бактерий Е. coli на обработку перекисью водорода и митомицином С.

6.1. Влияние перекиси водорода на бактерии Е. coli.

6.1.1. Рост и выживаемость бактерий.

6.1.2. Частота мутаций.

6.1.3. Влияние перекиси водорода на активность каталаз HPI,

HPII и экспрессию генов sulA и katG.

6.1.4. Изменение уровня и редокс-статуса глутатиона.

6.2. Влияние кверцетина на бактерии E.coli при действии перекиси водорода.

6.2.1. Рост, выживаемость и мутагенез.

6.2.2. Экспрессия sulAr.lacZ.

6.2.3. Влияние обработки хелаторами ионов железа и перекисью водорода.

6.3. Влияние митомицина С на рост и экспрессию sulAr.lacZ.Ill

Глава7. Обсуждение.

7.1. Ответ Escherichia coli на УФ-облучение.

7.2. Ответ Escherichia coli на действие перекиси водорода.

7.3. Роль глутатиона.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli"

Одной из важных систем, вовлеченных в защиту бактерий от повреждения ДНК при воздействии УФ-облучения и химических веществ, является SOS-система, обнаруженная Радманом в 1974 году. Два регуляторных белка LexA и RecA контролируют SOS-ответ, включающий индукцию около 40 генов, продукты которых участвуют в репликации ДНК, репарации и контроле деления клеток ( Fernandez de Henestrosa et al., 2000). При повреждении ДНК белок RecA активируется, связываясь с одноцепочечной ДНК в репликационной вилке, разрезает репрессор LexA и снимает репрессию генов SOS-ответа (Walker, 2000; Friedberg et al., 1995). В течение последних десятилетий усилиями многих исследователей были расшифрованы основные механизмы SOS-ответа, и это привело к более глубокому пониманию таких процессов как репарация, рекомбинация и мутагенез. Предполагается наличие подобной системы в клетках высших эукариот, что открывает новые перспективы в изучении онкогенеза.

В настоящее время все большее внимание уделяется изучению редокс-регуляции клеточной активности с участием таких тиоловых соединений как глутатион (GSH), тиоредоксин (Тгх) и глутаредоксин (Grx). Наиболее подробно молекулярные механизмы, участвующие в такой регуляции, изучены эукариотических клеток, в наименьшей степени - у бактерий (Октябрьский и Смирнова, 2007). Накопленные данные свидетельствуют о том, что клеточные редокс-системы могут участвовать в адаптации бактерий к изменяющимся условиям среды (Smirnova and Oktyabrsky, 1994; Смирнова и Октябрьский, 2005). На возможность редокс-регуляции SOS-ответа указывают опубликованные ранее данные о модуляции экзогенными низкомолекулярными тиолами экспрессии некоторых генов, входящих в SOS-регулон (Claycamp, 1988; Claycamp et al, 1990; Javor et al., 1988; Javor, 1989; Smirnova et al., 1994). Предполагается, что тиолы могут активировать SOS-ответ, участвуя как восстановители в реакциях, приводящих к повышению уровня активных форм кислорода (АФК), способных, в свою очередь, вызывать повреждения ДНК (Park and Imlay, 2003). Другой возможный путь -прямое или косвенное взаимодействие тиолов (в том числе, глутатиона или тиоредоксина) с белком RecA. На последнюю возможность указывает наличие в белке RecA SH-групп, существенных для его активности. Недавно обнаружено, что у Е. coli RecA, как и ряд других белков, связан с тиоредоксином (Kumar J.K et al., 2004). Однако, в целом, данные по этой проблеме немногочисленны и противоречивы.

Определение роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе клеток Е. coli, индуцированом УФ-излучением и химическими веществами, является одной из приоритетных задач в современной микробиологии, решение которой позволит продвинуться в понимании механизмов регуляции различных систем бактериальной клетки при адаптации к изменению параметров окружающей среды.

Основные задачи исследования:

5. Изучить влияние кверцетина на SOS-ответ при действии УФ-света и перекиси водорода.

Научная новизна работы.

Обнаружено, что у бактерий Е. coli тиоловые редокс-системы глутатиона и тиоредоксина играют важную роль в SOS-ответе, индуцируемом облучением дальним УФ-светом или пероксидом. Выраженность изменений и их направленность зависят от вида мутации и экспозиции.

Показано, что у бактерий Е. coli, дефицитных по синтезу глутатиона, наблюдается более высокая частота индуцированных мутаций и более высокая устойчивость к бактериостатическому действию дальнего УФ-света по сравнению с клетками родительского типа.

Впервые обнаружено, что при облучении дальним УФ-светом бактерии Е. coli, дефицитные по синтезу тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы, проявляют более высокий уровень экспрессии гена sulA, входящего в регулон SOS-ответа. Эти бактерии более устойчивы к бактерицидному и бактериостатическому действию дальнего УФ-света по сравнению с клетками родительского типа. Кроме того, в мутантах по тиоредоксинредуктазе наблюдалась более высокая частота УФ-индуцированных мутаций.

Показано, что мутанты по редокс-системам существенно отличались как между собой, так и от клеток родительского типа по своему ответу на окислительный стресс, вызванный действием экзогенной перекиси водорода. Как и в случае с УФ-облучением, из общего ряда мутантов выделяются бактерии, дефицитные по тиоредоксинредуктазе. Эти мутанты показали самый высокий уровень Н202-индуцируемого мутагенеза и экспрессии генов sulA и katG, а также повышенную каталазную активность и устойчивость к бактериостатическому действию оксиданта. Обнаружено также, по сравнению другими испытанными штаммами эти мутанты выделяются высоким базовым уровнем внутриклеточного глутатиона и способностью восстанавливать этот уровень после окислительного стресса. Одновременно эти бактерии имели самый низкий базовый уровень внеклеточного глутатиона.

Практическое и теоретическое значение работы.

1. Данные по устойчивости бактерий к действию УФ-света и перекиси водорода могут быть использованы для совершенствования методов стерилизации в медицине и биотехнологии.

2. Бактерии Е. coli, дефицитные по синтезу тиоредоксинредуктазы и показавшие высокий уровень Н2С>2- и УФ-индуцированных мутаций, могут быть использованы в научных исследованиях и биотехнологии для получения различных мутантов с полезными свойствами.

3. Бактерии Е. coli, дефицитные по глутаредоксину и обладающие повышенным экспортом глутатиона, могут быть использованы в биотехнологии для получения этого антиоксиданта без разрушения клеток.

4. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре физиологии растений и микроорганизмов ГОУ ВПО Пермский государственный университет.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Облучение бактерий УФ-светом приводит к повышению уровня внутриклеточного глутатиона во всех штаммах и снижению внеклеточного глутатиона в клетках родительского типа и у бактерий, дефицитных по тиоредоксинредуктазе.

