Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Митохондриальной АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Митохондриальной АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии"

На правах рукописи □□30583Б0

Качаева Евгения Владимировна

Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии

03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2007

003058360

Работа выполнена в Пущинском государственном университете на базе Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель

Доктор биологических наук, профессор Миронова Г.Д

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Звягильская P.A. доктор биологических наук, профессор Новоселова Е Г.

Ведущая организация

Институт физико-химической биологии им. А Н Белозерского при МГУ, г Москва

Защита состоится ZA иаъи 2007 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу:

142290 Московская обл., г. Пущино, ИБК РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН Автореферат разослан «¿¿¿> » (ллфыи^-_2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Кандидат биологических наук

Смолихина Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Митохондриальный АТФ-ингибируемый калиевый канал (миггоКАТФ), осуществляющий вход калия в MX, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране MX в 1991 г [Inoue et al, 1991] Однако, еще в 1981 г в лаборатории проф Мироновой из MX мембраны был изолирован белок с м м 55 кДа, обладающий, при встраивании в бислойные липидные мембраны, свойствами данного канала Исследованы его биофизические свойства, механизмы его регуляции и физиологическая роль [Миронова и др, 1981, 1996 (I, II), Gngonev et al., 1999, Mironova et al, 1999, 2004]. Было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al, 1992, Миронова и др., 1996 (I)]

Интерес к исследованию митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала (митоКАТФ) в последнее время возрос, поскольку было установлено, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите сердца от ишемии [Garlid et al, 1997, Vanden Hoek, 2000 и др ]

Найден целый ряд синтетических активаторов митоКАТФ, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al, 1992, Liu et al, 1998, Sato et al, 1998, Tsai et al, 2002] Недавно в нашей лаборатории был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКАХФ -уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Негода АЕ, 2001, Mironova et al, 2004] Кардиопротекторное действие УДФ до настоящего времени не было изучено

Помимо важной роли митоКдтф в защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают его участие в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al, 2003] Однако прямых доказательств роли канала в адаптации организма к гипоксии до настоящего времени не получено, следовательно, данный феномен также требует дополнительных исследований

Работа посвящена поиску новых путей кардиопротекции, так как, несмотря на большие усилия, направленные на лечение сердечно-сосудистых заболеваний, они все еще являются одной из первых причин смертности населения в мире Таким образом, актуальность поиска новых подходов к предупреждению и лечению этих заболеваний не вызывает сомнений

В настоящее время большинство исследователей считает, что конечным эффектором кардиопротекции, вызванной прекондицией, является митоКАТФ [Yellon et al, 1998, Петрищев и др , 2001] Как уже упоминалось выше, физиологическая роль и параметры функционирования митоКАТФ достаточно хорошо изучены, однако, его структурная организация до сих пор остается неизвестной Изучение структуры митоКАтф позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне

Целью настоящей работы является изучение кардиопротекторного действия специфического активатора митоКАТФ, уридиндифосфата (УДФ) и исследование роли данного канала в формировании адаптации организма к гипоксии, а также выяснение структурной организации митоКАТф канала

Задачи исследования

1 Изучить кардиопротекторное антиишемическое и антиаритмическое действие метаболических предшественников УДФ - уридина и УМФ на модели острого инфаркта миокарда у крыс

2 Исследовать параметры функционирования митоКАТФ у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода

3 Определить гомологию структуры исследуемого белка с м м 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков

4 Получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с мм 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ- ингибируемые К+ -каналы,

5. Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных МХ с использованием полученных антител (АТ) с целью доказательства принадлежности белка с мм. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ

Научная новизна работы. В данной работе впервые изучено антиишемическое и антиаритмическое кардиопротекторное действие веществ уридинового ряда - природных активаторов митоКдтф, на модели инфаркта миокарда Впервые также исследовались параметры функционирования митоКАТф у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также изучалась роль канала в формировании адаптации к кислородному голоданию у животных Проведено сравнение гомологии структуры митоКдтф с аминокислотной последовательностью известных белков

Научно-практическое значение работы. Представленная работа имеет научно-практическое значение, поскольку в работе обнаружено, что метаболический активатор митоКАТФ обладает выраженными анти-ишемическим и антиаритмическим свойством, то есть играет существенную роль в защите миокарда от ишемических повреждений Результаты проведенных в работе исследований открывают перспективу разработки нового подхода к предотвращению и лечению инфаркта миокарда и различного рода аритмий с использованием предшественников природного активатора митоКдтф, УДФ Изучение роли активации митоКАТФ при тренировке животных к кислородной недостаточности позволит в дальнейшем разработать пути повышения жизнеспособности организма в условиях гипоксии

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002 г), XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции (Самара, 2002), XXXIII научной конференции студентов (Самара, 2002), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), XV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003), на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство Регуляторы

энергетического обмена Клинико-фармакологические аспекты» (Москва, 2003), на XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), International Conference "Biological motility" (Пущино, 2004), XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), международной конференции «Рецепция и межклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2005), VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine (Moscow, 2006), VI International conference "Hypoxia m medicine" (Milan, Italy, 2006), международной конференции «Mitochondnal Physiology» (Austria, 2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 23 печатные работы

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 121 странице, иллюстрирована 22 рисунками и 9 таблицами, список литературы состоит из 346 наименований

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Митохондрии выделяли из печени и сердца крыс линии Вистар (250 гр ) общепринятым методом дифференциального центрифугирования Среда выделения содержала 250 мМ сахарозы, 10 мМ Трис-НС1, 0 5 мМ ЭГТА, рН 7 4, в случае митохондрий сердца в среду добавлялось 0 01% протеазы и 1 % альбумина

Выделение ^-транспортирующего белка из внутренней мембраны митохондрий печени и сердца крыс проводили методом водно-этанольной экстракции (Миронова и др, 1996) Очистка белка проводилась методом ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ-целлюлозы в качестве носителя Для дополнительной очистки проводили повторную хроматографию активной фракции Для окончательной очистки белка до электрофоретически гомогенного состояния проводился нативный электрофорез активной фракции с последующей экстракцией белка с геля

Ион-транспортирующая активность изучалась путем измерения электрических характеристик БЛМ, модифицированной исследуемым белком в условиях фиксации потенциала с использованием операционного усилителя МАХ406, соединенного с компьютером IBM РС/АТ286 для записи величины тока через мембрану Бислойная липидная мембрана формировалась методом Мюллера из раствора липидов 90% общих липидов мозга, 10% кардиолипина, растворенных в n-декане Суммарная концентрация липидов в n-декане составляла 20 мг/мл

Энергозависимый вход К+ в митохондрии определяли спектрофотометрическим методом по скорости набухания митохондрий в изотонической среде с КС1 в присутствии субстратов дыхания При работе по изучению влияния антител на АТФ-зависимый транспорт калия в митохондриях, использовалась гипотоническая среда Кинетику набухания регистрировали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий при длине волны 520 нм при постоянном перемешивании и термостатировании при 30°С на спектрофотометре "иу1коп" (Италия) Концентрация МХ белка в ячейке составляла 0 1 мг/мл Среда инкубации содержала 50 мМ КС1, 5 мМ НЕРЕБ, 5 мМ №Н2Р04, 5мМ янтарной кислоты или 0 1 М малата и 0 4 М глутамата, 0 5 мМ М§С12, 0 1 мМ ЭГТА, 5 мкМ цитохрома С, 2 мкМ ротенона, 1 мкМ циклоспорина А, рН 7 2. Набухание инициировали добавлением МХ Скорость набухания рассчитывалась по изменению светорассеяния за единицу времени

АТФ-зависимый выход К* из митохондрий проводили с использованием ^-селективного электрода по содержанию и скорости выхода катиона из деэнергизованных митохондрий в присутствии разобщителя окислительного фосфоршшрования Кинетику выхода калия регистрировали с помощью оригинального электрометрического усилителя, который через контроллер Ь-153 соединен с компьютером ЮМ РС486 Измерения проводились при постоянном перемешивании и термостатировании при 26°С Концентрация митохондриального белка в ячейке составляла 1,5-2 мг/мл Среда инкубации содержала 0 3 М сахарозу, 3 мМ КаН2Р04, 10 мМ Трис-НС1, рН 7.4 Содержание калия в митохондриях оценивалось в присутствии тритона Х-100, что приводит к полному выходу калия из митохондрий При проведении ингибиторного анализа с использованием иммуноглобулинов, использовалась гипотоническая среда (0 15 М сахарозы) Следует подчеркнуть, что данный метод позволяет регистрировать обращение работы АТФ-зависимого калиевого канала с использованием разобщителя, что дает возможность определять работу канала независимо от энергетического состояния митохондрий

Полярографическое определение параметров дыхания митохондрий проводили с помощью закрытого платинового электрода Кларка в кювете объемом 1 мл Концентрация белка в кювете составляла 1-2 мг/мл. Среда инкубации содержала 5 мМ Тга-НО, 200 мМ сахарозы, 50 мМ КС1, 5 мМ №Н2Р04, 3 мкМ ротенона, рН 7 2 Эксперименты проводились в закрытой ячейке при постоянном перемешивании и термостатировании при температуре 26°С

Для иммунохимических исследований митоКатф канала животных иммунизировали очищенным до электрофоретически гомогенного состояния белком с м м 55 кДа и получали поликлональные тканеспецифические антитела на этот белок Полученными антителами ингибировали АТФ-зависимый транспорт калия в митохондриях

Электрофорез и иммуноблотинг белка-канала с м.м. 55 кДа Проверку гомогенности очищенного белка с м м 55 кДа проводили с

помощью ДДЙ-ПААГ (10% гель) электрофореза с последующим переносом на нитроцелшолозную мембрану Проверка специфичности полученных антител проводилась далее непрямым Вестерн-блот анализом [Towbm et al, 1979] Титр полученных антител определяли методом непрямого дот-анализа Иммуноглобулины G для ингибиторного анализа выделяли из полученной антисыворотки методом дробного высаливания, хроматографии и диализа (Китти, 1991)

Ингибиторный анализ АТФ-зависимого транспорта К+ в митохондриях проводили анализируя скорости энергозависимого входа и ДНФ-индуцированного выхода калия из митохондрий Для улучшения проницаемости мембраны для иммуноглобулинов использовалась гипотоническая среда инкубации В качестве контроля использовалась преимунная сыворотка, а также сыворотка, содержащая специфические антитела на белок с м м 55 кДа, подвергнутая предварительно 5-тиминутному кипячению Также определялось влияние антител на параметры дыхания и фосфорилирования MX

MS-MALDI-TOF/TOF анализ (от англ Mass spectrometry/mass spectrometry-matrix assisted laser desorbtion/ionization — time of flight) Для анализа очищенный 55 кДа белок подвергали ферментативному гидролизу трипсином в денатурирующих условиях в геле. Для экстракции пептидной смеси после гидролиза проводили фингерпринтинг масс пептидов из геля ацетонитрилом/гидрокарбонатаммонием для анализа масс-спектрометрией Масс-спектральный анализ проводился на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex (Bruker, Daltonik) в режиме моноизотопической детекции 300-1800 Да Масс-спектры анализировались через базу данных MSDC и NCBI программой Mascot Работа выполнялась на базе ГУ Института физико-химической медицины им Ореховича, РАМН

Модель экспериментального острого инфаркта миокарда. Работа выполнялась совместно с сотрудниками Института экспериментальной медицины, г. Санкт-Петербург Для работы использовались самцы крыс линии Вистар (250 г ), которым вводили уридин и УМФ, а также ингибиторы КАТФ каналов (глибенкламид и 5-гидроксидеканоат (5-ГД)) Животные были поделены на экспериментальные группы, в зависимости от вводимых им препаратов Схема инъекций препаратов представлена в таблице

Инъекции препаратов выполнялись внутривенно У крыс проводилась окклюзия левой коронарной артерии (JIKA) в течение 60 минут без последующей реперфузии [Selye et al, 1960] Исследуемые препараты (уридин и УМФ) вводили внутривенно в дозе 30 мг/кг веса животного за 5 минут до окклюзии JIKA После выполнения эксперимента животные умерщвлялись

Таблица 1 Схема инъекций препаратов крысам с моделью острой ишемии миокарда

Группы животных I (контрольная группа) II III IV V VI VII VIII IX

Вводимые препараты

Уридин - + - - + - - + -

УМФ - - + - - + - - +

Глибенкламид - - - + + + - - -

5-ГД - - - - - - + + +

Анализ электрокардиограмм. Электрокардиограммы (ЭКГ) записывались при отведении II (ЕС1Т-03М2, Россия) при скорости движения бумаги 25 или 50 мм/с Чувствительность была настроена так, что 1 мВ = 10 мм отклонения ЭКГ регистрировалась до окклюзии, первые 30 минут окклюзии непрерывно и, затем, на 60-ой минуте после окклюзии

Анализ ишемических нарушений. Амплитуду Т-волны измеряли на ЭКГ перед окклюзией, а затем через 3, 30 и 60 минут после окклюзии Зона ишемической альтерации (ЗИА) определялась с использованием метода определения активности гликоген фосфорилазы [Fredenks, 1993] Полученное значение выражали как индекс ишемической альтерации (ИИА) ИИА = ]ГЗИА/линейное увеличение2 массу сердца.

Анализ нарушений ритма. Все нарушения ритма классифицируются в соответствии с конвенцией Лам бета [Walker et al, 1988] В работе измерялись время начала и длительность аритмии, количество экстрасистол (ЭС), частота возникновения и длительность тахикардии желудочков (ТЖ), а также длительность и частота возникновения фибрилляции желудочков (ФЖ) Все показатели измерялись в течение 30 минут постокклюзионного периода

Параметры функционирования митоКАтф канала у животных с различной резистентностью к гипоксии определяли при исследовании энергозависимого входа К+ в MX методом спектрофотометрии а также ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из митоходрий с помощью К*-селективного электрода Кроме того, в работе изучались параметры сопряженного дыхания MX у животных каждой группы

Отбор высоко- и ннзкоустойчивых крыс проводился с использованием барокамеры Группа высокоустойчивых (ВУ) животных выдерживала острую гипобарическую гипоксию, соответствующую подъему на высоту 11500 м, в течение 10-15 мин Низкоустойчивые (НУ) выдерживали эту высоту только в течение 1-1 5 мин [Лукьянова и др, 1999, Лукьянова, Коробков, 1981]

Интервальная гипоксическая тренировка проводилась методом прерывистой нормобарической гипоксии, при которой низкоустойчивые к

гипоксии животные помещались в специальную камеру, в которую подавался воздух с концентрацией кислорода в два раза ниже нормы (10% 02) на 10 минут 5 раз в день с 3-минутными интервалами Во время интервалов в камеру подавался воздух с нормальным содержанием кислорода Процедуру повторяли в течение 12 дней Для этого использовалась камера, сконструированная в научно-клинической лаборатории Hypoxia Medical Academy, Москва

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение физиологической роли митоКАТФ канала при гипоксии.

1.1. Изучение кардиопротекторного действия активации митоКАТФ канала уридииовыми нуклеотидами на модели экспериментального острого инфаркта миокарда.

Как было установлено ранее в нашей лаборатории [Mironova et al, 2004], УДФ является физиологическим активатором митоКАТФ Кардиопротекторное действие УДФ изучалось при введении животным т vivo его предшественников в клетке — уридина и УМФ, способных в отличие от самого УДФ, проникать через клеточную мембрану и фосфорилироваться в клетке до УДФ (Aussedat et al, 1984, Matsushita et al, 1970)

В работе оценивались следующие ишемические нарушения 1) индекс гапемической альтерации (ИИА) миокарда, определяемый исходя из размера зоны ишемической альтерации гистохимическим методом, и 2) величина обменной волны Т, определяемая на ЭКГ Показано, что ИИА снижается при внутривенном введении уридина в 2 раза и УМФ почти в 3 5 раза (Рис 1А)

Оба препарата также заметно снижают амплитуду Т-волны (Рис 1Б) Ингибиторы КАТФ каналов - глибенкламид (митохондриального и клеточного) и 5-ГД (митохондриального), блокируют положительное действие препаратов в обоих случаях (Рис 1)

Способность специфического ингибитора митоКдтф, 5-ГД, блокировать антиишемическое действие уридина и УМФ говорит о доминирующей роли митоКАТФ в защите миокарда от ишемических повреждений Т е защита миокарда от ишемических повреждений опосредуется, преимущественно, активацией митоКАТф

В работе также исследовалось влияние уридина и УМФ на нарушения сердечного ритма При этом определялись такие параметры, как количество экстрасистол, частота возникновения и длительность желудочковой тахикардии и фибрилляция желудочков

и 11 1

I <4

¡V 8 о

м-д--—. _

"■> кдм

Гп^ГД

А

£

10|* ! (М

1 " в

Ч-ГД

УМФ

Гл* ^ГД

Рис. 1. Влияние уридина и УМФ, а также специфических ингибиторов Кдтф каналов на ИИА миокарда и амплитуду Т-волны при ишемии миокарда.

Установлено, что уридин в 4 раза, а УМФ почти в 6 раз сокращают количество экстрасистол (Рис. 2А). Кроме того, уридин в 4 раза, а УМФ в 9.4 раза снижают продолжительность желудочковой тахикардии (Рис. 2Б). Антиаритмический аффект уридина и УМФ блокировался, главным образом, глибенкламидом, в то время как 5-ГД оказывал менее выраженный эффект (Рис. 2). Следовательно, антиаритмическое действие уридиновых препаратов опосредовано активацией обоих каналов, но, в большей степени, активацией ЩпоКдтф.

Фибрилляция является крайним проявлением нарушений ритма сердца, приводящим к гибели организма. Введение уридина в 4, а УМФ - в 10 раз снижает длительность фибрилляций (Рис. 3) и существенно уменьшает частоту возникновения фибрилляций, наблюдаемых при экспериментальном инфаркте миокарда. При этом ни глибенклзмид, ни 5-ГД не блокируют действие уридиновых препаратов на длительность фибрилляций, но почти полностью снимают защитный эффект уридина и УМФ на частоту возникновения фибрилляций. Следовательно, антифибрилдяторное действие уридина и УМФ опосредуется активацией митоКДТФ канала лишь частично.

Из полученных данных следует, что предшественники природного активатора митоКАХФ канала в перспективе могут использоваться как лекарственные препараты.

л

Б

.150 ; 400

* ззо

|,Э00

| 250 > зоо

] 150

; юз [ я

1

I

Ишемия ¥рид1« .

1:0 £ а ню

* I

¿1 ю 11 «■ Зе «

]1ш™пл Тпцяип— —— г?-гд

Рас. 2. Влияние уридина и УМФ на нарушения сердечного ритма.

> рлдЦН-

Е0

Рис. 3 Влияние уридина и УМФ на длительность фибрилляции желудочков.

"""гш* 5-гд в работе были

также получены данные о том, что введение уридина и УМФ через 5 минут после окклюзии приводит к заметному кардиопротеигорному эффекту, что позволяет говорить о перспективах использования данных препаратов не только для предупреждения, но и для лечения инфаркта миокарда. При этом, тот факт, что УДФ является метаболическим активатором канала, использование его производных в качестве лекарственных средств будет иметь ряд преимуществ, по сравнен и ¡о с синтетическими аналогами, поскольку они не обладают отрицательными побочными эффектами, присущими синтетическим лекарственным препаратам. Кроме того, концентрацию УДФ в клетке можно регулировать.

1.2. Параметры функционирования митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к г ипоксии.

Для изучения роли митоКдтф канала в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию, а также для понимания механизма кардио протектор но го действия активации канала, в работе была поставлена задача исследовать параметры дыхания, окислительного фосфорилировання и АТФ-зависим о го транспорта К+ в МХ печени и сердца крыс с различной устойчивостью к недостатку кислорода, а также у животных, адаптированных к гипоксии.

Показано, что скорость дыхания МХ во всех метаболических состояниях у высоко устойчивых животных значительно ниже таковой у низко устойчивых (Рис. 4А). Причем время, за которое фосфор илируется определенное количество АДФ у высоко устойчивых животных даже снижено.

Рис. 4. Скорость дыхания (А) и показатели фос формирования (Б) митохондрий сердца крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к гипоксии.

Это свидетельствует об исходно большей экономичности процесса синтеза АТФ у высоко устойчивых животных.

Адаптация низко устойчивых животных к гипоксии путем интервальной гипоксической тренировки, приводит к сопряжению дыхания, что, в свою очередь, выражается в снижении скорости дыхания (Рис. 4А), увеличении дыхательного контроля и сокращении времени, необходимого для фосфорилирования АТФ (Рис.4Б).

В работе также определялись параметры АТФ-зависНМОГО транспорта К+ в МХ крыс с различной резистентностью к гипоксии, а также у низкоусточивых крыс после их адаптации гипоксической тренировкой. Как следует из рисунка 5, скорость АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ определялась двумя методами (по входу (Рис. 5А) и выходу (Рис. 5Б) калия). У высокоустойчивых крыс скорость транспорта калия существенно выше, чем у низкоустойчивых. Гипоксическая тренировка приводит к увеличению скорости транспорта К" до уровня, сравнимого с аналогичными показателями высокорезистентных крыс (Рис. 5).

■А

и

А

Б

Рис. 5. Скорость энергозависимого входа К+ (А) и ДНФ-индуцированного выхода К+ (Б) из митохондрий печени и сердца крыс с различной устойчивостью к гипоксии.

Обращает на себя внимание тот факт, что концентрация калия в МХ высокоустойчивых и, особенно, адаптированных к гипоксии крыс значительно ниже, чем у низкоустойчивых животных (Рис. 6). То есть объем МХ у них не увеличен, а даже уменьшен, несмотря на увеличение скорости входа калия в МХ, Следовательно, адаптация приводит, по-видимому, не только к интенсификации энергозависимого входа К\ но и к значительной активации К+/Н4-обменника, который регулирует выход ионов калия из МХ. С этой точки зрения снижение активности КТН^-обменника может быть причиной высоко амплитудного набухания и следующего за ним повреждения МХ при высокой степени ишемии.

Рис. 6. Количество К+ в митохондриях сердца крыс с различной резистентностью и адаптированных к гипоксии.

Известно, что при гипоксии недостаток кислорода приводит к восстановлению переносчиков дыхательной цепи [Лукьянова, 2004].

Сеурдпе

Восстановление переносчиков I и III комплексов цепи, приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) [Kaplan-Bresler, 1965, Ferranti et al, 2003]

В норме MX превращают несколько процентов потребляемого кислорода в АФК [Lenaz et al, 2002], которые необходимы для функционирования дыхательной цепи [Kondrashova and Mironova, 1971], тогда как, повышенное образование АФК, наблюдаемое при гипоксии, служит основным повреждающим фактором [Starkov et al, 1997, Barger et al., 2002] Обнаруженная нами активация калиевого цикла, способствует слабому разобщению митохондрий и снижению мембранного потенциала Известно, что незначительное снижение мембранного потенциала (-13%) ведет к существенному уменьшению продукции АФК (до 80%) [Korshunov et al, 1997] С этими представлениями согласуются известные данные о том, что активация митоКАТФ канала сопровождается снижением концентрации АФК в клетке, способствуя сохранению уровня АТФ [Zweier et al, 1987, Раш et al, 2000]. Таким образом, обнаруженная нами активация калиевого цикла при адаптации к гипоксии и, следующее за этим снижением, образование АФК, может объяснить известную [Pearlstem et al, 2002, Li et al., 2002] защитную роль митоКАТФ канала при ишемии/реперфузии

2. Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала.

2.1. Определение структурной гомологии белка с м.м. 55 кДа аминокислотной последовательности известных белков методом MS-MALDI-TOF/TOF.

Следующим этапом работы было изучение структуры белка с м м 55 кДа, а именно, определение гомологичности этой структуры последовательностям известных белков MS-MALDI-TOF/TOF анализом

Показано, что белок с м м 55 кДа на 54% гомологичен белку-предшественнику, который, исходя из результатов анализа базы данных NCBI, является предшественником кальрегулина (Рис 7) Вероятно, белок с мм 55 кДа является конечным продуктом систем посттрансляционной модификации данного белка-предшественника

Процент перекрывания аминокислотных последовательностей типичного кальрегулина печени крысы, с последовательностями 55 кДа белка также оказался достаточно большим

Классический кальрегулин входит в состав семейства высококонсервативных белков с мм около 55 кДа, выделенных из ретикулума клеток печени, скелетной и гладкой мускулатуры, сердечной мышцы [Fliegel et al, 1989] Белки этого семейства связывают ионы кальция, цинка, других металлов, а также сахара, связанные с УДФ, и другие нуклеотиди- и трифосфаты Ранее в нашей лаборатории было показано, что белок с м м 55 кДа также способен связывать кальций и сахара, что говорит о

вероятной функциональной гомологии изучаемого 55 кДа белка и кальрегулина.

1 MLLSVPLLLG LLGLAAADPA IYFKSHgij DAWTORWVES KHKSDFGKFV 51 LSSGKFYGQO FKDKGI .QTSQ i>ARPYAi .SAR FEPFSNKGQT I.VVQMVKHE 101 ONrDCGGGYVÜLFPGGLDQK DMHGDSl.YNl M! GPDiCGPG TKKVi IV1FNY 151 KGKNVLINKD [RCKÖDEFTH I.Vn.IVRPDN TYHVKIDNSQ ' VEgßSLEDöW 201 DFLPPKK1KD PBAÄfCPEDWti ERAKIDDFTD SKPEDWDKPK: IflPDPDAKKP 251 EDWDEEMIXjE WEPPVrQNPE YKGEWKPRQf DMPDYKGTWI HPEIDNPEYS 301 PDAN1YAYDS FAVEGi.DLWQ VKSGTIFDNF ÜTNr>EAYAE EFGNETWGVT 351 &AAEKQMKDK QDEEQRLKEE EEDKKRKEEli EAEF)KEDEDD RDEDEDEEDE 401 KEEDEEDATG QAKDEL

Рис. 7. Аминокислотная последовательность предшественника кальрегулина. Участки структуры б ел ка-предшественника, совпадающие с последовательностями, имеющимися в белке с м.м. 55 кДа, выделены серым цветом.

В составе гтрекурсорного белка и кальрегулинов различных типов имеется характерная гидрофобная сигнальная последовательность из 17 аминокислотных остатков, MLLSVPLLLGLLGLAAA (1-17), посггрансляционно удаляемая гтротеолитическим расщеплением [Murthy et al., 1990], которая отсутствует в изучаемом нами белке. N-концевая последовательность с 17 по 27 аминокислотный остаток DPAIYFKE 55 кДа белка, структура которого была определена ранее в нашей лаборатории реакцией химической де1радации по Эдману [неопубликованные данные] совпадает с N-концом кальрегулина, прошедшего стадии посттрансляционного созревания. Причем, необходимо заметить, что большая часть перекрывающейся последовательности приходится на Р-домен кальрегулина, способного связывать нуклеотиды. Также, в перекрывающуюся последовательность включены высоконсервативные остатки триптофана, характерные для кальрегулинов в данных сайтах первичной последовательности, и стер и чес к и идентично расположенные в первичной аминокислотной последовательности кальрегулина консервативные антипараллельные бета-листы, формирующие Р-домен [Schweizer et а)„ 1993].

Важно отметить, что С-конец прекурсор но го белка, как и всех кальрегулинов, содержит сигнальную последовательность KDEL, определяющую локализацию этих белков в ретикулюме [Schweizer et а!., 1993], в то время как у изучаемого 55 кДа белка такой последовательности нет, что, вероятно, определяет локализацию исследуемого белка не в ретикулюме.

Возможно. исследуемый нами белок, гомологичный кальрегулину, проходит альтернативные стадии пострансляционных модификаций и созревания при биосинтезе. Такая модификация, вероятно,

позволяет ему встраиваться во внутреннюю мембрану митохондрий беспрепятственно и без значительных потерь энтропии и внутренней энергии при смене гидрофильной среды на гидрофобную Не исключено также дополнительное стерическое и физико-химическое влияние на химические свойства и конформационную норму со стороны компонентов мембраны митохондрий Учитывая все вышесказанное, на данном этапе исследования структуры митоКАТф, можно утверждать лишь, что белок с м м. 55 кДа является белком, обладающим высокой степенью структурной и функциональной гомологии с кальрегулином

2.2. Ингибиторный анализ активности митоКАТФ канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа.

Гомологичность белка с мм. 55 кДа кальрегулину вызвала необходимость доказательства принадлежности исследуемого белка к системе АТФ-ингибируемого транспорта калия в митохондриях. Поэтому следующей задачей работы является получение на данный белок поликлональных антител (АТ) и проведение анализа их влияния на АТФ-зависимый транспорт калия в интактных МХ.

Электрофоретически чистый белок с м м 55 кДа при встраивании в искусственные мембраны формировал К+ канал, ингибируемый физиологическими концентрациями АТФ. На данный белок в работе были получены поликлональные антитела

Анализ специфичности полученных антител методом Вестерн-блот показал, что они специфически связываются только с белком с м м 55 кДа, и не связываются ни с одним из белков суммарной митохондриальной фракции Этим же методом установлена тканеспецифичность АТ, полученных на белок-канал с м м 55 кДа

Для проведения ингибиторного анализа из полученной антисыворотки стандартным методом выделяли В качестве контроля использовались преимунной сыворотки и ^С антисыворотки,

подвергнутые предварительно кипячению в течение 5 минут Из рисунка видно, что полученные в работе АТ ингибируют как энергозависимый (Рис 8А), так и независящий от энергии АТФ- чувствительный транспорт калия в митохондриях (Рис 8Б), что показано двумя методами

Следует отметить, что контрольной сыворотки и

инактивированные кипячением, не влияли на этот транспорт Кроме того, антитела, полученные на исследуемый белок, выделенный из МХ печени крысы, не блокировали АТФ-чувствительный К+ транспорт в МХ сердца крысы, при использовании обоих методов исследования, т к, они обладают тканеспецифичностью, о чем упоминалось выше

А

Б

Рис 8. Ингибирование энергозависимого входа К* (А) и ДНФ-инидуцированного выхода (Б) ионов из МХ печени крысы антителами на белок с м м. 55 кДа.

Важно подчеркнуть, что полученные антитела не влияли на параметры дыхания и фосфорилированияМХ, что доказывает специфичность полученных антител именно к системе АТФ — чувствительного транспорта К+ в митохондриях, осуществляемого митоКАТФ (Рис. 9)

[0(211 •

400 ыкМ

ни

и I ипт

¡0 нкМ днф

Рис 9. Действие антител к К^-транспортирующему белку с мм 55 кДа, выделенному из МХ печени крысы на сопряженное дыхание МХ 1 - Контроль, 2 - 0,5 мг 1§в/мг белка митохондрий

0 0 17 зз 50 6 7 8 3 Мин

Полученные результаты доказывают, что белок с мм 55 кДа действительно участвует в формировании АТФ-зависимого калиевого канала внутренней мембраны МХ и, по всей видимости, согласно данным нашей лаборатории, является его канальной субъединицей [Мпопоуа е! а1,2004]

выводы.

На основании полученных в работе результатов были сделаны следующие выводы

1 Показано, что при экспериментальном инфаркте миокарда уридин и УМФ, предшественники уридиндифосфата, - активатора митоКдтф, снижают размеры зоны инфаркта миокарда более чем в 3 раза, участвуют в нормализации Т-волны и сердечного ритма, а именно, в 4-6 раз сокращают количество экстрасистол, в 5-10 раз снижают длительность желудочковой тахикардии и межжелудочковой фибрилляции

2 С использованием специфических ингибиторов цитоКАТФ и митоКАГФ каналов показано, что антиишемическое действие уридина обеспечивается, в основном, митохондриальным КАТф каналом, а антиаритмическое -цитоплазматическим

3 Антифибрилляторный эффект обоих препаратов, связан не только с активацией этих каналов но, по-видимому, опосредуется также и другими механизмами

4 Обнаруженное в работе кардиопротекторное действие уридина и УМФ позволяет говорить о перспективе использования этих веществ в качестве лекарственных препаратов для предупреждения и лечения инфаркта миокарда

5. Формирование устойчивости животных к недостатку кислорода, а также адаптация нормобарической гипоксической тренировкой низкоустойчивых животных сопровождается сопряжением дыхательной цепи, активацией митоКАТФ канала и К+Л Г - обменника

6 Показано, что белок с мм 55 кДа обладает высокой степенью структурной и функциональной гомологии с типичным представителем семейства кальрегулинов

7. В работе получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственную мембрану АТФ-ингибируемые К+ каналы Ингибиторный анализ АТФ-чувствителыюго калиевого транспорта в интактных МХ с использованием полученных антител показал, что белок с м м 55 кДа относится к системе АТФ-зависимого входа К+ митохондрий

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи

1 Негода А Е , Качаева Е В , Миронова Г Д, Чайлахян Л.М. "Механизм регуляции митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала адениновыми нуклеотидами" Доклады Академии наук, Т400, №1, с. 1-4, 2005

2. Krilova I В., Kachaeva Е V., Rodionova О М, Evdokimova N R., Balma М I., Mironova G D , Sapronov N S The Cardioprotective Effect of Uridine and Undine-5'-monophosphate, the Role of the Mitochondrial ATP-dependent Potassium Channel Experimental Gerontology, 2006,41(7) 697-703

3 Миронова Г Д, Качаева Е В , Копылов А.Т Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал I. Структура канала, механизм его функционирования и регуляция Вестник Российской Академии Медицинских наук, 2007, № 2, стр 44-50

4 Миронова Г Д, Качаева Е В , Крылова И Б , Родионова О М, Балина М.И, Евдокимова Н Р, Сапронов Н С Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал II Роль канала в защите сердца от ишемии Вестник Российской Академии Медицинских наук, 2007, 2, стр 34-43

5 Mironova G D, Kachaeva E.V, Krilova I.B , Rodionova О M , Sapronov N S ATP-dependent potassium channels of cell and mitochondrial membranes-their role in cardioprotection Hypoxia Medical Journal In press, 2007.

Тезисы конференций:

1 Скарга Ю Ю, Негода А Е и др "Структура и регуляция митохондриального Кдтф канала". Сборник тезисов: "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", 2002 г, стр 128

2 Качаева Е В. "Изучение митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала, реконструированного в бислойные липидные мембраны." Сборник тезисов XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции, 2002, стр 120

3 Качаева Е В «Исследование параметров функционирования митохондриального АТФ-чувствительногокалиевого канала при реконструкции в БЛМ» Сборник тезисов XXXIII научной конференции студентов, г Самара, 2002

4 Качаева Е.В, Пиголев А Е и др " Зависимость активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала от та ткани и воздействия температуры". Сборник тезисов международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация", г. Пущино, 2003, стр 245-247

5 Качаева Е В , Негода А Е и др "Активация АТФ-чувствительного калиевого канала внутренней мембраны митохондрий УДФ и ГДФ " Сборник тезисов XV зимней международной молодежной научной школы

«Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», г. Москва, 2003, стр 41

6 Миронова ГД, Скарга ЮЮ и др "Роль активаторов АТФ-зависимого калиевого канала митохондрий в предупреждении инфаркта миокарда " Статья в сборнике научных трудов- "Регуляторы энергетического обмена Клинико-фармакологические аспекты", стр 53-61, Томск, 2003. 7. Качаева Е В , Негода А Е, Миронова Г Д "Изменение активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала в зависимости от метаболического состояния животных и типа ткани " Сборник тезисов XVI зимней молодежной научной школы «перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» 2004, стр 10.

8 Качаева Е В , Негода А Е, Миронова Г Д «Сравнение параметров АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях со свойствами выделенного и реконструированного в БЛМ АТФ-зависимого К+ канала» Сборник тезисов III Съезда биофизиков России, 2004

9 Negoda А.Е, Kachaeva Е V. et al "Mitochondrial KAtp channel openers and their antiischemic and antiarrythmic action " Сборник тезисов: «Biological motility». 2004, p 51-53

10 Качаева E В , Негода A E., Миронова Г Д «Изучение АТФазной активности митохондриального АТФ-чувствительного каливого канала» Сборник тезисов XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», г Москва, 2005

11. Качаева Е В , Балина М.И, Негода А.Е , Миронова Г Д «Возрастные изменения активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала сердца крыс» Сборник тезисов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г Пущино, 2005

12 Негода А Е, Качаева Е В , Балина М И, Крылова И Б., Родионова О М, Сапронов Н.С, Миронова Г Д «Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал- структурная организация и роль в кардиопротекции» Сборник тезисов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино, 2005

13 Балина М И, Качаева Е В , Негода А Е. «Изменение активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала в зависимости от метаболического состояния животных» Сборник тезисов 9 международной конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», г Пущино, 2005.

14 Качаева ЕВ. «Специфическое ингибирование АТФ-зависимого К+ транспорта в интактных митохондриях поликлональными антителами, полученными на митоКдтф канал (белок с м м. 55 кДа)» Сборник тезисов 9 международной конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», г Пущино, 2005

15 Mironova G D., Krylova IВ , Negoda А Е, Rodionova О М, Kachaeva E.V, Evdokimova N P., Sapronov N S. The metabolic activators of mitochondrial ATP-dependent potassium channel and its role in cardioprotection International Congress "Mitochondrial physiology", Austria, p 95,2005

16 Kachaeva E V., Krilova IB , Rodionova O M., Sapronov N.S, Mironova G.D Effect of uridine nucleotides on adaptation of myocardium to ischemia VIII World Congress of The International Society for Adaptive Medicine (ISAM), p 149, 2006

17 SapronovNS, Krylova IB., Rodionova OM, Evdokimova NR, Kachaeva E.V, Mironova G D Comparative study on the cardoprotective properties of the uridine and uridine nucleotides II Russian-Chinese Conference on pharmacology, Perm, 2006

18. Mironova G D , Krylova IB , Rodionova O M , Kachaeva E.V, Sapronov NS, Tkachouk EN, Lukyanova LD The role of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel in adaptation to hypoxia International conference on Adaptive medicine Milano, Italy, 2006

i i

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25 09 2000 г Подписано в печать 05 04 07 Тираж 75 экз Уел пл 1,31 Печать авторефератов (095) 730-47-74, 778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Качаева, Евгения Владимировна

Введение 6 Обзор литературы

1. Системы транспорта калия в MX.

1.1. Транспорт калия в MX.

1.2. Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в MX.

1.3. Физиологическое значение транспорта калия в MX.

2. АТФ-ингибируемые калий-транснортирующие каналы.

2.1. АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны.

2.1.1. Структурная организации цитонлазматического

АТФ-зависимого калиевого канала.

2.1.2. Биофизические свойства цитоплазматичсского калиевого канала.

2.1.3. Модуляторы цитоплазматического калиевого канала.

2.1.3.1. Внутриклеточные нуклеотиды - регуляторы цитоКдтф канала.

2.1.3.2. Фармакологические регуляторы цитоКдтф канала.

2.1.4. Функциональная роль цитоКдтф канала в клетке.

2.2. АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны MX.

2.2.1. Структурная организация митоКдтф канала.

2.2.2. Биофизические свойства митоКдтф канала.

2.2.3. Модуляторы митоКдтф канала.

2.2.3.1. Метаболические модуляторы митоКдтф канала.

2.2.3.2. Фармакологические модуляторы митоКдтф канала.

2.4. Функциональная роль митоКдтф.

2.4.1. Активация митоКдтф в развитии устойчивости организма к гипоксии.

2.4.2. Механизмы защиты сердца при гипоксии, опосредованные активацией митоКдтф.

2.4.3. Феномен прерывистой гипобарической тренировки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Выделение MX.

1.1. Выделение MX печени крысы.

1.2. Выделение MX сердца крысы

2. Выделение и очистка митоКдтф канала.

3. Изучение энергозависимого входа К+ в MX методом спектрофотометрии.

4. Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из MX.

5. Полярографическое определение параметров дыхания MX.

6. Иммунохимическое исследование митоКдтф канала.

6.1. Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа. 56 6.1.1. Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка.

6.2. Иммунизация и анализ препарата антител. 56 6.2.1. Детекция специфических антител и определение титра.

6.2.1.1. Непрямой Дот-анализ.

6.2.1.2. Вестерн-Блот анализ.

6.3. Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа.

6.4. Ингибиторный анализ с использованием антител к белку с м.м. 55 кДа.

7. MS-MALDI-TOF/TOF анализ.

8. Модель экспериментального острого инфаркта миокарда.

8.1. Хирургические процедуры и модели животных.

8.2. Схема эксперимента

8.3. Анализ электрокардиограмм.

8.3.1. Анализ ишемических нарушений.

8.3.2. Анализ нарушений ритма.

8.4. Критерии отбора.

8.5. Статистический анализ. 65 9. Определение параметров функционирования митоКдтф канала крыс высоко- и низкоустойчивых к гипоксии.

9.1. Метод отбора высоко- и низкоустойчивых животных.

9.2. Адаптирование низкоустойчивых животных к недостатку кислорода методом прерывистой нормобаричсской гипоксии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение физиологической роли митоКдтф канала при гипоксии.

1.1. Изучение влияния активации митоКдтф канала уридиновыми нуклеотидами на повреждения миокарда при ишемии на модели экспериментального острого инфаркта миокарда.

1.1.1. Влияние уридина и уридин-5'-монофосфата на ишемические изменения сердечной активности, при введении препаратов до и после создания экспериментального инфаркта.

1.1.2. Антиишемическое действие уридина и уридин-5'-монофосфата.

1.1.3. Антиаритмичсский эффект уридина и уридин-5'-монофосфата.

1.2. Параметры функционирования митоКдтф канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии.

1.2.1. Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилированин в MX печени и сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии.

1.2.2. Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в MX печени сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии. 83 2. Изучение структурной организации митохондриального

АТФ-зависимого калиевого канала.

2.1. Определение гомологии белка с м.м. 55 кДа методом

MS-MALDI-TOF/TOF.

2.2. Ингибиторный анализ активности митоКдтф канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа.

2.2.1. Определение степени чистоты белка, используемого для иммунизации.

2.2.2. Иммунизация и определение титра полученных антител.

2.2.3. Определение специфичности полученных антител.

2.2.4. Выделение иммуноглобулинов G (IgG) из антисыворотки и проведение ингибиторного анализа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Митохондриальной АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии"

Митохондриальный АТФ-ингибируемый калиевый канал (митоКдтф), осуществляющий вход калия в MX, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране MX в 1991 г. [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой белка с м.м. 55 кДа, обладающий свойствами данного канала, был изолирован из MX мембраны в виде [Миронова и др., 1981]. Позднее было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)].

В настоящее время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального калиевого канала и его физиологическая роль [Миронова и др., 1996 (I, И); Paucek et al., 1992; Inoue et al., 1991; Garlid et al., 1997; Mironova et al., 1999; 2004]. Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос, поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [Grover et al., 1992; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоКдтф, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Недавно в лаборатории проф. Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКдтф - уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004; Негода А.Е., 2004]. Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как активатора К+-канала, и, следовательно, кардиопротектора, до настоящего времени не было изучено на животных.

Помимо важной роли митоКдтф в защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают участие активации канала в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al., 2003]. Однако прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных исследований.

Настоящая работа посвящена поиску новых путей кардиопротекции, так как, несмотря на большие усилия, направленнные на лечение сердечнососудистых заболеваний, они все еще являются одной из первых причин смертности в мире. Таким образом, актуальность поиска новых подходов к предупреждению и лечению этих заболеваний не вызывает сомнений. В настоящее время большинство исследователей считает, что конечным эффектором кардиопротекции, вызванной прекондицией, является митоКатф [Yellon et al., 1998; Петрищев и др., 2001]. Как уже упоминалось выше, физиологическая роль и параметры функционирования митоКдтф достаточно хорошо изучены, однако, его структурная организация до сих пор остается неизвестной. Изучение структуры митоКдтф позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне.

В связи с этим, целью данной работы было: изучить кардиопротекторное действие предшественников УДФ при ишемии миокарда, а также исследовать параметры функционирования митоКдтф У животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию , а также выяснить структурную организацию митоКдтф.

Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:

1) Изучить кардиопротекторное антиишемическое и антиаритмическое действие специфического активатора митоКдтф уридиндифосфата на модели острого инфаркта миокарда у крыс.

2) Исследовать параметры функционирования митоКдтф У крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода.

3) получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-ингибируемые К+ каналы;

4) Определить гомологию структуры исследуемого белка с м.м. 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков.

5) Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных MX с использованием полученных антител (AT) с целыо доказательства принадлежности белка с м.м. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К+ в MX.

Новизна исследования. В данной работе впервые изучено антиишемическое и антиаритмическое кардиопротекторное действие веществ уридинового ряда -природных активаторов митоКдтф, на модели инфаркта миокарда. Впервые также исследовались параметры функционирования митоКдтф у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также изучалась роль канала в формировании адаптации к кислородному голоданию у животных. Проведено сравнение гомологии структуры митоКдтф с аминокислотной последовательностью известных белков.

Научно-практическое значение работы. Представленная работа имеет научно-практическое значение, поскольку в работе обнаружено, что метаболический активатор митоКдтф обладает выраженными анти-ишемическим и антиаритмическим свойством, то есть играет существенную роль в защите миокарда от ишемических повреждений. Результаты проведенных в работе исследований открывают перспективу разработки нового подхода к предотвращению и лечению инфаркта миокарда и различного рода аритмий с использованием предшественников природного активатора митоКдтф, УДФ

Изучение роли активации митоКдтф при тренировке животных к кислородной недостаточности позволит в дальнейшем разработать пути повышения жизнеспособности организма в условиях гипоксии.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Качаева, Евгения Владимировна

выводы

1. Показано, что при экспериментальном инфаркте миокарда уридин и УМФ, предшественники уридиндифосфата, - активатора митоКАТФ, снижают размеры зоны инфаркта миокарда более чем в 3 раза, участвуют в нормализации Т-волны и сердечного ритма, а именно, в 4-6 раз сокращают количество экстрасистол, в 5-10 раз снижают длительность желудочковой тахикардии и межжелудочковой фибрилляции.

2. С использованием специфических ингибиторов цитоКдтф и митоКдтф каналов показано, что аптиишемическое действие уридина обеспечивается, в основном, митохондриальным Кдтф каналом, а антиаритмическое - цитоплазматическим.

3. Антифибрилляторный эффект обоих препаратов, связан не только с активацией этих каналов но, по-видимому, опосредуется также и другими механизмами.

4. Обнаруженное в работе кардиопротекторное действие уридина и УМФ позволяет говорить о перспективе использования этих веществ в качестве лекарственных препаратов для предупреждения и лечения инфаркта миокарда.

5. Формирование устойчивости животных к недостатку кислорода, а также адаптация нормобарической гипоксической тренировкой низкоустойчивых животных сопровождается сопряжением дыхательной цепи, активацией митоКдтф канала и К+/Н+ - обменника.

6. Показано, что белок с м.м. 55 кДа обладает высокой степенью структурной и функциональной гомологии с типичным представителем семейства кальрегулинов.

7. В работе получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственную мембрану АТФ-ингибируемые К+ каналы. Ингибиторный анализ АТФ-чувствительного калиевого транспорта в интактных MX с использованием полученных антител показал, что белок с м.м. 55 кДа относится к системе АТФ-зависимого входа К+ митохондрий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению роли митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала (митоКдтф) в защите сердца от ишемии, формировании адаптации животных к гипоксии, а также исследованию структурной организации данного канала.

Ранее было показано, что активация митоКдтф канала наряду с активацией цитоплазматического КАТф канала (цитоКдтф) играет важную роль в предохранении сердца от ишемических повреждений. К настоящему времени известно множество синтетических активаторов митоКдтф канала, обладающих кардиопротекторными свойствами. Ранее в нашей лаборатории был обнаружен природный активатор митоКдтф - уридип-5'-дифосфат (УДФ), способный в микромолярных концентрациях реактивировать канал, встроенный в искусственную бислойную липидную мембрану (БЛМ), и в инактных митохондриях, и предварительно заблокированный физиологической концентрацией АТФ [Негода, 2003, Mironova et al., 2004]. Механизм реактивирующего действия УДФ на канал пока не ясен. Тот факт, что УДФ является метаболическим препаратом, имеет большие перспективы в плане лечения, поскольку его концентрацию в клетке можно регулировать, и он не обладает побочными эффектами, возникающими при использовании синтетических препаратов.

В представленной работе было исследовано кардиопротекторное действие УДФ на митоКдтф. При этом использовались метаболические предшественники УДФ, способные, в отличие от самого УДФ, проникать в клетку [Matsushita et al., 1983; Aussedat et al., 1987]. Специфичность действия предшественников УДФ проверялась с использованием ингибитора как цитоплазматического, так и митохондриального Кдтф каналов, глибенкламида, а также специфического блокатора митоКдтф, 5-гидроксидеканоата (5-ГД). В работе с использованием модели острого экспериментального инфаркта миокарда у крыс определяли анти-ишемическое и антиаритмическое действие уридина и УМФ. Оценивались следующие параметры ишемических повреждений: размер зоны ишемической альтерации (ЗИА), выраженный л как индекс ишемической альтерации (ИИА) (ИИА=ЗИА/ линейное увеличение -массу сердца), а также изменение амплитуды Т-волны, являющейся основным показателем ишемических нарушений при инфаркте. При изучении антиаритмического действия препаратов методом электрокардиографии определялись количество экстрасистол, длительность желудочковой тахикардии и показатели фибрилляции желудочков.

Исследования показали, что при экспериментальной ишемии миокарда уридин и УМФ существенно снижают размеры зоны инфаркта миокарда (более чем в 3 раза), способствуют нормализации амплитуды Т-волны. Кроме того, наблюдается заметное улучшение параметров ритма сердца, а именно, количество экстрасистол снижается в 4-6 раз, длительность желудочковой тахикардии и межжелудочковой фибрилляции сокращается в 5-10 раз. При этом показано, что антиишемическое действие уридина и УМФ блокируется как глибенкламидом, так и 5-ГД, что говорит о преимущественном вкладе в защитное действие препаратов активации митоКдтф канала. В то же время антиаритмический эффект предшественников УДФ опосредован, активацией и митохондриалыюго, и цитоплазматического Кдтф каналов, но в большей степени, активацией цитоКдтф. Антифибрилляторный же эффект уридина и УМФ опосредуется не только активацией мито- и цитоКдтф каналов, но, в большей степени, другими механизмами, поскольку защитный эффект препаратов блокируется 5-ГД и глибенкламидом незначительно.

Поскольку в работе показано, что защитное действие препаратов проявляется также и при введении их уже после создания ишемии, то можно говорить о перспективах их использования не только для предупреждения, но и для лечения инфаркта миокарда.

В представленной работе также была изучена роль митоКдтф канала в формировании адаптации животных к кислородному голоданию. Для этого использовали крыс, разделенных на две группы (низкоустойчивые и высокоустойчивые) по способности выдерживать подъем на высоту в 11500 м. Кроме того, в работе низкоустойчивые животные, были адаптированы к недостатку кислорода прерывистой нормобарической гипоксической тренировкой.

Показано, что у высокоустойчивых животных митоКдтф канал работает эффективнее, а показатели сопряжения дыхательной цепи были выше, чем у низкоустойчивых. Адаптация низкоустойчивых животных к гипоксии сопровождается сопряжением дыхательной цепи и активацией митоКдтф канала. В то же время, поскольку набухания, которое, как предполагается, должно следовать за активацией митоКдтф, не наблюдается, так как количество калия в митохондриях, по нашим данным, не увеличивается, а даже снижается, вероятнее всего, активируется также и система выхода калия из митохондрий (система К+/Н+-обменника).

Задачей настоящей работы было также выяснение структурной гомологии белка с м.м. 55 кДа, формирующего канальную субъединицу митоКдтф канала [Mironova et al., 2004] аминокислотным последовательностям известных белков. Для этого проводился MS-MALDI-TOF/TOF анализ, с последующей обработкой результатов. Было показано, что белок с м.м. 55 кДа обладает высокой (54%) степенью структурной и функциональной гомологии с типичным представителем семейства кальрегулинов.

Полученный результат вызвал необходимость дополнительного исследования принадлежности исследуемого белка-канала к семейству митохондриальных белков. Для этого на 55 кДа белок, выделенный из митохондрий печени крысы и формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-чувствительный калиевый канал, были получены специфические поликлональные антитела. Вестерн-блот анализ с полученными антителами позволил выявить тканеспецифичность изучаемого белка-канала. Был также проведен ингибиторный анализ АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях, результаты которого показали, что AT на белок из митохондрий печени крыс ингибировали этот транспорт в митохондриях печени, но не сердца крыс. При этом они не влияли на показатели сопряженного дыхания митохондрий печени крыс. Следовательно, белок с м.м. 55 кДа действительно относится к системе АТФ-чувствительного входа К+ в митохондрии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Качаева, Евгения Владимировна, Пущино

1. Александров А.А., Берестовский Г.Н., Волкова С.П. Регуляция одиночного Ca/Na канала клетки в липидном бислое. // ДАН СССР. 1976, т. 227, с. 723-6.

2. Александров А.А., Берестовский Г.Н., Волкова С.П. Регуляция одиночного потенциалзависимого Ca/Na канала клетки в липидном бислое. // Биофизика сложных систем и радиационных нарушений. М.: Наука. 1977, с.33-39.

3. Антитела. Методы. Под ред. Китти. Изд-во "Мир", 1991, т. 1, с. 106-107.

4. Берестовский Г.Н. и Александров А.А. О транспотной структуре и воротном механизме реконструированного кальциевого канала клеток харовых водорослей. // Биофизика. 1983, т. 28, с. 816-20.

5. Бакеева Л.Е., Брустовецкий Н.Н. Межмитохондриальные септированные контакты в клетках печени суслика Citelius undulates при зимней спячке.// Биол.Мембр. 1993, 13(1): 36-43.

6. Березовский В.А. Гипоксия. Киев. Наука думка, 1978,250 с.

7. Гелетюк В.И., Казаченко В.Н. Дискретный характер проводимости канала в нейронах прудовика. // Биофизика. 1983, т.28, с.994-8.

8. Гелетюк В.И., Казаченко В.Н. Кластерная организация ионных каналов. М.: Наука. 1990,223 с.

9. Григорьев С. Диссертация кандидата биологических наук. 1999.

10. Евтодиенко Ю.В., Кудзина Л.Ю., МедведевБ.И., Юрков И.С. Непосредственное участие фосфолипидов в трансмембранном переносе ионов калия. // Биол.Мембр. 1996,13(5): 529-536.

11. Кудзина Л.Ю., Медведев Б.И., Поваляева Г.В., Фойгель А.Г., Евтодиенко Ю.В. Реконструкция К+-транспортирующей системы митохондрий на искусственных фосфолипидных мембранах. // Биофизика. 1974, 19(5): 765769.

12. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов,- М.: Мир, 1982.-270С.

13. Лукьянова Л. Функционально-метаболические особенности животных с различной индивидуально резистентностью к гипоксии. // Проблемы гипоксии: молеулярные, физиологические и медицинские аспекты. 2004, с. 156-170.

14. Лукьянова Л.Д., Дудченко A.M., Чернобаева Г.Н. и др. Прерывистая нормобарическая гипоксия. М., 1999, с. 139-153.

15. Лукьянова Л.Д., Дудченко A.M., Чернобаева Г.Н. и др., Прерывистая нормобарическая гипоксия. М., 1999, с. 139-153.

16. Лукьянова Л.Д., Коробков А.В. Физиологические и клинические проблемы адаптации к гипоксии, гиподинамии, гипотермии. Под ред. А.В. Коробкова -М. Медицина, 1981, т.2, с. 73-76.

17. Лукьянова Л.Д., Коробков А.В. Физиологические и клинические проблемы адаптации к гипоксии, гиподинамии, гипотермии. Под ред. А.В. Коробкова -М. Медицина, 1981, т.2, с. 73-76.

18. Маршанский А.А., Новгородов С.А., Ягужинский Л.С. Влияние специфических ингибиторов дыхательной цепи и АТФ-синтетазы на транспорт в митохондриях. // Биофизика. 1983,28(5): 830-834.

19. Маршанский А.А., Ягужинский Л.С. Влияние субстратов АТФ-синтетазы на индукцию процесса перекисного окисления липидов в митохондриях. // Биол.Мембр. 1985,2(11): 1081-1086.

20. Миронова Г.Д. Катион-транспортирующие белки митохондриальной и цитоплазматической мембран. Диссертация доктора биологических наук. 1985,270с.21.