Регуляция и экспрессия изоцитратлиазы у Gallus Domesticus в ходе эмбриогенеза и у крыс при экспериментальном диабете

Зийат М. Вадах

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция и экспрессия изоцитратлиазы у Gallus Domesticus в ходе эмбриогенеза и у крыс при экспериментальном диабете
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция и экспрессия изоцитратлиазы у Gallus Domesticus в ходе эмбриогенеза и у крыс при экспериментальном диабете"

На правах рукописи

РЕГУЛЯЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ У GALLUS DOMESTICUS В ХОДЕ ЭМБРИОГЕНЕЗА И У КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИАБЕТЕ

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ВОРОНЕЖ 2006

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Корнеева Ольга Сергеевна доктор биологических наук, профессор Ковалёва Тамара Андреевна

Ведущая организация: Всероссийский НИВИ патологии, формакологии и

терапии РАСХН

Защита состоится 29 июня 2006 года в 13— часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская площадь, 1, биолого-почвенный факультет, ауд. 59

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан 2006 года

Учёный секретарь диссертационного совета, д.б.н.

Грабович М.Ю.

*<0С>6Д-

ВВЕДЕНИЕ

В стрессовых ситуациях основным источником энергии и углерода являются нейтральные липиды. Образующиеся при липолизе жирные кислоты могут окисляться с помощью а, ß, ш -окисления. Продуктами такого окисления являются ацетил-СоА, сукцинил-СоА и некоторые другие продукты. Ацетил-СоА преимущественно используется для поддержания энергетического гомеостаза за счет окисления в цикле Кребса. Однако, необходимость синтеза углеводов, концентрация которых в стрессовых условиях существенно снижается, приводит к индукции глиоксилатного цикла, трансформирующего ацетил-СоА в сукцинат. Правильное решение данного вопроса важно для понимания механизма патологии и поиска способов профилактики и лечения многих заболеваний, в частности, обменного характера (диабет). Определение наличия глиоксилатного цикла в животных тканях имеет исключительно важное практическое значение. Современные исследования показали, что вирулентность патогенных бактерий и грибов, способных поддерживать хроническую инфекцию, определяется экспрессией ферментов ГЦ (McKinney et al., 2000; Lorenz et al., 2001).

В работах, проведённых на нашей кафедре, была показана индукция изоцитратлиазы (ИЦЛ, К.Ф. 4.1.3.1.) и малатсинтазы (MC, К.Ф. 4.1.3 2.) в печени голодающих крыс (Епринцев и др., 2002; Попов и др., 2000; Popov et al, 1998). В клетках углеводы образуются и утилизируются при работе ферментов, обеспечивающих функционирование центральных метаболических путей, то есть для решения проблемы поиска источников углерода для дополнительного биосинтеза углеводов в стрессовых условиях, приводящих к снижению их концентрации в клетке, необходимо проводить анализ взаимосвязи процессов дыхания и глюконеогенеза. Однако до настоящего времени ни в одной систематической группе животных, исключая нематод, не идентифицированы гены белков, обладающих изоцитратлиазной и малатсинтазной активностями. Кроме того, не достаточно изучена динамика экспрессионной активности глиоксилатного цикла. Такой пробел значительно затрудняет окончательное доказательство присутствия данного метаболического пути в тканях животных и делает невозможным применение имеющихся знаний о ГЦ в области

биомедицины.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА I

Цель и задачи. Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии и регуляции изоцитратлиазы у животных организмов.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. изучить изменение содержания главных субстратов и интермедиатов углеводного обмена в печени эмбрионов птиц G domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом;

2. выявить динамику активности ферментов основных метаболических путей у крыс с экспериментальным диабетом и у птиц в ходе эмбриогенеза;

3. исследовать индукцию изоцитратлиазной активности в печени эмбрионов птиц G. domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом;

4. получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты ИЦЛ из птиц и печени крыс;

5. изучить физико-химические свойства и кинетические характеристики ИЦЛ из печени эмбрионов птиц G.domesticus и печени крыс, страдающих аллоксановым диабетом;

6. сравнить физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики изоцитратлиаз из гепатоцитов эмбрионов G.domesticus и печени крыс, больных аллоксановым диабетом;

7. оптимизировать метод выделения РНК из печени животных и на основе анализа гомологичных последовательностей разработать праймеры для идентификации гена ИЦЛ у исследуемых объектов;

8. провести ОТ-ПЦР анализ мРНК для идентификации уникальных последовательностей гена ИЦЛ у эмбрионов G domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом.

Научная новизна. Показана возможность индукции ключевых ферментов глиоксилатного цикла в печени эмбрионов птиц и в печени крыс, страдающих аллоксановым диабетом.

Установлено, что в процессе эмбриогенеза у птиц и у крыс при экспериментальном диабете наблюдается интенсификация цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), увеличение активности аминотрансфераз. индукция ферментов ГЦ. Кроме того, у крыс снижается активность гликолиза и пентозофосфатнохо пути (ПФП). Показано, что активация глюконеогенеза в этих условиях происходит как за счет мобилизации запасных жирных кислот, так и за счет глюкогенных аминокислот.

Получены гомогенные ферментные препараты ИЦЛ из печени эмбрионов Gallus domesticus и печени крыс с аллоксановым диабетом. Исследованы

каталитические свойства и регуляторные аспекты ферментов, определена их молекулярная масса и субъединичное строение.

На основе разработанных лраймеров, впервые клонировали и идентифицировали участок гена ИЦЛ из печени эмбрионов птиц и печени крыс с экспериментальным диабетом. Получили библиотеку комплементарных ДНК и продуктов гена ИЦЛ из организмов различных таксономических групп.

Полученные результаты и данные литературы (Епринцев и др., 2002; Попов и др., 2001, 2000) убедительно свидетельствуют о присутствии глиоксилатного цикла не только в клетках прокариот, растений и нематод и позволяют рассматривать данный метаболический путь как универсальный механизм конверсии жирных кислот в углеводы в животных организмах разного уровня организации.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболических процессов в клетках насекомых и высших животных. Разработанная схема выделения высокоочищенных препаратов может быть использована для получения коммерческих препаратов фермента. Найденный метод стабилизации фермента позволяет сохранять его активность в течение длительного времени, что обеспечивает возможность применения препарата изоцитратлиазы для медицинской диагностики и в биохимических исследованиях, которые могут быть использованы в научно-исследовательских работах. Разработанные методы позволяют обосновать применение разгрузочно-диетической терапии (пищевой депривации) для профилактики и лечения болезней обмена веществ (ожирение, подагра, диабет). Подтверждение присутствия ГЦ в тканях высших животных открывает перспективу для разработки новых лекарственных препаратов против патогенных микроорганизмов животных и человека (McKinney et al., 2000; Lorenz et al., 2001).

Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии и молекулярной биологии, спецкурсов по этимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 9й8 и lO2® международной конференции молодых учёных (Пущино, 2005, 2006), на XLIII международной конференции аспирантов

(Новосибирск, 2005), на международной научной конференции «Современные проблемы адаптации» (Махачкала, 2006), на межрегиональной конференции молодых учёных (Нерюнгри, 2005), на межрегиональной конференции «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2004, 2005, 2006), на межрегиональной конференции «Физиология и психофизиология мотиваций» (Воронеж, 2005).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 10 публикациях — 4 статьях и 6 тезисах.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (204 источника). Иллюстрационный материал включает 24 рисунка, 16 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Эксперименты были проведены на эмбрионах птиц Gallus domesticus L. на различных стадиях онтогенеза и на белых беспородных самцах лабораторных крысах Rattus rattus L. в возрасте 3-4 месяцев и массой 180 - 200г.

Получение эмбрионов птиц и создание условий экспериментального диабета. Яйца птиц Gallus domesticus L. инкубировали при температуре 38° С при постоянной необходимой влажности. Эмбрионы птиц получали на разных стадиях развития.

Опытные животные (Rattus rattus), выращиваемые на обычном рационе вивария, были инъектированы подкожно 5% аллоксаном (200 мг / кг веса, раствор в 0,9% NaCl). Развитие диабета отслеживали по содержанию глюкозы в плазме крови. Определения концентрации глюкозы в крови проводили стандартным методом с использованием глюкозооксидазы и пероксидазы (La Chema, Чехия).

Определение активности ферментов и содержания метаболитов.

Активность исследуемых ферментов определяли спектрофотометрически. За единицу активности принимали количество фермента, превращающего 1мкМ субстрата за 1 минуту при 25°С и оптимальном значении pH Содержание интермедиатов определяли энзиматическими методами (Детлафф,1974).

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили методом Лоури (Lowry et al., 1951). Содержание белка в высокоочищенных препаратах - по поглощению при 280 нм и 260 нм.

Выделение и очистка Фермента. Для получения высокоочищенных препаратов изоцитратлиазы из печени крыс и птиц были разработаны специальные схемы очистки, включающие получение гомогената; высаливание сульфатом аммония; гель-фильтрацию на сефадексе G-25; хроматографию на ионнообменнике ДЭАЭ - Toyopearl и гель-хроматографию на Toyopearl HW-65.

Аналитический электрофорез. Электрофорез нативного фермента проводили по модифицированной методике Дэвиса (Davis, 1964). Для специфического проявления изоцитратлиазы применяли модифицированный реагент Шиффа (Reeves, 1972). Для универсального окрашивания белков использовали метод проявления нитратом серебра (Shevchenko et al., 1996).

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов. Кинетические и регуляторные характеристики ферментов изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, констант ингибирования проводили с использованием линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Диксон, 1982).

Выделение РНК, ДНК и проведение ПНР. Для выделения тотальной РНК использовали метод фенол-хлороформной экстракции РНК (Chomczynski, 1987). Выделение ДНК проводили по методике, описанной в "Short protocols in molecular biology" (Ausubel, 1997) с небольшими модификациями, связанными с объектом исследования. Визуализацию результатов экстракции РНК, ДНК проводили с помощью электрофореза в 1%-агарозном геле. Для идентификации гена ИДЯ использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специально синтезированными дегенерированными праймерами (Епринцев и др., 2001; Birnboim, 1979). ПЦР проводили на амплификаторе ДНК фирмы Biometra®

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 5 кратной биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы - в трёх повторностях. Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики. В таблицах и на рисунках приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. Для построения графиков применяли программы линейной и параболической аппроксимации. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента (Лакин, 1980).

РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ АЛЛОКСАНОВОГО ДИАБЕТА

В результате исследования было показано, что средняя концентрация глюкозы у контрольных крыс составила 5,5 + 0,4 мМ. Оптимальным количеством аллоксана, вызывавшего достоверно значимое увеличение

концентрации глюкозы в крови, но не подавлявшей нормальной активности крыс, являлось однократное введение 200 мг на 1 кг веса. После введения опытным животным аллоксана у крыс развивался диабет и концентрация глюкозы в крови увеличивалась до 16,1 + 0,8 мМ. Этот эффект достигал максимального значения к 4 дню после введения аллоксана и практически не снижался в последующую неделю проведения эксперимента.

ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ ОСНОВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИАБЕТЕ И В ПЕЧЕНИ ЭМБРИОНОВ ПТИЦ.

Особую роль с точки зрения межсистемной кооперации, особенно в ходе эмбриогенеза, выполняет такой важнейший орган как печень, где протекают глюконеогенетические процессы. В печени синтезируется глюкоза, формируются кетоновые тела, а также транспортная форма жира -приоритетные энергетические субстраты организма, используемые другими органами. Снижение концентрации глюкозы в клетке приводит к мобилизации печёночного гликогена и его содержание на 14 сутки аллоксанового диабета полностью иссякает (табл.1). Параллельно происходит некоторое снижение гликолитических (фосфоенолпируват, пируват, лактат) и других интермедиатов (малат, 2-оксоглутарат). Однако гомеостаз глюкозы печени практически не изменяется, что достигается как ограничением её утилизации, так и активацией глюконеогенетических процессов.

Таблица

Динамика содержания углеводов в ткани печени (на гр. ткани)

Показатель Контроль Аллоксановый диабет (14 суток)

Гликоген, мкмоль в 258,00±2,60 10,00±0,11

расчете на глюкозу

Глюкоза, мкмоль 6,14±0,08 5,86±0,06

ФЕП, нмоль 88,03±0,88 70,56±0,06

Пируват, нмоль 144.56±1,53 119,35±1,12

Лактат, мкмоль 1,56±0,01 0,78±0,06

2-оксоглутатарат, нмоль 180,89±1,67 140,67±1,08

Малат, мкмоль 0,24±0,03 0,56±0,04

Ацетоацетат, мкмоль 0,78±0,01 0,12±0,01

п=5, р<0,01

Этому способствует снижение активности исследованных ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути, альдолазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, соответственно. Повышение концентрации ацетил-КоА (о чем свидетельствует повышение концентрации ацетоацетата) инактивирует гликолиз. Печень и почки получают энергию посредством окисления жирных кислот. Мышцы также переключаются с утилизации глюкозы в качестве источника энергии на использование жирных кислот, что останавливает трансформацию пирувата (ПВК) в ацетил - КоА. В результате ГТВК, лактат и аланин переносятся в печень и превращаются в глюкозу.