4. Наибольшие изменения характерны для мутантов Е. coli, дефицитных по тиоредоксину А и тиоредоксинредуктазе. У этих бактерий наблюдались повышенные уровни экспрессии sulA, а также более высокая устойчивость к бактериостатическому и бактерицидному действию дальнего УФ-света по сравнению с клетками родительского типа.

5. Повышенная устойчивость мутантов Е. coli по тиоредоксинредуктазе к действию пероксида связана с высоким уровнем экспрессии генов sulA и katG, а также с повышенной каталазной активностью.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на молодежной конференции УрО РАН «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Пермь, 2007); VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет» (Пермь - Н.Новгород - Пермь, 2008).; II конгрессе студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз 2009» (Пермь, 2009).

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах печатного текста, иллюстрирована 41 рисунком и 5 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Список литературы включает 230 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ушаков, Вадим Юрьевич

ВЫВОДЫ

2. Наибольшие изменения обнаружены у мутантов, дефицитных по тиоредоксину 1 и тиоредоксинредуктазе. У этих бактерий наблюдались повышенные уровни экспрессии sulA, а также более высокая устойчивость к бактериостатическому и бактерицидному действию дальнего УФ-света по сравнению с клетками родительского типа.

3. Облучение бактерий УФ-светом приводило к повышению уровня внутриклеточного глутатиона во всех штаммах и снижению внеклеточного глутатиона в клетках родительского типа и в бактериях, дефицитных по тиоредоксинредуктазе.

4. Выявлена положительная корреляция между уровнем внутриклеточного глутатиона и УФ-индуцированной экспрессией гена sulA в штаммах Е. coli, дефицитных по глутатиону, тиоредоксину, тиоредоксинредуктазе и в клетках родительского типа.

5. При действии на бактерии Е. coli перекиси водорода из общего ряда мутантов выделяются бактерии, дефицитные по тиоредоксинредуктазе. Эти мутанты показали самый высокий уровень Н202-индуцируемого мутагенеза и экспрессии генов sulA и katG, а также повышенную активность каталаз HPI HPII и устойчивость к бактериостатическому действию оксиданта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ушаков, Вадим Юрьевич, Пермь

1. Бурчуладзе Т.Г. Сенсибилизированное НАДН образование однонитевых разрывов в плазмидной ДНК при действии ближнего УФ излучения / Т.Г. Бурчуладзе, Э.Г. Сидерис, Г.Я. Фрайкин//Биофизика. -1990.-Т. 35.-С. 722-725.

2. Владимиров Ю.А. Инактивация ферментов ультрафиолетовым облучением / Ю.А. Владимиров//Соросовский образовательный журнал. — 2001.-Т. 7.-С. 20-27.

3. Глазер В.М. Гомологичная генетическая рекомбинация / В-М. Глазер//Соросовский образовательный журнал. 1998. - Т. 7. - С. 13-21 ■

4. Максимов А.Ю. Влияние флавоноидов на экологию энтеробактерии / А.Ю. Максимов, Н.Б. Ремезовская, В.А. Демаков//Экология 2003. — Т. 2.-С. 121-125.

5. Октябрьский О.Н. Редокс-регуляция клеточных функций / О.Н. Октябрьский, Г.В. Смирнова//Биохимия. 2007. - Т. 72. - С. 158-174.

6. Патрушев Л.И. Экспрессия генов / Л.И. Патрушев. М.: Наука, 2000. - С. 449-452.

7. Потапенко А.Я. Ультрафиолетовое излучение солнца и здоровье человека/ А.Я. Потапенко//Соросовский образовательный журнал. — 2004. -Т. 8.-С. 1-9.

8. Смирнова Г.В. Статус глутатиона и экспрессия антиоксидантНЫХ генов у Escherichia coli при действии цистина и перекиси водорода / Г.В. Смирнова, Н.Г. Музыка, О.Н. Октябрьский//Биохимия. 2005. - Т. 70. — С. 1119-1129.

9. Смирнова Г.В. Изменение количества SH-соединений в культураХ Escherichia coli и Bacillus subtilis при переходе в стационарную фазу / Смирнова, О.Н. Октябрьский//Микробиология. 1990. - Т.59. - С. 387393.

10. Смирнова Г.В. Глутатион у бактерий / Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский//Биохимия. 2005. - Т. 70. - С. 1459-1473.

11. Сойфер BIT. Репарация генетических повреждений / В.Н. Сойфер//Соросовский образовательный журнал. 1997. - Т. 8. - С. 4-13.

12. Allocati N. Effect of anaerobic environment on the glutathione transferase isoenzymatic pattern in Proteus mirabilis / N. Allocati, A. Aceto, L. Cellini, M. Masulli, B. Dragani, R. Petruzzelli, C. Di Ilio//FEMS Lett. 1997. -V. 147.-P. 157-162.

13. Apontoweil P. Glutathione biosynthesis in Escherichia coli K12: properties of the enzymes and regulation / P. Apontoweil, W. Berends//Biochim. Biophys. Acta. 1975a. -V. 399. - P. 1-9.

14. Apontoweil P. Isolation and initial characterization of glutathione-deficient mutants of Escherichia coli К 12 / P. Apontoweil, W. Berends//Biochim. Biophys. Acta. 1975b. - V. 399. - P. 10-22.

15. Area P. Formation of an adduct between fosfomycin and glutathione: a new mechanism of antibiotic resistance in bacteria / P. Area, M. Rico, A.F. Brana, C.J. Villar, C. Hardisson, J.E. Suarez//Antimicrob. Agents Chemother. -1988.-V. 32.-P. 1552-1556.

16. Arner E.S.J. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase / E.S.J. Arner, A. Holmgren//Eur. J. Biochem. 2000. - V. 267. - P. 6102-6109.

17. Arscott L.D. Inactivation-reactivation of two-electron reduced Escherichia coli glutathione reductase involving a dimer-monomer equilibrium / L.D. Arscott, D.M. Drake, J.C. Williams//Biochem. 1989. - V. 28. - P. 3591-3598.

18. Aslund F. Glutaredoxin-3 from Escherichia coli. Amino acid sequence, 'H and ,5N NMR assignments, and structural analysis / F. Aslund, K. Nordstrand, K.D. Berndt, M. Nikkola, T. Bergman//J. Biol. Chem. 1996. - V. 271.-P. 6736-6745.

19. Aslund F. Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol-disulide status / F. Aslund, M. Zheng, J. Beckwith, G. Storz//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. - V. 96. - P. 61616165.

20. Bayer M.E. Association of thioredoxin with the inner membrane and adhesion sites in Escherichia coli / M.E. Bayer, M.H. Bayer, C.A. Lunn, V. Pigiet//J. Bacterid. 1987. - V. 169. - P. 2659-2666.

21. Benson F.E. Evidence of abortive recombination in ruv mutants of Escherichia coli / F.E. Benson, S. Collier, R.G. Lloyd//Mol. Gen. Genet. -1991.-V. 225.-P. 266-272.

22. Bors W. Flavonoid antioxidants: rate constants for reaction with oxygen radicals / W. Bors, C. Michel, M. Saran//Methods Enzymol. 1994. - V. 234. -P. 420-429.

23. Boots A.W. The quercetin paradox/A.W. Boots, H. Li, R. Schins, R. Duffin, J. Heemskerk, A. Bast, G. Haenen//Toxicol. Appl. Pharm. 2007. - V. 222. - P. 89-96.

24. Boots A.W. Oxidized quercetin reacts with thiols rather than with ascorbate: implication for quercetin supplementation / A.W. Boots, N. Cubben, G.Haenen, A. Bast//Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - V. 308. -P.560-565.

25. Brawn К. Increased superoxide radical production evokes inducible DNA repair in Escherichia coli / K. Brawn, I. Fridovich//J. Biol. Chem. 1985. -V. 260.-P. 922-925.

26. Brigelius R. Mixed disulfides: biological functions and increase in oxidative stress / R. Brigellius//Oxidative stress / Academic Press. London, 1985.-P. 243-272.

27. Cohen G. Glutathione peroxidase: the primary agent for the elimination of hydrogen peroxide in erythrocytes / G. Cohen, P. HochsteinZ/Biochem. — 1963.-V. 2.-P. 1420-1426.

28. Courcelle J. Comparative gene expression profiles following UV exposure in wild-type and SOS-deficient Escherichia coli / J. Courcelle, A. Khodursky, B. Peter, P.O. Brown, C. Hanawalt // Genetics. 2001. - V. 158. -P. 41-64.

29. Buchardt S.E. UmuD mutagenesis protein of Escherichia coli: overproduction, purification and cleavage by RecA / S.E. Buchardt, R. Woodgate, R.H. Scheuremann, H. Echols//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -V. 85.-P. 1811-1815.

30. Bushweller J.H. Structural and functional characterization of the mutant Escherichia coli glutaredoxin (C14-S) and its mixed disulfide with glutathione / J.H. Bushveller, F. Aslund, K. Wuthrich, A. Holmgren//Biochem. 1992. - V. 31.-P. 9288-9293.

31. Capaldo F.N. Analysis of the growth of recombination-deficient strains of Escherichia coli K-12 / F.N. Capaldo, G. Rumsey, S.D. Barbour//J. Bacteriol. 1974. - V. 118. - P. 242-249.

32. Chamberlaine J. Lipid peroxidation and other membrane damage produced in Escherichia coli К1060 by near-UV radiation and deuterium oxide / J. Chamberlain, S.H. Moss//Photochem. Photobiol. 1987. - V. 45. - P. 625630.

33. Chase J.W. Amplification of ssb-l mutant single-stranded DNA binding protein in Escherichia coli / J.W. Chase, J.B. Murphy, R.F. Whittier, E. Lorensen, J. Sninsky//J. Mol. Biol. 1983. - V. 164. - P. 193-211.

34. Chen Z. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures / Z. Chen, H. Yang, N. Pavletich//Nature. 2008. -V. 453.-P. 489-494.

35. Cirz R.T. Inhibition of mutation and combating the evolution of antibiotic resistance / R.T. Cirs, J. Chin, D. Andes, V. Crecy-Lagard, W. Craig, F. Somesberg//PLoS Biology. 2005. - V. 3. - P. 1024-1033.

36. Claycamp H.G. Dithiotreitol pretreatment and inducible repair in UV-irradiated Escherichia coli K-12 cells / H.G. Claycamp//Int. J. Radiat. Biol. -1988.-V. 53.-P. 381-393.

37. Claycamp G. Thiol and hydrogen peroxide modification of recA induction in UV-irradiated wild-type and catalase-deficient Escherichia coli K-12 / G. Claycamp, K.-K. Ho, C. DeRose//Mutat. Res. 1990. - V. 235. - P. 101-109.

38. Connor M.J. Depletion of cutaneous glutathione by ultraviolet radiation / M.J. Connor//Photochem. Photobiol. 1986. - V. 438. - P. 69-73.

39. D'Ari R. The SOS-system / R. D'Ari/ZBiochimie. 1985. - V. 67. - P. 343-347.

40. Damdimopoulos A.E. Human mitochondrial thioredoxin. Involvement in mitochondrial potential and cell death / A.E. Damdimopoulos, A. Miranda-Visuete, M. Pelto-Huikko, J.-A. Gustaffson, G. Spyrou//J. Biol.Chem. 2002. -V. 277.-P. 33249-33257

41. Derman A.F. Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli / A.F. Derman, W.A. Prinz, D. Belin, J-Beckwith//Science. 1993. -V. 262. - P. 1744-1747.

42. Dyson H.J. Assignment of the proton NMR spectrum of reduced and oxidized thioredoxin: sequence-specific assignments, secondary structure, and global fold / H.J. Dyson, A. Holmgren//Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 7074-7087.

43. Egelman E.H. Implications of the RecA structure / E.H. Egelman//Biol. Reports Ltd. 2009. - V. 1 (7) - P. 1-3.

44. Eklund H. Structural and functional relations among thioredoxins of different spicies / H. Eklund, F. Gleason, A. Holmgren//Proteins: Struct., Funct., Genet.-1991.-V. 11.-P. 13-28.

45. Elledge S.J. Protein required for ultraviolet light and chemical mutagenesis: identification of the products of the umuC locus of Escherichia colil S.J. Elledge, G.C. Walker//J. Mol. Biol. 1983. -V. 164. - P. 175-192.

46. Epel B.L. Inhibition of growth and respiration by visible and near-visible light / B.L. Epel// Photophisiology. 1973. - V. 8. - P. 209-229.

47. Fahey R.C. Occurrence of glutathione in bacteria / R.C. Fahey, W.C. Brown, W.B. Adams., M.B. Worsham//J. Bacteriol. 1978. - V. 33. - P. 11261129.

48. Favre A. Transfer RNA: from photophysys to photobiology / A. Favre, G. Thomas//Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1981. - V. 10. - P. 175-195.

49. Fenton H.J.H. The oxidation of polyhydric alcohols in the presence of iron I HJ.H. Fenton, H. Jackson//! Chem. Soc. Trans. 1899. - Vol.75. -P.l-11.

50. Frank E.G. Regulation of SOS mutagenesis by proteolysis / E.G. Frank, D.G. Ennis, M. Gonzales, A.S. Levine, R. Woodgate/ZProc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.-V. 93.-P. 10291-10296.

51. Friedberg E.C. DNA repair and mutagenesis / E.C. Friedberg, G.C. Walker, W. Siede//ASM Press. Washington, DC, 1995.

52. Fuchs J.A. Isolation of an Escherichia coli mutant deficient in glutathione synthesis / J.A. Fuchs, H.R. Warner//J. Bacteriol. 1975. - V. 124. -P. 140-148.

53. Goerlich O. Induction of the SOS response by hydrogen peroxide in various Escherichia coli mutants with altered protection against oxidative DNA damage / O. Goerlich, P. Quillaret, M. Hofnung//J. Bacteriol. 1989. - V. 171. -P. 6141-6147.

54. Gonzales-Flecha В. Homeostatic regulation of intracellular hydrogen peroxide concentration in aerobically growing Escherichia coli / B. Gonzales-Flecha, B. Demple//J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 7173-7181.

55. Greenberg J. Glutathione in Escherichia coli is dispensable for resistance to H2O2 and gamma radiation / J. Greenberg, B. Demple//J. Bacteriol. 1986. -V. 168.-P. 1026-1029.

56. Greer S. Glutathione reductase from Escherichia coli: cloning and sequence analysis of the gene and relationship to other flavoprotein disulfide oxidoreductases / S. Greer, R.N. Perham/ZBiochem. 1986. - V. 25. - P. 27362742.

57. Gushima H. Purification and characterization of glutathione synthetase from Escherichia coli / H. Gushima, T. Miya, K. Murata, A. Kimura//J. Appl. Biochem. 1983. - V. 5. - P. 210-218.

58. Herman L. Transduction studies on the role rec+ gene in the ultraviolet induction of prophage X / L. Herman, S.E. Luria,//J. Mol. Biol. 1967. - V. 23. -P. 117-133.

59. Hill T.M. s/z-independed filamentation in Escherichia coli is I ex A depended and requires DNA damage for induction / T.M. Hill, B. Sharma, M. Valjavec-Gratian, J. Smith//J. Bacteriol. 1997. -V. 179. - 1931-1939.

60. Holmgren A. Glutathione-dependent synthesis of deoxyribonucleotides / A. Holmgren//J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. - P. 3661-3669.

61. Holmgren A. Thioredoxin / A. Holmgren//Ann. Rev. Biochem. 1985. -V. 54.-P. 237-271.

62. Holmgren A. Thioredoxin and glutaredoxin systems / A. Holmgren//J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 13963-13966.

63. Holmgren A. Thioredoxin structure and mechanism: conformation changes on oxidation of the active-site sulphydryls to a disulfide / A. Holmgren//Structure. 1995. -V. 3. - P. 239-243.

64. Holmgren A. Thiol redox control via thioredoxin and glutaredoxin systems / A. Holmgren, C. Johansson, C. Berndt, M.E. Lonn, C. Hudemann, C.H. Lillid//Biochem. Soc. T. 2005. - V. 33. - P. 1375 - 1377.

65. Holmgren A. Thioredoxin and thioredoxinreductase / A. Holmgren, M. Bjornstedt/ZMethods in Enzymology. 1995. - V. 252. - P. 199 - 209.

66. Hoog J.O. Nucleotide sequence of the thioredoxin gene from Escherichia coli / J.O.Hoog, H. Bahr-Lindstrom, S. Josephson, B.I. Wallace, S.R. Kushner, H. Jornvall, A. Holmgren//Biosci. Rep. 1984. - V. 4. - P. 917-923.

67. Horii T. Organization of recA gene of Escherichia coli. / T. Horii, T. Ogawa, H. Ogawa//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 77.-P. 313-317.

68. Houten B. Nucleotide excision repair in Escherichia coli / B. Houten//Microb. Mol. Biol. Rev. 1990. - V. 54. - P. 18-51.

69. Howard-Flanders P. DNA repair and genetic recombination: studies on mutants of Escherichia coli defective in these processes / P. Howard-Flanders, R.P. Boyce//Radiat. Res. 1966. - V. 6. - P. 156-181.

70. Huisman O. An inducible DNA replication-cell division coupling mechanism in Escherichia coli / O. Huisman, R. D'Ari//Nature (London). -1981.-V. 290.-P. 797-799.

71. Iizuka M. Purification and some properties of glutathione ^-transferase from Escherichia coli / M. Iizuka, Y. Inoue, K. Murata, A. Kimura//J. Bacteriol. — 1989. V. 171.-P. 6039-6042.

72. Inouye M. Pleiotropic effect of the recA gene of Escherichia coli uncoupling of cell division from deoxyribonucleic acid replication / M. Inouye//J. Bacteriol. 1971. - V. 106. - P. 539-542.

73. Imlay J.A. Mutagenesis and stress responses induced in Escherichia coli by hydrogen peroxide / J.A. Imlay, S. Linn//J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 2967-2976.

74. Ishioka К. Abortive recombination in Escherichia coli ruv mutants block chromosome partitioning / K. Ishioka, A. Fukuoh, H. Iwasaki, A. Nacata, H. Shinagava//Genes Cells. 1998. - V. 3. - P. 209-220.

75. Ivanova A. Role of rpoS (katF) in OxyR-independed regulation of hydroperoxidase I in Escherichia coli / A. Ivanova, C. Miller, G. Glinsky, A. Eisenstark//Mol. Microbiol. 1994. - V. 12. - P. 571-578.

76. Jagger J. Physiological effects on near-ultraviolet radiation on bacteria / J. Jagger//Photochem. Photobiol. Rev. 1983. - V. 7. - P. 1-73.

77. Jacob U. Hsp33"s redox switch has a novel zinc-binding motif / U. Jacob, M. Eser, J.C. Bardwell//J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 38302-38310.

78. Janion C. Some aspects of the SOS response system a critical survey / C. Janion//Acta Biochimica Polonica. - 2001. - V. 48. - P. 599-610.

79. Javor G. Thiol-sensitive genes of Escherichia coli / G. Javor//J. Bacteriol. 1989.-V. 171.-P. 5607-5613.

80. Javor G. Thiol-sensitive promoters of Escherichia coli / G. Javor, C. Stringer, J.-I. Ryu//J. Bacteriol. 1988. -V. 170. - P. 3291-3293.

81. Jeng M.F. High-resolution solution structures of oxidized and reduced Escherichia coli thioredoxin / M.F. Jeng, A.P. Campbell, T. Begley, A. Holmgren, D.A. Case, P.E. Wright, H.J. Dyson//Structure. 1994. - V. 2. - P. 853 -868.

82. Kanakis C.D. DNA interactions with naturally occurring antioxidant flavonoid quercetin, kaempferol, and delphinidin / C.D. Kanakis, P.A. Tarantilis, M.G. Polissiou, S. Diamantoglou, H.A. Tajmir-Riahi//J. Biomol. Struct. Dyn. 2005. - V.22. - P.719-724.

83. Karu A.E. Introduction of Escherichia coli recA protein via recBC and alternative pathways: quantitation by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / A.E. Karu, E.D. Belk//Mol. Gen. Genet. 1982. - V. 185. - P. 275282.

84. Katti S. Crystal structure of thioredoxin from Escherichia coli at 1,68 A resolution / S. Katti, D. LeMaster, H. Eklund//J. Mol. Biol. 1990. - V. 212. -P. 167-184.

85. Keyer K. Superoxide and the production of oxidative DNA damage / K. Keyer, A.S. Gort, J.A. Imlay//J. Bacteriol. 1995. - Vol.177. - P.6782-6790.

86. Keyer K. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free-iron levels / K. Keyer, J. Imlay//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 13636-13640.

87. Koch A.L. Inactivation of membrane transport in Escherichia coli by near UV-light / A.L. Koch, R.J. Doyle, H.E. Kubitschek//J. Bacteriol. 1976. -V. 126.-P. 140-146.

88. Kohevar I.E. Cutaneous photobiology / I.E. Kohevar, R.W. Gange//Photochem. Photobiol. 1983. - V. 37. - P. 659-700.

89. Kosower N.S. Diamide, an oxidant probe for thiols / N.S. Kosower, E.M. Kosower//Methods Enzymol. 1995. - P. 123-133.

90. Kosower N.S. The glutathione status of cells / N.S. Kosover, E.M. Kosower//Internat.Rev.Cytol. 1978. - V. 54. - P. 109-160.

91. Kowalczykowski S.C. Mechanistic aspects of the DNA strand exchange activity of E. coli RecA protein / S.C. Kowalczykowski//Trends Biochem. Sci. 1987. - V. 12.-P. 141-145.

92. Kowalczykowski S.C. Initiation of genetic recombination and recombination-depended replication / S.C. Kowalczykowski//Trends Biochem. Sci.-2000.-V. 25.-P. 156-165.

93. Kowalczykowski S.C. Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli / S.C. Kowalczykowski, D.A. Dixon, A.K. Eggleston, S.D. Lauder, W.M. Rehrauer//Microbiol. Rev. 1994. - V. 58. - P. 401-465

94. Kramer G.F. Oxidative mechanisms of toxicity of low-intensity near-UV light in Salmonella typhimurium / G.F. Kramer, B.N. Ames//J. Bacteriol. — 1987.-P. 2259-2266.

95. Kumar J.K. Proteomic analysis of thioredoxin-targeted proteins in Escherichia coli / J. K. Kumar, S. Tabor, C.C. Richardson//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -V. 101. - P. 3759-3764.

96. Kuramitsu S. Cysteinyl residues of Escherichia coli RecA protein / S. Kuramitsu, K. Hamaguchi, H. Tachibana, T. Horii, T. Ogava, H. Ogava //Biochem. 1984. - V. 23. - P. 2363-2367.

97. Kuzminov A. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage X / A. Kuzminov//Microb. Mol. Biol. Rev. 1999. - V. 63.-P. 751-813.

98. Kuzuhara T. DNA and RNA as new binding targets of green tea catechins / T. Kuzuhara, Y. Sei, K. Yamaguchi, M. Saganuma, H. Fujiki//J. Biol. Chem. 2006. - V.281. - P. 17446-17456.

99. Laurent T.C. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleotides. IV. Isolation and characterization of thioredoxin, the hydrogen donor from Escherichia coli / T.C. Laurent, E.C. Moore, P. Reichard//J. Biol. Chem. 1964. - V. 239. - P. 3436-3444.

100. Lawrence C.W. Mutation frequency and spectrum resulting from single abasic site in a single-stranded vector / C.W. Lawrence, A. Borden, S.K. Banerjee, J.E. LeClerc//Nucleic Acids Res. 1990. -V. 18. - P. 2153-2157.

101. Lennon B.W. Twists in cataysis: alternating conformations of Escherichia coli thioredoxin reductase / B. W. Lennon, C.H.Jr. Williams, M.L. Ludwig//Science. 2000. - V. 289. - P. 1190-1194.

102. Lewis L.K. Identification of high affinity binding sites for LexA which define new DNA damage-inducible genes in Escherichia coli / L.K. Lewis, G.R. Harlow, L.A. Gregg-Jolly, D.W. Mount//J. Mol. Biol. 1994. - V. 241. -P. 507-523.

103. Llagostera M. Influence of S9 mix in the induction of SOS system by quercetin / M. Llagostera, S. Garrido, J. Barbe, R. Guerrero, J. Rueff//Mutat. Res. 1987.-V. 191.-P. 1-4.

104. Lloubes R. The promoters of the genes for colicin production, release and immunity in the ColA plasmid: effects of convergent transcription and LexA protein / R. Lloubers, D. Baty, C. Lazdunslci//Nucleic Acids Res. 1986. — V. 14.-P. 2621-2636.

105. Lloyd R.G. Effect of ruv mutations on recombination and DNA repair in Escherichia coli K-12 / R.G. Lloyd, F.E. Benson, C.E. Shurvinton//Mol. Gen. Genet.- 1984.-V. 193.-P. 303-309.

106. Lim C.J. Cloning and nucleotide sequence of the trxA gene of Escherichia coli K-12 / C.J. Lim, D. Geraghty, J.A. Fuchs//J. Bacteriol. -1985.-V. 163.-P. 311-316.

107. Lin J.J. (A)BC exinuclease: the Escherichia coli nucleotide excision repair enzyme / J.J. Lin, A. Sancar//J. Mol. Biol. 1992. - V. 6. - P. 22192224.

108. Lindsley J.E. Dissociation pathway for RecA nucleoprotein filaments formed on linear duplex DNA / J.E. Lindsley, M.M. Cox//J. Mol. Biol. 1989. -V. 205.-P. 695-711.

109. Loewen P.C. Levels of coenzyme A-glutathione mixed disulfide in Escherichia coli / P.C. Loewen//Can. J. Biochem. 1978. - V. 56. - P. 753759.

110. Loewen P.C. Levels of glutathione in Escherichia coli / P.C. Loewen//Can. J. Biochem. 1979. - V. 57. - P. 107-111.

111. Lwoff A. Lysogeny / A. LwoffZ/Bacteriol. Rev. 1953. - V. 17. - P. 237-269.

112. Mannervik B. Glutathione: General Review of Mechanism of Action / B. Mannervic, I. Carlberg, K. Larson/VGlutathione: chemical, biochemical and medical aspects. Parts А, В / New York, 1989 P. 476-516.

113. Martin J.L. Thioredoxin a fold for all reasons / J.L. Martin//Structure. — 1995.-V. 3.-245-250.

114. McEntree K. Genetic analysis of the Escherichia coli K-12 srl region / K. McEntree//J. Bacteriol. 1977. - V. 132. - P. 904-911.

115. McKenzie G. The SOS response regulates adaptive mutation / G. McKenzie, R. Harris, P. Lee, S. Rosenberg//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2006. V. 97. - P. 6646-6651.

116. Meister A. On the cycles of glutathione metabolism and transport / A. Meister//Curr. Top. Cell Regul. 1981. -V. 18. - P. 21-58.

117. Meister A. Glutathione / A. Meister, M.E. Anderson//Annu. Rev. Biochem. 1983. - V. 52. - P. 711 -760.

118. Meister A. New aspects of glutathione biochemistry and transport -selective alteration of glutathione metabolism / A. Meister//Nut.Rev. 1984. -V. 42.- P. 397-410.

119. Melidou M. Protection against nuclear DNA damage offered by flavonoids in cells exposed to hydrogen peroxide: the role of iron chelation / M. Melidou, K. Riganacos, D. Galaris//Free Radic. Biol. Med. 2005. - V. 39. - P. 1591-1600.

120. Mellon I. Induction of the Escherichia coli lactose operon selectively increases repair of its transcribed DNA strand / I. Mellon, P.C. Hanawalt//Nature. 1989. - V. 342. - P. 95-98.

121. Meury J. Glutathione and the gated potassium channels of Escherichia coli / J. Meury, A. Kepes//The EMBO J. 1982. - V. 1. - P. 339-343.

122. Meyer R.R. The single-stranded DNA-binding protein of Escherichia coli / R.R. Meyer, P.S. Laine/ZMicrob. Mol. Biol. Rew. 1990. - V. 54. - P. 342-380.

123. Miller J.H. Experiments in molecular genetics / J.H. Miller Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972.

124. Miller C. SOS response induction by beta-lactams and bacterial defense against antibiotic lethality / C. Miller, L.E. Tomsen, C. Gaggero, R. Mosseri, H. Ingmer, S.N. Cohen//Science. 2004. - V. 305. - P. 1629-1631.

125. Miranda-Vizuete A. Cloning, expression, and characterization of a novel Escherichia coli thioredoxin / A. Miranda-Vizuete, A.E. Damdimopoulos, J.A. Gustafsson, G. Spyrou//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 30841-30847.

126. Mizusawa S. Protein degradation in Escherichia coli: the Ion gene controls the stability of the SulA protein / S. Mizusawa, S. Gottesman//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V. 80. - P. 358-362.

127. Mody R. Influence of far-ultraviolet radiation on permeability of outer membrane of Escherichia coli / R. Mody, S. Krishnamurthy, P. Dave//Can. J. Microbiol. 1989. - V. 35. - P. 1022-1030.

128. Mooze E.D. Association of glutathione synthetase deficiency and diminished amino acid transport in yeast / E.D. Mooz//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. - V. 90. - P. 1221-1228.

129. Moore E.C. Purification and properties of thioredoxin reductase from Escherichia coli / E.C. Moore, P. Reichard, L. Thelander//J. Biol. Chem. — 1964. V. 239. - P. 3445-3452.

130. Mukherjee A. Inhibition of FtsZ polymerization by SulA, an inhibitor of septation in Escherichia coli / A. Mukherjee, C. Cao, J. Lutkenhaus//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. - V. 95. - P. 2885-2890.

131. Murata K. Overproduction of glutathione and its derivatives by genetically engineered microbial cells / K. Murata, A. Kimura//Biotechnol. Adv. 1990. - P. 8. - P. 59-96.

132. Mustard J. A. Analysis of Escherichia coli RecA interaction with LexA, X CI, and UmuD by site-directed mutagenesis of recA / J.A. Mustard, J.W. Little//J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 1659-1670.

133. Nagai K. Zinc-finger motifs expressed in E. coli and folded in vitro direct specific binding to DNA / K. Nagai, Y. Nakaseko, K. Nasmyth, D. Rhodes//Nature. 1988. - V. 332. - P. 284-286.

134. Newton G.L. Low-molecular weight thiols in Streptomyces and their potential role as antioxidants / G.L. Newton, R.C. Fahey, G. Cohen, Y. Aharonowitz// J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 2734-2742.

135. Newton Y. Distribution of thiols in microorganisms: mycothiol is a major thiol in most actinomyces / Y. Newton, K. Arnold, M.S. Price, C. Sherrill, S.B.

136. Delcardayre, Y. Aharonowitz, D. Cohen, J. Davies, R.C. Fahey, C. J. Davis//J. Bacteriol.- 1996.-V. 178.-P. 1990-1995.

137. Noctor G. Glutathione: biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in transformed plants / G. Noctor, A.M. Arisi, L. Jouanin, K.J. Kunert, H. Rennenberg, H. J. Foyer//J. Exp. Bot. 1998. - V. 49. -P. 623-647.

138. Nordberg J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system / J. Nordberg, E.S.J. Arner//Free Radic. Biol. Med. 2001. -V.31.- 1287- 1312.

139. Nygaard O.V. Radioprotectors and Anticarcinogens / O.V. Nygaard, M.G. Simic//Academic Press, New York 1983.

140. Nygren H. Immunoelectron microscopic localization of glutaredoxin and thioredoxin in Escherichia coli cells / H. Nygren, B. Rozell, A. Holmgren, H.A. Hansson//FEBS Lett.-1981.-V. 133.-P. 145-150.

141. Opperman T. A model for a umuDC depended prokaryotic DNA damage checkpoint / T. Opperman, S. Murli, B.T. Smith, G.C Walker//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 9218-9223.

142. Osuji G.O. Glutathione turnover and amino acid uptake in yeast / G.O. Osuji//FEBS Lett. 1980. - V. 110. - P. 192-194.

143. Park S. High levels of intracellular cysteine promote oxidative DNA damage by the Fenton reaction / S. Park, J. Imlay//J. Bacteriol. 2003. — V. 185.-P. 1942-1950.

144. Peac M.J. Revised spectra for the inactivation of Haemophilus influenzae transforming DNA by monochromatic ultraviolet light / M.J. Peac, R.W. Tuveson //Photochem. Photobiol. 1979. - V. 29. - P. 855-856.

145. Peac M.J. Inactivation of transforming DNA by ultraviolet light / M.J. Peac, J.G. Peac, R.B. Webb//Mutat. Res. 1973. - V. 20. - P. 143-147.

146. Potamitou A. Protein levels of Escherichia coli thioredoxins and glutaredoxins and their relation to null mutants, growth phase, and function / A.

147. Potamitou, A. Holmgren, A. Vlamis-Gardikas//J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. -P. 18561-18567.

148. Prinz W.A. The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in Escherichia coli cytoplasm / W.A. Prinz, F. Aslund, A. Holmgren, J. Beckwith//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272 - P. 15661-15667.

149. Qin J. The high-resolution three-dimensional solution structures of oxidized and reduced state of human thioredoxin / J. Qin, G.M. Clore, A.M. Gronenborn//Structure. 1994. - V. 2. - P. 503 - 522.

150. Ramabhadran T.V. Mechanism of growth delay induced in Escherichia coli by near ultraviolet radiation / T.V. Ramabhadran, J. Jagger//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. - V. 73. - P. 59-63.

151. Rangarajan S. A phenotype for enigmatic DNA polymerase II in replication restart in UV-irradiated Escherichia coli / S, Rangarajan, R. Woodgate, M.F. Goodman//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 9224-9229.

152. Rhee S.G. Peroxiredoxin, a novel family of peroxidases / S.G. Rhee, S.W. Kang, T.-S. Chang, W. Jeong, K. Kim//IUBMB Life. 2001. - V. 52. - P. 35-41.

153. Roca A.I. RecA protein: structure, function, and role in recombinational repair / A.I. Roca, M.M. Cox//Prog. Nucleic. Acid Res. Mol. Biol. 1997. -V. 56.- P. 129-223.

154. Roberts J.W. Proteolytic cleavage of bacteriophage X repressor in induction / J.W. Roberts, C.W. Roberts//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. -V. 72.-P. 147-151.

155. Roland K.L. In vitro analysis of mutant LexA proteins with an increased rate of specific cleavage / K.L. Roland, M.H. Smith, J.A. Rupley, J.W. Little//J. Mol. Biol. 1992. - V. 228. - P. 395-408.

156. Romero M.Jo.M. The evaluation of Escherichia coli as a model for oxidant stress in mammalian hepatocytes: role of glutathione / M.Jo.M. Romero, A.T. Canada//Toxicol. Appl. Pharm. 1991. - V. 111. - P. 485-495.

157. Rosental F.I. The ocular dose of ultraviolet radiation from sunlight exposure / F.I. Rosental, M. Safrone, H.R Taylor//Photochem. Photobiol. -1985.-V. 42.-P. 163-171.

158. Ruegg U. Cleavage of disulfide bonds in proteins / U. Ruegg, J. Rudinger//Meth. Enzymol. 1977. - V. 47. - P. 111-116.

159. Russel M., Construction and characterization of glutaredoxin-negative mutants of Escherichia coli / M. Russel, A. Holmgren//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 990-994.

160. Russel M. Thioredoxin or glutaredoxin in Escherichia coli is essential for sulfate reduction but not for deoxyribonucleotide synthesis /М. Russel, P. Model, A. Holmgren//J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 1923 - 1929.

161. Sakuda S. Structure of novel disulfide of 2-(N-acetylcysteinyl)amino-2-deoxy-P-D-glucopyranosyl-myo-inositol produced by Streptomyces sp / S. Sakuda, Z.-Y. Zhou, Y. Yamada//Biotech. Biochem. 1994. - V. 58. - P. 1347-1348.

162. Sammartano L.J. The effects of exogenouos catalase on broad-spectrum near-UV (300-400 nm) treated Escherichia coli cells / L.J. Sammartano, Tuveson R.W.//Photochem. Photobiol. 1984. - V. 40. - P. 607-612.

163. Sammartano L.J. Hydrogen peroxide induced resistance to broad-spectrum near-ultraviolet light (300-400 nm) inactivation in Escherichia coli / L.J. Sammartano, Tuveson R.W.//Photochem. Photobiol. 1985. - V. 41. - P. 267-370.

164. Sassanfar M. Nature of the SOS-inducing signal in Escherichia coli. The involvement of DNA replication / M. Sassanfar, J.W. Roberts//J. Mol. Biol. -1990.-V. 212.-P. 79-96.

165. Schafer F.Q. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple / F.Q. Shafer, G.R. Buettner//Free Radic. Biol. Med. -2001. -V. 30. P. 1191-1212.

166. Schlacher K. DNA polymerase V and RecA protein, a minimal mutasome / K. Schlacher, K. Leslie, C. Wyman, R. Woodgate, M. Cox, M. Goodman//Mol. Cell Biol. 2005. - V. 17. - P. 561-572.

167. Schnarr M.P. DNA binding properties of LexA repressor / M.P. Schnarr, P. Oertel-Buchheit, M. Kazmayer, M. Granger-Schnarr//Biochimie. 1991. — V. 73.-P. 423-431.

168. Seaver L. Alkyl hydroperoxide reductase is the primary scavenger of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli / L. Seaver, J. Imlay//J. Bacteriol.-2001.-V. 183.-P. 7173-7181.

169. Shellhorn H.E. Regulation of hydroperoxidase (catalase) expression in Escherichia coli / H.E. Schellhorn//FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 174. -P.4769-4776.

170. Shen X. Escherichia coli DNA polymerase V subunit exchange: a post-SOS mechanism to curtail error-phone DNA synthesis / X. Shen, R. Woodgate, M.N. Goodman//J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 52546-52550.

171. Sherrill C. Import and metabolism of glutathione by Streptococcus mutans / C. Sherril, R.C. Fahey//J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 1454-1459.

172. Shinagawa H. RecA-protein depended cleavage of UmuD protein and SOS-mutagenesis / H. Shinagawa, H. Iwasaki, T. Kato, A. Nakata//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988.-V. 85.-P. 1806-1810.

173. Slilaty S.N. Lysine-156 and serine-119 are required for LexA repressor cleavage: a possible mechanism / S.N. Slilaty, J.W. Little//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. -V. 84. - P. 3987-3991.

174. Smith K.C. Molecular photobiology / K.C. Smith//Academic Press. -New York and London, 1969. P. 77 - 103.

175. Smirnova G.V. Effects of menadione and hydrogen peroxide on glutathione status in growing Escherichia coli / G.V. Smirnova, N.G. Muzyka, M.N. Glukhovchenko, O.N. Oktyabrsky/ZFree Radic. Biol. Med. 2000. - V. 28.-P. 1009-1016.

176. Smirnova G.V. Near-ultraviolet radiation and hydrogen peroxide modulate intracellular levels of potassium and thiols in Escherichia coli / G.V. Smirnova, O.N. Oktyabrsky//Current Microbiol. 1994. - V. 28. - P. 77-79.

177. Smirnova G. Induction of the alkylation-inducible aidB gene of Escherichia coli by cytoplasmic acidification and N-ethylmaleimide / G.V. Smirnova, O.N. Oktyabrsky, E.V. Moshonkina, N.V. Zakirova//Mutat. Res. -1994.-V. 314.-P. 51-56.

178. Smirvova G.V. Influence of polyphenols on Escherichia coli resistance to oxidative stress / G.V. Smirnova, Z.Y. Samoylova, N.G. Muzyka, O.N. Oktyabrsky//Free Rad. Biol. Med. 2009. - V. 46. - P. 759-768.

179. Sprott G.D. Differential effect of near-UV and visible light on active transport and other membrane process in Escherichia coli / G.D. Sprott, W.G. Martin, H. Scheneider/ZPhotochem. Photobiol. 1976. - V. 24. - P. 21-27.

180. Sprott G.D. The electrochemical proton gradient and phenylalanine transport in Escherichia coli irradiated with near-ultraviolet light / G.D. Sprott, J.R. Usher//Can. J. Microbiol. 1977. -V. 23. - P. 1683-1688.

181. Stapleton A. Flavonoids can protect maize DNA from the induction of ultraviolet radiation damage/ZPlant.Physiol. 1994. - V. 105. - P. 881-889.

182. Stefankova P. Thioredixin structural and functional complexity / P. Stefankova, M. Kollarova, I. Barak//Gen. Physiol. Biophys. - 2005. - V. 24. -P. 3-11.

183. Stewart E.J. Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins / E.J. Steward, F. Aslund, J. Beckwith//EMBO J. 1998. - V. 17. - P. 5543-5550.

184. Story R. M. The structure of the E. coli RecA protein monomer and polymer / R.M. Story, .I.T. Weber, T. A. Steitz//Nature. 1992. - V. 355. -P. 318-325.

185. Storz G. Oxidative stress / G. Storz, J. Imlay//Curr. Opin. Microbiology.- 1999. — V. 2.-P. 188-194.

186. Sun Y. Redox regulation of transcriptional activators / Y. Sun, L.W. Oberley//Free Radic. Biol. Med. 1999. -V. 21. - P. 335-348.

187. Suzuki H. Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K12: purification and properties / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Tochikura//J. Bacteriol.- 1986a.-V. 168.-P. 1325-1331.

188. Suzuki H. Glutamyl transpeptidase from Escherichia coli K-12: formation and localization / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Tochikura//J. Bacteriol. 1986b.-V. 168.-P. 1332-1335.

189. Suzuki H. Isolation, genetic mapping and characterization of Escherichia coli K12 mutants lacking y-glutamyltranspeptidase / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Tochikura//J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 3926-3931.

190. Suzuki H. DNA sequence of the Escherichia coli K-12 y-glutamyltranspeptidase gene, ggt / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, T. Tochikura//J. Bacteriol. -1989.-V.171.-P.5169-5172.

191. Taber H. Near ultraviolet induction of growth delay studies in a menaqinon-deficient mutant of Bacillus subtilis / H. Taber, J. Pomerants, G.N. Halfenger//Photochem. Photobiol. 1978. - V. 28. - P. 191-196.

192. Tang M. UmuD'2C is an error-phone DNA polymerase, Escherichia coli pol V / M. Tang, X. Shen, E.G. Frank, M. O'Donnell, R. Woodgate, M.F. Goodman//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 8919-8924.

193. Tamura T. A new selenoprotein from human lung adenocarcinoma cells: purification, properties, and thioredoxinreductase activity / T. Tamura, T.C. Stadman//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 1006 - 1011.

194. Takemoto T. Different mechanisms of thioredoxin in its reduced and oxidized forms in defense against hydrogen peroxide in Escherichia coli / T. Takemoto, Q.-M Zhang, S Yoney//Free Radic. Biol. Med. 1998. - V. 24. - P. 556-562.

195. Theam K. Role of stringent response in the expression and mechanism of near-ultraviolet induced growth delay / K. Theam, Favre A.//Eur. J. Biochem. -1984.-V. 145.-P. 137-142.

196. Thelander L.Thioredoxin reductase. Characterization of a homogenous preparation from Escherichia coli В / L. Theleander//Eur. J. Biochem. 1968. -V. 242. - P. 852-859.

197. Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione. Application to mammalian blood and other tissues / F. Tietze//Anal. Biochem. 1969. - V.27. - P. 502-522.

198. Tsuchida S. Glutathione transferases / S. Tsuchida//Encyclopaedia of Cancer / Academic Press. San Diego, 1997. - P. 733-743.

199. Tuggle C.K. Glutathione reductase is not required for maintenance of reduced glutathione in Escherichia coli K-12 /С.К. Tuggle, J.A. Fuchs//J. Bacteriol. 1985. - V. 162. - P. 448-450.

200. Tyrrel R.M. A common parthway for protection of bacteria against damage by solar UVA (334 nm, 365 nm) and oxidizing agent (H202) / R.M. Tyrrel//Mutat. Res. 1985. -V. 145. - P. 129-136.

201. VanBogelen R.A. Differential induction of heat shock, SOS and oxidative stress regulons and accumulation of nucleotides in Escherichia coli / R.A. VanBogelen, P.M. Kelley, F.C. Neidhard//J. Bacteriol. 1987. - V. 169. -P. 26-32.

202. Vergauwen B. Exogenous glutathione completes the defense against oxidative stress in Haemophilus influenzae / B. Vergauen, F. Pauwels, M. Vaneechoutte, J.J. Van Beeumen//J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 15721581.

203. Visick J. RpoS- and OxyR-independent induction of HPI catalase at stationary phase in Escherichia coli and identification of rpoS mutation in common laboratory strains / J. Visick, S. Clark//J. Bacteriol. 1997. - V. 179. ~ P. 4158-4163.

204. Vlamis-Gardikas A. Cloning, overexpression, and characterization of glutaredoxin 2, an atypical glutaredoxin from Escherichia coli / A, Vlamis

205. Gardikas, F. Aslund, G. Spyrou, T. Bergman, A. Holmgren//J. Biol. Chem. -1997. V. 272. - P. 11236-11243.

206. Vuilleumier S. Bacterial glutathione ^-transferases: what are they good for? / S. Vuilleumier//J. Bacteriol. 1997. -V. 179. - P. 1431-1441.

207. Walker G.C. Bacterial Stress Responses / G.C.Walker, B.T. Smith, M.D. Sutton//ASM Press. Washington, D.C. - 2000. - P. 131-144.

208. Wallace B.I. Genetic and physical analysis of the thioredoxin (trxA) gene in Escherichia coli K12 / B.I. Wallace, S.R. Kushner//Gene. 1984. - V. 32. -P. 399-408.

209. Wang L. FtsK is an essential cell division protein that localized to the septum and induced that as part of the SOS-response / L. Wang, J. Lutkenhaus//Mol. Microbiol. 1998. - V. 29. - P. 731-740.

210. Weisemann J.M. Mutations at the cysteine codons of the recA gene of Escherichia coli / J.M. Weisemann, G.M Weinstock//DNA. 1988. - V. 7. - P. 389-398.

211. Wigle T.J. Directed molecular screening for RecA ATPase inhibitors / T.J. Wigle, S.F Singleton//Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007. - V. 17. - P. 3249-3253.

212. Williams C.H.Jr. Mechanism and structure of thioredoxin reductase from Escherichia coli / C.H.Jr. Williams//FASEB J. 1995. - V. 9. - P. 1267-1276.

213. Witkin E.M. Ultraviolet mutagenesis and inducible DNA repair in Escherichia coli / E.M. Witkin//Bacteriol. Rev. 1976. - V. 40. - P. 869-907.

214. Zheng M. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation / M. Zheng, F. Aslund, G. Storz//Science. 1998.

Информация о работе

Ушаков, Вадим Юрьевич
кандидата биологических наук
Пермь, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ушаков, Вадим Юрьевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ушаков, Вадим Юрьевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ушаков, Вадим Юрьевич, Пермь

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coli
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология