Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие неорганических ионов и биологически активных веществ с модельными мембранными структурами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие неорганических ионов и биологически активных веществ с модельными мембранными структурами"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ К.В.ЛОМОНОСОВА

Физический Факультет

На правах рукописи УДК 577.32

ХВАНГ Дон Юн

ЗАИКОДЕЙСТБИЕ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ИОНОЗ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ' ВЕЩЕСТВ С МОДЕЛЬНЫМИ МЕКВРАННЫМИ СТРУКТУРАМИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва

- 1994

Работа выполнена на кафедре Биофизики Физического факуль' Московского государственного университета имени М.В.Ломоносов.

Научные руководители:

доктор Физико-математических наук, профессор В.А.ТВЕРДИО кандидат физико-математических наук Г.Б.ХОМУТОВ

Официальные оппоненты:

доктор Физико-математических наук В.Н.БУРАВЦЕВ кандидат Физико-математических наук Л.В.БЕЛОВОЛОВА Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной Биофизики Российской Академии Наук (г.Пущине).

¿3

/б

¿О

в аудите

Защита состоится ■70С£1Х1М 1994 г.в К) ФА на заседании специализированного совета N3 С

(К.053.05.77) в МГУ им. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Мое* Воробьевы горы, МГУ, Физический Факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физичес* Факультета Московского государственного университета.

Автореферат разослан В? р^ 1994 г -/

Ученый секретарь специализированно кандидат физ.-мат.наук

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Изучение физических механизмов

взаимодействия неорганических ионов и биологически активных веществ с мембранными структурами является одним из важнейших направлений биофизики, существенным как для решения Фундаментальных проблем биофизики клетки , так и для решения прикладных вопросов биоэлектроники и биомедицины.

В настоящее время в рамках таких новых направлений микроэлектроники, как нанотехнология, молекулярная и биоэлектроника, ключевой проблемой является создание принципиально новой элементной базы, обеспечивающей достижение предельно малых размеров (нанометры) компонентов электронных схем и устройств, и использующей новые эффективные и надежные принципы передачи, хранения и обработки информации. С этой точки зрения перспективным представляется использование новейших достижений молекулярной биофизики, имеющей дело с расшифровкой физических механизмов электронного и ионного транспорта в биологических системах, явлений преобразования энергии и информации на молекулярном уровне. Решение этой проблемы связывается с исследованием возможностей использования в качестве потенциальных кандидатов на роль таких элементов и компонентов отдельных (био)мопекул, ионных комплексов и надмолекулярных структур. Большое внимание в связи с этим уделяется изучению высокоупорядоченных искусственных пленарных молекулярных структур - ленгмюровских пленок и липидных мультиспоев. Исследование взаимодействия компонентов водной фазы с ленгмюровским моноспоем и их адсорбции на монослое важно и актуально, поскольку открывает перспективы создания технологии для получения разнообразных многокомпонентных пленок Ленгмюра-Блоджетт (Л-Б), содержащих встроенные функционально важные молекулы без использования сложных процедур синтеза. Кроме того, высокоупорядоченные молекулярные ленгмюровские монослои на поверхности водной фазы являются оптимальной модельной системой для исследования процессов на границе раздела Фаз и физико-химических

свойств поверхности модельных и биологических мембран.

Важной проблемой является также исследование взаимодействи лекарственных и биологически активных веществ с мембранами макромопекулярными структурами организма. Большинство таких вещест являются сложными молекулами, обладающими выраженными гидрофобными гидрофильными или амфифипьными свойствами. Их взаимодействие различными молекулярными структурами организма лежит в основе и лекарственного действия, но зачастую является причиной побочного в ряде случаев негативного, действия на организм. Нами исследован взаимодействие Фуросемида (диуретика, вызывающего активно выделение ионов натрия, калия, магния, хлора, фосфата и воды почках), (ингибитора анионного транспорта в эритроцитах)

аламетицина (мембранного каналоформера, выделяемого из бактерий) ленгмюровскими монослоями. Данные модельные исследоваки существенны для понимания молекулярных механизмов взаимодействи этих Фармакологических препаратов с нативными мембранами.

Наряду с исследованием молекулярных ленгмюровских монослоев исследование пипидных мультиспоев представляет большой интерес дл получения менее дорогих и сложных технологий в соэдани микроэлектронных устройств. Значительные усилия направляются н развитие методик по производству полупроводников, в частности сульфида кадмия, в виде маленьких обособленных частиц. Таки вещества, будучи представлены в нанометровом диапазоне, показывай квантовые Эффекты, не проявляющиеся, когда эти же материал составляют макроскопическое тело. Монослойные методики уж применялись для получения таких малых кластеров, особенно Фендлеро и др. ,которые использовали сзндвичевые структуры в организованны монослоях для получения СйБ в виде частиц нанометрового диапазона Небольшие кластеры СйБ были получены Уангом и др.

В 1988 г Жао с соавторами описали способ получения полуволны пленок, состоящих из монокристапов СйБ, СиБ, ЮэЗ, гпБ, НдБ и 1п2£ на поверхности плоской биспойной пипилной мембраны (БЛМ) изготовленной по методу Мюллера.

Наша задача заключалась в исследовании возможности создан* дискретных полупроводниковых структур с использование

эазработанной ка кафедре биофизики методики (синтез нерастворимой ;оли полупроводника в порах мембранных каналоформеров). Для этого необходима матрица соответствующих размеров. Нами был выбран »гитохондриальный порин, известный также как VDAC (voltage dependent anion channel). Выбор обоснован следующими обстоятельствами. Порин *вляется каналом, относительно легко реконструируемым в БЛМ. В то ке время канал, образованный митохоняриалъным порином имеет достаточно большой диаметр около 2 нм, что обеспечивает прохождение зовольно больших ионов и может привести к Формированию юлупроводниковых структур необходимых размеров. Порин обладает зчень слабой акионоселективностью, что способствует прохождению <ереэ канал как положительных, так и отрицательных ионов. VDAC является потенциалзависимым, что позволяет управлять каналом, заставляя его бить либо в открытом, пибо в закрытом состоянии при юдаче на мембрану различных значений потенциала. В отличие от других каналов, порин, по-видимому, образует структуру с фиксированным диаметром, «то обеспечивает определенный стандарт. <роме того, порин содержит внутри канала и на поверхности множество юложитепьных и отрицательных зарядов, что может способствовать нормированию полупроводниковых структур внутри канала и пи вблизи зго входов.

Поскольку влияние двухвалентных ионов на свойства порина в 1итературе не описано, нашей непосредственной задачей стало 1зучение изменений в электрических характеристиках каналов, збраэованных порином в БЛМ, вызываемых ионами Cd и Na.

Целью настоящей работы являлось исследование взаимодейстивия <еорганических ионов и биологически активных веществ с модельными лембраными системами.

3 связи с этим были поставлены следующие основные задачи;

1.Исследовать изменения Формы изотермы сжатия моноспоя :теариновой кислоты при варьировании рН и концентрации ионов меди з водной субфаэе в присутствии натрия.

2.Исследовать взаимодействие одновалентных катионов с >осфолипидными липосомами.

3.Исследовать взаимодействия биологически активных вещест Фуросемида, ОЮБ, аламетицина с лекгмюровским монослоем стеариновс кислоты.

4.Исследовать влияние сульфид-аниона на проводимое! поринового канала в присутствии двухвалентных катионов металлов.

Научная новизна результатов

а) Показано, что в процессе связывания меди кпастерообразования на поверхности монослоя электростатическо взаимодействие играет важную роль.

б) Обнаружено, что молекулы Фуросемида и йЮБ эфоективн взаимодействуют с лекгмюровским монослоем, встраиваются в моносло и изменяют его структуру, вызывая характерные изменения форм изотерм сжатия.

в) Обнаружено, что молекулы аламетицина, локализованные смешанном монослое, конкурируют с молекулами стеариновой кислоты з место на границе раздела Фаз.

г) Обнаружено, что сульфид натрия в концентрации 0.1 мМ н' влияет существенно на электрические характеристики пориновоп канала в бислойной мембране.

Практическое значение работы

■Изучен ряд модельных систем, существенных для понимание действия лекарственных препаратов и дпя развития новы: биофизических технологий наноэлектроники.

Апробация работы

По теме диссертационной работы опубликована одна печатна! работа и одна принята к публикации в международном журнале. Основные результаты диссертации докладывались на семинаре кафедрь биофизики физического факультета МГУ(1994г.).

Структура и обьем работы.

Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списке

цитированной литературы. Диссертация изложена ка _ страницах,

содержит _ рисунков и _ таблиц, список литературы включает

_ наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, пределены цель и задачи исследования, его научная новизна и рактическая значимость.

В первой главе дан обзор литературы, в котором описаны олучение и методы исследования пленок Ленгммра-Блоджетт. Описаны изико-химические свойства катионов металлов и биологически ктивных веществ (Фуросекид, DIDS, апаметицин) и их взаимодействие : пленками Ленгмира-Елоджетт и другими модельными биомембранами, [эложена цель работы.

Во второй главе описаны материалы и методы. В работе [спопьзовапи стеариновую кислоту С18Нз602 и хпорид меди СиС12*2Н20 [роизводства Фирмы "Serva". Лля получения деионизованной воды 'проводимость 20 МОм/см) использовали систему очистки" воды 'MilXiQ" фирмы "Millipore". Приведена схема пенгмюровской ванна для [сследования взаимодействия ионов металлов и биологически активных ¡еществ с ленгмюровскими пленками. Установка имеет специальную :истему для эффективного перемешивания водной Фазы под монослоем, [эменения состава и отбора проб водной Фазы без нарушения состояния юнослоя, включающую перистальтический насос и ванну специальной >ормы. Описаны применяемые в работе методы снятия Р-А-изотерм (Р-юверхностное давление, выраженное в дин/см на единицу длины юдвижного барьера, А- площадь, приходящаяся на одну молекулу в «онослое, выраженая в А2 /молекулу) и метод структурного ^следования: электронный парамагнитный резонанс.

В третьей гпаве описано проведенное нами исследование ззаимодействия катионов меди с моноспоем стеариновой кислоты в трисугствии натрия и взаимодействие одновалентных катионов с (юсфолипидными липосомами.

На рис.1-2. представлены результаты исследования влияния сатионов На+ на форму изотермы сжатия ленгмюровского монослоя

стеариновой кислоты. В присутствии в волной фазе ионов Ыа+ форма изотермы сжатия монослоя стеариновой кислоты практически не зависит от концентрации Ыа+ в водной Фазе (в пределах концентраций 0.1-0.5М) и характеризуется отсутствием выраженного коллапса(что может свидетельствовать о возросшей стабильности монослоя), большой величиной максимального поверхностного давления, достигаемого в монослое(~70мН/м), а также несколько большей по сравнению со случаем чистой водной фазы величиной А0(площадь монослоя, при которой начинается рост поверхностного давления от О по мере сжатия монослоя). При этом Фазовые переходы в монослое значительно менее выражены. Считается, что наблюдаемые характерные изменения Формы изотермы сжатия монослоя стеариновой кислоты в присутствии ионов Ыа+ обусловлены их связыванием и электростатическими взаимодействиями с заряженными карбоксильными группами стеариновой кислоты монослоя.

В присутствии ионов меди в исследуемой области величин рН водной Фазы (от 5.0 до значения рН-6.1,при котором начинается образование нерастворимого гидроксида меди Си(ОН)г) на Р-А изотермах монослоя стеариновой кислоты не наблюдается заметных переходов, а величина поверхностного давления Р начинает расти от 0 при существенно больших значениях А, чем в соответствующих Р-А изотермах, получаемых в случае чистой водной фазы и водной Фазы, содержащей ионы Ыа4(см.рис.2). При этом величина Р оказывается значительно меньше при значениях А, соответствующих максимальному поверхностному давлению в Р-А изотермах, получаемых в случае чистой водной Фазы и в присутствии в ней одновалентых катионов.

Эти изменения Формы Р-А диаграмм в присутствии ионов меди в водной Фазе обусловлены, видимо, изменением характера межмолекулярных взаимодействий в монослое, когда определяющим становится не взаимодействие между собой отдельных молекул стеариновой кислоты или стеарата мели, а образование на поверхности монослоя новых медьсодержащих структур. Полученные ранее результаты действительно свидетельствуют о том, что в условиях наших экспериментов (рН 5.6, исходная концентрация меди 5*10~4 М)

- О 1М ЫоС!

--0.2м ЫаС1

Рис.1. Р-А изотерма монослоя стеариновой кислоты в присутствии в водкой Фазе ИаС! (0.1К и 0.2И), рН=б.

¡5 — о.зм ^-с-.е-й"!.'

N

К 80 Л -5

3

Площадь на одну молекулу (А2 на молекулу)

Рис.2. Р-А изотерма монослоя стеариновой кислоты в присутствии в водной фазе НаС1(0.1М и О.ЗМ) и СиС12*2Н20 (5*10_4М) ,рН=б.

наблюдается значительное связывание Си2+ с моноспоем и образование кластеров, зависящее от степени сжатия монослоя. Наибольшее связывание (-100 Cu/St) (St-стеариновая кислота) наблюдалось при величине Ря20 мН/м, при дальнейшем сжатии монослоя и повышении величины Р концентрация ионов меди в водной Фазе вновь увеличивалась.

О принципиальной роли электростатических взаимодействий в описываемых процессах связывания ионов меди и кластеробразования на поверхности монослоя свидетельствуют полученные нами экспериментальные данные о том, что присутствие в водной Фазе наряду с ионами меди ионов одновалентных катионов Na+ в концентрациях - Ю-1 M практически полностью исключает связывание меди с монослоем в количествах, превышающих стехиометрию 1/1 для Cu/St (что является пределом чувствительности для наших измерений концентрации меди в водной Фазе). Форма Р-А изотермы монослоя стеариновой кислоты на медьсодержащей водной субфазе при рН=5.9 в присутствии ионов Ка+ в водной Фазе по мере увеличения концентрации Na+ от 0.1 до 0.5М все более соответствует Форме изотермы сжатия монослоя в области рН<5.0 (где кластеры меди не образуются).

Влияние одновалентных катионов на свойства липосом изучали методом ЭПР с использованием гидрофобных отрицательно и положительно заряженных спиновых зондов. Добавление одновалентных катионов в среду инкубации липосом способствовало встраиванию отрицательно заряженного зонда 14 в липосомы (рис.3), но препятствовало встраиванию положительно заряженного зонда САТ12 (рис.4). С увеличением концентрации катионов их действие возрастало, причем эффективность катионов убывала в последовательности KH+i>Li+ >Na+ >К+ fcRb+ tCs+. Если не принимать во внимание ион аммония, это соответствует возрастанию размеров дегидратированных катионов (их кристаллических радиусов). Можно думать, что подобная зависимость обусловлена дегидратацией ионов, по крайней мере частичной, при связывании их мембранами. Связывание Na+ и Li+ лигандными атомами может существенно отличаться от связывания К+ , Rb+, CS+. Лигандными атомами в данном случае, вероятно, выступают кислородные атомы фосфатных групп

ot =4-

,9

А k [А А в

15 Гс d =-Ё

1,S 1.6 R,a €S+

1) -спектр ЭПР зоил» Ii.n • препарате пипосо» «э tHTHHl и кардиолипила. Конпентреви« Аилосок 0,28 «да иЯхуЬ.цич! 1 X* ЭДТА, 10«К ТРИС-КС1, рК 7.0,

«скиост» изменения параметра распределения аок»а „у липосомами и средой от крист.плкч.ского Р"»У" ui>г в срелу одновалентных катионов. Хониаитрачии 75 ЯЛ ( • ) И 150 ( О ).

150 МЫ

• 75мМ

1.0 1,2 1,4 1,6 1,В Н,А J

Na*

K+i [Rb+ |Cs+ inkj-

Рис. 4-. (а) - спектр ЭПР зонда СХТ12 в препарате пилосом из смеси лецитина и кардиолипииа. Концентрация липоеои 2.2 »г/мл. Среда инкубации: ЮиИ Трис-HCl, IKK ЭЛТА, рН 7.0, JO'C.

(Б) - зависимость изменения параметра распреаеяеки* аонла CMi3 нежа у липосоиаки и срелоя от кристаллического радиусе «обавп.ены« а среду одновалентны* катионов. Лилосоим 2.2 кг/*п. Ср.»а иякубаиин: 1нК ЭЛТЛ, ЮиИ Трис-HCl, рН 7.0, 20*С. Концентрации кетиоков 75 мМ ( • ) и 150 мМ ( О ).

фосфолипидов. Взаимодействие одновалентных катионов с этими группами уменьшало отрицательный заряд пипосом и влияло тем самым на распределение парамагнитных зондов.

Четвертая глава посвящена исследованиям взаимодействия биологически активных веществ с монослоем стеариновой кислоты.

Нами исследованы изменения Формы Р-А изотермы монослоя стеариновой кислоты на поверхности водной Фазы, вызываемые взаимодействием фуросемида и ОЮЭ (концентрация 10~4М) с монослоем при различной ионной силе и величине рН раствора. Экспериментально наблюдаемые Р-А изотермы пенгмюровского монослоя стеариновой кислоты, получаемые при различном составе водной Фазы, представлены на рис. 5-8. На этих рисунках площадь монослоя представлена в А2 на одну молекулу стеариновой кислоты. Форма Р-А изотермы монослоя стеариновой кислоты на чистой водной субфазе, отражавшая все характерные фазовые состояния монослоя, не зависит от рН в широком интервале значений рН водной фазы. Добавление в водную Фазу сахарозы (250мМ сахарозы, 7,5мМ КС1) ипи ИаС1 (145мМ КаС1, 7,5мМ КС1) вызывает определенные изменения Формы Р-А изотермы монослоя -Фазовые переходы менее выражены, отсутствует характерный коллапс, значительно больше максимальное поверхностное давление, создающееся в монослое, причем эти изменения практически не зависят он рН в исследованном диапазоне величин рН (от 7,5 до 6,1) (рис. 5-8). Добавление Фуросемида в водную Фазу под моноспоем (конечная концентрация 10~4 М ) приводит к существенному сдвигу Р-А изотермы ( практически без изменения её Формы ) в область большей величины площади монослоя (при неизменном количестве молекул стеариновой кислоты, образующих монослой). Этот эффект наблюдается как в случае с высоким содержанием сахарозы, так и КаС1 в водной Фазе. При этом в первом случае (среда содержит 250мМ сахарозы, 7,5мМ КС1) эффект практически одинаков при варьировании величины рН от 7,4 до 6,1 (рис.5). В присутствии в водной «азе ИаС1 индуцированный Фуросемидом сдвиг Р-А изотермы в области больших величин плошали монослоя в "жидкой" Фазе монослоя при величине рН водной Фазы 7,4 больше,чем при рН 6,1; в области "твердой" Фазы моноспоя этот сдвиг

. свхврозв 250 mW , 7 i mM KCl,pH« + 0.1 гпм фуросемид

а)

)0 10 00 20 00 30 00 40.00. 50.00 60.0-0 >шадъ на одну молекулу [К2- на «олекулу)

• NoCl UO mW , 7.5 mW KCJ.pH«7 4

• + 01 ты фуросеккд

а)

0.00 10.ОО 20.00 30.00 40-00. 50-00 60.00 Плошала на одну молекулу (А2 на молекулу)

шаль на одну молекулу (А2 на молекулу)

изотермы моноспо* стеариновой кислоты в отсутствие и твчи в водкой «азе «уросемида (концентрация 10"' К). 1кой фазы: 250кМ сахарозы. 7. 5мЧ KCl. а )?Н«7. А. 6}рН*6. 1.

Рис 6.Р-А изотермы момослоя стеариновой кислоты в отсутствие vt в присутствии в воинов *вз® +урос*ммла (концентрация 10'* fi). Состав волной *аэы: J40K.4 NaCi. 7. 5*М KCl. aJpH»7.4. 6jpH«6.1.

становится одинаков для обеих величин рН (рис.6). Наблюдаемый эффект хорошо согласуется с известными литературными данными о взаимодействии сложных органических молекул с легмюровскими монослоями, результатом которого, как правило, является значительное "расширение" моноспоя. Наблюдаемое нами увеличение площади монослоя стеариновой кислоты, вызываемое присутствием в водной Фазе фуросемида, обусловлено, по-видимому, также адсорбцией и встраиванием молекул Фуросемида в область гидрофильных голов стеариновой кислоты.

Добавление ОЮЭ в водную Фазу под монослоем также вызывает значительные изменения формы изотермы сжатия монослоя стеариновой кислоты (рис.7,8). При этом в присутствии ОЮЭ в водной Фазе рост поверхностного давления в монослое по мере его сжатия (начало "жидкой" Фазы) начинается при величинах площади монослоя, заметно превышающих соответствующие величины площади в случае монослоя на водной фазе в отсутствие МПЭ (аналогичный эффект наблюдается в случае с Фуросемидом). Однако дальнейший ход изотермы сжатия существенно отличается в присутствии БЮв по сравнению с соответствующей изотермой в присутствии фуросемида: Р-А изотерма монослоя в присутствии ИОБ имеет меньший наклон и пересекает Р-А изотерму моноспоя стеариновой кислоты на водной субфазе в отсутствие 0103. Максимальное поверхностиое давление, создающееся в монослое (при котором происходит разрушение моноспоя) в присутствии ЙМЕ такое же, как и в отсутствие ОЮЭ в водной фазе. Эти изменения Формы Р-А изотермы, вызываемые СЮЭ, заметно больше в случае низкой ионной силы водной Фазы (250мМ сахарозы, 7,5 мМ КС1) , чем в случае высокой (в присутствии 145 мМ МаС1), что свидетельствует о значительном вкладе электростатических взаимодействий в наблюдаемый эффект. Наблюдаемое в наших экспериментах "конденсирование" монослоя -смещение Р-А изотермы в присутствии при величинах Р >30 мН/М в область меньшей площади

монослоя (при одной и той же фиксированной величине Р) по сравнению с Р-А изотермой моноспоя в отсутствие ЭЮБ - эквиваленте уменьшению количества молекул стеариновой кислоты в монослое по мере его сжатия в присутствии 0103 в водной Фазе. Наблюдаемое явление может

- - Сахароза 250 mM , 7.5 тМ КС1,рН=7.» - + 0.1 тм dids

aj

--No Г! НО mW .

- + О I тМ DIDS

7.5 тМ КС1.рНв7Ч

лпТ

10 00 20.00 30.00 40.0Э^ 50.00 60.00 цадь на одну молекулу (А2 на молекулу)

> 70.0 X

60.0

f

5 50.0 с

¿40 0 с

§ зо.о и

S 20.0

х С.

С 100

а)

О 00 10.00 20.00 30.00 40.00. 50.00 ео.оо Плошадь на одну молекулу на копекулу)

• Сахароза 250 тМ . 7.5 тМ КС1.оН«6.1 + 0.1 ггм DIPS

^ ео.о ;

Natt 140 тМ . 7.5 тМ КС1.рН=б.1 + 0.1 тМ DIDS

б)

? г: со 1С с: зссз дгс:, е.\с: с аль на одну молекулу 1 А2 на молекулу!

S ео.о

^

J3.C- -

х 23.0 • с. '

с,:: 20 ос зэсс -or: f о.со

Пловадь на олну молекулу 1Л2 на молекулу)

отермы кокоспоя стеариновой кислоты в отсутствие и и в водной еаэе DIDS (концентрация 10"4 М). Состав lflOwX NaCl. 7, 5иГ1 KCl. а)рн-7.3. 6)pH»6.L.

Рис .P-Ä изотермы монослоя стеариновой кислоты в отсутствие и в присутствии в волной фазе DIDS (концентрани* 10~4 Ml. Состав волной «вэк: 250И.К сахарозы. 7. 5иК KCl. «|рВ-7. «. 6|рн>6. 1.

0.0

I

«3.0 1

быть обусловлено структурными изменениями и формированием структурных дефектов в монослое, индуцированными ОЮБ, а также выходом в волну» Фазу из мокоспоя по мере его сжатия вместе смолекулами 0103 определенного количества молекул стеариновой кислоты.

Нами экспериментально исследованы изменения формы изотермы сжатия смешанного монослоя (стеариновая кислота+аламетицин) на поверхности водной фазы, происходящие при варьировании соотношения количеств компонентов монослоя. При внесении апаметицина в обьемную водную Фазу (из спиртового раствора, конечная концентрация 10"4М) на поверхности водной Фазы наблюдается образование пленки молекул апаметицина. Об этом свидетельствуют результаты исследования изотермы сжатия "чистой" поверхности водной Фазы, содержащей аламетицин. На поверхности такой водной Фазы практически невозможно формирование монослоя стеариновой кислоты, поскольку не происходит растекания по поверхности капепь раствора стеариновой кислоты в хлороформе.

На рис. 9 представлены результаты исследования изотерм сжатия смешанного монослоя стеариновой кислоты и аламетицина. Из рис. 9 видно,что даже при очень малом содержании аламетицина в монослое (1/100031) форма изотермы сжатия такого монослоя заметно отличается от изотермы сжатия монослоя чистой стеариновой кислоты - фазовые переходы значительно менее выражены. При увеличении содержания аламетицина в .монослое (начиная с соотношения 1/10031.) на изотерме сжатия монослоя наблюдается характерное плечо при значениях поверхностного давления -30-35мН/м, соответствующее, коллапсу монослоя аламетицина и отражавшее процессы вытеснения молекул аламетицина из монослоя в водную Фазу.

Пятая глава посвящена влиянию сульфид-аниона на проводимость поринового канала в присутствии двухвалентных катионов металлов.

В экспериментах, проведенных на модифицированной митохондриальной мембране, было показано, что каная находится в открытом состоянии при-напряжениях ниже 20 мВ, и ток увеличивается линейно с увеличением потенциала на мембране, а при напряжениях

Аламетицин:стеариновая кислота = 1 : 100 Аламетицин: стеариновая кислота = 1 : 1000

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 _ 50.00

Площадь на одну молекулу стеариновой кислоты (Á2 на молекулу)

te. 9. Р-А изотерма смешанного монослоя стеариновой кислоты и таметицина(1:100 и 1:1000)

выше 20 мВ канал находится в основном в закрытом состоянии.

В записи проводимости одиночных каналов на самописце были получены подсостояния проводимости, что совпадает с существующими данными.

Подсостояния проводимости на мембране изменяются при разных значениях напряжения на мембране. При разности потенциалов не мембране (РПМ) 5мВ не обнаружены подсостояния. При ЮмВ уже выявляются два подуровня проводимости, а при 15 мВ - шесть подсостояний.

10 кВ

Л Л/Л0

1) 1.37 ± 0.26 нСм 0.31 ± 0. 06

2)2.81 ± 0.28 нСм 0.65 ± 0. 06

15 мВ

Л Л/Л0

1)0.43 + 0. 04 нСм 0.1 ± 0. 01

2)1.38 + 0.22 нСи 0.32 ± 0. 05

3)1.81 + 0.22 нСм 0.42 ± 0. 07

4)2.63 + 0.47 нСм 0.61 ± 0. .11

5)3.36 + 0.22 нСм 0.78 ± 0. 05

6)3.88 ± 0.34 нСм 0.90 ± 0. .08

где Л = 4.3 нСм. , См - сименс

Таким образом, электрические характеристики мембраны, модифицированной митохондриапьным порином, в наших экспериментах не отличаются существенно от известных по литературным данным.

Были проведены эксперименты при добавлении СбБО^ с концентрациями от 0.1 до 1 мМ для определения ропи анионов супьоатс в описанных выше эффектах, и было установлено, что СйБО^ в даннок диапазоне концентрации несущественно влияет на потенциал закрыванш канала и на проводимость каналов.

В присутствии ионов сульфата кадмия наблюдалось значительное повышение электрических шумов мембраны.

Сульфид натрия, добавленный к растворам, омывающим мембрану, модифицированную порином, не влиял на её' электрические характеристики.

В дальнейших исследованиях на мембране с митохондриальным порином мы добавляли с одной стороны (соответствующей аноду) СйБ04, а с другой стороны - Ка2Б.

Вольтамперные характеристики поринового канала, полученные для дискретных значений РПМ в отсутствие модификаторов, а также при добавлении СйБ04 с двух сторон или СсЗБС^ с одной стороны и Иа23 -с другой, приведены на рис .10. В первых двух случаях они соответствуют полученным в этой же лаборатории результатам.

Нами были построены гистограммы подуровней проводимости для каналов порина, полученные в экспериментах при добавлении с одной стороны мембраны постоянной концентрации На2Э 0.1 мМ, а с другой стороны мембраны разных концентраций Сс1Б04, равных: 0.1мМ, О.ЗмМ, О.бмМ, 1.0мМ. В этих экспериментах мы обнаружили следующие эффекты: 1) С увеличением концентрации СсИЭОф некоторые подуровни проводимости, характерные для канала в отсутствии Сйв04 и На23, сначала несколько смещаются, а затем исчезают.

2) Одновременно с исчезновением нескольких подуровней исчез также подуровень, появившийся в присутствии Сс1304 с обеих сторон при концентрациях 1-1.ЗмМ.

Результаты измерений зависимости трансмембранного тока от концентрации СйБ04 при разных значениях РПМ приведены на рис. При увеличении концентрации происходит увеличение тока через канал под влиянием ионов Сс1 и N8.

На рис. 11. приведена зависимость проводимости канала от напряжения при различных концентрациях СЗБО^ и постоянном значении концентрации При малых концентрациях присутствие Ыа2Б и Сс!504

не влияет существенно на потенциалзависимость канала порина, так как при этих концентрациях потенциал закрывания канала существенно не меняется.

— РоЛ1 — N»,8, СсЕО — саз С,. Сей о,

Рис. 10. Вольтамперные характеристики поринового канала отсутствие модификаторов, и при добавлении СсШо4 с двух сторон ил СсШо4 с одной стороны и Ка2Б - с другой.

1Ыа231 = 0. 1 *М

5 10 15 20

Разность потенциалов на мембране, мВ

1-е- • С! -»—' 05 я*« ■ Си -е- с '3 ^

Рис. 11. Зависимость проводимости канала от напряжения пг различных концентрациях С<3304 и постоянном значении концентрации

Основные выводы

1.Показано,что присутствие в водной Фазе наряду с ионами меди дновалентных катионов натрия практически исключает связывание меди

моноспоем в количествах, превышающих стехиометрию 1:1 Си:Б1. При том форма изотермы сжатия мокослоя стеариновой кислоты на едьсодержащий водной субфаэе в присутствии ионов натрия оответствует Форме изотермы сжатия в области низких рН, где пастеры меди на поверхности мокоспоя не образуются. Полученные езультаты свидетельствуют о принципиально важной роли лектростатических взаимодействий в процессах образования кластеров еди на поверхности Ленгмюровского мокослоя стеариновой кислоты.

2.Методом ЭПР проведено исследование связывания катионов елочных металлов и аммония с модельными биомембранами. Полученные ами результаты подтверждают имеющиеся в литературе данные о том, то одновалентные катионы меньших размеров лучше адсорбируются на азличных мембранах. Однако, проницаемость немодифицированных ислойных мембран, как плоских, так и сферических, может быть ной:проницаемость для К* может быть выше, чем для Ка+.

3.Проведено комплексное исследование взаимодействия ряда иологически активных молекул с ленгмюровским монослоем стеариновой ислоты с помощью анализа изменений Формы изотерм сжатия монослоя, слученные результаты свидетельствуютчто исследование заимодействия лекарственных и биологически-активных веществ, а акже компонентов биомембран с ленгмюровским моноспоем позволяет оделировать и выявлять особенности их взаимодействия с ембранными структурами и является перспективным для выяснения еханизмов их Функционального действия, определения и рогнозирования их неспецифического воздействия на биологические истемы.

4. Исследовано взаимодействие Фуросемида и ОЮЭ(ингибиторов кионного транспорта в эритроцитах) с монослоем стеариновой кислоты

зависимости от состава и величин рН водной фазы. Полученные езультаты указывают на то, что молекулы фуросемида и 0103 ФФективно взаимодействуют с ленгмюровским монослоем, моделирующим иологические мембраны, встраиваются в монослой и изменяют его

структуру, вызывая характерные изменения Формы изотерм сжатия.

5. Проведено исследование взаимодействия каналоформера аламетицина с пенгмюровским моноспоем стеариновой кислоты. Полученные результаты указывают на то, что молекулы аламетицина обладают сильно выраженными поверхностно-активными свойствами и образуют стабильный пенгмюровский монослой на роверхности водной Фазы. Молекулы аламетицина, локализованные в смешанном монослое, конкурируют с молекулами стеариновой кислоты за место на границе раздела фаз.

6. Обнаружено, что сульфид натрия в концентрации 0.1 мМ не влияет сушественно на электрические характеристики поринового канала в бислойной мембране. В присутствии Na2S уменьшается ингибирующее действие CdS04 на проводимость поринового канала. Na2S приводит к изменению вероятностей подсостояний поринового канала как в отсутствие CdS04, так и при его добавлении, однако не изменяет качественно зависимость проводимости канала от разности потенциалов на мембране при различных концентрациях CdS04.

По теме диссертации опубликованы работы:

1.Г.Б.Хомутов,Хванг Дон Юн, С.А.Яковенко, В.А.Твердислов, И.Бернхарт "Взаимодействие Фуросемида и DIDS с ленгмюровским монослоек стеариновой кислоты.", препринт Физического Факультета МГУ, 1994г.

2.Vsevolod A.lVerdislov, Gennady B.Khomutov, Sergey A.Yakovenko, Hwang Don Youn, Anna ITu. Bogdanova, Ingolf Bernhardt "Furosemid and DIDS Penetration into Langmuir Films of Stearic Acid. The Influence of Low Ionic Strength and pH. "

Colloids and Surfaces B. Biointerfaces. ( в печати )

ООП Зкз$-тг. ."'ГУ 3-г:.44_Ю0-94г.