В печени крыс с экспериментальным диабетом нами показана интенсификация глюконеогенетических процессов на ферментативном уровне. Так, на фоне снижения активности ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути происходит активация фосфоенолпируват-карбоксикиназы (ФЕПКК) и интенсификация дыхательного метаболизма (табл.2). Роль ФЕПКК заключается в синтезе ФЕП как предшественника глюкозы, образуемой в реакциях обращенного гликолиза. Рост активности ФЕПКК при экспериментальном диабете отражает увеличение скорости синтеза фермента в ответ на недостаток глюкозы.

Таблица 2

Изменение активности ферментов в печени крыс, страдающих аллоксановым диабетом

Активность Контроль Опыт (14 день)

фермента, Е/гр.с.м. Печень Почки Печень почки

Фосфоенолпируват- 0,41±0,15 0,406±0,09 0,98±0,02 0,57±0,02

карбоксикиназа

Глюкозо-6- 2,05±0,08 0,54±0,06 0,20±0,02 0,28±0,02

фосфатдегидрогеназа

Малатдегидрогеназа 39,1±1,22 45,3±1,41 86,2±2,32 99,3±2,60

Аконитатгидратаза 2,45±0,06 2,6± 0,06 8,3±0,03 7,2±0,11

Сукцинатдегидрогеназа 1,31±0,03 0,84±0,01 1,72±0,04 1,29±0,02

Изоцитратлиаза 0 0 2,6^0,06 0,94±0,03

Малатсинтаза 0 0 1,4±0,04 0,6±0,02

(п=6, р<0,05)

Мышцы - самый богатый источник глюкогенных аминокислот при диабете и голодании. Однако, выживание животного организма прямо коррелирует со

способностью двигаться, для чего необходимо сохранить структурные белки. Это достигается переключением метаболизма на такой путь, при котором в качестве источника энергии используется не глюкоза, а жирные кислоты и кетоновые тела. У растений и микроорганизмов глюконеогенез из липидов обеспечивается функционированием пероксисомального или мито-хондриального р - окисления жирных кислот, глиоксилатного цикла, участка цикла Кребса, ФЕПКК и обращенного гликолиза. Исследование динамики количества интермедиатов и активности ферментов основных метаболических путей на разных этапах эмбриогенеза цыплят свидетельствуют об интенсификации глюконеогенетических процессов (табл. 3).

Таблица 3

Динамика активности ферментов основных метаболических путей в

печени цыплят в ходе эмбриогенеза (р<0,03, п—5).

Развитие Активность ферментов, Е/ гр.с.м.

(дни) мдг сдг VI ицл ПК ФЕПКК АсАТ

6 2,73± 0,55± 0,27± 0 0,3 2± 0,45± 26,33±

0,08 0,02 0,01 0,01 0,02 0,56

7 3,31± 0,67± 0,11± 0 1,64± 0,5± 31,29±

0,09 0,02 0,01 0,05 0,03 0,67

9 3,39± 0,85± 1,56± 0,55± 2,61± 0,48± 26,33±

0,11 0,04 0,05 0,03 0,08 0,02 0,56

10 ЗДЗ± 0,97± 1,52± 0,86± 1,14± 0,29± 31,42±

0,13 0,03 0,04 0,02 0,03 0,01 0,65

11 3,56± 1,01± 1,67± 0,88± 1,53± 0,29± 28,06±

0,14 0,03 0,03 0,02 0,03 _ 0,01 0,47

14 0,45± 1,19± 1,88± 1,07± 1,27± 0,25± 45,63±

0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,01 0,66

15 1,61± 1,91± 10± 1,78± 0,39± 0,57± 62,55±

0,04 0,05 0,33 0,05 0,01 0,02 0,68

16 1,64± 2,7± 5,6± 2,29± 2,83± 0,13± 68,22±

0,04 0,09 0,14 0,06 0,07 0,01 0,75

17 2,20± 1,14± 3,3 7± 1,18± 0,57± 0,16± 56,44±

0,05 0,03 0,08 0,04 0,01 0,01 0,56

18 1,67± 1,56± 4,5± 1,00± 0,67± 0,83± 56,59±

0,03 0,04 0,11 0,03 0,02 0,023 0,57

19 2,77± 2,03± 4,71± 0,93± 1,15± 1,94± 62,11±

0,07 0,06 0,12 0,02 0,03 0,05 0,58

21 4,27± 1,18± 6,86± 1,64± 0,86± 0,91± 54,08±

0,15 0,04 0,24 0,04 0,03 0,03 0,54

Регуляция активности ПК играет важную роль в поддержании уровня фосфоенолпирувата (ФЕП). Однако содержание ФЕП в печени контролируется и ферментами глюконеогенеза, в частности активностью ФЕПКК. Определения её активности показали её присутствие не только в печени зародыша птиц, но и в желтке. Вероятно, в зародыше существует два независимых фонда ФЕП, причём наличие ФЕПКК отражает не только образование и расход данного метаболита, но и внутриклеточную активность всего глкжонеогенетического процесса. Действительно, снижение активности ФЕПКК в печени зародыша на 9 сутки развития коррелирует со снижением количества ФЕП в этот же период.

Характер уменьшения активности ФЕПКК полностью совпадает со снижением активности ПК и уменьшение количества ПВК, что позволяет говорить о реципроктной регуляции гликолиза и глюконегенеза. Работами Мильмана (1973) было показано, что своеобразие зародыша костистых рыб заключается в резком пространственном разграничении ПК и ФЕПКК между структурами желтка и зародыша. Опыты, проведённые с изолированными бластодермами, которые хорошо проницаемы для аминокислот, подтвердили отсутствие ресинтеза гликогена из этих соединений. В связи с этим постепенное увеличение активности АсАТа вплоть до вылупления цыплят обеспечивает рост и развитие зародыша. Следует отметить, что субстратами глюконеогенеза в зародыше могут служить только интермедиаты цикла Кребса и жирные кислоты. Наиболее благоприятным условием глюконеогенеза является такое функциональное состояние ткани (например, печени), при котором увеличивается содержание свободных жирных кислот, ацетоацетата и ацетил-КоА, что и наблюдается в период эмбриогенеза птиц.

ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЦИТРАЛИАЗ ИЗ ПЕЧЕНИ СЛЮМЕБТЮТв И Я.ИАТТЕ^

С помощью многостадийной очистки были получены электрофоретически гомогенные препараты из печени крыс, страдающих аллоксановым диабетом и эмбрионов птиц (табл.4,5).

Электрофоретические исследования полученных препаратов ИЦЛ показали наличие одной белковой полосы у обоих объектов исследования.

Таблица 4

Очистка изоцитратлиазы из печени эмбрионов птиц Gallus domesticus L.

Стадии Активность, Белок, мг Уд. акт., Степень Выход,

Очистки Е Е/мг очистки %

Гомогенат 3,743± 0,152 200,42± 8,02 0,019+ 0,001 1 100

Фракционирование 3,514± 83,14± 0,042± 2,21 93,85

сульфатом аммония 0,143 2,53 0,001

Гель-фильтрация 3,034± 63,12± 0,048± 2,5 81,02

через сефадекс С-25 0,112 1,82 0,001

Ионообменная 0,468± 1,64± 0,285± 15,0 12,51

хроматография на 0,022 0,08 0,014

ОЕАЕ-Тоуореаг1

Гель-хроматография 0,168± 0,074± 2,273з= 119,5 4,5

на Тоуореаг! НЛ\'-60 0,012 0,001 0,112

n=5, p<0,05

Таблица 5

Очистка изоцитратлиазы из печени крыс с экспериментальным диабетом

С гадии очистки Активность Белок, Уд. акт. Выход, Степень

Е мг Е/мг % очистки

Гомогенат 27,32± 1,35 268,05± 13,15 0,105± 0,005 100 1,0

Фракционирование 18,23± 73,33± 0,253+ 66,6 2,5

сульфатом аммония 0,91 3,15 0,012

(50-70%)

Гель-фильтрация на 17,53± 65,87± 0,272± 64,1 2,7

Сефадексе С-25 0,85 2,85 0,012

Ионообменная 10,82± 3,42± 3,202± 39,5 32,0

хроматография на 0,52 0,15 0,162

ДЭАЭ-Тоуореаг1

Гель-фильтрация на 5,11± 0,44± 12,403± 18,7 124,0

Тоуореаг! Н\У-65 0,23 0,02 0,615

п=5, р<0,05

Данные белковые полосы обладали изоцитратлиазной активностью, что подтверждено специфическим проявлением (рис.1).

Рис. 1 Электрофореграммы препаратов ИЦЛ.

А) ИЦЛ из печени эмбрионов птиц; Б) ИЦЛ из печени крыс с экспериментальным диабетом: I - универсальное окрашивание нитратом серебра; II - специфическое проявление; Р - белковая полоса; F - фронт красителя.

Молекулярную массу (Мг) ИЦЛ определяли гель-фильтрацией на Toyopearl HW-65, используя маркерные белки. Мг ИЦЛ из печени крыс 4 составила 180±3 кДа, а из печени эмбрионов птиц - 140±2 кДа.

Электрофоретические исследования с DsNa показали, что ИЦЛ из обоих объектов исследования является гомотетрамером с Мг субъединиц 46±3 и 36±1 кДа для печени крыс и эмбрионов птиц, соответственно (рис.2).

Ранее было установлено димерное строение молекулы ИЦЛ из дрожжей Candida tropicalis (Masaaki, 1986) с молекулярной массой субъединиц 65 кДа Приблизительно такая же масса субъединиц была установлена у нематоды Coenorabditis elegans (61,6 кДа) (Jameel,1985), у семян Lupinus (66 кДа) (Vincenzine, 1986), у пыльцы Pinns densiflora (65 кДа) (Chigen, 1986) однако у первых двух объектов изоцитратлиаза была тетрамером, а у сосны состояла из трёх субъединиц.

Для изучения pH оптимума исследуемого фермента использовали разные буферные системы. Наибольшую активность ИЦЛ из обоих объектов исследования проявляла в Tris - HCl- буфере с pH 7,5. Обнаружено ингибирование ИЦЛ из обоих объектов исследования сахарофосфатами по конкурентному типу. Расчитанные по методу Диксона (Диксон, 1982) значения

констант ингибирования (К,) фермента для печени эмбрионов птиц составили по глюкозо-6-фосфату - 0,3 мМ, фруктозо-6-фосфату 0,06 мМ. Значения К, ИЦЛ из печени крыс составили для глюкозо-1-фосфата 1,25 мМ, а для глкжозо-6-фосфата - 1,6 мМ. Ранее было показано, что модуляторами изоцитратлиазы являются интермедиаты глюконеогенеза (Сюш ег а1., 1981; Kornberg, 1958).

Рис.2 Определение молекулярной массы субъединиц ИЦЛ методом Бв-^а-электрофореза. А) ИЦЛ из пчени эмбрионов птиц; Б) ИЦЛ из печени крыс с аллоксановым диабетом. 1 - целлюлаза (94,6 кДа); 2 — бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа); 3 - яичный альбумин (45 кДа); 4 - карбоангидраза (31 кДа); 5 - ингибитор трипсина (21,5 кДа); 6 - лизоцим (14,4 кДа); 7 - ИЦЛ

Специфичными для животных тканей является ингибирование активности ИЦЛ глюкозофосфатами, причем особый интерес представляет то, что наиболее сильным ингибитором изоцитратлиазы является непосредственный предшественник гликогена глюкозо-1-фосфат. Подобная регуляция, на наш взгляд, подтверждает то, что физиологическим смыслом индукции глиоксилатного цикла в печени животных при данных состояниях является обеспечение утилизации жирных кислот для поддержания энергетического баланса клеток и поддержания в них достаточного уровня углеводов. Ингибирование ИЦЛ из обоих объектов исследования аминокислотами не обнаружено.

Таким образом, сравнение свойств гомогенных препаратов изоцитратлиаз из куколок бабочки Р.таскаоп и печени голодающих крыс с данным ферментом из других источников указывает на некоторое сходство таких характеристик, как удельная активность, молекулярная масса, количество и

молекулярная масса субъединиц, значения рН-оптимума, констант ингибирования и констант Михаэлиса. Особый интерес представляет сильное ингибирование изоцитратлиазы непосредственньми предшественниками гликогена.

ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНА ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ У ЖИВОТНЫХ ОРГАНИЗМОВ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР

Для всех объектов исследования проведена экстракция тотальной РНК (рис.3) с последующей обратной транскрипцией мРНК (рис.4), а также успешно выделена геномная ДНК.

v Ш" /> "rt

' flS^j

28 S рРНК 18 S pPHK

- tPHK

28 S pPHK 18 S pPHK

tPHK

Рис. 3 Тотальная РНК из печени эмбрионов птиц (а) и печени крыс (б)

Оптимизированы условия проведения полимеразной цепной реакции. Температура отжига праймеров для кДНК из эмбрионов птиц составила 49 С. Такая температура оказалась оптимальной и для идентификации гена изоцитратлиазы из печени крыс с аллоксановым диабетом. ГТЦР - анализ кДНК гепатоцитов крыс и птиц привёл к идентификации ампликона большей длины продуктов (около 400 п.н.) (рис.5) по сравнению с продуктом гена из Е coli (360 п.н.). Можно предположить, что ИЦЛ, индуцируемая в тканях крыс, кодируется геном, отличным от такового из прокариот, растений и нематод.

В ходе эволюции нуклеотидная последовательность исследуемого гена могла сильно измениться и важным аргументом, подтверждающим эту гипотезу, является наличие бифункционального фермента нематоды С elegans, сочетающего каталитические активности ИЦЛ и МС (Liu, 1995).

Таким образом, сконструированная пара праймеров образует единую универсальную систему, которая эффективно выявляет гены ИЦЛ у организмов различного уровня организации.

Рис. 4 Электрофорез кДНК, полученной обратной транскрипцией мРНК

Большинство литературных данных свидетельствуют о возникновении изоцитратлиазной и малатсинтазной активностей в животных тканях в экстремальных и патологических состояниях, а также на некоторых этапах онтогенеза (Епринцев, 2005; Попов, 2000; Волвенкин, 1999; 1996; Khan et al., 1980; Popov, 1998, 1996; Davis, 1990; Song, 2000; Kamel, 1982). Общей характеристикой таких состояний является острая необходимость в глюконеогенезе. Глиоксилатный цикл - важный этап трансформации жирных кислот в углеводы в растениях и бактериях. Однако некоторые данные -литературы свидетельствуют о выполнении ГЦ этой же функции в тканях животных.

Полученные данные свидетельствуют об особенностях организации и ферментативной регуляции глюконеогенеза у эмбрионов птиц G domesticus L и у крыс при экспериментальном диабете. Результаты исследований указывают на перестройку метаболических путей для использования запасных нейтральных липидов в качестве основного источника энергии и углеводов. В частности, это подтверждается увеличением активности аминотрансфераз и ключевого фермента глюконеогенеза — фосфоенолпируваткарбоксикиназы. Для животных тканей биохимический механизм трансформации жирных кислот, образующихся при липолизе, в углеводы до сих пор остается дискуссионным вопросом (Jones et al., 1999).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рис. 5 ОТ-ПЦР кДНК с геи - специфичными олигонуклеотидиыми праймерами для ИЦЛ (а) из печени эмбрионов птиц (б) из печени крысы с экспериментальным диабетом.

Окисление жирных кислот в животных тканях возможно с помощью а-, (3, и и- окисления, при этом образуются ацетил-СоА и сукцинил-СоА. р-окисление является наиболее выгодным процессом, так как при этом сохраняется органическое вещество клетки и запасается энергия. (3-окисление может протекать как в митохондриях, так и в пероксисомах, обеспечивая массовую продукцию ацетил-КоА.

Полученные нами результаты показывают, что дальнейшее превращение продукта р - окисления жирных кислот - ацетил-СоА у обоих объектов исследования связано с глиоксилатным циклом и обеспечивает образование сукцината. Установленная активация ферментов цикла Кребса свидетельствует о том, что последующая трансформация сукцината осуществляется за счет дикарбоновой ветви цикла трикарбоновых кислот. Образующийся при этом оксалоацетат необходим как для поддержания энергетического метаболизма, так и обеспечения обращенного гликолиза. Фосфоенолпируваткарбоксикиназа - ключевой фермент глюконеогенеза, также увеличивает свою активность, что показывает возможность синтеза de novo углеводов в клетках печени крыс с аллоксановым диабетом и эмбрионов птиц. У крыс на фоне развития экспериментального диабета наблюдали снижение активности ключевого фермента пентозофосфатного пути глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что

свидетельствует о замедлении процесса, приводящего к расходованию запасных углеводов. Таким образом, в данных физиологических состояниях не прекращаются, а интенсифицируются процессы глюконеогенеза.

Индукция ключевых ферментов глиоксилатного цикла у птиц в ходе эмбриогенеза и у крыс с экспериментальным диабетом указывает на функционирование ГЦ. Установлено, что в печени при данных состояниях происходит появление активности ИЦЛ и МС. Следует заметить, что у контрольных животных активности данных ферментов не обнаруживаются.

Получение в электрофоретически гомогенном состоянии ключевого фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиазы из печени эмбрионов птиц и печени крыс с аллоксановым диабетом является важным аргументом, свидетельствующим об идентификации ГЦ. Сравнительное исследование физико-химических и регуляторных свойств ИЦЛ показало, что основные свойства изучаемого фермента из обоих объектов мало отличаются по своим характеристикам (удельной активности, степени очистки, молекулярной массе, сродству к различным субстратам и др.) от ИЦЛ из других организмов. Впервые полученный гомогенный препарат ИЦЛ из птиц и крыс использовали для определения молекулярной массы фермента. Значение молекулярной массы изоцитратлиазы из печени крыс с экспериментальным диабетом составило 180 кДа, для эмбрионов птиц 140 кДа. Выявлено, что ИЦЛ из печени крыс и эмбрионов птиц является изологическим тетрамеров с молекулярной массой субъединиц 46 и 36 кДа. Изучение каталитических свойств показало, что изоцитратлиаза из обоих объектов исследования подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, определены значения Км. Из регуляторных аспектов наибольший интерес представляет тот факт, что наибольшее ингибирование данных ферментов наблюдается при действии конечных продуктов глюконеогенеза, а именно глюкозо-1-фосфатом и глюкозо-6-фосфатом, т.е. регуляция осуществляется по принципу обратной связи. Это может свидетельствовать о том, что физиологическим смыслом индукции глиоксилатного цикла у обоих объектов исследования, является обеспечение утилизации жирных кислот для поддержания энергетического баланса клеток, а также поддержания уровня глюкозы.

Определение присутствия глиоксилатного цикла в животных тканях имеет исключительно важное практическое значение. Современные исследования показали, что глиоксилатный цикл необходим для вирулентности патогенных бактерий и грибов (McKinney, 2000, Lorenz, 2001; Manabe, 2000; Bishai, 2000). ИЦЛ и МС - факторы устойчивости Mycobacterium tuberculosis, Candida

albicans и многих других патогенов животных, человека и растений. Показано, что Aicl мутанты М tuberculosis и С. albicans не способны поддерживать хроническую инфекцию. Вовлечённость ГЦ в патогенез предполагает использование ИЦЛ и MC патогенов в качестве мишеней для действия лекарств (Lorenz et al., 2002; Graham et al., 1999).

Проведенные исследования по клонированию ИЦЛ показали наличие нуклеотидной последовательности, гомологичной изоцитратлиазе из растений и микроорганизмов в геноме животных. Данные выводы основываются на результатах проведения полимеразной цепной реакции с праймерами, разработанными по консервативным последовательностям в составе активного центра белка. Одна из этих последовательностей включает 3 аминокислоты, входящие в состав активного центра, другая 5 аминокислотных остатков Полимеразная цепная реакция проводилась с комплементарной ДНК, полученной в результате обратной транскрипции всех мРНК, выделенных из печени крыс с экспериментальным диабетом и эмбрионов птиц. В результате анализа продуктов ПЦР у обоих объектов исследования идентифицированы продукты гена оклоло 400 п.н., что приблизительно соответствует по длине генам ИЦЛ из других организмов (кукуруза, Е coli, В leptomitiformis). Кроме того, наблюдали отжиг праймеров при более низкой температуре. Возможным объяснением результатов низкой температуры отжига праймеров на кДНК крыс и птиц является отсутствие достаточной для амплификации гомологии между праймерами и нуклеотидной последовательностью кДНК. В ходе эволюции последовательность нуклеотидов гена фермента ИЦЛ могла сильно измениться, в результате исследуемый ген у крыс может иметь низкую гомологию с аналогичным геном растений и микроорганизмов. Фактом, подтверждающим эту гипотезу, является наличие бифункционального фермента нематоды С elegans, сочетающего каталитические активности ИЦЛ и MC (Liu, 1995). Учитывая, что эволюция маркерных ферментов ГЦ от микроорганизмов до нематод привела к подобной трансформации, то изменения гена ИЦЛ у животных могут быть ещё более существенными. В связи с этим полученный результат ПЦР - анализа РНК крыс позволяет предположить возможность использования ИЦЛ микроорганизмов в качестве мишени для действия лекарств против ряда патогенов животных (Vereecke, 2002). Подтверждение этого предположения, по-видимому, откроет перспективу для разработки новых лекарств против инфекций млекопитающих и их применения без негативных последствий.

Таким образом, полученные данные в совокупности с известными из

литературы фактами убедительно свидетельствуют о присутствии глиоксилатного цикла не только в клетках прокариот, растений и нематод, но и в тканях животных разного уровня организации. Это позволяет рассматривать данный метаболический путь как уникальный сохранённый в ходе эволюции у животных организмов универсальный механизм конверсии жирных кислот; в углеводы. Однако, глиоксилатный цикл не функционирует постоянно, а индуцируется при патологических состояниях и на некоторых стадиях онтогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что у птиц в ходе эмбриогенеза и у крыс при аллоксановом диабете происходит ускорение метаболизации жирных кислот, приводящее к интенсификации глюконеогенетических процессов, о чём свидетельствуют изменения количества важнейших интермедиатов глюконеогенеза (фосфоенолпирувата, ацетоацетата и др.).

2. Установленные изменения активности ферментов центральных метаболических путей (индукция глиоксилатного цикла, интенсификация работы ЦТК, аминотрансфераз) обеспечивают потребность в глюкозе, необходимой для эмбрионального развития птиц. В печени крыс при аллоксановом диабете показано уменьшение активности гликолиза и пентозофосфатного пути, что свидетельствует о снижении утилизации глюкозы.

3. Показано, что в печени эмбрионов птиц С.с1оте$Нсш и крыс Я.гаМш с экспериментальным диабетом происходит индукция ключевых ферментов глиоксилатного цикла — изоцитратлиазы и малатсинтазы.

4. С помощью разработанной схемы выделения и очистки, включающей пять стадий, получены электрофоретически гомогенные препараты ИЦЛ из печени эмбрионов птиц и крыс с аллоксановым диабетом. Значения удельной активности составили 12,4 и 2,3 Е/мг.белка; степени очистки 124 и 120 раз; выхода 18,7 и 4,5 % из гепатоцитов крыс и эмбрионов птиц, соответственно.

5. Установлено различие в значениях молекулярных масс и четвертичной структуре ИЦЛ из обоих объектов исследования. Мг ИЦЛ из печени птиц О йотезйсил составила 140±3 кДа, из печени крыс КгаПш 180±4 кДа Электрофорез в присутствии показал, что молекула фермента из обоих объектов исследования является изологическим тетрамером с Мг субъединиц 45 и 36 кДа, для гепатоцитов крыс и эмбрионов птиц, соответственно.

6. Выявлено, что ИЦЛ из тканей животных и птиц имеют сходные каталитические свойства и подчиняются кинетике Михаэлиса-Мэнтен. Км по

изоцитрату из печени крыс 1,6 мМ, из печени эмбрионов птиц - 5 мМ Особенностью метаболической регуляции является конкурентное ингибирование ИЦЛ глюкозо-6-фосфатом у обоих объектов исследования.

7. На основе программного анализа гомологичных последовательностей ИЦЛ разработаны и синтезированы праймеры для идентификации гена ключевого фермента глиоксилатного цикла у живтоных организмов. С помощью метода ОТ-ПЦР в мРНК печени эмбрионов птиц и печени крыс с аллоксановым диабетом обнаружен ПЦР-продукт гена ИЦЛ.

8. Предложена гипотетическая схема регуляции и экспрессии работы ключевого фермента глиоксилатного цикла - изоцитратлиазы у птиц в ходе эмбриогенеза и у крыс в условиях экспериментального диабета.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Углеводный метаболизм курицы Gallus domesticus в период эмбриогенеза / М.Ю. Шевченко, З.М. Вадах, А.Т. Епринцев и др.// Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Межрегиональный сборник научных работ, посвященный памяти А.А.Землянухина.- Воронеж: ЦЧР кн. изд .-2005. -Вып.7,- С.198-203.

2. Характеристика экспрессии изоцитратлиазы в куколках бабочки Р machaon L. / М.Ю. Шевченко, З.М. Вадах, А.Т. Епринцев и др.// Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж: ЦЧР кн. изд..-2004. - Вып.6,- С.182-189.

3. Регуляция экспрессионной активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла у организмов разных таксонов / М.Ю. Шевченко, З.Н.Вадах, В.Н. Попов // Биология - наука XXI века: Материалы 9й2 Путинской конф. молодых учёных. - Пущино (18-22 апреля), 2005.- Т.1. - С. 104.

4 Роль ферментов основных метаболических путей в адаптационных процессах у голодающих крыс / Н.Ф. Полина, М.Ю. Шевченко, З.Н. Вадах // Студент и научно-технический прогресс: материалы XLIII международной научной студенческой конференции. - Новосибирск, 2005. - С. 119-120. 5. Количественные изменения интермедиатов при адаптации крыс к пищевой депривации / М.Ю. Шевченко, З.Н. Вадах, Н.В. Рожков, Н.Ф. Полина, А.Т Епринцев, В.Н. Попов // Физиология и психофизиология мотиваций. Межрегиональный сборник научных работ.- Воронеж, 2005. - Вып.7. - С.48-52. 6 Перспективы использования изоцитратлиазы патогенных микроорганизмов в качестве мишени для новых средств терапии инфекционных заболеваний человека и животных / М.Ю. Шевченко, Н.Ф. Полина, З.Н. Вадах, А.Т. Епринцев // Тезисы VI межрегиональной научно-

Аллоксановый диабет

о. ¡еосо.,1

Потребность в углеводах ~

I липолиз ТкнрСТ;

ТлицёЬин

Эмбриогенез

^ Кетоновые тела

малат

Глюкоза крови

Глюкозо-.„, ^ 6-фосфат>

Ц^Фосфоенойпируват,

Е»ЕПКК

_г_2,_*-J

Рис. 6 Возможный молекулярный механизм регуляции и экспрессии ИЦЛ при индукции глиоксилатного цикла в гепатоцитах (/.йотечйсиа и И.гсМш. СБИЕ- чувстчительные элементы к источнику углерода; РРАЛ - рецептор пролиферации пероксисом; ИЦЛ - изоцитратлиаза; МС - малатсинтаза; ФЕПКК - фосфоенолпируваткарбоксикиназа. Ингибирование процессов . Активация процессов-.

практической конференции молодых учёных. - Нерюнгри. 2 апреля, 2005. -С.28.7.

7. Очистка изоцитратлиазы из печени эмбрионов Gallus domesticus L. / М.Ю. Шевченко, Н.Ф. Полина, З.Н. Вадах, А.Т. Епринцев // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2006. - №2., С.36-41.

8. Очистка изоцитратлиазы из печени эмбрионов Gallus domesticus L. / М.Ю. Шевченко, Н.Ф. Полина, З.Н. Вадах, А.Т. Епринцев // Биология - наука XXI века: Материалы X Пушинской конф. молодых учёных. - Пущино (17-21 апреля), 2006,- T.l. - С.104.

9 Регуляция и экспрессия активности ключевого фермента глиоксилатного цикл - изоцитратлиазы у животных. Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Межрегиональный сборник научных работ. -Воронеж: ЦЧР кн. изд..-2006. - Вып.8,- С.182-189.

10 Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенезе у птиц Gallus domesticus L. в ходе эмбриогенеза. / М.Ю. Шевченко, Н.Ф. Полина, З.М. Вадах, А.Т. Епринцев // Тезисы международной научной конференции молодых учёных. -Махачкала. 23-26 октября, 2006. - С.32.

Сдано в набор 24.05.06 Подписано в печать 24 05.2006 Бумага офсетная 70 гр/см3. Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Печать трафаретная Уел П Л 1,5 Тираж 100

Номер заказа 398.

Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии Издательско-полиграфического центра ВГУ

г. Воронеж, Университетская площадь, 1, ком. 43, тел.208-853.

лот Л Tvwf

»14611

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зийат М. Вадах

ВВЕДЕНИЕ

• Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие аспекты патогенеза сахарного диабета.

1.1.1. Особенности протекания биохимических процессов при аллоксановом диабете.

1.2. Физиолого-биохимические особенности печени.

1.3. Общая схема трансформации основных запасающих веществ в животном организме.

1.4. Биохимические аспекты процессов, ведущих к интенсификации глюконеогенеза.

1.4.1. Трансформация липидов в гликоген у высших животных.

1.4.2. Ультраструктурные изменения клеток животных при патологических процессах.

1.4.3. Роль глюконеогенетических ферментов и интермедиатов в эмбриогенезе и при экспериментальном диабете.

1.5. Роль глиоксилатного цикла в трансформации жиров в углеводы у организмов разных таксонов.

1.5.1. Глиоксилатный цикл - определяющий этап глюконеогенеза.

1.5.2. Распространение глиоксилатного цикла. ф 1.5.2.1. Функционирование глиоксилатного цикла у микроорганизмов.

1.5.2.1.1. Экспрессия маркерных ферментов глиоксилатного цикла у патогенных микроорганизмов.

1.5.2.2. Функционирование глиоксилатного цикла у растений и грибов

1.5.2.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных.

1.5.3. Характеристика маркерных ферментов глиоксилатного цикла.

1.5.3.1. Структура гена и белка изоцитратлиазы.

1.5.3.2. Структура гена и белка малатсинтазы.

1.5.4. Физико-химические характеристики изоцитратлиазы.

1.5.5. Кинетические и регуляторные свойства изоцитратлиазы.

1.5.6. Регуляция экспрессионной активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла.

1.5.7. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Цель и задачи.

2.2. Объекты и методы исследования.

2.2.1. Объекты исследования.

2.2.2. Методы исследования.

2.2.2.1. Создание модели аллоксанового диабета у крыс Rattus Rattus L.

2.2.2.2. Выращивание эмбрионов птиц Gallus domesticus L.

2.2.2.3. Получение экстрактов различных тканей. у 2.2.2.4. Дифференциальное центрифугирование.

2.2.2.5. Определение активности ферментов.

2.2.2.6. Определение концентрации метаболитов углеводного обмена.

2.2.2.7. Определение количества белка.

2.2.2.8. Выделение и очистка ферментов.

2.2.2.9. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония.

2.2.2.10. Гель-фильтрация и ионообменная хроматография.

2.2.2.11. Определение молекулярной массы фермента. ф 2.2.2.12. Электрофоретические исследования белков.

2.2.2.13. Определение массы субъединиц фермента.

2.2.2.14. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов.

2.2.2.15. Экстракция суммарной РНК.

2.2.2.16. Проведение обратной транскрипции мРНК и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). t 2.2.2.17. Определение количества РНК и ДНК.

2.2.2.18. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей

2.2.2.19. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.

2.2.2.20. Статистическая обработка данных.

2.3. Полученные результаты и их обсуждение.

2.3.1. Разработка модели экспериментального диабета.

2.3.2. Динамика содержания основных субстратов и метаболитов в печени крыс при экспериментальном диабете и в печени эмбрионов птиц.

2.3.3. Динамика активности ферментов основных метаболических путей в печени крыс с экспериментальным диабетом и в печени эмбрионов птиц.

2.3.3.1. Индукция ферментов глиоксилатного цикла у крыс при экспериментальном диабете и у птиц в ходе онтогенеза.

2.3.4. Изучение субклеточной локализации глиоксилатного цикла в животных тканях.

2.3.5. Очистка изоцитратлиазы из печени крыс с аллоксановым диабетом и изучение ее свойств.

2.3.6. Очистка и изучение свойств изоцитратлиазы из печени эмбрионов птиц.

2.3.7. Сравнение свойств ИЦЛ из печени крыс и эмбрионов птиц.

2.4. Характеристика экспрессии ИЦЛ в печени эмбрионов птиц и в печени крыс, страдающих аллоксановым диабетотм.

2.4.1. Разработка праймеров для идентификации гена изоцитратлиазы в геномах животных различных таксономических групп.

2.4.2. Проведение ПЦР для обнаружения гена ИЦЛ в геномах животных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция и экспрессия изоцитратлиазы у Gallus Domesticus в ходе эмбриогенеза и у крыс при экспериментальном диабете"

Актуальность проблемы. Возможность конверсии жиров в углеводы у млекопитающих и птиц всё ещё подвергается сомнению (Holmes, 1993; Jones, 1999). Считается, что окисление липидов может приводить к образованию кетоновых тел и их последующему вовлечению в энергетический обмен. Наличие ферментов Р - окисления жирных кислот в животных пероксисомах и феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при глубоком голодании (Лебкова, 1984) позволяют предположить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла (ГЦ), способных конденсировать две молекулы ацетил-КоА, образующегося при Р-окислении, в сукцинат, как это происходит в растительной и бактериальной клетках. Правильное решение данного вопроса важно для понимания механизма патологии и поиска способов профилактики и лечения многих заболеваний, в частности, обменного характера. Определение наличия глиоксилатного цикла в животных тканях имеет исключительно важное практическое значение. Современные исследования показали, что вирулентность патогенных бактерий и грибов, способных поддерживать хроническую инфекцию, определяется экспрессией ферментов ГЦ (McKinney et al., 2000; Lorenz et al., 2001).

В работах, проведённых на нашей кафедре, была показана индукция изоцитратлиазы (ИЦЛ, К.Ф. 4.1.3.1.) и малатсинтазы (МС, К.Ф. 4.1.3.2.) в печени голодающих крыс (Епринцев и др., 2002; Попов и др., 2000; Popov et al., 1998). До настоящего времени ни в одной систематической группе животных, исключая нематод, не идентифицированы гены белков, обладающих изоцитратлиазной и малатсинтазной активностями. Кроме того, не достаточно изучена динамика экспрессионной активности глиоксилатного цикла. Такой пробел значительно затрудняет окончательное доказательство присутствия данного метаболического пути в тканях животных и делает невозможным применение имеющихся знаний о ГЦ в области биомедицины.

Состояние вопроса, цели и задачи. Ферменты глиоксилатного цикла успешно изучались на растениях, микроорганизмах и низших животных. Тип круглые черви, или нематоды, является в настоящее время единственным таксоном животных, в тканях которых убедительно доказано функционирование ГЦ.

Khan и McFadden указывают на присутствие активностей МС и ИЦЛ в период эмбриогенеза нематоды Caenorhabditis elegans. В ранних эмбрионах количество желточных триглицеридов значительно превышают содержание углеводов и белков. Установлено, что в ходе последующего развития рост активностей ферментов ГЦ имеет линейную зависимость и коррелирует с ярко выраженным уменьшением отношения триглицериды/углеводы. Другими авторами ферменты ГЦ обнаружены в 15-дневной личинке Ascaris suum, в которой ГЦ также участвует в ресинтезе гликогена из запасных триглицеридов. Максимальная активность ИЦЛ и МС соответствует периоду наиболее интенсивного понижения уровня гликогена в тканях. Активности ферментов ГЦ и новообразующийся гликоген локализованы в задней части нематоды. В это же время с помощью электронной микроскопии в этой же части тела установлено наличие многочисленных липидных включений, предшественников гликогена. Таким образом, ферменты глиоксилатного цикла обнаружены в некоторых Rabdithida: Turbatrix aceti, Caenorhabditis briggsae, Rhabditis anomala, Panagrellus redivivus, Caenorhabdibis elegans. В одной из работ указывается на присутствие ИЦЛ активности в некоторых видах морских моллюсков. Данные о ГЦ у членистоногих немногочисленны. Тем не менее, имеющиеся данные свидетельствуют о работе ГЦ на некоторых этапах онтогенеза этих животных. Так, ИЦЛ была очищена из развивающихся зародышей клеща Hyalomma dromedarii. Данные о распространении ферментов глиоксилатного цикла у насекомых отсутствуют. В 1980 году было установлено наличие в гомогенате мочевого пузыря жабы Bufo marinus активности малатсинтазы и изоцитратлиазы. Активности данных ферментов цитохимически и биохимически обнаруживались в печени цыплят при действии витамина D3. Кроме того, исследования бурого жира, взятого у медведей, находящихся в зимней спячке, показали, чтот эта ткань способна выполнять пероксисомалыюе цианид - нечувствительное окисление жирных кислот и обладает активностью ключевых ферментов ГЦ. Очень интересно отметить, что существуют данные об обнаружении активности маркерных фнрментоов ГЦ в печени человека. Работами последних лет доказано то, что ИЦЛ и МС активности - факторы устойчивости, способные поддерживать хроническую инфекцию Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans и многих других патогенов животных, человека и растений. Однако до сих пор нет единого мнения о возможности функционирования глиоксилатного цикла в тканях высших животных. В большинстве случаев не былы подробно изучены некоторые важные биохимические характеристики ферментов глиоксилатного цикла. Также не достаточно изучена динамика экспрессионной активности глиоксилатного цикла, тем более на молекулярном уровне.

Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии и регуляции изоцитратлиазы у животных организмов.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. изучить изменение содержания главных субстратов и интермедиатов углеводного обмена в печени эмбрионов птиц G.domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом;

3. исследовать индукцию изоцитратлиазной активности в печени эмбрионов птиц G.domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом;

4. получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты ИЦЛ из птиц и печени крыс;

8. провести ОТ-ПЦР анализ мРНК для идентификации уникальных последовательностей гена ИЦЛ у эмбрионов G.domesticus и в печени крыс, больных аллоксановым диабетом.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Показана возможность индукции ключевых ферментов глиоксилатного цикла в печени эмбрионов птиц и в печени крыс, страдающих аллоксановым диабетом.

Установлено, что в процессе эмбриогенеза у птиц и у крыс при экспериментальном диабете наблюдается интенсификация цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), увеличение активности аминотрансфераз, индукция ферментов ГЦ, у крыс снижение активности гликолиза и пентозофосфатного пути (ПФП). Показано, что активация глюконеогенеза в этих условиях происходит как за счет мобилизации запасных жирных кислот, так и за счет глюкогенных аминокислот.

Получены гомогенные ферментные препараты ИЦЛ из печени эмбрионов Gallus domesticus и печени крыс с аллоксановым диабетом. Исследованы каталитические свойства и регуляторные аспекты ферментов, определена их молекулярная масса и субъединичное строение.

На основе разработанных праймеров, впервые клонировали и идентифицировали участок гена ИЦЛ из печени эмбрионов птиц и пчени крыс с экспериментальным диабетом. Получили библиотеку комплементарных ДНК и продуктов гена ИЦЛ из организмов различных таксономических групп.

Практическая значимость исследования. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболических процессов в клетках насекомых и высших животных. Разработанная схема выделения высокоочищенных препаратов может быть использована для получения коммерческих препаратов фермента. Найденный метод стабилизации фермента позволяет сохранять его активность в течение длительного времени, что обеспечивает возможность применения препарата изоцитратлиазы для медицинской диагностики и в биохимических исследованиях, которые могут быть использованы в научно-исследовательских работах. Разработанные методы позволяют обосновать применение разгрузочно-диетической терапии (пищевой депривации) для профилактики и лечения болезней обмена веществ (ожирение, подагра, диабет). Подтверждение присутствия ГЦ в тканях высших животных открывает перспективу для разработки новых лекарственных препаратов против патогенных микроорганизмов животных и человека (McKinney et al., 2000; Lorenz et al., 2001).

Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии и молекулярной биологии, спецкурсов по энзимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 9— и 10— международной конференции молодых учёных

Пущино, 2005, 2006), на XLIII международной конференции аспирантов (Новосибирск, 2005), на международной научной конференции «Современные проблемы адаптации» (Махачкала, 2006), на межрегиональной конференции молодых учёных (Нерюнгри, 2005), на межрегиональной конференции «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2004, 2005, 2006), на межрегиональной конференции «Физиология и психофизиология мотиваций» (Воронеж, 2005).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 10 публикациях - 4 статьях и 6 тезисах.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зийат М. Вадах

выводы

3. Показано, что в печени эмбрионов птиц G.domesticus и крыс R.rattus с экспериментальным диабетом происходит индукция ключевых ферментов глиоксилатного цикла - изоцитратлиазы и малатсинтазы.

5. Установлено различие в значениях молекулярных масс и четвертичной структуре ИЦЛ из обоих объектов исследования. Mr ИЦЛ из печени птиц G.domesticus составила 140±3 кДа, из печени крыс R.rattus 180±4 кДа. Электрофорез в присутствии Ds-Na показал, что молекула фермента из обоих объектов исследования является изологическим тетрамером с Mr субъедипиц 45 и 36 кДа, для гепатоцитов крыс и эмбрионов птиц, соответственно.

6. Выявлено, что ИЦЛ из тканей животных и птиц имеют сходные каталитические свойства и подчиняются кинетике Михаэлиса-Мэнтен. Км по изоцитрату из печени крыс 1,6 мМ, из печени эмбрионов птиц - 5 мМ.

Особенностью метаболической регуляции является конкурентное ингибирование ИЦЛ глюкозо-6-фосфатом у обоих объектов исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение путей биохимической адаптации организма к дефициту углеводов и, в частности, исследование участия в подобной адаптации глиоксилатного цикла направлено на решение важной проблемы - выяснение распространённости глиоксилатного цикла у различных таксономических групп животных. Определение присутствия глиоксилатного цикла в животных тканях имеет исключительно важное практическое значение.

Глиоксилатный цикл был открыт у бактерий, выращиваемых на ацетете (Kornberg et al., 1957). Позднее ГЦ был найден у организмов различных таксономических групп (бактерий, грибов, растений, животных) при различных физиологических и аптологических состояниях (цистирование, прорастание, старение, смена субстрата, пищевая депривация, метаморфоз и др.).

Большинство литературных данных свидетельствует о возникновении изоцитратлиазной и малатсинтазной активностей в животных тканях в экстремальных и патологических состояниях, а также на некоторых этапах онтогенеза (Епринцев, 2005; Попов, 2000; Волвенкин, 1999; 1996; Khan et al., 1980; Popov, 1998, 1996; Davis, 1990; Song, 2000; Kamel, 1982). Общей характеристикой таких состояний является острая необходимость в глюконеогенезе. ГЦ - важный этап трансформации жирных кислот в углеводы в растениях и бактериях. Однако многочисленные данные литературы свидетельствуют о выполнении ГЦ этой же фунции в тканях животных. Для исследования возможности индукции ИЦЛ были выбраны два вида животных разных систематических групп. Оба объекта исследования в условиях эксперимента представляют модель организма, для выживания которого необходима конверсия липидов в углеводы. Данный процесс особенно необходим, поскольку известно, что нейроны головного мозга и эритроциты утилизируют исключительно глюкозу (Страйер, 1986).

Полученные данные свидетельствуют об особенностях организации и ферментативной регуляции глюконеогенеза у эмбрионов птиц G.domesticus L. и у крыс при экспериментальном диабете. Результаты исследований указывают

126 на перестройку метаболических путей для использования запасных нейтральных липидов в качестве основного источника энергии и углеводов. В частности, это подтверждается увеличением активности аминотрансфераз и ключевого фермента глюконеогенеза - фосфоенолпируваткарбоксикиназы. Для животных тканей биохимический механизм трансформации жирных кислот, образующихся при липолизе, в углеводы до сих пор остается дискуссионным вопросом (Jones et al., 1999). Окисление жирных кислот в животных тканях возможно с помощью^ -,JS -, и О- окисления, при этом образуются ацетил-СоА и сукцинил-СоА. -окисление является наиболее выгодным процессом, так как при этом сохраняется органическое вещество клетки и запасается энергия. -окисление может протекать как в митохондриях, так и в пероксисомах, обеспечивая массовую продукцию ацетил-КоА.

Полученные нами данные свидетельствуют, что дальнейшее превращение ацетил-СоА у обоих объектов исследования связано с глиоксилатным циклом и обеспечивает образование сукцината. Установленная активация ферментов цикла Кребса свидетельствует о том, что последующая трансформация сукцината обеспечивается за счет дикарбоновой ветви цикла трикарбоновых кислот. Образующийся при этом оксалоацетат необходим как для поддержания энергетического метаболизма, так и обеспечения обращенного гликолиза. ФЕП-карбоксикиназа - ключевой фермент глюконеогенеза, также увеличивает свою активность при голодании, что показывает возможность синтеза de novo углеводов в клетках печени крыс с аллоксановым диабетом и эмбрионов птиц. У крыс на фоне развития экспериментального диабета наблюдалось снижение активности ключевого фермента пентозофосфатного пути глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что свидетельствует о замедлении процесса, приводящего к расходованию запасных углеводов. Таким образом, в данных физиологических состояниях не прекращаются, а интенсифицируются процессы глюконеогенеза. Остаётся нерешённой проблема участия в глюконеогенезе глиоксилатного цикла.

Для ответа на поставленный вопрос, на первом этапе, проводили исследования индукции ключевых ферментов глиоксилатного цикла у птиц в ходе эмбриогенеза и у крыс с экспериментальным диабетом. Установлено, что в данных состояниях (в печени) происходит появление активности ИЦЛ и МС. Следует заметить, что у контрольных животных активности данных ферментов не обнаруживаются.

Получение в электрофоретически гомогенном состоянии ключевого фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиазы из печени эмбрионов птиц и печени крыс с аллоксановым диабетом является важным аргументом, свидетельствующим о идентификации ГЦ. Сравнительное исследование физико-химических и регуляторных свойств ИЦЛ показало, что основные свойства изучаемого фермента из обоих объектов мало отличаются по своим характеристикам (удельной активности, степени очистки, молекулярной массе, сродству к различным субстратам и др.) от ИЦЛ из других организмов. Впервые полученный гомогенный препарат ИЦЛ птиц и крыс использовали для определения молекулярной массы. Значение молекулярной массы изоцитратлиазы из печени крыс с экспериментальным диабетом составило 180 кДа, для эмбрионов птиц 140 кДа. Выявлено, что ИЦЛ из печени крыс и эмбрионов птиц является изологическим тетрамером с молекулярной массой субъединиц 46 и 36 кДа, соответственно. Изучение каталитических свойств показало, что изоцитратлиаза и обоих объектов исслеования подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, определены значения Км. Из регуляторных аспектов наибольший интерес представляет тот факт, что наибольшее ингибирование данных ферментов наблюдается при действии конечных продуктов глюконеогенеза, а именно глюкозо-1-фосфатом и глюкозо-6-фосфатом, т.е. регуляция осуществляется по принципу обратной связи. Это может свидетельствовать о том, что физиологическим смыслом индукции глиоксилатного цикла у обоих объектов исследования, является обеспечение утилизации жирных кислот для поддержания энергетического баланса клеток, а также поддержания уровня глюкозы.

Современные исследования показали, что глиоксилатный цикл необходим для вирулентности патогенных бактерий и грибов (McKinney, 2000; Lorenz, 2001; Manabe, 2000; Bishai, 2000). ИЦЛ и МС - факторы устойчивости Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans и многих других патогенов животных, человека и растений. Показано, что &>icl мутанты М. tuberculosis и С. albicans не способны поддерживать хроническую инфекцию. Вовлечённость ГЦ в патогенез предполагает использование ИЦЛ и МС патогенов в качестве мишеней для действия лекарств (Lorenz et al., 2002; Graham et al., 1999). Проведенные нами исследования по клонированию ИЦЛ показали наличие нуклеотидной последовательности, гомологичной изоцитратлиазе из растений и микроорганизмов в геноме животных. Данные выводы основываются на результатах проведения полимеразной цепной реакции с праймерами, разработанными по консервативным последовательностям в составе активного центра белка. Одна из этих последовательностей включает 3 аминокислоты, входящие в состав активного центра, другая 5 аминокислотных остатков. Полимеразная цепная реакция проводилась с комплементарной ДНК, полученной в результате обратной транскрипции всех мРНК, выделенных из печени крыс с экспериментальным диабетом и эмбрионов птиц. В результате анализа продуктов ПЦР у обоих объектов исследования идентифицированы продукты гена оклоло 400 п.н., что приблизительно соответствует по длине генам ИЦЛ из других организмов (кукуруза, E.coli, B.leptomitiformis). Кроме того, наблюдали отжиг праймеров при более низкой температуре. Возможным объяснением результатов низкой температуры отжига праймеров на кДНК крыс и птиц является отсутствие достаточной для амплификации гомологии между праймерами и нуклеотидной последовательностью кДНК. В ходе эволюции последовательность нуклеотидов гена фермента ИЦЛ могла сильно измениться, в результате исследуемый ген у крыс может иметь низкую гомологию с аналогичным геном растений и микроорганизмов. Фактом, подтверждающим эту гипотезу, является наличие бифункционального фермента нематоды С. elegans, сочетающего каталитические активности ИЦЛ и МС (Liu, 1995).

129

Учитывая, что эволюция маркерных ферментов ГЦ от микроорганизмов до нематод привела к подобной трансформации, то изменения гена ИЦЛ у животных могут быть ещё более существенными. В связи с этим полученный результат ПЦР-анализа РНК крыс позволяет предположить возможность использования ИЦЛ микроорганизмов в качестве мишени для действия лекарств против ряда патогенов животных (Vereecke, 2002). Подтверждение этого предположения, по-видимому, откроет перспективу для разработки новых лекарств против инфекций млекопитающих и их применения без негативных последствий.

Таким образом, полученные данные в совокупности с известными из литературы фактами убедительно свидетельствуют о присутствии глиоксилатного цикла не только в клетках прокариот, растений и нематод, но и в тканях животных разного уровня организации. Это позволяет рассматривать данный метаболический путь как уникальный сохранённый в ходе эволюции у животных организмов универсальный механизм конверсии жирных кислот в углеводы. Однако, глиоксилатный цикл не функционирует постоянно, а индуцируется при патологических состояниях и на некоторых стадиях онтогенеза.

Аллоксановым диабет

Потребность в углеводах

Эмбриогенез Л

МС ген

-*■ ИЦЛ ген

Mg ген

Рис. 24 Возможный молекулярный механизм регуляции и экспрессии ИЦЛ при индукции глиоксилатного цикла в гепатоцитах G.domesticus и R.rattus. CSRE- чувстчительные элементы к источнику углерода; PPAR - рецептор пролиферации пероксисом; ИЦЛ - изоцитратлиаза; МС - малатсинтаза; ФЕПКК - фосфоенолгшруваткарбоксикиназа. Ингибирование процессов Активация процессов

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зийат М. Вадах, Воронеж

1. Детерман Г. Гель-хроматография.-М.: Мир, 1970.-252с.

2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты М. : Мир, 1982. - Т. 3. - 216 с.

3. Епринцев А.Т., Москалев Е.А., Попов В.Н. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. Москва. 2001. С.9-14.

4. Епринцев А.Т., Семёнова Е.В., Попов В.Н. Индукция аконитатгидратазы в гепатоцитах голодающих крыс // Биохимия. 2002.- Т.67, №7. - С. 956-966.

5. Епринцев А.Т., Шевченко М.Ю., Попов В.Н. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P.machaon L. // Биохимия. -2004. -Т.69, №4. С.467-472.

6. Епринцев А.Т., Шевченко М.Ю., Попов В.Н. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P.machaon L. II Биохимия. -2004. Т.69, №4. - С.467-472.

7. Землянухин А. А., Епринцев А. Т., Землянухин Л. А., Игамбердиев А. У. Субклеточная локализация изоформ аконитатгидратазы в высших растениях //Физиология растений, 1984, т. 31, вып. 2, с. 337-343.

8. Землянухин А.А., Землянухин Л.А., Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У Глиоксилатный цикл растений Воронеж: ВГУ, 1986. - 148 с.

9. Игамбердиев А. У. Микротельца в метаболизме растений. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1990. 148 с.

10. Кац В.А., Г.А. Лавникова, С.А. Синицкая Ультраструктура эмбриональной липосаркомы человека // Архив патологии 1984.- Т.46, вып. 5.- С.38-45.

11. Козырева Т.В., Р.А. Верхогляд. Адаптация к холоду и структура терморегуляционого ответа при медленном и быстром охлаждении // Российский физиологический журнал.- 1997. -№14. С. 135-141

12. Кондрашова М.Н. Формакологическая коррекция гипоксических состояний Москва: Мир, 1989.- 96 с.

13. Лакин Г.Ф. Биометрия. М: Высшая школа, 1980, 293с.

14. Лебкова Н.П. Современные представления о внутриклеточных механизмахобеспечения энергетического гомеостаза в норме и при патологии // Вестник РАМН.- 2000.-№9.-С.6-22.

15. Лебкова Н.П. Субклеточная локализация карнитинацетилтрансферазы в клетках разных органов интактных и голодающих крыс // Бюлл. экспер. биол. и медицины -1983.- №7.- С.32-35.

16. Лебкова Н.П. Субклеточная локализация карнитинацилтрансферазы в клетках различных органов интактных и голодающих крыс // Бюлл. экспер. и биол. медицины,- 1983.-№7. С.32-35.

17. Лебкова Н.П. Трансформация липидов в гликоген в клетках животныхи человека//Архив патологии.- 1981.-№2.- С.71-77.

18. Лебкова Н.П., Колесова О.Е., Горбунова В.Д. Внутриклеточное превращение жирных кислот в гликоген у крыс с аллоксановым диабетом по данным электронной авторадиографии // Бюлл. экспер. биол. и медицины -1984.- №12.- С.734-736.

19. Лебкова Н.П., Смольянников А.В. Механизмы трансформации жирных кислот при пищевой депривации // Архив патологии -1983.- Т.45, №7. С. 41-47.

20. Львова С.П., Чубуркова С.С. Содержание гликогена фосфорилазная активность в различных мышцах крыс и сусликов при гипотермии, самосогревании и зимней спячке // Украинский биохимический журнал.-1983.- Вып.55, №1.- С.39-44.

21. Майланов И.С. Температурная компенсация у гомойотермных животных // Российский физиологический журнал.- 1997. -№9.-С. 102-110.

22. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека:-М.: Мир, 1993.-Т.2-418 с.

23. Мауэр Г. Диск-электрофорез.М: Мир, 1971.-222с.

24. Методы биологии развития. / Под ред. Т.А. Детлафа. М., 1974.

25. Мешкова Н.П., Северин С.Е. Практикум по биохимии. Изд-во МГУ, 1979.-430 с.

26. Мильман Л.С., Юровицкий Ю.Г. Механизмы энзиматической регуляции135углеводного обмена в раннем эмбриогенезе. М.: Наука, 1973. - 236 с.

27. Муравская Э.А., Фонтаз Е.В. Энергетические траты у Scorpena porcus при зимнем голодании //Гидробиологический журнал.- 1982.- Т. 18, №2.- С.77-81.

28. Панин JT.E. Биохимические механизмы стресса Новосибирск: Высшая школа, 1983.-213 с.

29. Панченко Л.Ф., Герасимов A.M., Антоненко В.Д. Роль пероксисом в патологии клетки. Москва: Мир, 1981.-312 с.

30. Пинейру де Корвалыо М.А.А., Землянухин А.А., Епринцев А.Т. Малатдегидрогеназа высших растений. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1991.-216 с.

31. Попов В.Н., Волвенкин С.В., Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в различных тканях голодающих крыс // Известия РАН, Серия биологическая 2000., №6. - С. 663-667.

32. Попов В.Н., Игамбердиев А.У., Волвенкин С.В. Очистка и свойства изоцитратлиазы и малатсинтазы из печени голодающих крыс // Биохимия.-1996.-Т.61, Вып. 10,- С. 1898 1903.

33. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология / Пер. с англ. Москва: Мир, 2000. - 529 с.

34. Страйер Л. Биохимия М. : Мир, 1984. - Т. 1. - 232 с.

35. Тыщенко В.П. Физиология насекомых Москва: МГУ, 1986. - 283 с.

36. Филлипович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Высш. шк., 1993. - 496 с.

37. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений //Тр. Всерос. конф. физиол. Растений 2002 г., Санкт-Петербург СПб., 2002.- 241 с.

38. Шустов Е.Б. Физиология экстремальных состояний. Москва: Наука, 1998. -247 с.

39. Andrikopoulos S., Proietto J. The biochemical basis of increased hepatic glucose production in a mouse model of type 2 (noninsulin- dependent) diabetes mellitus // Diabetologia. 1995.- Vol. 38, №12. - P.1389-1396.

40. Atomi H. Umemura К., Ueda M., Tanaka A. Transcriptional regulation of peroxisomal glyoxylate cycle enzymes of an nalkane- assimilating yeast, Candida tropicalis II Ann. N. Y. Acad. Sci. 1996. - Vol. 804. - P.684-686.

41. Atwal O.S., Bray T.M. Glycogen accumulation in alveolar type II cells in 3-methylindole-induced pulmonary edema in goats // Am. J. Pathol. 1981. -Vol.105, №3.-P.255-262.

42. Ausubel F.M. Short protocols in molecular biology / Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. et al. Third edition. Wiley, New York. 1997. - 564 p.

43. Ballard F.J., Hopgood M.F., Reshef L. Synthesis of phosphoenolpyruvate carboxykinase (guanosine triphosphate) by' isolated liver polyribosomes // Biochem. J. 1974. - Vol.144, №2. - P.l99-207.

44. Barrett E.J., Liu Z. Hepatic glucose metabolism and insulin resistance in NIDDM and obesity // Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 1993. - Vol.7, №4.- P.875-901.3-5.л

45. Beale E.G., Hartley E.G., Granner J.L. 6-0 '-dibutyryl cycle AMP and glucose regulate the amount of messenger RNA coding for hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) // J. Biol. Chem. 1982. - Vol.257, №4. - P.2022-2028.

46. Beeckmans S., Kanarek L. Demonstration of Physical interaction between consicutive enzymes of the citric acid cycle and of aspartate aminotransferase // Europ. J. Biochem. 1981. - V.l 17, №.3. . p.527-535.

47. Beeckmans S., Khan A.S., Van Driessche E., Kanarek L. Specific association between the glyoxylic-acid-cycle enzymes isocitrate lyase and malate synthase // European Journal of Biochemistry. 1994. - V.224, №1. - P. 197- 201.

48. Behari R., Baker A. The carboxyl terminus of isocitrate lyase is not essential for import into glyoxysomes in an in vitro system? // Journal of Biological Chemistry. 1993. - V.268, №10. - P.7315-7322.

49. Benevides J.M., Tremblay G.C., Hammen C.S. Determination of isocitrate lyase and malate synthase activities in a marine bivalve mollusk by a new method of assay // Сотр. Biochem. Physiol. B. 1989. - Vol. 94. - P. 779-782.

50. Berardi E., Gambini A., Bellu A.R. ALG2, the Hansenula polymorpha isocitrate lyase gene. // Yeast. 2003 - Vol.20, №9. - P.803-811.

51. Borst P. How proteins get into microbodies (peroxisomes, glyoxysomes, glycosomes) // Biochimica et Biophysica Acta. 1986. - V. 866, №4. - P. 179-203.

52. Bowyer P., Mueller E., Lucas J. Use of an isocitrate lyase promoter-GFP fusion to monitor carbon metabolism of the plant pathogen Tapesia yallundae during infection of wheat // Mol. Plant Pathol. 2000. - Vol.1. - P. 253-262.

53. Boyd R.D. Britton R.A., Knoche H. Oxidation rates of major fatty acids in fasting neonatal pigs // J. Anim. Sci. 1982. - Vol.55, №1. - P.95-100.

54. Brown V.K., Box V.L Occurrence of the glyoxylate-shunt in the epidermis of rats. Br. J. Dermatol. -1968. Vol.80. - P.740.

55. Burchell A., Burchell B. Identification and purification of a liver microsomal glucose6-phosphatase // Biochem. J. 1982. - Vol. 205, №3. p.567-573.

56. Carlson C.W., Baxter R.C., Ulm E.H., Pogell B.M. Role of oleate in the regulation of "neutral" rabbit liver fructose 1,6-diphosphatase activity // J. Biol. Chem. 1973. - Vol. 248, №16. - P.5555-5561.

57. Cioni M., Pinzauti G., Vanni P. Comparative biochemistry of glyoxylate cycle // Comp.Biochem. and Physiol.-1981.-V.70, B, N 1.- P. 1-26.

58. Clarke S.D., Baillie R., Jump D.B. Fatty acid regulation of gene expression. Its role in fuel partitioning and insulin resistance // Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1997. -Vol.827.-P.178-187

59. Cole S. T. Brosch R., Parkhill J. // Nature 1998 - Vol.393. - P.537-544.

60. Consoli A., Nurjahan N., Gerich J.E., Mandarino L.J. Skeletal muscle is a major site of lactate uptake and release during hyperinsulinemia // Metabolism. 1992. -Vol.41, №2.-P. 176-179.

61. Consoli A., Nurjahan N., Gerich J.E., Mandarino L.J. Skeletal muscle is a major site of lactate uptake and release during hyperinsulinemia // Metabolism. 1992. -Vol.41, №2.-P. 176-179.

62. Cornberg H.L., Madsen N.B. The metabolism of C2 compounds in microorganisms. III. Synthesis of malate from acetate via the glyoxylate cycle //138

63. Biol. Chem. J. -1958. Vol.68, №3. - P.549-557.

64. Corrector C., Bosca L, Sols A. Biphasic effect of fructose 2,6-bisphosphate on the liver fructose-1, 6-bisphosphatase: mechanistic and physiological implications // FEBS Lett. 1984. - Vol.167, №2. - P. 199-202.

65. Cortay J.C., Negre D., Galinier A. Regulation of the acetate operon in Echerichia coli: purification and functional characterization of the IclR repressor // EMBO Journale. 1991. -Vol. 103. - P.675-679.

66. Cozzone AJ. Regulation of acetate metabolism by protein phosphorylation in enteric bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 1998.-Vol. 52, P. 127-164.

67. Dandekar Т., Schuster S., Snel B. Pathway alignment: application to the comparative analysis of glycolytic enzymes // Biochem. J. 1999. - Vol. 343. -P.l 15-124.

68. Davis W.L., Goodman D.B. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver // Source Anatomical Record. 1992. - V. 234, № 4. - P. 461-468.

69. Davis W.L., Goodman D.B., Crawford L.A. Hibernation activates glyoxylate cycle and gluconeogenesis in black bear brown adipose tissue // Biochim Biophys Acta. 1990. - Vol.1051, №3. -P.276-278.

70. Davis W.L., Goodman D.B., Crawford L.A. Hibernation activates glyoxylate cycle and gluconeogenesis in black bear brown adipose tissue // Biochim Biophys Acta. 1990. - Vol.1051, №3. - P.276-278.

71. Davis W.L., Jones R.G., Goodman D.B. Cytochemical localization of malate synthase in amphibian fat body adipocytes: possible glyoxylate cycle in a vertebrate // J. Histochem. Cytochem. 1986. - Vol. 34, №5. - P.689-692.

72. Davis W.L., Matthews J.L., Goodman D.B. Glyoxylate cycle in the rat liver: effect of vitamin D3-treatment//FASEB J. 1989.-Vol. 3. - P. 1651-1655.

73. Davis W.L., Matthews J.L., Goodman D.B. Glyoxylate cycle in the rat liver: effect of vitamin D3-treatment // FASEB J. 1989. -Vol. 3. - P. 1651-1655.

74. Day J.L. The metabolic consequences of adrenergic blockade: a review / Day J.L. // Metabolism. 1975. - Vol. 24, №8. - P.987-996.

75. De Duve С., Baudhuim P. Peroxisomes (microbodies and related particles) // Physiol. Rev. 1966. - Vol.46, №2. - P.323-357.к

76. De los Reyes B.G., Myers S.J., McGrath J.M. Differential induction ofglyoxylate cycle enzymes by stress as a marker for seedling vigor in sugar beet СBeta vulgaris) II Mol. Genet. Genomics. 2003. - Vol.269, №5. - 692-698.

77. Didier R., Remesy C., Demigne C. Changes in glucose and lipid metabolism in starved or starved-refed Japanes quail (Coturnix coturnix) in relation to fine structure of liver cells // Сотр. Biochem. and Physiol. 1983. - Vol. A74, №4. -P.839-848.

78. Dildy-Mayfield J.E., Leslie S.W. Mechanism of inhibition of N-Methyl-D Aspartate-stimulated increases in free intracellular Ca concentration by ethanol // J. Neurochem. 1991. - Vol.56. -P.1536-1543.

79. Elgersma Y., Tabak H.F. Proteins involved in peroxisome biogenesis and functioning// Biochim. Biophys. Acta. -1996. V.1286, №3. - P.269-283.

80. Elliott K.R., Pogson C.I. Preparation and characterization of isolated parenchymal cells from guinea pig liver // Mol. Cell. Biochem. 1977. - Vol.16, №1.-23-29.

81. Fargeix C, Gindro K, Widmer F. Soybean (Glycine max. L.) and bacteroid glyoxylate cycle activities during nodular senescence // J. Plant. Physiol. 2004. -Vol.161, №2.-P.183 -190.

82. Farrar E., Frye B. Factors affecting normal carbohydrate levels in Rana pipiens II• Gen. and сотр. Endocrinology. 1979. - Vol.39, №3. - P.358-371.

83. Fideu M., Soler G., Ruiz-Amil M. Nutritional reguletion of glicolisis in rainbow trout // Ibid. 1983. - Vol. В 74, №4. - P. 795-799.

84. Frevert J., Koller W., Kindl H. Occurence and biosynthesis of glyoxysomal enzymes in ripening cucumber seeds // Physiol.Chem. 1980. - Vol.361, №10. -P.1557-1565.

85. Frevert J., Koller W., Kindl H. Occurence and biosynthesis of glyoxysomal enzymes in ripening cucumber seeds // Physiol.Chem. 1980. - Vol.361, №10. -P.1557-1565.

86. Garcia F., Pons A., Alemany M Tissue glycogen and lactate levels in starved and in protein-fed domestic fowl chicks (G.Domesticus) // Arch. Intern. Physiol, et Biochim. 1987. - Vol. 95, №4. - P.299-303

87. Gemmrich A.R. Isocitrate lyase in germinating spores of the fern Anemia phyllitids / Gemmrich A.R. // Phytochemistry. 1979. - Vol.18, №6. - P. 11431146.

88. Godavari H.R. Isocitrate lyase in green leaves // Plant Physiol. 1973. - Vol.51, №6. - P.863-867.

89. Goh L.L., Koh R., Loke P., Sim T.S. Thermostable malate synthase of Streptomyces thermovulgaris II J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003. - Epub ahead of print.

90. Goodman D.B., Davis W.L., Jones R.G. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: possible stimulation by aldosterone // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980.- Vol.77, №3.-P.1521-1525.

91. Goodman D.B., Davis W.L., Jones R.G. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: possible stimulation by aldosterone // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980.- Vol.77, №3.-P.1521-1525.

92. Gould S.J., Keller G.A., Subramani S. Identification of peroxisomal targeting signals located at the carboxy terminus of four peroxisomal proteins // Journal of Cell Biology. 1990. - Vol.107, №3. - P.897-905.

93. Graham R.M., Morgan E.H., Baker E. Characterisation of citrate and iron citrate uptake by cultured rat hepatocytes // J. Hepatol. 1998. - V. 29, № 4. - P. 603-613.

94. Hand A. Morphologic and cytochemical identification of peroxisomes in the rat parotid and other exocrine glands // J. Histochem. Cytochem. 1973. - Vol.21,2. -Р.131-141.

95. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. // Nature. 2000. - Vol.406. -P.477-483.

96. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. // Nature. 2000. - Vol.406. -P.477-483.

97. Heroux M. Butterworth R.F. Regional alterations of thiamine phosphate esters and of thiamine diphosphate-dependent enzymes in relation to function in experimental Wernicke's encephalopathy // Neurochem. Res. 1995. - Vol.20. -P.87-93.

98. Holmes R.P. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embrionic chick liver//Biochim. Biophys. Acta. 1993.-Vol. 1158.-P. 47-51.

99. Jahoor F., Peters E.J., Wolfe R.R. The relationship between gluconeogenic substrate supply and glucose production in humans // Am. J. Physiol. (Endocrinol Metab 2) 1990. - P.E228-E296.

100. Johanson C.E., Parandoosh Z., Smith Q.R. / С1-НСОЗ exchange in choroid plexus: analysis by the DMO method for cell pH // Am. J. Physiol., 1985 Vol.249, P.478-484.

101. Kamel M.Y., Fahmy A.S. Biochemical studies of tick embriogenesis. Purification and partial characterisation of isocitrate lyase from eggs of the tick Hyalomma dromedarii // Сотр. Biochem. Physiol. B. 1982. - Vol. 72. - P. 107-115.

102. Kato A., Hayashi M., Nishimura M. Oligomeric proteins containing N-terminal targeting signals are imported into peroxisomes in transgenic Arabidopsis // Plant. Cell. Physiol. 1999. - Vol. 40, №6 -P.586-591.

103. Kazuo N., Amano Y., Nakadate M. Purfication and properties of isocitrate lyase142from Candida brassicae E-17 II Ferment and Bioeng. 1989. - Vol.67, №3. -P.153-157.

104. Keller H., Dreyer C., Medin J. Fatty acids and retinoids control lipid metabolism through activation of peroxisome proliferator-activated receptor-retinoid X receptor heterodimers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90, №6. -P.2160-2164.

105. Khan A.S., Van Driessche E., Kanarek L. & Beeckmans S. Purification of the glyoxylate cycle enzyme malate synthase from maize (Zea mays L.) and characterization of a proteolytic fragment // Prot. Expr. Purif. 1993. - Vol.4. -P.519-528.

106. Khan A.S., Van Driessche E., Kanarek L., Beeckmans S. The purification and physicochemical characterization of maize (Zea mays L.) isocitrate lyase // Archives of Biochemistry & Biophysics. 1992.- Vol.297, №1.- P.9-18.

107. Khan F.R., McFadden B.A. Embryogenesis and the glyoxylate cycle // FEBS Lett.- 1980.-Vol. 115. P. 312-314.

108. Kokavec A., Crowe S.F. Alcohol consumption in the absence of adequate nutrition may lead to activation of the glyoxylate cycle in man // Medical Hypotheses. 2002. - Vol.58, №5. - P.411-415.

109. Kornberg H.L. Krebs H.A. Synthesis of cell constituents from Сг-units by a modigied tricarboxylic acid cycle //Nature. 1957. - Vol.179. - P.988-991.

110. Kornberg H.L., Beevers H. The glyoxylate cycle as stage in the conversion of fat to carbohydrase in castor beans // Biochem.Biophys. Acta. 1957. - Vol.26. -P.531-537.

111. Kroetz D.L., Yook P., Coester p., Bianchi P., Pineau T. Peroxisome Proliferator-activated Receptor controls the hepatic CYP4A induction adaptive response to Starvation and diabetes //J. Biol. Chem- 1998 V. 273.- P. 31581-31589.

112. Lamb Y.E., Riezman H., Becker W.M., Leaver J. Regulation of glyoxysomal enzymes during germination of cucumber. II. Isolation and immunological detection of isocitrate lyase and catalase // Plant Physiol. 1978. - Vol.62, №3. -P.754-760.

113. Latruffe N. and Vamacq J. Peroxisome proliferators and peroxisome proliferator activated receptors (PPARs) as regulators of lipid metabolism // Biochimie.-1997.- V. 79.- P. 81-94.

114. Lazarow P.B., Fujiki J. Biogenesis of peroxisomes // Ann. Rev. Cell. Biol.-1985. Vol.1. -P.489-530.

115. Lazarus R., Sparrow D., Weiss S. T. Alcohol intake and insulin levels. The normative aging study // Amer. J. Epidemiol. 1997. - Vol.145. - P.909-916.

116. Lewis C.E., Doyle J.J. Phylogenetic utility of the nuclear gene malate synthase in the palm family (.Arecaceae) // Mol. Phylogenet. Evol. 2001. - Vol.19, №3. -P.409-420.

117. Lieber C.S. Hepatic and other medical disorders of alcoholism: from pathogenesis to treatment // J. Stud. Alcohol. 1998. - Vol.59. - P.9-25.

118. Liu F., Thatcher J.D., and Epstein H.F. Induction of glyoxylate cycle expression in Caenorhabditis elegans: a fasting response throughout larval development // Biochemistry. 1997. - Vol. 36. - P.255-260.

119. Liu F., Thatcher J.D., Barral J.M. et al. Bifunctional glyoxylate cycle protein of Caenorhabditis elegans: a developmentally regulated protein of intestine and muscle // Dev. Biol. 1995. - Vol. 169. - P.399-414.

120. Lo Conte L., Ailey В., Hubbard T. J. SCOP: a structural classification of proteins database // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol.28. - P.257-259.

121. Lo Conte L., Brenner S. E., Hubbard T. J. SCOP database in 2002: refinements accommodate structural genomics // Nucleic Acids Res. 2002. Vol.30. - P.264-267.

122. Lorenz M.C., Fink G.R. Life and death in a macrophage: role of the glyoxylate cycle in virulence // Eukaryot. Cell. 2002. - Vol. 1. - P.657-662.

123. Lorenz M.C., Fink G.R. The glyoxylate cycle is required for fungal virulence // Nature. 2001. - Vol. 412. - P. 83-86.

124. Lucas P.C., O'Brien R.M., Mitchell J.A., et al. A retinoic acid response element is part of a pleiotropic domain in the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol.88, №6. - P.2184-2188.

125. Lyle R., Deboer G., Harrison R. et al. Plasma and liver metabolites and glucose kinetics as effected by prolonged ketonemia-glucosuria and fasting in steers // J. Dairy Sci. 1984. - Vol.67, №10. - P.2274-2282.

126. Malhotra O.P., Srivaslava P.K. Isolation and characterization of isocitrate lyase of castor endosperm // Arch. Biochem. and Biophys. 1982. - Vol.214, №1. -P.164-171.

127. Manival X., Ghisolfi-Nieto L., Joseph G. et al. RNA-binding strategies common to cold-shock domain and RNA recognition motif containing proteins // Nucleic Acids Res. 2001. - Vol.29. - P.2223-2233.

128. Masaaki U., Ueda M., Matsuki T. et al. Properties of isocitrate lyase from an alkane-utilizable yeast, Candida tropicalis II Agr. And Biol. Chem. 1986. -Vol.50, №1.-P.127-134.

129. Masters C. Gluconeogenesis and the peroxisome // Mol. Cell. Biochem. 1997 Vol.166.-P.159-168.

130. Maxwell D.P., Maxwell M.D., Nanssler G. et al. Microbodies and glyoxylate cycle enzymes activities in filamentous fungi // Planta. 1975. - Vol.124, №1.-P.109-123.

131. McClard R.W., Atkinson D.E. Effects of fructose 6-phosphate and adenylates on the activities of rabbit liver fructose bisphosphatase and phosphofructokinase // Arch. Biochem. Biophys. 1979. - Vol.194, №1. - P.36-43.

132. McLaughlin Y.C., Smith S.M. Metabolic regulation of glyoxylate cycle enzyme synthesis in detached cucumber cotyledons and protoplasts // Planta. -1994. -Vol.195, №l.-P.22-28.

133. Menendez J., Valdes I., Cabrera N. The ICL1 gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter // Yeast. 2003. - Vol.20, №13. - P.1097-1108.

134. Menendez J., Valdes I., Cabrera N. The ICL1 gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter // Yeast. 2003. - Vol.20, №13. -P.1097-1108.

135. Mizunuma H., Tashima Y. Effect of Mn2+ on fructose 2,6-bisphosphate inhibition of mouse liver, intestinal, and muscle fructose-1, 6-bisphosphatases // Arch. Biochem. Biophys. 1983. - Vol.226, №1. - P.257-264.

136. Molina I., Pellicer M.T., Badia J. Molecular characterization of Escherichia coli malate synthase G. Differentiation with the malate synthase A isoenzyme // Eur. J. Biochem. 1994. - Vol. 224. - P.541-548.

137. Morgunov I.G., Kondrashova M.N., Kamzolova S.V. Evidence of the glyoxylate cycle in the liver of newborn rats. // Med. Sci. Monit. 2005. - Vol. 11, №2:B, P.57-60.

138. Mortensen P.B. The possible antiketogenic and gluconeogenic effect of the omega-oxidation of fatty acids in rats // Biochim Biophys Acta. 1980. - Vol. 7, №620(2), P. 177-185.

139. Mullen R.T., Gifford D.J. Isocityrate luase from germinated loblolly pine megagametophytes: enzyme purification and immunocharacterization // Plant Physiol, and Biochem. 1995. - Vol.33, №1. - P.87-95.

140. Muller M., Hogg Y.F., De Duve C. Distribution of tricarboxylic acid cycle enzymes and glyoxylate cycle enzymes between mitochondria and peroxisomes in Tetrahymenapyriformis II J.Biol.Chem. 1968. - Vol.243. - P.5385-5395.

141. Murray C.J., Salomon J.A. Modeling the impact of global tuberculosis control strategies//Proc. Natl. Acad. Sci. 1998.-Vol.95. - P.l 3881-13886.

142. Murzin A.G. OB (oligonucleotide oligosaccharide binding) fold common structural and functional solution for nonhomologous sequences // EMBO J. -1993.- Vol.12. -P.861-867.

143. Nordlie R.C. Glucose-6-phosphatase-phosphotransferase: Role and regulation in relation to gluconeogenesis // Gluconeogenesis. N.Y.: Ley and Sons. 1976. - P. 93-152.

144. Osumi M., Kazama H., Sato S. Microbody-associated DNA in Candida tropicalis pK 233 cells // FEBS Lett. 1978. - Vol.90, №2. - P.309-312.

145. Parkhill J, Wren B.W., Thomson N.R. et al. // Nature. 2001. Vol.413. - P.523-527.

146. Pegorier J., Duee P., Assan R. et al. Changes in circulating fuels pancreatic hormones and liver glicogen concentration in fasting of suckling newborn pigs // J. Develop. Physiol. 1981. - Vol.3, №3. - P.203-217.

147. Peinado J., Lopez-Soriano F.J., Argiles J.M. The metabolism of acetone in the pregnant rat//Rep. 1986.-Vol.6, №11 -P.983-989.

148. Phue J.N., Shiloach J.Transcription levels of key metabolic genes are the cause for different glucose utilization pathways in E. coli В (BL21) and E. coli К (JM109) // J. Biotechnol. 2004. - Vol. 109, №2. - P.21 -30.

149. Pinzauti G., Giachetti E., Vanni P. Isocitrate lyase of conifers (Pinus pined) II Int. J. Biochem. 1982.-Vol.14, №4.-P.267-275.

150. Poore R.E., Hurst C.H., Assimos D.G., Holmes R.P. Pathways of hepatic oxalate synthesis and their regulation // Am J Physiol. 1997. - Vol.272, №1. - P.289-294.

151. Popov V.N., Igamberdiev A.U., Schnarrenberger C. et al. Induction of glyoxylate cycle enzymes in rat liver upon food starvation // FEBS Lett. 1996. - Vol. 390. -P. 258-260.

152. Popov V.N., Volvenkin S.V., Eprintsev A.T. Glyoxylate cycle enzymes are present in liver peroxisomes of alloxan-treated rats // FEBS Lett. 1998. - Vol. 440. - P.55-58.

153. Ranaldi F., Vanni P., Giachetti E. Enzyme catalysis in microgravity: steady-state kinetic analysis of the isocitrate lyase reaction // Biophys. Chem. 2003. -Vol.103, №2.-P. 169-177.

154. Reaven G.M. Role of insulin resistance in human disease // Diabetes. 1988. Vol.37, №12. -P.1595-1607.

155. Rebrin K., Steil G.M., Getty L., Bergman R.N. Free fatty acid as a link in the regulation of hepatic glucose output by peripheral insulin // Diabetes. 1995. -Vol.44, №9.-P.1038-1045.

156. Reeves H.C., Volk M.J. Determination of isocitrate lyase activity in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1972. - Vol.48, №2. - P.437-441.

157. Reinscheid D.J., Eikmanns B.J., and Sahm H. Malate synthase from Corynebacterium glutamicum: sequence analysis of the gene and biochemical characterization of the enzyme // Microbiology. 1994. - Vol.140. - P.3099-3108.

158. Ronne H. Glucose repression in fungi // Trends Genet. 1995. - Vol.11, №1. -P. 12-17.

159. Rowsell E.V., Snell К., Carnie J.A., Rowsell K.V. The subcellular distribution of rat liver 1-alanine-glyoxylate aminotransferase in relation to a pathway for glucose formation involving glyoxylate // Biochem. J. 1972. - Vol.127. - P. 155-165.

160. Rua J., Soler J., Busto F., de Arriaga D. The pH dependence and modification by diethyl pyrocarbonate of isocitrate lyase from Phycomyces blakesleeanus // European Journal of Biochemistry.- 1995.- V. 232, N 2.- P.381-390.

161. Rubin H. Trelease R.N. Subcellular localization of glyoxylate cycle enzymes in Ascaris suum larvae // J. Cell Biol. 1976. - Vol. 70. - P. 374-383.

162. Scheideler N.L. Schlaich K. et al. Monitoring the switch from housekeeping to pathogen defense metabolism in Arabidopsis thaliana using cDNA arrays // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - P.l0555-10561.

163. Schmid G., Durchslag H., Biedermann G. Molecular structure of malate synthase and structural changes upon ligand binding to the enzyme. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1974, vol. 58, № 2, p. 419-426.

164. Schnarrenberger C., Martin W. / Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyoxylate cycle of higher plants. A case study of endosymbiotic gene transfer. // Eur. J. Biochem. FEBS -2002 V. 269, P. 868-883.

165. Schoonjans K., Staels В., Auwerx J. Role of the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) in mediating the effects of fibrates and fatty acids on gene expression//J. Lipid. Res. 1996. - Vol.37, №5. - P.907-925.

166. Sharma S., Sharma G. Age-related glicogen changes in bruchilds // Mech. Ageing and Develop. 1980. - Vol.13, №4. - P.397-400.

167. Sharma V., Sharma S., Hoener zu Bentrup K. Structure of isocitrate lyase, a persistant factor of Mycobacterium tuberculosis II Nat. Struct. Biol. 2000. -Vol.7.-P. 663-668.

168. Siddiqui A.A., Stanley C.S., Berk S.L. Cloning and expression of isocitrate lyasefrom human round Strongyloides stercoralis II Parasite. 2000. - Vol. 7. - P.233-236.

169. Siddiqui A.A., Stanley C.S., Berk S.L. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round Strongyloides stercoralis II Parasite. 2000. - Vol. 7. - P.233-236.

170. Smith C.V., Huang C., Miczak A. et al. Biochemical and structural studies of malate synthase from Mycobacterium tuberculosis // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P.1735-1743.

171. Song S. Can the glyoxylate pathway contributes to fat-indused hepatic insulin resistance? // Med. Hypotheses. 2000. - Vol. 54. - P. 739-747.

172. Spector L. B. Citrate cleavage and related enzymes. In: Enzymes. New York -London, 1972, p. 357-389.

173. Stumvoll M., Meyer C., Mitrakou A. et al. Renal glucose production and utilization: new aspects in humans // Diabetologia. 1997. - Vol.40, №7. - P.749-757.

174. Sundaram Т. K., Chell R. M., Wilkinson A. E. Monomeric malate synthase from a thermophvlic Bacillus. Molecular and kinetic characteristics. Arch. Biochem. and Biophys., 1980, vol 199 № 2 p 515-525.

175. Surendranathan K.K., Nair P.M. Properties of an Mg -independent isocatrate lyase from gamma irradiated preclimacteric banana (Musa cavendishii) // Proc. Indian Acad. Sci. 1978. - Vol.87, ser. B, №4. - P. 119-126.

176. Thomson A.D., Leevy C.M. Observations on the mechanism of thiamine hydrochloride absorption in man // Clin. Sci. 1972. - Vol.43. - P. 153-163.

177. Titus D.E., Becker W.M. Investigation of the glyoxysome-peroxisome transition in germinating cucumber cotyledons using double-label immunoelectronmicroscopy //Journal of Cell Biology. 1985. - Vol.101, №4. - P. 1288-1299.

178. Tontonoz P., Ни E., Devine J. et al. PPAR gamma 2 regulates adipose expression of the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene // Mol. Cell. Biol. 1995. Vol.15, №1.-P.351-357.

179. Trelease R. N. Biogenesis of glyoxysomes and leaf peroxisomes // Ann. Rev. Plant Physiol., 1984, vol. 35, p. 190-212.

180. Tsai M.J., O'Malley B.W. Molecular mechanisms of action of steroid/thyroid receptor superfamily members // Annu Rev. Biochem. 1994. - Vol 63. - P.451-486.

181. Tsukamoto T. Shimozawa N. Fujiki Y. Peroxisome assembly factor 1: nonsense mutation in a peroxisome-deficient Chinese hamster ovary cell mutant and deletion analysis // Molecular & Cellular Biology. 1994. - Vol. 14, №8. - P.5458-5465.

182. Van den Bosch H., Schutgens R.B., Wanders R.J., Tager J.M. Biochemistry of peroxisomes // Annu Rev. Biochem. 1992. - Vol.61. - P. 157-197.

183. Veneziale C.M., Donofrio J.C, Nishimura H.The concentration of P-enolpyruvate carboxykinase protein in murine tissues in diabetes of chemical and genetic origin // J. Biol. Chem. 1983. - Vol.258, №23. - P. 14257-14262.

184. Watson G.M., Tabita F.R. A ribulose-l,5-bisfosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for phylogenetic and enzymological investigation // FEMS Microbiol. Lett. 1997.-Vol.146.-P.13-22.

185. Wicheanvonagoon S., Arinze I.J. Phosphoenolpyruvate carboxykinase from guinea pig liver mitochondria. Immunological evidence for increase in enzyme amount during neonatal development // Biochem. J. - 1984. - Vol.221, №1. -P. 105-111.

186. Wolins N.E., Donaldson R.P. Specific binding of the peroxisomal protein targeting sequence to glyoxysomal membranes // Journal of Biological Chemistry.- 1994. Vol.269, №2. - P.l 149-1153.

187. Woodward J., Merrett M.J. Induction potential for glyoxylate cycle enzymes during the cell cycle of Euglena gracilis II Eur. J. Biochem. 1975. - Vol.55, №3.- P.555-559.

188. Yanagawa M., Maeda-Nakai E., Yamakawa K. The formation of oxalate from glycolate in rat and human liver // Biochim. Biophys. Acta. 1990. - Vol.1036, №1. - P.24-33.

189. Zawadzki J.K., Wolfe R.R., Mott D.M. Increased rate of Cori cycle in obese subjects with NIDDM and effect of weight reduction // Diabetes. 1988. - Vol. 37, №2.-P. 154-159.

190. Zimatkina T.I., Zimatkin S.M. Thiamine deficiency as predisposition to, and consequence of, increased alcohol consumption // Alcohol Alcohol. 1996. -Vol.31.-P.421-427.

Информация о работе

Зийат М. Вадах
кандидата биологических наук
Воронеж, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Регуляция и экспрессия изоцитратлиазы у Gallus Domesticus в ходе эмбриогенеза и у крыс при экспериментальном диабете - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы